BACTÉRIOLOGIE DES EAUX
planI. Les méthode générales de prélèvement
et analysesII. Dénombrement des germes témoignant
d’une pollution fécale:II.1 Coliformes totauxII.2 Coliformes fécauxII.3 Streptocoques fécauxII.4 Clostridium sulfito-réducteursII.5 BactériophageIII. Recherche et dénobrement des germes
pathogènesIV. Principaux maladies à transmission
hydrique
INTRODUCTION L’objectif de l’analyse bactériologiqued’une eaux n’est pas d’effectuer un inventairede toutes les espèces présentes, mais derechercher soit celle qui sont susceptibles d’etrepathogènes, soit celles qui sont indicatrices decontamination fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement quidoit mettre en œuvre des méthodes assurantl’absence de contamination et la surviebactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodesgénérales d’examen bactériologique des eaux suiviesdes recherches de bactéries indicatrices de pollutionet d’éfficacitée de traitement puis des bactériesspécifiques pathogènes
I.I méthodes de prélèvement
Matériel de prélèvement : flacon en verre (borosilicaté de préférence)
de 250 à 1000 ml. flacon en plastique à usage unique stérilisés
par le fabriquant.Appareils de prélèvement :
Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement d‘eau un puits, au centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac, on doit utiliser des appareils tel que le plongeur et la canne à prélèvement.
plongeur Canne à prélèvement
En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..)
L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni modifié l’échantillon.
Des précautions doivent être prises à trois niveau:
Le matériel de prélèvement Le mode de prélèvementLe transport la conservation des échantillon
Mode de prélèvement
Méthodes générales de dénombrement
en milieu solide En milieu liquide
Méthode par incorporation
Méthode par étalement
Méthode par filtration
Méthode de détermination du
nombre le plus probable (PPN)
Méthodes en milieu solide
Méthode par incorporation:
Principe:L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées.
Mode opératoire
.
1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml)
3)faire un mouvement de rotation
2) Incorporer le milieu en surfusion
Incuber
Faire le dénombrement
méthode par étalement
Principe:L’échantillon d’eau à analyser est
étaler à laSurface d’un milieu gélose sans traced’humidité: après incubation, les
colonies quise développent à la surface sontdénombrées.
Mode opératoire
Etaleur stérile (râteau)
Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml
Incuber
Dénombrer les colonies développer à la surface
Méthode par filtration
Principe:L’échantillon d’eau à analyser est filtré
àTravers une membrane qui retient les
microorganisme. La membrane est ensuite
placéesur un milieu gélosé. Durant
l’incubation, descolonies se forment à la surface de lamembrane
Mode opératoire
Technique de dénombrement en milieu liquide
Principe générale:Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de sesDilution sont incorporées dans un milieu liquide
conçuPour permettre la croissance d’un micro-
organismeou de groupe de microorganismes. la croissance
setraduit par l’apparition d’un trouble du milieu et,éventuellement, une modification visible ( virage
d’unindicateur de pH coloré)
Méthode du nombre le plus probable
Principe: Cette méthode est une estimation statistique dunombre de micro-organisme supposés distribués dansl’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimationde la densité bactérienne est obtenue parapplication du principe de vraisemblance, à partir deréponses positives observées pour une ou plusieursdilution successives de la suspension bactérienneoriginelle. Il s’agit d’une méthode quantique et nonpas énumératif.
Mode opératoire On ensemence des dilutions successives de l’eau
à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque).
On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme.
Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence de micro-organisme, plus d’un micro-organisme peut être responsable d’une culture positive.
Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).
Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécaleNotion d’indicateur comme l’origine de la plupart des micro-organismespathogènes véhiculés par l’eau est fécale,le principe du contrôle de la qualité de l’eau reposesur la démonstration que l’eau distribuée ne contientpas de germes provenant de contamination fécale.Pour cela, on recherche des indicateurs de contaminationfécale, appelés aussi germes témoins de contaminationfécale. On parle également d’indicateurs de traitement
quipermettent d’évaluer l’efficacité des différents
traitementsDe potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différentsgermes.
Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature :
Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population.
Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale : systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de féces d’animaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans l’eau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre.
Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau.
Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout.
Dénombrement des micro-organismes revivifiables
Définition:On entend par microorganismes : Bactéries,
Levures,Moisissures se développant en aérobiose,
lorsque l’essaiest effectué selon la méthode spécifiée.Le principe consiste à mettre en évidence les
bactéries Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les
germes spécifiques de l’eau. Et celles qui se développent à 37°C favorisant
ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud.
dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées.
Dans l’usine de potabilisation, il permet de contrôler l’efficacité des différentes étapes du traitement.
dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe d’une multiplication bactérienne dans le réseau ou d’une intrusion de bactéries à l’intérieur de celui-ci.
Dans les réservoirs et châteaux d’eau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de l’eau et sur la reviviscence des germes
Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
Définitions:Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non
sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C.
Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte :
Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia.
Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena.
Intérêt: la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C :intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale surecoliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale.La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux.
Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou entérocoque
Définition : bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes,formant des chainettes, non sporulées,
catalasenégative, possédant l’antigène D, cultivant enanaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capablesd’hydrolyser l’esculine en présence de bile.Ils se répartissent en deux genres : streptococcus et enterococcus.
Intérêt: les entéroques sont plus résistant que les
coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne.
La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau.
Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.
Recherche et dénombrement des spores des bactéries sulfito-
réductrices et clostridium sulfito-réducteurs
Définitions:Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices :formes de résistance de micro-organismes sedéveloppant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou48h en gélose viande foie et donnant des coloniestypiques réduisant le sulfite de sodium.
Spores de clostridium sulfitoréducteurs : mêmedéfinition que la précédente pour des bacilles à
Grampositif, ne possédant pas de catalase et ayantl’aspect morphologique des clostridium.
Intérêt: ils ne sont pas tous des indicateurs de
contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste.
L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection.
Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.
III. Méthode de recherche et Dénombrement des germes témoignant d’une pollution
fécale:analyse technique Volume
de PE Milieu utilisé
T d’incubation
confirmation
µ-organismerevivifiables
Incorporation en milieu liquide
1 ml Gélose à l’extrait de levure
37° OU 20° C -
Coliformes totaux
filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC
37° C Colonies typiqueOX-
Coliformes fécaux
filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC
44° C Colonies typique
StreptocoqueDu Gr D
filtration 100 ml Gélose Slanetz et bartley
37° C Colonies typiques +Litsky
Colistridiums sulfito-réducteurs
Incorporation en milieu solide
20 ml Gélose tryptome sulfite à la D- cyclosérine
37 ° C Colomies typique
IV. Recherche des bactéries pathogènesIV.1 Recherche de salmonellaDéfinition:
Des bacille Gram négatifs (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48
h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir.
Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques.
Méthode de recherche
Pré-enrichissement
Enrichissement primaire
Enrichissement secondaire
Lecture et interprétation : Repérer les colonies caractéristiques. Faire une identification biochimique
basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC…
Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence.
Recherche de vibrion cholérique
Définition: Bacille Gram négatif droits ou
incurvés, Très mobiles, Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans
production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes.
Méthode de recherche
Recherche de Staphylocoques à coagulase positive :
Définition: Cocci à Gram (+) Isolées ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un
milieu sélectif Chapman au mannitol.
L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée.
Méthode de recherche
Recherche de Pseudomonas aérogénosa
Définition: Un bacille Gram négatif Oxydase (+) Capable de produire de l’ammoniac
à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est
également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.
Méthode de recherche
Critères microbiologiques d’une eau potable
Les principales maladies à transmission hydrique