' i I

P 1

? 9

3 . .

I

0Ad -Z 1

'Nombre: C u i l l e r m o P l u l l i e r t C a r l i n .

Mat r i cu l a : 802221 15.

C a r r e r a : B i o l o g i a . &. /Area d e con c en t r a c i Ó n : B i o 1 og 1 a exp e r i men t a 1.

T r i m e s t r e : Décimo, 83-0.

H o r a s se-mana: 20. I

L u g a r donde se l l e v ó a cabo: D e p a r t a m e n t o de B i o q u i m i c a d e l a I

f a c u l t a d de M e d i c i n a de l a U n i v e r s i d a d N a c i o n a l Autónoma d e MCxico.

Fecha de i n i c i o : 31 de e n e r o d e 1983.

/ F e c h a de t e r m i n a c i ó n : 28 de o c t u b r e d e 1 9 8 3

i / N o m b r e d e l t u t o r , p u e s t o y a d s c r i p c i 6 n : D r . M a r i o C a l c a g n o M.,

p r o f e s o r de t i e m p o completo, t i t u l a r "A"; c o o r d i n a d o r d e I n v e s t i

I

I \

i 1

g a c i 6 n .

/ T í t u l o : Mecanismo c i n é t i c o d e l a G l u c o s a m i n a 6 - f o s f a t o i s o m e r a s a

(desaminasa) d e E s c h e r i c h i a c o l i .

.

,

-. P r o y e c t o f i n a l d e S e r v i c i o S o c i a l

q u e p r e s e n t a G u i l l e r m o M u l l i e r t C a r l i n .

Introducción.

En e l catabolismo de los aminoazúcares interviene l a glucosanina-

6-P isomerasa ~desaminasa~,~2-amino-2-desoxi-D-glucosa-6-fosfato c g

t o 1 isomerasa (desaminante) E.C.5.3.1.10.) (1);que se abreviará en

adelante como GlcNHZ6P isomerasa. Esta enzima cataliza l a reacción

reversible-que forma glucosamina-6P (GlcNH26P), a partir de fructosa

6-P .(Fru6P> y NH3.

<Fru6P)= 0.18 mM a 30 O C y pH 7.7, considerando l a concentración

del agua igual a l a unidad) (21, puede tener una función biosintéti

ca. La formación de aminoazúcares en microorganismos y animales se

realiza principalmente por l a transaminación entre l a glutamina .y

l a Fru6P ,catatizada por l a enzima glucosamina-6-P isomerasa forma-

deora de g1utaminaCE.C. 5.3.1.19.); pera, se mencionan en l a litera-

tura ta existencia de especies carentes de esta enzima, como dipte-

ros de los géneros Musca y Drosophila ( 3 , 4 ) y mutantes de E. coli

K ( 5 ) ; en los cuales l a formación de quitina o pared celular, res-

pectivamente, no manifiesta alteraciones. Esto hace de interés e l

estudio de l a reacción en e l sentido biosintético, (formación de

GLcNH26P a partir de Fru6P y NH3), aspecto a l cual se ha prestado

muy poca atención hasta e l momento.

Dado e l Carácter reversible de l a reacción (Keq=(GlcNH26P)/(NH3)

Se ha observado que esta enzima es regulada por N-acetil D-gluco - samina-6-P (GlcNAcóP, que l a activa (efecto K positivo) (6,7,8) y

por nucleótidos de adenina (AMP, ADP) que l a inhiben ( 9 1 , y mani-

fiesta una intensa cooperatividad homotrópica con respecto a ambos

sustratos arccares fosfato, no asi con respecto a l NH3(10). De a-

cuerdo a estas observaciones; se trata de un sistema alostérica re-

versible, funcional en ambos sentidos , l o que constituye un ejemplo único en e l metabolismo y adquiere especial interés desde e l punto

de vista regulatorio.

También si se considera l a reacciOn en si, se trata de una isome-

rización cetoaldólica que tiene lugar simultáneamente con una amina

ción-desaminación, (mecanismo de Amadori), Único ejemplo conocido

en biologia.

- .

3

.

Antecedent es.

En trabajos previos efectuados en e l laboratorio en e l cual se re alizard esta investigación (111, se ha demostrado l a existencia de un patr6n de velocidades iniciales en sentido biosintético de l a reac

ción, que corresponde a un mecanksmo secuencial, para e l cual se

pueden aplicar las siguientes ecuaciones de velocidad inicial y de

Ha 1 dane:

1

Vm(F)(N) VcKm F Km N

+(F) K m G+ (G) "b Km G Km F ; Keq- V-

Donde;

También se encontró un patrón de inhibición por'productos en e l

sentido catabólico (inhibición por Fru6P y Nil3), que puede d e s c r i birse mediante l a ecuación: 11

F=Fru6P, N=NH3, G=GlcNH26P, c=sentido catabólico,

b=sentido biosintético.

(NI (F)-(G)Keq 'b V- Vb(G>Keq Vb(G) (N)Keq

+ Km F + ( N I + K m N(FI + + (N)(F)

De acuerdo a estos resultados puede postularse un mecanismo de ti-

'cKm N

'bKm GKeq

'C v C

po secuencial ordenado, que se esquematiza de acuerdo a la notacion

de Cleland (12)

Los patrones de velocidades iniciales, en los cuales e l Km aparen- te para uno de los substratos biosintéticos (Fru6P o NH no depen-

de de l a concentración del otro,,nO puede interpretarse como un ar-

gumento a favor de un mecanismo de adición a l azar; ya que, esta su

posición s ó l o seria válida en condiciones de equilibrio rápido, pe-

ro no de estado estacionario ( 1 3 ) . En este último caso, e l patrón

3

-

particular observado, (con intersección de Las familias de rectas I

I en l a rama negativa del eje de Las abscisas), puede interpretarse

como una coincidencia fortuita de algunas Constantes del modelo c i

nético ( 1 1 ) . I - !

4

La confirmación del mecanismo que parece inferirse de estos res-

tados; requerirá de experimentos complementarios mediante e l USO de

inhibidores competitivos en ambos sentidos de l a reacción (14);expe

rimentos en equilibrio (apagamiento de fluorescencia por ligandos,

diálisis en equilibrio con sustrqtos marcados, etc.) y estudios c i -

nCticos con sustratos y productos alternativos.

m Objetivos.

1.- Purificación de l a enzima.

2.- Sintetizar los reactivos necesarios para e l estudio cinético,

que n o se puedan adquirir comercialmente.

3.- Estudios de l a inhibición por análogos estructurales de los

sustratos, en ambos sentidos de l a reacción (inhibidores competiti-

vos y sustratos alternativos).

4.- Estudios medinate procedimientos en equilibrio.

5.- Estudios complementarios.

Materiales y métodos.

La purificación de l a enzima s e llevó a cabo por un procedimiento

ya desarrollado en e l laboratorio (10). La sintesis de l a GlcNAc6P

se hizó de acuerdo a l procedimiento establecido por Leloir y Cardini

(6). La elaboración del 2-amino-2-desoxi glucitol-6-fosfato (GlcNHZ-

OH6P) fue a partir de l a GlcNH26P por reducción con KBH4 en una re-

lación de 1.5 moles por mol de Gl'cNH26P, en K2B407 20 mM pH 8.5 a

{temperatura ambiente. La mezcla s e ajustó a pH 6 y se pasó por una

.columna de Douex 50 H (9x150 mm) y se eluyó con H C L 0.05 n. Las +

fracciones que dieron positiva la reacción con l a ninhidrina (15)

se reunieron y se liofilizaron.

Todos los estudios cinéticos fueron realizados a 30 O C en una mez - cia de reacci6n de 200 ut, en presencia de 0.85 mM de GlcNAC6P; pa-

ra los estudios de inhibición se usó como amortiguador Tris-HCL pH

7.7, y para los estudios de variación del Km en función del pH se

utilizó e l mismo amortiguador por arriba de pH 7.2, y PIPES por a-

bajo del mismo valor; en ambos sentidos de l a reacción se desenca-

denó por l a adición de l a enzima.

1

En e l sentido catabólico, poniendo diferentes concentraciones de

5

GlcNH26P se incubó por un tiempo fijo llevando l a reacción a su

termino por l a adición de 2 m l de HCl 10 N. Las concentraciones de

Fru6P se determinaron por e l método de Roe (16) como l o describen

Davis y Gander (171, leyendo l a absorbancia a 512 nm.

En e l sentido de formación de G”lcNH26P, las medidas de velocidad

s e hicieron determinando l a cantidad de producto formado a tiempo

fijo utilizando l a rección de Elson-Morgan (18) como lo describen

Levy y McAllan (191, conteniendo la mezcla de reacción diferentes

concentraciones de los sustratos, Fru6P y NH4Cl. La reacción se d e

tuvo calentando por un minuto en baño de agua a ebullición. l a can-

tidad de GlcNH26P formada fue corregida por blancos correspondientes

para l a presencia de GlcNAc6P. En ambos sentidos de l a reacción e l

avance se conservó por debajo del 5% de conversión. Los datos se procesaron de acuerdo a Johansen y Lumry (20) y en

los estudios de inhibición presentados en dobles reciprocas, para

los estudios de variación del Km presentados en una grefica de Km

vs pH; luego siguiendo el análisis propuesto por Dixon (I), en una gráfica de pKm vs pH.

La

La

term

Resultados.

purificación de l a enzima se encuentra resumida en l a tabla 1.

pureza de los reactivos sintetizados en e l laboratorio se de-

nó por cromatografia en capa-fina; dando para ambos compuestos

una sola mancha, corriendolos en e l sistema cromatografico adecuado

y revelandolos con e l método apropiado.

E l estudio de l a inhibición de l a reacción por e l GlcNH20H6P (fig.

1,2 y 3 ) resultó un patrón de inhibición competitiva Dara los 3 s u s -

tratos; obteniendose una K i de 1.7’ uM para l a reacción en sentido ca - tabólico, y para e l sentido biosi’ntético una Ki de 22.65 UN varian-

do Fru6P y una Ki de 2.2 uM variando NH4Cl.

Los estudios mediante procedimientos en equilibrio, apagamiento

de fluorescencia de l a enzima, no se pudieron realizar por que des - de m i llegada a l Departamento de Bioquimica a l a fecha no se ha re - parado e l fluorómetro del mismo.

I

L o s estudios complementarios realizados fueron los de variación

del Km en función d e l pH. En l a f i g u r a 4 se muestra e l efecto del

i

12

I

3

I

i I

I i i I

! 1

i I

I 1 I

I

I

I

I

I

I

( g r u p o a m i n o ) y o t r o s i t i o p a r a l a u n i ó n d e l f o s f a t c ; 1 ? 1 G l c N H 2 0 H

6P, o c u p a r í a t o d o e l s i t i o a c t i v o . A l e s t a r o c u p a d o e l s i t i o a c t i v o

( e n e l s i t i o q u e a c e p t a e l g r u p o a m i n o ) n o p u e d e e n t r a r a l s i t i o

e l NH3 o NH4, p o r l o q u e s e e n t i e n d e f á c i l m e n t e l a i n h i b i c i ó n com-

p e t i t i v a p r e v i s t a p a r a e l NH C l . S i n e m b a r g o , s i e l i n h i b i d o r s e

p u e d e u n i r a l s i t i o a c t i v o s o l a m e n t e p o r e l f o s f a t o , e s t a r i a o c u p a n

d o e l s i t i o d e u n i ó n d e l a F r u ó P l o q u e e x p l i c a r i a L a i n h i b i c i ó n

c o m p e t i t i v a p a r a l a F r u ó P , s i n d e s c a r t a r e l m e c a n i s m 2 s e c u e n c i a 1 o r

d e n a d o p o s t u l a d o .

+

4 /I

E n e l K m m i n i m o p a r a embos a z ú c a r e s (pH d e 7 . 7 1 , e l K m p a r a e l

NH4CL n o e s e l ó p t i m o . E l Km m i n i m o p a r a N H 4 C l

s u s f o r m a s i ó n i c a s ) s e e n c u e n t r a más c e r c a n o a 7 ( f i g s . 6 , 7 y 8 ) .

C o m p a r a n d o e s t e v a l o r p a r a e l Km m í n i m o p a r a l a F r u 6 * ( e n q u e s u

r a n g o d e K m m i n i m o n o e s t a n e s t r e c h o como p a r a l a G L c N H 2 6 P ) s e

p u e d e s u p o n e r q u e p a r a e l s e n t i d o c a t a b ó l i c o d e l a r e a c c i ó n (como

e s u n i r r e a c t a n t e ) s u P H ó p t i m o s i e s e t PH ó p t i m o p a r a l a G L C N H - 6 P ; s i m e m b a r g o , e l p H ó p t i m o p a r a e l s e n t i d o b i o s i n t t t i c o ( q u e e s

b i r r e a c t a n t e ) h a y q u e c o n s i d e r a r ambos p H e s de l o s s ~ s t r a t o s , t e -

n i e n d o un pH ó p t i m o p a r a l a r e a c c i ó n e n e s t e s e n t i d o a l r e d e d o r d e

7-2 .

( e n c ~ l q u i e r a d e

2

E l c a m b i o d e p e n d i e n t e q u e p r e s e n t a n l a p a r t e a ) y l a p a r t e b )

d e l a f i g u r a 5 , e n t r e 8 . 2 y 8 . 4 s u g u i e r e q u e h a y u n 3 r u p o SH e n e l

s i t i o a c t i v o d e l a e n z i m a p a r a ambos a z ú c a r e s p o r l o s v a l o r e s d e

p K a s q u e p r e s e n t a D i x o n ( 1 ) . . +

E l h e c h o d e q u e p e r m a n e z c a c o n s t a n t e e l pKm p a r a e l NH4 ( f i g . 1 1 )

a p a r t i r d e 7 . 6 , y q u e e l pKm p a r a e l NH3 v a r i e e n e s e r a n g o d e pH

s u g u i e r e q u e e l s u s t r a t o e s e l p r i m e r o ; e s t a s u g e r a n c i a s e p u e d e

v e r t a m b i e n e n l a f i g u r a 7 , e n l a q u e , e n l a p a r t e m i s a l c a l i n a ;

m a y o r c o n c e n t r a c i 6 n d e NH e l K m i s e v a h a c i e n d o c a d a v e z más a l t o . 3

C o n c t u s i o n e s .

Los e x p e r i m e n t o s d e i n h i b i c i ó n r e a l i z a d o s n o d e s c a r t a n e l m d c a n i s - mo s e c u e n c i a 1 o r d e n a d o p o s t u l a d o . A ú n q u e ambos a z ú c a r e s t e n g a n u n

pH ó p t i m o s e m e j a n t e , e l h e c h o d e q u e e l a m o n i o t e n g a un pH d i f e r e n

t e ; h a c e q u e l a r e a c i ó n e n s e n t i d o c a t a b ó l i c o t e n g a u n pH ó p t i m a

e n t r e 7 . 6 y 7 . 8 , y q u e l a r e a c c i ó n e n s e n t i d o b i o s i i t 6 t i c o t e n g a

u n pH ó p t i m o a l r e d e d o r d e 7 . 2 . P o r l o s e s p e r i m e n t o s r e a l i z a d o s , l a

-

+ 4' f o r m a i 6 n i c a q u e s i r v e d e s u s t r a t o e s e l an

I

19

pH sobre e l Km para ambos azúcares, teniendo un minimo Óptirnri para

ambos entre 7.6 y 7.8. En e l análisis propuesto por Dixon(1) (fig.

5 ) es importante señalar e l cambio de pendiente de O a -1; para la

parte a ) en 8.2 y para l a parte bl en 8.4 . Conrespecto a l a variación del Km del NH4Cl en l a figura 6 se ve

que en e l rango en e l que para los azúcares se hace mínimo, para e s

te sustrato se hace máximo y permanece constante entre 20 y 22 mM.

Considerando l a disosioción que presenta e l NH4Cl en NH4 y C l ;

y a su vez e l NH4 puede estar en esta forma iónica o sin protonar,

NH3; cualquiera de las formas en que sepresente puede ser e l sus-

trato de l a enzima. En las figuras 7 y 8 se muestra la variación

del Km para NH3 y NH4 respectivamente. Para deducir cual es l a foc

ma idnica del sustrato, siguiendo e l análisis propuesto por Dixon,

en las figuras 9, 1 0 y 11; se muestra l a variación d e l pKm en fun-

cidn del pH; para NH4Cl, NH3, NH4. Es importante notar que ppra las

posibles formas del sustrato hay una diferencia significativa en su

comportamiento; para e l NH3 (fig. I O ) es una linea con pendiente de

-1, y para e l NH4 presenta una quebradura alrededor de 7.6 (pH),

permaneciendo constante hasta el valor de 8.8 .

- - +

+

+

+

+

Discusión.

EL patr6n de inhibición competitiva con respecto a l GlcNH OH6P

para e l sentido catabólico, por l a K i de 1.7 uM (fig. 1); se dedu - 2

ce que l a forma abierta de l a GlcNH26P es l a forma que s

sustrato a la enzima. Como análogo del producto (hacia e

tido de l a reacción) se esperaria un patrón de inhibición

ducto,para e l mecanismo secuencia1 ordenado planteado en

cedentes, como e l que predice Rudolph (21); en e l que e l

rve de

otro se'

por pro-

los ante-

producto

( o su análogo) presentarian una inhibición competitiva para e l NH4Cl

figura 2, no se obtiene un patrón de inhibición no competitiva para

l a Fru6P; sino competitivo.

y una inhibición no competitiva para l a Fru6P. Como es claro en l a I

i

1 I

S i consideramos que un inhibido-r competitivo es aquel que se une

a l sitio activo de l a enzima(sitio a l que se une e l sustrato), e l

sitio activo de l a GlcNH26P tendria un sitio para l a unión del NH

20

Resumen.

Se purificó l a glucosamina 6-fosfato isomerasa Cdeaminasa1,CE.C.

5.3.1.10). Los patrones de inhibición por GlcNH20H6P resultaron de

tipo competitivo para los tres sustratos; l o que no apoya e l meca-

nismo cinético postulado. Para cada sentido de l a reacción hay un

diferente; en el sentido catabólico de 7 .6 a 7.8, y en e l pH óptimo

sentido b

! e l e l NH4 +

osintético de 7.2 . La orma iónica que sirve de sustrato

I

L i t e r a t u r a c i t a d a .

Pi

1 .- 2.-

3.-

4.-

5.-

6,-

7.- 8.-

9. -

10.-

11 .- 12.-

13.-

14.-

15.-

16.-

17.- 18.-

19.-

20.-

21 * -

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