Les méthodes d’etudés de coliformes

REPUBLIC ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de L'Enseignement supérieure et de la Recherche Scientifique

Réalisé par: Saidi Sara Dirigé par:

Mdm mehamdi

1 . Introduction.2 .Recherche et dénombrement des coliformes totaux et

fécaux.3 .Méthodes classiques de détection des coliformes .

3.1 .Les méthodes de dénombrent .3.2 . Méthode en milieu solide.

3.2.1 .Méthode par filtration :3.2.2 .Méthode par incorporation:

3.2.3 .Méthode par étalement 3.3 .Technique de dénombrement en milieu liquide:

4 .La nouvelle méthode pour l’étude des bactéries fécales .appliquées au bassin de la Seine

4. 1 .Développements méthodologique.4.2 . Objectif.

4.3 .Méthode enzymatique pour le dénombrement d’ Escherichia coli.

4.3.1. Principe de la méthode enzymatique.4.3.2. Interprétation .

5 .Conclusion .

Sommaire

Introduction Les coliformes sont des micro-organismes que nous retrouvons partout dans notre environnement, dans notre corps, de même que dans celui de tous les êtres vivants. L'ensemble de ces coliformes se nomme coliformes totaux. Certains groupes de coliformes se retrouvent dans les excréments des animaux à sang chaud; ce sont les coliformes fécaux.

Définitions:Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C. Ils se répartissent en fait en deux catégories :

Les germes d’origine fécale stricte : Ces coliformes sont capables de se développer à 44°C Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia.

Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena.

2.Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

les deux méthodes traditionnelles d'énumération des coliformes sont la détermination du Nombre le Plus Probable (NPP) en milieu liquide, et le dénombrement des Unités Formant Colonie (UFC) après incubation sur

milieu gélosé spécifique .

3.Méthodes classiques de détection des bactéries coliformes:

3.1LES MÉTHODES DE DÉNOMBREMENTS:

en milieu solide En milieu liquide

Méthode par incorporation

Méthode par étalement

Méthode par filtration

Méthode de détermination du

nombre le plus probable (NPP)

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est filtré à Travers une membrane qui retient les micro organisme. La membrane est ensuite placée sur un milieu Mac conkey ou chapman TTC. Durant l’incubation, les colonies se forment à la surface de la .Membrane

3.2.1Méthode par filtration:

3.2Méthodes en milieu solide

100ml de chaque échantillon d’eau recueilli ont été filtrés sur une membrane stérile d’acétate de cellulose 0.22um millipore, cette dernière est ensuite déposée sue une gélose de Mac conkey puis incubée pendant 24 heures a 37C pour le dénombrement des coliformes totaux et a 44C pour le dénombrement des coliformes fécaux .

 

Protocole expérimental:

La méthode manuelle :

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide(milieu VRBL ou DCL) préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées .

3.2.2Méthode par incorporation:

Mode opératoire

1 )volume d'eau à ensemencer ( 1

ml)

3)faire un mouvement de

rotation 2 )Incorporer

le milieu en surfusion (VRBLOU DCR)

Incuber

Faire le dénombrement

MÉTHODE PAR ÉTALEMENT:

Principe:L’échantillon d’eau à analyser est étaler à la Surface d’un milieu (VRBL ou DCL) sans trace d’humidité: après incubation, les colonies qui se développent à la surface .sont dénombrées

Mode opératoire

Incuber Dénombrer les colonies développer à la surface

Etaleur stérile (râteau)

Volume d'eau à ensemencer 1 ml

GÉLOSE VRBL DOMAINE D’UTILISATION: La gélose lactosée biliée au

cristal violet et au rouge neutre (VRBL) est un milieu sélectif utilisé .

pour les recherche et dénombrement des coliformes dans l’eau, le lait, les produits laitiers et les autres produits alimentaires.

La présence simultanée de cristal violet et de sels biliaires assure l’inhibition des bactéries à Gram positif .

-La fermentation du lactose se traduit par une acidification, révélée par le virage au rouge de l’indicateur pH (rouge neutre), et par la précipitation d’acides biliaires autour des colonies.

• Les coliformes présentent des colonies violacées de diamètre

égal ou supérieur à 0,5 mm après 24 heures d’incubation.

3.3 Technique de dénombrement en milieu

liquide

La numération des coliformes est réaliséé par ensemencement de 1 ml de l’echantillon et de ses dilution dans un bouillon lactosé bilé au vert brillant BLBVB les essais sont effectués en double ou triple et les resultats analysés par méthode de .Mac Grady

BOUILLON LACTOSÉ BILIÉ AU VERT BRILLANT

(BLBVB)•DOMAINE D’UTILISATION :

BLBVB est utilisé pour les recherche et dénombrement des coliformes, des coliformes thermotolérants et d’Escherichia coli dans le lait, les produits laitiers et les autres produits alimentaires, les eaux d’alimentation résiduaires.

La présence simultanée de bile de bœuf et de vert brillant provoque l’inhibition de la presque totalité des microorganismes à Gram+ et des bactéries à Gram- autres que les coliformes .

-Le développement des coliformes

se manifeste par l’apparition d’une turbidité, associée à une production de gaz dans la cloche de Durham par suite de la fermentation du lactose .

La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) utilise une méthode statistique pour connaître le nombre (le plus probable) de bactéries présentes dans 1 mL de dilution.

 

• Si le tube est + = il y a au moins une bactérie / mL de la dilution considérée

• Si le tube est - = il y a moins de une bactérie / mL de la dilution considérée

Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2, 3, 4 ou 5) et on compare les résultats à une table

statistique = la table de Mac Grady

4.La Nouvelle méthode pour l’étude des bactéries fécales appliquées au bassin de la Seine

( Groupe de Microbiologie des Milieux Aquatiques,

Université Libre de Bruxelles, Belgique)

Le bassin de la Seine est un des plus densément peuplé d'Europe. Cette importante pression anthropique, implique des rejets très importants desbactéries fécales dans ses eaux, essentiellement par les .eaux usées domestiques et les rejets agricoles

La détection des pollutions fécales dans les milieux naturels se fait habituellement par larecherche des germes indicateurs de contamination fécale, des bactéries spécifiques de la flore intestinale .

Les méthodes classiques d'énumération des coliformes dans les eaux naturelles sont basées sur la mise en culture des échantillons dans ou sur des milieux nutritifs sélectifs. En raison de certaines limitations des méthodes traditionnelles, de nombreuses autres techniques de détection des coliformes ont été développées, Une des méthodes basées sur les propriétés enzymatiques des coliformes ne nécessite pas de .mise en culture des échantillons

4.1 Développements méthodologiques

Dans se travail l’objectif était d’optimiser cette méthode pour la détection quantitative des coliformes dans les eaux douces naturelles et les eaux usées, afin de l’utiliser comme alternative aux traditionnels dénombrements sur milieu gélosé sélectif .

4.2 Objectif

4.3 méthode enzymatique pour le dénombrement

d’Escherichia coli

4.3.1 Mise au point de la méthode enzymatique:

La méthode originale développée dans ce travail est basée sur la mesure d’une activité Enzymatique spécifique du coliforme fécal le plus abondant, Escherichia coli: l’activité b-Dglucuronidasique

4.3.2 Principe de la méthode enzymatique :

4.3.3 la Méthode enzymatique:

L'apparition de fluorescence est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent dans l'échantillon, qui est elle-même proportionnelle au nombre d’E.coli dans l'échantillon si la quantité d'enzyme par bactérie est constante .

 

4.3.2 Interprétation

L’avantage de la méthode

enzymatique

ne comporte aucune étape

de mise en culture

permet un gain de temps

d’incubation considérable par

rapport aux méthodes

classiques sur milieu gélosé

(réponse en 20 à 30 minutes)

un long temps de réponse

ne permettent pas de

détecter les pollutions fécales en

milieu naturel

ne permettent pas d’y détecter

les bactéries ‘actives mais

non cultivables

les inconvénients des méthodes

classique

•L’intérêt de la détection des coliformes, à titre d’organismes indicateurs, réside dans le fait que leur survie dans l’environnement est généralement équivalente à celle des bactéries pathogènes et que leur densité est généralement proportionnelle au degré de pollution produite par les matières fécales

• Les coliformes fécaux sont donc des indicateurs des taux de contamination qui ont une résistance au traitement élevée para port à celle des espéces pathogénes par conséquence leurs absence nous assurons que notre échantillons est bien traité

conclusion

Merci pour votre attention