nIRECTION DE LENVIRONNEMENT ET DE LAMENAGEMENT LfITORAL
ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES
DE SEDIMENTS COTIERS
PAR ACTION CHIMIQUE ET PHYSIQUE
DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP
DEL -lABORATOIRE MICROBIOLOGIE
DEL 9212
IFREMER-DEROIEL
II~ 111111111 111111111111111 11111 1111 OEL04439
IFREMER Centre de BREST SDP BP 70 29280 PLOUZANE Teacutel 98224040 Teacutelex 940 627
DIRECTION DE L E~VIRONNENE)lT ET DE Lf~~NAGEMENT LITTORAL (DEL)
Laboratoire de Microbiologie
ALlTEUR (S ) DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP
CODE
Ndeg DEL 2212
TITRE ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES DE SEDIMENTS COTIERS PAR ACTION CBIMIQUE ET PHYSIQUE
Date Mars 1992
Tirage nb 20
CONTRAT (intituleacute)
Ndeg
DIFFUSION
Libre X Restreinte Confidentielle
RESUME
Min dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes du seacutediment nous avons testeacute diffeacuterentes meacutethodes physiques et chimiques pour relarguer les bacteacuteries des particules Une eacutetude preacuteliminaire a permis de deacutefinir des concentrations et des temps daction non toxiques pour des bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
Les diffeacuterentes techniques testeacutees ne permettent daugmenter la numeacuteration dans le meilleur des cas (action du lauryl sulfate de sodium) que dune demi uniteacute log
ABSTRACT
Mots-cleacutes Bacteacuteries seacutediments adheacutesion techniques de deacutecrochage
Key words
rrREJlIlER
1
SOMMAIRE
INTRODUCIION middot bull S
1 - ETUDE DE LA TOXICITE DES TECHNIQUES UTILISEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES S
11 Souches bacteacuteriennes S
12 Traitements physiques 7
121 Protocole 7 122 Reacutesultats 7 123 Conclusion 8
13 Produits chimiques testeacutes 9
131 Protocole 9 132 Reacutesultats 10 133 Conclusion 11
n - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT 11
21 Mateacuteriel et meacutethodes 11
22 Reacutesultats middot 11
ESSAI Ndeg 1 middot 12 ESSAI Ndeg 2 middot 12 ESSAI Ndeg 3 middot 13 ESSAI Ndeg 4 middot 14 ESSAI ~ 5 14 ESSAI Ndeg middot lS ESSAI Ndeg 7 1S
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION 16
BmUOGRAPHIE ~ 18
5
INTRODucnON
Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)
1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES
Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
11 Souches bacteacuteriennes
Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix
- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp
- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium
Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante
middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC
middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC
middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique
6
bull middot middot middotbull
bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull
bullbull bullbullmiddot middot bullbullbullmiddot
bullbull middot middot middot middotbullbullbull bullmiddot bullmiddot bull bullbull bullbullbull
bullmiddotbull bullbullbullbull middot bullbull middotbull bullbull middotbull t- middot middot middot middot bull bull bull middot bullmiddot bull bull bull bull bull
bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull
middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull
] Support
Fibre Irlysaxharidique
Membrane externe de la bacteacuterie
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Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
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VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
IFREMER Centre de BREST SDP BP 70 29280 PLOUZANE Teacutel 98224040 Teacutelex 940 627
DIRECTION DE L E~VIRONNENE)lT ET DE Lf~~NAGEMENT LITTORAL (DEL)
Laboratoire de Microbiologie
ALlTEUR (S ) DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP
CODE
Ndeg DEL 2212
TITRE ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES DE SEDIMENTS COTIERS PAR ACTION CBIMIQUE ET PHYSIQUE
Date Mars 1992
Tirage nb 20
CONTRAT (intituleacute)
Ndeg
DIFFUSION
Libre X Restreinte Confidentielle
RESUME
Min dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes du seacutediment nous avons testeacute diffeacuterentes meacutethodes physiques et chimiques pour relarguer les bacteacuteries des particules Une eacutetude preacuteliminaire a permis de deacutefinir des concentrations et des temps daction non toxiques pour des bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
Les diffeacuterentes techniques testeacutees ne permettent daugmenter la numeacuteration dans le meilleur des cas (action du lauryl sulfate de sodium) que dune demi uniteacute log
ABSTRACT
Mots-cleacutes Bacteacuteries seacutediments adheacutesion techniques de deacutecrochage
Key words
rrREJlIlER
1
SOMMAIRE
INTRODUCIION middot bull S
1 - ETUDE DE LA TOXICITE DES TECHNIQUES UTILISEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES S
11 Souches bacteacuteriennes S
12 Traitements physiques 7
121 Protocole 7 122 Reacutesultats 7 123 Conclusion 8
13 Produits chimiques testeacutes 9
131 Protocole 9 132 Reacutesultats 10 133 Conclusion 11
n - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT 11
21 Mateacuteriel et meacutethodes 11
22 Reacutesultats middot 11
ESSAI Ndeg 1 middot 12 ESSAI Ndeg 2 middot 12 ESSAI Ndeg 3 middot 13 ESSAI Ndeg 4 middot 14 ESSAI ~ 5 14 ESSAI Ndeg middot lS ESSAI Ndeg 7 1S
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION 16
BmUOGRAPHIE ~ 18
5
INTRODucnON
Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)
1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES
Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
11 Souches bacteacuteriennes
Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix
- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp
- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium
Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante
middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC
middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC
middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique
6
bull middot middot middotbull
bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull
bullbull bullbullmiddot middot bullbullbullmiddot
bullbull middot middot middot middotbullbullbull bullmiddot bullmiddot bull bullbull bullbullbull
bullmiddotbull bullbullbullbull middot bullbull middotbull bullbull middotbull t- middot middot middot middot bull bull bull middot bullmiddot bull bull bull bull bull
bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull
middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull
] Support
Fibre Irlysaxharidique
Membrane externe de la bacteacuterie
4 LE GtyCOCUlX io pordt la __
dau UctftI W ~ l1li coaJUNH 4 moillCliUCJ li (cM _ecuac CI ici tt (or_ crlUM foree cie w J uas HIIC1Le MM mer egraveiaeI 1(UI rrvnij1AaUOMtVuccllU1ftIIIIl PV1_ru ta tMftJotaDC tA~I CltUWll4t 4middot GlUN 1 4bra H-cau- fuh U1f~ bullbull ~_J C CDIIfIl
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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ
Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
SOMMAIRE
INTRODUCIION middot bull S
1 - ETUDE DE LA TOXICITE DES TECHNIQUES UTILISEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES S
11 Souches bacteacuteriennes S
12 Traitements physiques 7
121 Protocole 7 122 Reacutesultats 7 123 Conclusion 8
13 Produits chimiques testeacutes 9
131 Protocole 9 132 Reacutesultats 10 133 Conclusion 11
n - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT 11
21 Mateacuteriel et meacutethodes 11
22 Reacutesultats middot 11
ESSAI Ndeg 1 middot 12 ESSAI Ndeg 2 middot 12 ESSAI Ndeg 3 middot 13 ESSAI Ndeg 4 middot 14 ESSAI ~ 5 14 ESSAI Ndeg middot lS ESSAI Ndeg 7 1S
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION 16
BmUOGRAPHIE ~ 18
5
INTRODucnON
Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)
1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES
Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
11 Souches bacteacuteriennes
Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix
- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp
- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium
Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante
middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC
middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC
middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique
6
bull middot middot middotbull
bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull
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] Support
Fibre Irlysaxharidique
Membrane externe de la bacteacuterie
4 LE GtyCOCUlX io pordt la __
dau UctftI W ~ l1li coaJUNH 4 moillCliUCJ li (cM _ecuac CI ici tt (or_ crlUM foree cie w J uas HIIC1Le MM mer egraveiaeI 1(UI rrvnij1AaUOMtVuccllU1ftIIIIl PV1_ru ta tMftJotaDC tA~I CltUWll4t 4middot GlUN 1 4bra H-cau- fuh U1f~ bullbull ~_J C CDIIfIl
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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ
Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
5
INTRODucnON
Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)
1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES
Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire
11 Souches bacteacuteriennes
Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix
- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp
- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium
Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante
middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC
middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC
middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique
6
bull middot middot middotbull
bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull
bullbull bullbullmiddot middot bullbullbullmiddot
bullbull middot middot middot middotbullbullbull bullmiddot bullmiddot bull bullbull bullbullbull
bullmiddotbull bullbullbullbull middot bullbull middotbull bullbull middotbull t- middot middot middot middot bull bull bull middot bullmiddot bull bull bull bull bull
bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull
middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull
] Support
Fibre Irlysaxharidique
Membrane externe de la bacteacuterie
4 LE GtyCOCUlX io pordt la __
dau UctftI W ~ l1li coaJUNH 4 moillCliUCJ li (cM _ecuac CI ici tt (or_ crlUM foree cie w J uas HIIC1Le MM mer egraveiaeI 1(UI rrvnij1AaUOMtVuccllU1ftIIIIl PV1_ru ta tMftJotaDC tA~I CltUWll4t 4middot GlUN 1 4bra H-cau- fuh U1f~ bullbull ~_J C CDIIfIl
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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ
Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
6
bull middot middot middotbull
bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull
bullbull bullbullmiddot middot bullbullbullmiddot
bullbull middot middot middot middotbullbullbull bullmiddot bullmiddot bull bullbull bullbullbull
bullmiddotbull bullbullbullbull middot bullbull middotbull bullbull middotbull t- middot middot middot middot bull bull bull middot bullmiddot bull bull bull bull bull
bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull
middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull
] Support
Fibre Irlysaxharidique
Membrane externe de la bacteacuterie
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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ
Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
7
middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml
middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute
12 Traitements physiques
121 Protocole
Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)
- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents
- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)
- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation
Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium
122 Reacutesultats
Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)
a) Ultra-sons
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl
US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104
US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp
US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
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ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
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Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
8
b) Agitation magneacutetique
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans AM 88 let 96 let 18 104
AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104
AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3
AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3
c) Vortex
E coli Salmonella spp S faecium
M (t 0) M (t 0) M (t 0)
Sans V 65 104 11 10 213 104
V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104
V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3
123 Conclusion
Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant
Ultra-sons 10 min
Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)
Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
9
13 Produits chimiques testeacutes
131 protocole
Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)
Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)
NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS
TESTEES
Sel de sodium Peacuteriodate de sodium
01
001
0001
Sel de sodium Pyrophosphate de sodium
001 M
0001 M
00001 M
Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique
01
001
0001
Sel dazote Ureacutee
01
001
0001
Deacutetergent PRIL 2
02
Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium
01
001
0001
Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
10
Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees
Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute
132 Reacutesultats
Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique
1 Peacuteriodate de Na
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Ps aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
001 lt 001 0001 001 001 001
2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches
3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches
5 PRIL
Souche E coli SalmoneUa spp
A hydrophila Pa aeruginosa
Acinetobacter spp
S faecium
Concentration produit
2 2 2 2 lt 02 lt 02
6 LSS
Souche E coli Salmonella spp
A hydrophila Pa aeruginosa
AcinetolHuter spp
S faecium
Concentration produit
0001 0001 0001 01 0001 0001
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
11
133 Conclusion
Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes
Produits Periodate de Na
Pyropho de Na
Ureacutee EDTA PRIL LSS
Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001
fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT
21 Mateacuteriel et meacutethodes
Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1
)
A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique
- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex
Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non
seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)
22 Reacutesultats
Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec
M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide
1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
12
ESSAI Ndeg 1
Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)
Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats
M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement
Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0
US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984
ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min
2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Traitement M (z cr) 1
Sans traitement 865 (z 092) 1(t
Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0
V 104 (z 022) 1(t 2023
EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01
AM 745 (z 064) 1(t lt0
V 80 (z 424) 1(t lt0
UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01
AM 875 (z 176) 1(t 116
V 86 (z 198) 1(t lt0
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
13
ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase
US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats
Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1
Traitement M (t 0) 1 shy -~
Sans traitement 76 (1 028) 104
Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0
V 53 (1 099) 104 lt0
Pyrophosphate de Na 01 M
US
V
50 (1 169) 1Q4
46 (1 155) 104
lt0
lt0
UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1
V 50 (1 198) 1Q4 lt0
EDTA 1
US
V
53 (1 042) 1Q4
455 (1 134) lQ4
lt0
lt0
Sans traitement 63 (1 127) 104
PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002
V 805 (t 332) 1Q4 2778
Periodate de Na
0005
US
V
76 (1 099) 1Q4
56 (1 014) 104
2063
lt0
LSS 0001
US
V
156 (plusmn 131) lOS
114 (1 08) lOS
14762
8095
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
14
ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat
Traitement Nb Bactml 1
Sans traitement 64 Hr
Periodate de Na 0005
AM 67 Hr 469
Pyrophosphate de Na 01 M
AM 41 104 lt0
UREE 1 AM 63 104 lt0
EDTA 1 AM 67 Ur 469
LSS 0001
AM 78 104 2187
Tween 80 1
AM 55 ur lt0
ESSAI Ndeg 5
Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement
AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure
Traitement Mto 1
Sans traitement 333 (t 042) 104
Periodate de Na
0005
AM 286 (t 050) 1Q4 lt0
LSS 0001
AM 376 (t 068) 1Q4 1291
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
15
ESSAI Ndeg (
Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)
Traitement M (t 0) 1
Sans traitement 5 reacuteplicats
256 (t 040) 104
LSS 0003
5 reacuteplicats
AM 216 (t 083) 1Q4 lt0
LSS 0003
3 reacuteplicats
US 266 (t 015) 104 78
ESSAI Ndeg 7
Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)
Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110
ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250
LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale
PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351
SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219
VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126
YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600
16
M(plusmn 0) sans traitement
M(plusmn 0) apregraves traitement
1
Triton 35 (plusmn 071) 104
515 (plusmn 021) 104
AM
Vi
50 (plusmn 127) 104
51 (plusmn 071) 104
428
lt0
Marlophen 35 (plusmn 071) 104
48 (plusmn 071) 1~
AM
Vi
395 (plusmn 035) 104
485 (plusmn 106) 1~
143
10
Brij 35 (plusmn 071) 1~
46 (plusmn 028) 1~
AM
Vi
50 (plusmn 042) 104
495 (plusmn 049) 104
428
76
ID - DISCUSSION ET CONCLUSION
De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries
Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable
Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose
En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)
17
Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
18
BIBUOGRAPIllE
ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621
BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90
CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287
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Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile
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