N° d'enregistrement
au C.N.R.S. %4-cÂ-
THESE DE DOCTORAT D'ETAT ES SCIENCES NATURELLES
présentée
A LA FACULTE DES SCIENCES
DE PARIS
par
Josette T A N"G U y
pour obtenir"
.LE GRADE DE DOCTEUR ES - SCIENCES
Sujet de la Thèse: QUELQUES ASPECTS DU METABOLIS~Œ DES COMPOSES PHENOL1QUES
CHEZ LES Nicotiana HYPERSENSIBLES AU VIRUS DE LA MOSAIQUE
DU TABAC SOUCHE COMMUNE •
Soutenue le
O.R.S.T.O.M.
PARIS
1970
Avant-Propos
Ce travail·a pu être réalisé au Laboratoire de Biochimie de la res~s'
tance de l'Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer, grâce àson Directeur Général, Monsieur le Professeur G. CAMUS, qui a bien voulu, enoutre, nous faire l'honneur d'assumer la présidence de notre jury.
Monsieur C. MARTIN, Directeur de Recherche à l'Institut National dela Recherche Agronomique, et notre Dirècteur scientifique à l'ORSTOM a orientéinitialement ce travail. Depuis 1965, il n'a cessé de le suivre, de nous faireprofiter de ses vastes connaissances, de ses critiques et de ses suggestions.Il nous a toujours accueillie avec bienveillance et n'a jamais hésité à nous alcorder une aide matérielle précieuse. Qu'il trouve ici l'expression de notreplus profonde gratitude.
Madame J. POLONSKY, Directeur de Recherche au Centre National de laRecherche Scientifique, Monsieur le Professeur L. HIRTH président du ComitéTechnique de Phytopathologie et Zoologie de l'ORSTOM, ont bien voulu s'intéres'ser à notre travail et faire partie du jury de notre thêse. Nous les prionsd'agréer tous nos remerciements.
Nous voudrions également exprimer notre v~ve reconna~ssance au Docteur J.B. HARBORNE qui nous a accueillie dans son laboratoire de l'Universitéde Liverpool et nous a fait partager ses nombreuses connaissances sur la chimie des phénols.
Nous tenons à associer à ces remerciements Monsieur M. MEIFFREN quia guidé nos premiers pas dans le domaine de la recherche et n'a cessé depuisnotre entrée à l'ORSTOM de nous prodiguer ses nombreux conseils.
Nous voulons remercier de façon toute particuliêre Monsieur M. GALLE'qui nous a fourni toutes les plantes utilisées au cours de nos recherches, etdont la collaboration précieuse fut sans doute l'un des facteurs déterminantsde la réalisation de ce travail.
Notre gratitude est également acquise à Madame M. HARDY dont les conseils techniques nous ont été fort précieux, et à Madame J. ROUVEROT qui a apporté à l'exécution de ce travail une aide efficace et dévouée.
Nous remercions également }~demoiselle Y. ROUSSEL pour ses conseilsrelatifs à la rédaction et à la réalisation de ce mémoire.
Enfin, nous remercierons tous nos amis et collêgues desS.S.C. deBondy pour l'ambiance de cordiale sympathie qu'ils ont contribué à faire régneet sans laquelle ce travail n'aurait pu être mené à bien.
-,2 -
..
Sommaire
l n t r 0 duc t ion .................................................................................. , .. 7
Chapitre Pre mie r
HISTORIQUE .................................................................... Il .. 9
19
12
1215
16
10Les composés en CG' C6 - Cl, CG - C2 ou dérivésde l'acide benzoique •...........................Les composés en CG - C3 ou dérivés de l'acidecinnamique ..
1.- Les acides cinnamiques ......•2.- Les coumarines......... • •.....
B -
C - Composés en CG - C3 - CG ou flavonoides ..•••.•••••••••..
III.Accumulation des substances phénoliques chez lesplantes en réponse à des blessures causées aussibien par des agents pathogènes que par des facteursmécaniques ..
l. Généralités 9II. Classification des composés phénoliques) inventaire
de ceux identifiés dans le tabac • . . • • . . • . . . • . • . . . . . . . • . . . . . • • . 10
A-
Cha pit r e 2 l
MATERIEL ET TECHNIQUES ANALYTIQUES 20
l. Matériel végétal ..II. Méthodes générales d'étude des composés aromatiques
2020
~ 3 -
Identification de ces combinaisons
Séparation des combinaisons (hétérosides et esters)
22
22
22222222
23
2324
24
242425
25
25
2526
26
2021
Solvants .Révélation des chromatogrammes
Généralités .Acides-phénols, coumarinesFlavonols .
Acides-phénols, coumarinesFlavonols .
Chromatographie sur papier
Hydrolyse acide . • . • • • • . . . . . • .•••.•.Hydrolyse alcaline .••.•.•.•.•••••••.••.Hydrolyse enzymatique ••..•••••••....•..••Extraction et purification des aglycones
Séparation des aglycones
Identification des aglycones
ab
ab
abC
},- Les
abcd
},-
2.-
3.-
Généralités .Préparation des extraits .Hydrolyses des extraits initiaux. Séparation etidentification des aglycones ••.•.•..•..•••••.••.•.
différents types d'hydrolyse •••••....
E
ABC
D -
III.Dosage des composés phénoliques
a Réactif de Folin et Ciocalteub Solution aqueuse de Naz C0 3
2. - Mode opératoire .••...••••••...•
Principes .Dosage global des composés phénoliques
1.- Réactifs .
Comparaison des Rf avec ceux des produitsde référence .Purification des substances phénoliques .•..••...•Identification des produits isolés .•...•••••
262727
27
30
31
3132
32
3232
32
Réalisation des spectres ••••.•••...•.••••Identification des produits résultant de1 'hydrolyse
ab
},-
2.3.-
AB
Dosage des différents composés après séparationet purification par chromatographie sur papier
C -
},
2.-Utilisation du réactif des phénolsEtablissement des courbes d'étalonnage
33
3333
- 4 -
Cha pit r e 3
ETUDE, EVOLUTION QUALITATIVE DES COMPOSES PHENOLIQUESDANS DES Nicotiana xanthi N.C., INFECTES A 20 ET 30 OcPAR LE VIRUS DE LA MOSAIQUE DU TABAC SOUCHE COMMUNE.EXAMEN DU COMPORTEMENT DE CES SUBSTANCES DANS DES TABACSVIROSE S DE LA VARIETE Samsun .....................•................
1. Résultats expérimentaux35
35A -
B -
Identification des polyphénols présents dans lesfeuilles saines de Nicotiana xanthi n.c ..••••••.••.•.••••
1.- Dérivés de l'acide cinnamique •.•.•••.•...••.••..•.••2.- Flavonosides· .3.- Conclusions .
Evolution qualitative des composés phénoliques dansles feuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c.,infectés à 20 Oc par le virus de la mosaïque dutabac .
35
353942
42
}.-
2.-
3.-
Identification des aglycones présents dansles hydrolysats d'extraits initiaux de feuil-les de Nicotiana xanthi n.c.virosées à 20 Oc ......•.Etude des combinaisons (hétérosides et esters)apparaissant dans les feuilles nécrosées deNicotiana xanthi n.c., infectés à 20 Oc parle virus de la mosaïque du tabac •.•.••••••.•••••••••
a - Dérivés de l'acide cinnamique •••••.••••.••..••.•b - Dérivés de l'acide benzoïque •••••••.•.•.•.•..••.c Substances non encore identifiées apparais-
sant sur les chromatogrammes réalisés à par-tir d'extraits de feuilles nécrosées •.••••.•••••
Conclusions
45
48
4959
60
61
C - Etude des polyphénols dans des Nicotiana xanthi n.c.virosés à 30 Oc par le virus de la mosaïque du tabac •••...
D - Evolution qualitative des composés phénoliques dansles feuilles inoculées de Nicotiana xanthi n.c.soumis à des transferts thermiques •••••..•••••.•••••••••.
1.- Transfert thermique de 20 à 30 Oc ........•.•........2.- Transfert thermique de 30 à 20 Oc ............••...•.
E - Etude des composés phénoliques dans des feuillesvirosées de Nicotiana tabacum variété Samsun •.••...•••.•..
II. Discussion, interprétation des résultats
- 5 -
61
62
6262
62
63
Cha pit r e 4
EVOLUTION QUANTITATIVE EN FONCTION DU TEMPS DES CO}ŒOSESPHENOLIQUES DANS DES Nicotiana xanthi N.C., INFECTES A20 ET 30 Oc PAR LE VIRUS DE LA MOSAIQUE DU TABAC .•..•••.•..•..•.•• 69
1. Résultats expérimentaux 69
A -
B -
Evolution des teneurs en phénols totaux et enprincipaux phénols au cours de l'infectionvirale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c ...•..•••.....••••••
1.- Ph_énols totaux .2. - Principaux phénols .
a - Acides chlorogéniques .•....••••••..••.•••.••....b - Rutine, nicotiflorine .c - Acides p-coumaryl et férulylquiniques .••••••.•••d - Férulylglucose, scopoline ....•.•••••....••.•••.•
3.- Conclusions
Evolution des teneurs en phénols totaux et en principaux phénols au cours de l'infection virale à30 0 C du Nicotiana xanthi n. c. . .
1.- Phénols totaux .••••.•.......•...............•.•..•••2.- Principaux phénols .3.- Conclusions .
70
7070
70707071
86
86
868695
C - Evolution quantitative des composés phénoliquesdans des tabacs virosés de la variété Xanthi n.c.soumis à des transferts thermiques •••••.••••••.•.•.••••••
1.- Transfert thermique de 20 à 30 Oc2.- Transfert thermique de 30 à 20 Oc
il. Discussion, interprétation des résultats
95
95
110
120
Rés u m é Con c lus 1 0 n s G é n é r ale s 122
..
Réf é r e n ces b 1 b 1 i 0 g r a p h 1 que s 127
Introduction
Le Nicotiana tabacum xanthi n.c. inoculé avec le virus de la mosaique du Tabac souche commune, réagit à partir de 13-14 Oc par des lésions locales nécrotiques (9]). Rapidement après l'inoculation, les cellules danslesquelles sont produits les nouveaux virions sont détruites, la multiplication s'arrête et l'infection reste localisée. C'est le phénomène de l'hypersensibilité. Entre 29 et 30 Oc le virus envahit l'ensemble de la plante saufle méristème apical, et la nécrose de la feuille inoculée est remplacée parun simple jaunissement. Dans ce cas, le déroulement de l'infection virale estle même chez un hôte sensible, le Nicotiana tabacum variété sanmun par exempleque chez un hôte hypersensible. Il y a généralisation du virus dans la plante.Les propriétés biologiques des particules virales synthétisées à 30 Oc chez unhôte hypersensible ne se différencient pas de celles produites à 20 Oc chez unhôte sensible comme le Nicotiana samsun.
Les travaux entrepris dans le laboratoire (92), montrent que l'arrêtde la multiplication virale chez un hôte hypersensible, n'est pas dû comme leprétendait une théorie devenue classique à la formation d'une barrière de cellules mortes isolant l'ARN infectieux dans une zone restreinte de l'hôte, maisà un autre processus. Il existe dans les cellules vivantes situées autour de lanécrose d'hypersensibilité des éléments dotés de pouvoir infectieux mais incapables dans certaines conditions (20 OC) d'imposer leur information génétiqueaux cellules qui les hébergent. Une simple élévation de température (30 Oc -35 OC) permet au virus de diriger sa propre replication et donc de provoquerla synthèse de ses protéines (replicases, protéine du manteau) en utilisant" lessystèmes métaboliques de l'hôte (nucléotides, acides aminés, ATP formé par lemétabolisme intermédiaire). Il devient alors capable d'envahir les tissus del'hôte (infection systémique) comme il le fait chez un individu sensible quelleque soit la température.
Le matériel génétique du virus de la mosaique du Tabac est de l'ARN.Il est présent à l'état de polynucléotides à simple chaîne (monocaténaire). Ildoit exister des mécanismes permettant à l'ARN infectieux monocaténaire de seperpétuer. Si l'on affecte une polarité (+) à l'ARN infectieux d'un virus, lacellule infectée doit pouvoir reproduire des molécules douées de même signe dansla descendance. La replication ne pouvant évoluer que selon une polarit~ antiparallèle vis-à-vis de la chaîne d'ARN parentale, on peut donc concevoir que lebrin (+) ne puisse être repliqué directement. Dans un premier temps on a reconstitution d'un intermédiaire à double chaîne (ARN - ARN) dite forme replicative
- 7 -
(7,97). Il Y a synthèse d'un brin (-) au contact d'un brin (+) de la manièresuivante
ARN (+) ---> ARN (+-).
Dans un second temps, on synthétise des brins de polarité (+) en repliquant des brins de polarité (-)
ARN (+-) ~ ARN (+) (144).
L'enzyme catalysant la formation du brin (+) à partir de la forme replicative est l'ARN replicase (8,65 , 145). Il peut également exister un secondenzyme qui catalyse la production du brin (-) à partir de la forme (+) (143).
L'ARN viral (+) joue le rôle d'ARN messager, donc de matrice, et doitcontenir l'information génétique des replicases et de la protéine du manteau.
Les examens faits au microscope électronique (93) sur des cellulesvivantes avoisinant les lésions nécrotiques à 20 oC, ne permettent pas de mettreen évidence des particules virales complètes. Par contre, il est observé trèsfréquennnent un matériel de structure irrégulière. Lors du retour à 30 oC, ce matériel a tendance à disparaître, et on observe de nombreux bâtonnets (V.M.T.)ainsi que des structures qui seraient des formes incomplètes de virus.
Il peut exister dans les cellules infectées à 20 Oc un mécanisme bloquant l'une ou l'autre des différentes étapes conduisant au virion complet. Laperturbation pourrait se situer au niveau de l'ARN replicase. La mise hors-circuit de l'enzyme proviendrait soit de la répression de sa synthèse, .soit del'inhibition de son activité. Ce processus pourrait être réalisé grâce à un métabolite produit par le N.xanthi n.c. virosé à 20 oC. Cette substance pourraitêtre thermolabile, ou sans être sensible à la température l'enzyme nécessaireà sa synthèse serait inhibé ou détruit aux températures supérieures à 29 oC.
Les composés phénoliques étant selon certains auteurs (40) impliquésdans les processus biochimiques conduisant à l'expression du phénomène d'hypersensibilité au virus, il nous a paru intéressant d'étudier les variations subies par ces substances au cours de l'hypersensibilité et de voir s'il existeun lien entre métabolisme des phénols hypersensibilité et température.
Un rappel de nos principales connaissances concernant les phénolsidentifiés jusqu'à ce jour dans le tabac, et l'accumulation de tels composéscomme une réponse non spécifique à différents types d'agressions, précèdera ladescription du matériel et des techniques, utilisés au cours de ces recherches.
Les bases théoriques et techniques-étant établies, nous ahorderonsl'étude des composés phénoliques dans les Tabacs sains de la variété xanthin.c., puis les variations subies par ces substances au cours de la réactiond'hypersensibilité et lors de la généralisation du virus dans la feuille inoculée. Ce chapitre comportera également une analyse de l'évolution CLualitative desphénols dans des Tabacs virosés de la variété samsun.
La dernière partie du travail sera consacrée à une étude des phénols~
effectuée en fonction du temps, dans les N.xanthi n.c. infectés à 20 et 30 Ocpar le virus de la mosaïque du Tabac. Elle permettra ainsi de résoudre le problème du rôle des composés phénoliques dans la formation des lésions localesnécrotiques~ et donc de la réaction d'hypersensibilité.
- 8 -
Chapitre Pre mie r
HISTORIQUE
Dans une première partie, nous avons cherché à faire une mise aupoint aussi précise que possible de nos connaissances actuelles sur les substances phéno1iques. Il nous a semblé intéressant de donner une classificationde ces composés, et de dresser un inventaire de ceux qui jusqu'à présent ontété identifiés dans le tabac. La plupart de ces études ont été effectuées surdes tabacs cultivés à l'étranger et particulièrement sur des tabacs f1ue-cured.
l - GENERALITES •
Les composés phéno1iques sont caractérisés par la présence dans leurmolécule d'un ou de plusieurs noyaux benzéniques simples ou accolés. Parmi cessubstances on rencontre des composés simples mais aussi des polymères de massemoléculaire élevée comme les tanins condensés et la lignine. Ces substances renferment rarement un seul groupement fonctionnel, ce qui justifie le terme deI po1yphéno1s" ou de substances "po1yphéno1iques". La fonction phénol est souventassociée à d'autres groupements fonctionnels comme le groupement carboxyle(-COOR). Les phénols sont dans leur grande majorité engagés dans des combinaisons esters ou hétérosides. La plupart des hétérosides sont des O-hétérosides,la liaison se faisant entre le groupement hydroxyle du noyau (ou ag1ycone) et lafraction réductrice de l'ose. Les esters résultent de la combinaison du groupement carboxyle d'un acide-phénol avec un hydroxyle alcoolique.
- 9 -
II - CLASSIFICATION DES CCMPOSES PHENOLIQUES.INVENTAIRE- DE CEUX IDENTIFIES DANS LE TABAC.
Ces diverses substances peuvent être réparties en trois grands groupes. Cette classification rend compte des théories actuellement admises sur labiosynthèse de ces composés. Elle s'établit de la manière suivante:
A - les composés en Cp C6 - Cl' C6 - Cz ou dérivés de l'acide benzoique (1)
B - les composés en C - C3 ou dérivés de l'acide cinnamique (II, III)6
C - les composés en C - C - C6 ou f1avonoïdes (IV) .6 3
~o
ml
A - Cam pas é s 8 n
d 8 l' a cid 8
C6 • C6 - Cl' C6 - C2 a u d é r i v é s
b 8 n z a i q U 8 (tableau 1).
-la -
TAe,LEAU l
FORMULt~ OE,'i PRINC\PAUX PHENOl!» eN c 6 ,C6-C1 ~T CE, _ C2,InENTlFIE.S
DANS LE T~BAC SEt
aCHs
OH OH OCH~
gcaïac.al m _cré sol l,l,3.trimé tho x)' benzene
CHO
OH
CHO CO-CHa
p_ani sai déhyde D_hydroxyacétophénone
HO C\-\:l,- CH== Cl-\~ HO CH:=: CH-CH 3
eugé nol isoeugénol
HO
R
COOHR : R':: H- ë.lc'uje p. hydroxybenzoïqueR =0H1 R' = H - acide pro tocatéchiqLle
R ::: OCH) 1 R' =H- aride van·l\tiqu~
R =R' = 0 CH 3 ,=-acid{2 syringiquC2.
CH~-COOH HO CH~-COOl-
ac.ide
p.nydroxyphénylat:~ tiqueëlc.ide.
m. hydrollyphpnylatét ique
CH~-COOH
OH
ëlci de
o. hydro xyphpn ylaœkiquE'
Les études faites par YANG et WENDER en 1962 (151) sur le tabac et lafumée de cigarette ont permis de mettre en évidence les acides méta- et parahydroxybenzoique, protocatéchique, vanillique, et ortho-, méta-, et para-hydroxyphénylacétique.
Il est probable que de telles substances proviennent de la transformation par pyrolyse ou par voie chimique des polyphénols présents dans le tabacvert.
c i n n a mi que.
B - Cam pas é sen
del'a cid e
o u d é r i v é s
. Ce groupe englobe les acides cinnamiques et les coumarines. Dans' cesdernières substances, la chaîne en C3 est sous forme d'hétérocycle oxygéné. Onpeut considérer que les différentes coumarines dérivent des acides cinnamiquesortho-hydroxylés.
Les acides cinnamiques possèdant une double liaison, peuvent existersous deux formes isomères, acide cis-cinnamique et l'acide trans-cinnamique.Comme le montrent les formules suivantes, seules les formes cis sont susceptibles de se cycliser pour donner les coumarines.
.iiu:'lde c.is _ dnnamique acide trans_ cinnamiquQ
1.- Les acides cinnamiques (tableau II).
Certains acides hydroxycinnamiquesont été identifiés à l'état libredans le tabac sec, et dans le tabac flue-cured. En 1962, YANG et WE1~ER (151)ont identifié dans le tabac et la fumée de cigarette les acides para-coumarique,férulique, caféique, sinapique, l'acide méiilotique (acide ortho-hydroxyphénylpropionique) et l'acide phlorétique (acide para-hydroxyphénylpropionique). Certains de ces acides ont été observés dans les feuilles de tabac vert: l'acidemélilotique par GEISSMAN et HINREINER en 1952 (53), l'acide caféique parWILKINSON et coll. en 1954 (146), SHIROYA et coll. en 1955 (128) et REID en 1956(I 10) •
-- 12 -
TABLEAU 1[
fORMULES DE5 PRiNCIPAUX DERIVE'i DE l'A(IDE (INNAt'\IQUE
HO C H:=CH-COOH R'
R
R,: R': H j acide? p _c.oumariqu~R= OH. R' = H ; êiH:"lde caféique.R::. 0 [H5r R';::. H; ac.idE? férulique.R ::: R':: OCH 3 ,; aCIde s",napique
R~ OH" R' =H; aCIde mÉ'1 ilotique
R :: H/ R' =OHi a[·ld~ ph\aritiquE
HO
HO
HO
CH==CH-COO3
4
4
H0 '1--:5::---""/
CH=:CH-COO
at:ide chlorogéniquEJou
acide caféyl_ 3 quinique
acide néo thlorogé niqueou
adde caféyl _ 5 qu·mique
Les dérivés hydroxylés de l'acide cinnamique se rencontrent dans la. plante verte sous forme de combinaisons. Ces complexes sont le plus souvent des
depsides constitués par l'union d'un dérivé de l'acide cinnamique avec l'acidequinique. De toutes les combinaisons c'est l'acide chlorogénique (ester de l'acide caféique et de l'acide quinique) qui est quantitativement le plus important.Sa présence dans le tabac semble avoir été observée dès 1884 par SAVERY (122)quî isole un acide "tobacotannique". GORTER en 1909 (54) démontre la présence decet acide dans de nombreux végétaux dont le Nicotiana tahacum 1., cet auteur conclue que ce polyphénol donne naissance par hydrolyse aux acides caféique et quinique. La structure de ce composé a été proposée par FREUDENBERG en 1920 (48),puis établie par FISHER et DANGSCHAT en 1932 (45). Elle correspond à celle del'acide caféyl-3 quinique. Avec le développement des techniques chromatographiques l'acide chlorogénique a été observé dans le tabac par un grand nombre d'auteurs comme ROBERTS et HOOD en 1951 (113), REID en 1956 (110), MARTIN en .. 1958(90) et JACOBSON en 1961 (75).
En 1951 ROBERTS et WOOD (113) mettent en évidence par chromatographiesur papier trois substances réagissant positivement avec le réactif de l'acidechlorogénique. L'existence d'isomères possibles de cet acide avait été envisagéepar un certain nombre d'auteurs. Il faut attendre 1953 pour que CORSE (31) isoled'un extrait de pêches un isomère auquel il donne le n0m d'acide néochlorogénique et pour lequel il précise la structure (acide caféyl-5 quinique). En 1958SONDHEIMER (130) sépare par chromatographie sur silice, à partir de grains decafé, une substance qu'il nomme ''bande 510". Sa structure fut élucidée parSCARPATI et ESPOSITO en 1963 (126), elle est celle de l'acide caféyl-4 quinique.Il est admis à l'heure actuelle qu'il n'existe que trois isomères possibles del'acide chlorogénique : l'acide caféyl-3 quinique ou chlorogénique, l'acide caféyl-4 quinique ou'~ande 510", et l'acide caféyl-5 quinique ounéochlorogénique.
D'autres combinaisons de l'acide caféique avec l'acide quinique ont étéidentifiées ainsi l'acide isochlorogénique. Ce composé serait un mélange de plusieurs composés comme les acides dicaféyl-4, 5 quinique, dicaféyl-3, 4 quiniqueet dicaféyl-3, 5 quinique [CORSE et coll. en 1965 (32~. L'acide dicaféyl-l, 4quinique ou cynarine a été également observé dans l'artichaut par PANIZZI etSCARPATI en 1954 (105). Ces substances n'ont pas été observées dans le tabac.
Il est possible d'envisager par analogie avec l'acide chlorogénique etses isomères l'existence possible de dérivés similaires formés à partir des autres acides hydroxycinnamiques comme les acides para-coumarique et férulique.De tels depsides ont été décrits, en particulier les acides férulylquiniques.Ceux-ci ont été mis en évidence dans les grains verts de café par PICTET etBRANDERBENGER en 1960 (108) et LENTNER et DEATHERAGE en 1959 (86). CORSE et coll.(33) ont en 1962 déterminé la structure du depside le plus important c'est-à-·.dire de l'acide férulyl-3 quinique. L'acide para-cournarylquinique a été trouvédans le thé, les pommes et les poires par CARTHRIGHT et coll. en 1955 (27).HILLIAMS en 1958(148) a montré qu'il existait deux isomères de cet acide dansles pommes vertes à cidre de la variété "Yarlington Hill". HASLAM et coll. en1961 (67) ont donné au depside le plus abondant la structure de l'acide paracoumaryl-3 quinique.
D'autres combinaisons de ces acides ont été identifiées en particulierles esters du glucose (para-coumaryl-l glucose, férulyl-l glucose, caféyl-l glucose) par HARBORNE et COR~~R en 1961 (63) dans les feuilles de Raphanus sativus,
- 14 -
les pétales de Petuniq hybrida etd~ntirrhinummajus.
Dans le cadre du tabac REID en 1956 (110) puis JEAN et REID en 1959(76) identifient dans les extraits de feuilles de tabacs flue-cured les acideschlorogénique, néochlorogénique, mais ils observent également la présence dedeux autres depsides qui pourraient être les acides para-coumarylquiniques.WEAVING en 1958 (142) détecte ces mêmes composés dans un extrait de tabac fluecured. RUNECKLES en 1963 (117) a observé l'acide néochlorogénique et l'acidepara-coumarylquinique dans des disques foliaires de tabac, et grâce aux étudesfaites à l'aide de marqueurs il a montré que les feuilles de ces plantes sontcapables de synthétiser les acides férulyl et para-coumarylquiniques à partirdes acides cinnamiques correspondants. RUNECKLES et WOOLRICH en 1963 (118) ontmontré que si l'on fournissait à ces feuilles de tabac les acides férulique etpara-coumarique il y avait formation des esters du glucose et des glucosides.En 1965 ZANE et coll. (154) identifient dans le tabac de cigarette les acidescaféyl-3, caféyl-4, caféyl-5 quiniques, les acides férulyl et para-coumarylquiniques, le férulylglucose et le caféylglucose.
2.- Les coumarines (tableau III).
Certains auteurs ont identifié la scopolétine à l'état libre dans laplanta verte. MIZUKAMI en 1951 (96) a extrait cette coumarine à partir de raci-
TABLE.AU TIr
FOR~ULES DES PR\N[ IPAUX DERIVES DE lA [OUMAR1~E (AC,LYCON E~)
R:'
HO
R: H_ umbeltiférone
R:: OH _ Qsc:ulél:ine
R ': OCH 3 _ sc:opolétine
R:: 0 (H 31 R'= OH _ fraxétineR =H, R' =OH -- daphnétine
..
- 15 "'"
nes et AKAIKE en 1955 (1) à partir d'un extrait de feuilles. YANG et coll.l'ont identifiée en 1958 (150) dans les tabacs turcs air-cured et flue-cured.DIETERMAN et col. en 1959 (37) ont mis en évidence dans des tabacs semblablesla présence d'esculétine.
Le tabac vert contient des hétérosides dont le plus important est lascopoline (glucoside-7 scopolétine), sa présence dans le tabac a été établie parREID en 1956 (110). SARGENT et SKOOG en 1961 (121) ont mis en évidence dans descals et des racines de tabac la présence d'autres dérivés de la scopolétine comme le gentiobioside-7, le primeveroside-7. La cichoriine ou glucoside-7 esculétine a été identifiée par RUNECKLES en 1962 (115) dans le Nicotiana tabacum L.Ce glucoside semble être la seule forme de combinaison de l'esculétine dans legenre Nicotiana •.
c - Cam pas é s e n a u fla von a ide s
(tableauxIV et V).
Les substances appartenant à ce groupe sont caractérisées par unestructure commune en C6- C3- C6 dans laquelle deux cycles benzéniques sont reliés par un élément en C3 différent selon la nature des flavonoïdes. Elles peuvent se répartir en trois familles
1. Les flavones, flavonols et composés voisins,- flavones,
flavonols,isoflavones,flavanones,flavanonols,flavanes.
2. Les chalcones, dihydrochalcones et aurones.
3. Les anthocyanes.
Les composés présents dans le tabac appartiennent à la première et àla dernière famille et sont essentiellement des flavonols et des anthocyanes.Les principales combinaisons sont les hétérosides de la quercétine et du kaempférol. Le principal hétéroside de la quercétine est la rutine (rhamno-glucoside3 quercétîne). C'est le polyphénol quantitativement le plus important dans letabac après les acides chlorogéniques. Le premier à avoir observé la rutine dansle tabac fut certainement CHARAUX en 1924 (28), elle fut ensuite isolée de cetteplante par HASEGAWA en 1931 (66) et NEUBERG et KOBEL en 1936 (99). Ce polyphénola été bien isolé sur des chromatogrammes par ROBERTS et WOOD en 1951 (113),SHIROYA et coll. en 1955 (128) et AKAlKE en 1955 (1).
L'isoquercitrine ou monoglucoside-3 quercétine a été identifiée dansdes tabacs verts par KURILO en 1937 (85). REID en 1956 (110) a également signélé la présence de ce glucoside dans le tabac. Les hétérosides du kaempférol sontmoins abondants bien que WADA en 1952 (140) ait signalé la présence du rhamnoglucoside-3 kaempférol dans les fleurs de Nicotiana sylvestris et que WATANABE
•- 16 -
TABLEAU 1Y
FORMULE5 DES DIffERENTS TYPES DE 5U~5TAN(E~ RPPARTENANT AUX fLAVONOïDES
flavonol
isof\avo ne
/Ilo
flavanone
~C
/'OHH~
flCl\lane
anthOCYëlne
1 \o
flavanonol
chateone.
~ 3'
~C=CH-< B >..~/ 6' 'j'C .
"oaurone
)C~-<B~H",
1\o
dihydrochalcone
et WENDER (141) l'aient détecté dans les appendices floraux du Nicotiana tabacwn.
TABLEAU V
FORMULES DES DEUX AGLYCOWES PRE5rNT5 DANS LE TABAC
A L'ETAT D' HETERD51DE5
HO )/ "OH
C\ \o
OH
R:: H _ kal! mpférolR :: 0 H _ qUE rr:~1:ine
- - 18 -
III - ACC1JMULATION DES SUBSTANCES PH:EmLIQUESCHEZ LES PlANTES EN REP<:NSE A DES BLESSURESCAUSEES AUSSI BIEN PAR DES AGENTS P.A'I'HC.GENESQUE PAR DES FACI'EI.JRS MOCANIQLTES.
Le phénomène d'accumulation des phénols dans les plantes est observédans le cas d'attaque d'agents pathogènes [ANDREAE en 1948 (4), MARTIN en 1958(90), KUC et coll. en 1956 (84D ou de blessures [JOHNSON et SCHALL en 1952(77), LIEBERMAN et coll. en 1959 (87) et AKAZAWA et coll. en 1960 (2B •
Dans le cadre du. tabac, BEST détecte en 1936 (15), puis isole en 1944(16) à partir des racines de tabacs virosés un corps qu'il identifie à la scopolétine, mais il est en fait probable que ce composé soit le glucoside de lascopolétine, c'est-à-dire la scopoline [MARTIN en 1958 (90)1 • Ce dernier montreune accumulation de scopoline, d'acide chloro~énique dans [e Nicotiana samsunvirosé avec le virus de la mosaïque du Tabac lMARTIN en 1958 (90)1. SEQUEIRA etKELMAN en 1962 (127) mettent en évidence ce même processus dans le cas d'un tabac infecté par Pseudomonas solanacearum. HAMPTON et coll. en 1964 (59) observent la formation de deux substances fluorescentes différentes de la scopolineet de l'acide chlorogénique, dans les tissus foliaires d'un Nicotiana tabacuminfecté avec le virus de la mosaïque du Tabac. Ces deux composés apparaissentau moment de la formation des nécroses d'hypersensibilité, et s'accumulent autour des lésions locales. Ces substances sont absentes dans un tabac développantune infection systémique. Elles pourraient être identiques ~ celles qui s'accumulent lors de l'infection d'un Nicotiana tabacum par Collectotrichum destructivum [YU et HAMPTON en 1964 (153)] . Ces composés sont absents dans les tabacssains et il est à noter que ce dernier pathogène induit également des lésionslocales nécrotiques.
Ce phénomène d'accumulation est à rapprocher de celui constaté dansdes tabacs carencés en certains éléments minéraux. LOCHE en 1966 (88) a mis enévidence une accumulation de polyphénols (chlorogéniques, rutine, scopoline)'dans des tabacs carencés en azote et en soufre. Ces carences se traduisent parl'apparition de deux substances particulières possédant des caractères à la foispolyphénolique et aminé. Les essais d'identification lui ont permis de penserque ces corps pourraient être des complexes entre un dérivé et l'acide cionamique (acide caféique, acide trihydroxycinnamique ou esculétine) et un ou plusieursacides aminés.
L'accumulation peut alors apparaître comme une réponse non spécifiqueà différents types d'agressions.
- 19 - ..
Cha pit r e 2
MATERIEL ET TECHNIQUES ANALYTIQUES
I - .MATERIEL VEGErAL.
Nous utilisons soient de jeunes Nicotiana xanthi n.c., soient desNicotiana tabacum samsun cultivés en serre, au stade où il possèdent 3-4 feuilles entièrement développées.
Trois jours avant l'inoculation,les plantes sont placées dans des salles où la température est de 20 ou 30 oC. Dans ces chambres climatisées, la température est constante à! 1 oC, l'humidité relative est de 70 %, et les tabacssont soumis à un éclairement de 8000 lux pendant les 16 heures ~e photopériode.
Le virus de la mosaique du Tabac (préparation purifiée en suspensiondans l'eau) est inoculé mécaniquement sur la face supérieure de feuilles ayantterminé leur croissance. Le nombre de lésions par feuille est approximativementsitué entre 100 et ISO.
II - MEITHODES GENERALES D'ElUDEDES CCMPOSES PHENOLIQUES.
A - G é n é raI i tés .
L'étude des composés phénoliques a bénéficié tout particulièrement dudéveloppement de la chromatographie sur papier. Ces composés se séparent sur pa-
- 20 -
pier dans de bonnes conditions et un nombre limité de solvants est suffisatlt~
Ces corps sont également faciles à mettre en évidence, le plus souvent en faisant appel à leur fluorescence en lumière ultraviolette. Il est enfin possibled'identifier un composé inconnu à partir de microquantités mises en oeuvre surpapier.
Les phénols n'existent pas à l'état libre dans les végétaux, leur présence dans les extraits provient la plupart du temps d'une hydrolyse totale oupartielle, pendant les opérations d'extraction. Ils se rencontrent essentiellement dans la nature sous forme de combinaisons avec les glucides'ho-hétérosides,faisant intervenir des liaisons acétals de type éther-oxyde -C-O-y-. Dans lecas des acides phénols les combinaisons sont le plus souvent des esters avec desliaisons -CO-O-ç-.
Il est toujours préférable de commencer l'étude des composés phénoliques d'un matériel végétal inconnu, par l'identification des aglycones libéréspar hydrolyse acide ou alcaline, ou parfois même enzymatique (le mot aglyconedésigne la fraction non glucidique des hétérosides et la fraction phénoliquedes esters).
l'identification des compo-
simple, puisque à une même substance, ildifférents types de combinaisons. Ellenature de la liaison unissant l'aglycone
Cette opération est la pluscorrespondre dans un tissu donnéégalement nous renseigner sur lafraction non phénolique.
Les problèmes à résoudre pour conduire àphénoliques d'un matériel végétal sont:sés
peutpeutà la
- l'extraction à partir du matériel végétal,l'hydrolyse et la séparation des aglycones,
- la séparation des différents types de combinaisons,- l'identification de ces combinaisons.
B - Pré par a t ion des e x t rai t s
Les feuilles de tabacs à analyser sont pesées, puis broyées à raisonde un gramme de poids frais pour deux volumes de méthanol, en présence de sablede Fontainebleau relavé. Le broyat est centrifugé à froid et le culot lavé plusieurs fois avec du méthanol. Les surnageants sont ensuite réunis.
Le méthanol entraînant les chlorophylles , il est nécessaire de leséliminer par de l'éther de pétrole. Pour cela, l'extrait est concentré sous vide au moyen d'un évaporateur rotatif à 30 oC. Le jus étant rendu aqueux, leschlorophylles sont extraites à l'aide d'éther de pétrole. Les solutions ainsidébarassées des chlorophylles sont mises à sec et reprises avec du méthanol contenant 50 % d'eau (à raison d'un ml de méthanol à 50 % pour un gramme de poidsfrais) •
- 21 -
c - H Y d r 0 l Y s e s d 8 S 8 X t r a i t s i n i t i a u x.
S é p a r a t ion 8 t i d 8 n t i f i c a t ion d e s
a g l Y C 0 n 8 s.
1.- Les différents types d'hydroZyses.
a. Hydrolyse acide: L'hydrolyse acide est effectuée pour rompre les liaisons-ç-O-ç- qui interviennent dans les O-hétérosides. Elle est réaliséeen milieu H Cl N, sous réfrigérant à reflux, au bain-marie bouillantpendant un temps qui peut varier de 30 minutes à une heure.
L'hydrolyse acide peut être également utilisée pour rompre les liai-sons esters, mais plusieurs transformations dont il faut tenir compte peuvent seproduire. Ainsi un certain nombre d'acides cinnamiques tout particulièrementl'acide para-coumarique tendent à se décomposer dans de telles conditions. Laformation d'escùlétine à partir de l'acide caféique est accélérée, comme cellede la coumarine à partir de l'acide ortho-cournarique. Ce type d'hydrolyse entraîne également une importante lactonisation de l'acide quinique. Il est souvent préférable de scinder les divers esters cinnamiques par une hydrolyse alcaline.
b. Hydrolyse alcaline: L'hydrolyse alcaline des esters des acides phénolsest faite en milieu Na OH N, à la température du laboratoire pendant4 heures, sous atmosphère d'azote. Pour étudier les produits résultant de cette hydrolyse, il est nécessaire de repasser en milieu acide. Cette opération est réalisée à l'aide d'une solution d'acidechlorhydrique concentré dans un bac d'eau glacée afin d'éviter unehydrolyse acide.
c. Hydrolyse enzymatique: L'hydrolyse enzymatique est réalis~e à l'aide d'unepréparation commerciale de S-glucosidase. Cet enzyme hydrolyse spécifiquement les liaisons Bentre une molécule de glucose et un aglycone. Le traitement est effectué dans un tampon acétate de sodium(pH = 4,5) à température ambiante pendant un temps qui peut varier dequelques minutes à plusieurs heures. L'hydrolyse est arrêtée par addition de quelques gouttes d'alcool éthylique, puis par chauffage aubain-marie bouillant durant une minute. La solution est alors filtrée,mise à sec à 45 Oc et reprise par de l'éthanol à 50 %.
d. Extraction et purification des aglycones : Les aglycones sont extraits deshydrolysats acides et alcalins à l'aide de solvants non misciblescomme l'acétate d'éthyle ou l'éther éthylique. Nous avons préféréutiliser l'éther éthylique, car ce solvant n'entraîne pas les nombreux produits d'oxydation des phénols. La couche éthérée est alorsmise à sec puis reprise par de l'alcool éthylique. Si l'on veut séparer uniquement les acides-phénols, on doit purifier l'extrait éthéré par une solution aqueuse de bicarbonate de sodi.um à 5 p _ 100. Lesacides se transforment en sels solubles dans l'eau, les autres phénols
- 22 -
"
restent dans la couche éthérée. La couche bicarbonatée est ensuiteacidifiée et les acides-phénols sont à nouveau extraits par de l'é~
ther éthylique. Cette purification n'est pas toujours totale, car sila solution de bicarbonate est trop alcaline, les phénols ayant uncaractère acide faible passent partiellement en milieu aqueux, inversement si la couche bicarbonatée n'est pas suffisamment alcaline lesphénols restent en partie dans là couche éthérée initiale obtenueaprès hydrolyse.
2.- Séparation des agLycones.
La séparation des aglycones se fait par chromatographie sur papierWhatman nO 1 en descendant. Les solvants employés diffèrent. selon le groupe del'aglycone.
a. Acides-phénols, coumarines: Les acides benzoïques cinnamiques et les coumarines sont séparés dans les mêmes conditions.
Un certain nombre de solvants sont utilisés, en particulier le toluène acétique. Ce solvant proposé par BATE-SMITH (12) est constitué
par la phase organique du mélange toluène 4, acide acétique l, eau 5. Avant lachromatographie, le papier doit être équilibré 24 heures avec la phase aqueusedu mélange. Le temps de développement est de 4 heures. Les acides para-coumarique, férulique, sinapique, vanillique, syringique, salicylique et les coumarinescomme l'umbelliférone et la scopolétine migrent dans ces conditions.'
Les séparations sont faites également par chromatographie à deux dimensions en utilisant pour la première direction le butanol acétique (couche supérieure du mélange butanol 4, acide acétique l, eau 5) ou le butanol éthanol (buthanol 4, éthanol l, eau 2). Dans la deuxième dimension on utilise de l'acideacétique à 2 ou à 10 %.
Le butanol acétique a été proposé par PARTRIDGE (107) pour la séparation des sucres, puis appliqué pour la séparation des flavonoïdes par BATE-SMITH(10). Ce solvant doit être renouvelé très souvent car le vieillissement entraîne une estérification et par voie de conséquence une modification des Rf' Dansla seconde direction on emploie un solvant légèrement acide pour éviter des traînées de spots et ainsi permettre de meilleures séparations. La concentration enacide peut varier de 2 à 15 %, les Rf sont d'autant plus élevés que la concentration est plus forte. Dans les solvants aqueux les isomères cis et trans desacides cinnamiques sont séparés (147).
La méthode qui permet une meilleure résolution des différents acidesphénols (benzoïques et cinnamiques) et des coumarines apparaît être celle adoptée par IBRAHIM et TOWERS (74). Elle consiste à effectuer une chromatographie àdeux dimensions, en utilisant pour la première direction la couche supérieuredu mélange benzène 6, acide acétique 7, eau 3. Le papier ne doit pas être équilibré avec la phase aqueuse de ce mélange, cette opération provoquant des traînées de spots. Dans la deuxième direction, on utilise le mélange suivant: formiate de sodium 10, acide formique l, eau 200. Le front de ce solvant est assezirrégulier, mais ceci ne perturbe pas les séparations. Les isomères cis et transsont séparés dans ce solvant aqueux. Il est prudent de ne pas chauffet un telchromatogramme.
- 23 -
b. Flavonols: Le butanolacétique est également employé pour la séparation deces aglycones, mais le solvant le plus spécifique est le Forestal.Ce solvant·proposé initialement par BATE-SMITH (11) pour la séparation des anthocyanidines, est préparé en mélangeant de l'acide acétique 30, de l'eau 10, et de l'acide chlorhydrique concentré 3.
3.- Identification des agZycones.
a. Généralités: L'identification des aglycones (acides .phénols, coumarines,flavonols) se fait par comparaison des Rf et des réactions coloréesavec des produits de référence. La plupart de ces marqueurs sont disponibles commercialement, à l'exception toutefois de l'acide mélilo-tique. Cet acide a été isolé et purifié d'hydrolysats acides et enzymatiques d'extraits de feuilles de deux Légumineuses [Dipteryx odorata~ GZiricidia sepium (55)]. Ces plantes nous sont parvenues deTrinidad (Antilles Anglaises) grâce au Docteur GRIFFITHS. La détection sur les chromatogrammes se fait par examen de leur fluorescence
oen lumière de Wood (3660 A). Le caractère acide que possèdent un grandnombre de phénols est largement utilisé. Ces substances présententune modification de structure et donc de fluorescence et de coloration en ultraviolet quand on passe en milieu alcalin. Le procédé dedétection le plus simple consiste à exposer le chromatogrfu~e aux vapeurs d'une solution concentrée d'ammoniaque et à l'examiner sous lalumière ultraviolette. On peut également pulvériser une solution à10 % de Na Z C0 3 •
b. Acides-phénols, coumarines : Leur mise en évidence peut se faire en utilisantdiverses réactions comme celle de copulation avec des sels de diazonium (para-nitraniline diazotée, acide sulfanilique diazotée-benzidine diazotée). Les différents acides-phénols donnent des colorationscaractéristiques qui varient en fonction du pH.
La para-nitraniline nous a donné les meilleurs résultats. Ce réactifest préparé selon le mode opératoire donné par SWAIN (133). On mélange au momentde l'emploi, 5 ml de para-nitraniline à 0,5 % dans l'acide chlorhydrique 2 N,0,5 ml de nitrite de sodium à 5 %, et, 15 ml.d'acétate de sodium à 20 %. Chaqueacide donne, après pulvérisation de ce réactif, différentes colorations. La pulvérisation d'une solution aqueuse à 20 % de carbonate de sodil@ modifie ces colorations.
Plusieurs précautions doivent être prises ; il ne faut pas exposer lechromatogramme aux vapeurs d'ammoniaque avant sa pulvérisation, et la premièrepulvérisation doit être légère.
D'autres réactions sont également utilisées comme celle d'HOEPFNER(72). Cette réaction de nitrosation a surtout été décrite pour la caractérisation de l'acide caféique et des acides-phénols et coumarines possédant deux hydroxyles adjacents. Elle peut également être employée avec succès pour la révélation d'un grand nombre d'autres composés comme les acides para-coumarique,férulique, sinapique, vanillique et la scopolétine. Le chromatogramme est d'abord pulvérisé avec du nitrite de sodium à 1 % dans l'acide acétique à 10 %. Lescolorations sont ensuite modifiées par pulvérisation de soude normale.
- 24 -
La coumarine est facilement détectée sur un chromatogramme après pulvérisation d'une solution aqueuse à 5 % de soude. Le chromatogramme est exposéquelques minutes aux radiations ultraviolettes. La coumarine apparaît alors sousforme d'une tache jaune fluorescente.
c. Flavonols: Les substances réagissent avec le chlorure d'Àluminium par formation d'un complexe jaune en lumière visible, et prenant une fluorescence jaune sous la lumière de Wood.
o - S é par a t ion des cam b i n ais 0 n s
(h été ras ide s e t est ers).
1.- Chromatographie sur papier.
a. Solvants: Le couple de solvants de base utilisé pour séparer les nombreuxcomposés phénoliques présents dans l'extrait initial non hydrolyséest le butanol acétique et l'acide acétique dilué. Ces solvants serévèlent satisfaisants pour séparer les flavonosides, mais ne donnentpas de résultats suffisants pour les différentes combinaisons d'unmême acide cinnamique (dérivés du glucose, esters de l'acide quinique). Il a donc été nécessaire de trouver un ou plusieurs solvantscapables de bien les séparer. Les solvants utilisés, en particulierle butanol éthanol (butanol 4, éthanol 1, eau 2) et le butanol ammoniaque (phase organique du mélange: butanol J, ammoniaque 2 N J),sont ceux proposés par HARBORNE et CORNER (63). Les dérivés des acides cinnamiques et du glucose ont des Rf plus élevés que ceux des esters de l'acide quinique dans le butanol éthanol et dans le butanolammoniaque tandis que, c'est l'inverse dans le butanol acétique. Cessolvants sont employés pour la première direction, l'acide acétiquedilué étant utilisé dans le second d~veloppement. Ces différents composés possèdant une double liaison peuvent exister sous deux formesisomères cis et trans qui se transforment facilement l'une dans l'autre et sont séparées par chromatographie sur papier dans un solvantaqueux.
Les nombreuses combinaisons d'un même acide cinnamique sont égalementbien séparées par chromatographie bidimensionnelle utilisant en première direction le mélange butanol 14, pyridine 3, eau J et le système méthyle isobutylecétone J4, acide formique 3, eau 2 pour la deuxième dimension. Le butanol pyridine donne le même type de séparation que le butanol éthanol ou le butanol mmnoniaque. Le butanol pyridine et la méthyle isobutyle cétone donnent des valeursde Rf irrégulières en fonction des conditions, en particulier ces valeurs ne sontpas les mêmes en chromatographie descendante et en chromatographie ascendante.
L'emploi de ces différents solvants permet une bonne résolution desnombreuses combinaisons des acides cinnamiques.
- 25 -
b. Révélation des chromatogrammes: La détection des nombreuses combinaisonsse fait à l'aide de leur fluorescence sans réactif, puis après exposition aux vapeurs d'ammoniaque ou après pulvérisation d'une solution aqueuse à 10 % de Na2 C0 3 • Dans les conditions alcalines les esters de l'acide caféique prennent une fluorescence jaune, ceux du férulique apparaissent verts, tandis que les esters de l'acide p-coumarique fluorescent en violet. Les flavonosides possèdant un ou plusieurs résidus glucidiques fixés en position 3 de l'hétérocycle central sont bruns en ultraviolet. Les dérivés de la quercétine deviennent jaunes après exposition aux vapeurs d'ammoniaque, tandis queceux du kaempférol apparaissent verts.
E - 1 den tif i c a t ion d e ces C 0 m b i n ais 0 n 5.
Pour identifier ces combinaisons (hétérosides et esters) il est nécessaire de comparer leurs Rf dans les différents solvants et leurs fluorescences avec ceux des produits de référence. Après avoir été isolées et purifiéespar chromatographie sur papier, les substances sont identifiées par la considération de leur spectre d'absorption, et par l'étude des produits résultant deleur hydrolyse.
1.- Comparaison des Rf avec ceux des produits de référence.
Il est difficile de comparer un Rf expérimental aux valeurs signaléesdans la littérature étant donné la difficulté d'obtenir des Rf reproductibles.Il devient indispensable d'opérer sur chaque chromatogramme par comparaison avecdes produits de référence. Comme la majorité de ceux-ci ne sont pas disponiblescommercialement (exceptions faites pour les acides chlorogénique,
isochlorogénique, la rutine) il est nécessaire de les isoler de plantes oùils ont été signalés.
Le para-coumaryl-I glucose est isolé d'~n extrait de pétales d'Antirrhinum majus (63), le férulyl-I glucose et le caféyl-I glucose sont obtenus depétales de Petunia hybrida (63), tandis que l'acide para-coumaryl-3 quinique estextrait de pommes vertes à cidre (148). C'est à partir de grains verts de caféde la variété robusta (33) (86) (130) que les acides férulyl-3, et caféyl-5 quiniques sont isolés et purifiés.
Si l'on ne dispose pas de marqueurs, la considération des valeurs relatives de Rf par rapport à celles des corps voisins, peut présenter un intérêtindéniable, car il existe une relation entre les valeurs des Rf et la structurechimique des composés. Ce problème a été discuté par BATE-SMITH et WESTALL (14)et par BATE-SMITR (13). En considérant la fonction
1RH ::: log (Rf - 1)
ces auteurs constatent une relation linéaire de ~ en fonction du nombre de OHet de résidus glucidiques pour un même groupe de substances.
ROBERTS et coll. (119), HARBORNE (60) en étudiant la migration d'un
- 26 -
certain nombre de flavonoïdes dans un solvant alcoolique (butanol acétique) etdans un solvant aqueux, ont pu dégager un certain nombre de conclusions qui peuvent jouer un grand rôle dans l'identification de ces composés. Ces déductionspeuvent être étendues à toutes les substances phénoliques. Elles sont les suivantes :
1. Une augmentation du nombre de OH phénolique diminue le Rf aussi biendans un solvant alcoolique (butanol acétique) que dans un solvant aqueux.
2. La méthylation des hydroxyles augmente le Rf dans les deux types desolvants. Un composé possèdant un groupe ortho-dihydroxylé à un Rf plus basdans un solvant alcoolique d'une substance ayant deux hydroxyles non adjacents.
3. La glucosidification augmente le Rf dans un solvant aqueux, mais lediminue dans un solvant alcoolique.
D'autre part, la considération des Rf des dérivés de l'acide cinnamique dans des solvants comme le butanol éthanol ammoniaque et le butanol pyridine permet pour un même acide cinnamique de savoir si l'on est en présence d'unester du glucose ou dtun dérivé de l'acide quinique.
Les variations des Rf des diverses combinaisons de l'acide cinnamiqueen fonction de la nature et du nombre de substituants dans un solvant alcoolique et dans un solvant aqueux, sont illustrées par la figure 1.
Ces considérations sont intéressantes, mais pour obtenir une identification rigoureuse, il est nécessaire d'identifier chaque substance, pour cela,il est nécessaire de l'isoler à l'état pur.
2.- Purification des substances phénoliques.
L'isolement à l'état pur d'un composé phénolique est fait par chromatographie sur papier. Dans la majorité des cas, nous déposons la solution à analyser sur toute la longueur d'une feuille Whatman nO 3. si le papier est tropépais et n'assure pas un fractionnement suffisant nous utilisons du papier Whatman nO 2.
Après séparation dans le solvant approprié on découpe les bandes et onles élue le plus souvent avec de l'éthanol contenant 30 % d'eau. Si la bande contient plusieurs pigments nous purifions à nouveau dans un autre solvant. Il estsouvent nécessaire de recommencer l'opération plusieurs fois. Ces différentesopérations conduisent à l'isolement à l'état pur des substances phénoliques. Parallèlement à ces divers fractionnements, il est indispensable de réaliser unechromatographie bidimensionnelle qui permet de situer à chaque instant, l'étatd'avancement de la purification.
Ces produits sont utilisés dans la liqueur d'élution ou dans de l'étha-nol.
3.- Identification des produits isolés.
a. Réalisation des spectres d'absorption L'opération est délicate car le sol-vant extrait du papier certaines impuretés. Pour éliminer l'effet deces impuretés, il est nécessaire de traiter une feuille de papier comme un chromatogramme proprement dit mais sans déposer la solution àanalyser. Après élution, nous avons donc une solution contenant unique-
~ 27 -
LEGENDE
en pointillé : déri\J~s du glu cos~E'n hachuré : dérivé.s de l'acide. quinique
oeg = o. eoumary'_1 glucosl?peg = p. cQumëlryl_1 gluc.os2Feg = Férul~'-1 glucosesig = sinapyl_1 glucosecag = caféyl -1 9'ucos~
pcrul: = p. coumë)r~'_1 rhamnoglucosE'ccg2n = o. coumaryL 1 genl:\obiose
C89'!n =caféyl -1 genl:iob\osl!pc.q:::t adde p. coumaryl _ 3 quiniQuefeq :: acide féruh}\ _3 qu'lniqueI:aq = acide caFéyl_'3·· quinique
sépara~ion des "Isomères ci~. el I:rans. dans le solvantaqueux ( 1 = i S'amère trans ; 2. = isomère cis)
•• '---"-'-~------"._-"---,-.--,-- --,---_•._._'_._._ -.",-- ------.- _.,- ._"'- -,-,-- -_,_.__ ._ - '1
~111
.1
0:1
., 0-1Spct de départ
w'----:~:p
FIG. 1 VAR!f\TlONS DES RF DE5 DI\lER<;ES COMBINA\SON5 DE L'ACIDE. ClNNAtll110LHEM'fONtTIOM DE LA NATURE ET DU NOMBf\ê DE SUf:>5TITUf-lNT5, DI:;N5DANS UN SOLVAN T ALCOOLIQUE (BUTANOL ETHf-\NOl) ET DANS UN.5DLVANT A9UEUX.
ment les impuretés du papier et c'est par rapport à cette solution quenous traçons le spectre de la substance phénolique.
Les spectres sont tracés dans l'éthanol. Il faut toujours définir lanature du solvant utilisé et comparer les spectres des corps à étudier, à ceuxdes produits de référence préparés dans les mêmes conditions.
Le spectre est tracé en milieu neutre et en milieu alcalin. L'additiond'un alcali permet d'obtenir le spectre de l'ion phénolate différent de celui duphénol libre.
L'usage de différents sels minéraux comme le chlorure d'Aluminium (AlC1
3), l'acétate de sodium (Na OAc), l'acide borique (H
3B0 3 ), en produisant des
déplacements dans les spectres permettent de localiser un certain nombre de fonctions, et d'avoir une idée'sur la structure de la substance.
Prenons comme exemple un flavonol dont la structure s'établit de lamanière suivante :
Ce flavonol a 'une structure mésomère s'établissant sous les trois formes suivantes :
( al
0-
Lb)
- 28 -
0'"
( C )
Ces composés absorbent dans deux régions du spectre ultraviolet, d'unepart entre 310 et 380 m~ (Bande 1), d'autre part entre 240 et 275 m~ (Bande II).
La bande l correspond à la structure b (79) elle fait intervenir laconjugaison entre le noyau B et le groupement CO de l'hétérocyc1e central. Labande II correspond à la structure a et fait intervenir la conjugaison avec lenoyau A.
Si le composé possède un OH libre en position 5 ou 3 il est capablede donner avec le groupe CO un complexe en présence d'aluminium utilisé sousforme de Al C1
3• La formation d'un tel complexe entraîne un mouvement bathochro
mique du spectre. Les hydroxyles en 3 et 5 n'interviennent pas de façon identique, avec la position 3 le complexe est plus stable et le déplacement plus important.
Si la substance possède un groupement ortho-dihydroxy1é, elle est capable de former un complexe de ché1ation avec l'acide borique et ainsi d'entraîner un mouvement bathochromique du spectre.
Avec l'acétate de sodium, l'alcalinité du milieu est moins grande etseules les fonctions phénols ayant un caractère acide fort seront ionisées enparticulier le OH en 7. On doit alors observer un mouvement bathochrome de labande II. Si cet hydroxyle est engagé dans une liaison hétérosidique ce mouvementbathochrome n'apparaît pas.
Les spectres des acides cinnamiques et des coumarines ne diffèrent pasprofondément, cependant les acides cinnamiques existant sous forme d'isomèrescis et trans ont sur le pic principal à 310-330 m~ un épaulement (62). Cet épaulement dépend de l'importance relative de ces deux isomères.
Dans tous les cas l'étude des spectres des différentes substances phéno1iques a permis de dégager un certain nombre de conclusions :
1. L'hydroxy1ation de la molécule entraîne un mouvement bathochrome dansla position du maximum absorbant à la plus grande longueur d'onde. Dans le casdes f1avono1s cela entraîne un mouvement hypsochrome de la band~ II.
2. La méthy1ation et la glucosidification ont des effets similaires setraduisant par un mouvement hypsochrome.
Nous devons également constater que l'ionisation du groupement carboxyle d'un acide-phénol (acides benzoïque cinnamique) a un effet hypsochrome surle spectre. Ce fait est très utile pour distinguer les acides-phénols de leursesters (acide féru1ique ~À 1 l' + 18 m~, féru1y1-1 glucose ~À 1 l' + 50 m~).a ca ~ a ca ~
Le chlorure d'Aluminium est utilisé en solution alcoolique à 5 %. L'alcalinité est obtenue par NaOH 2N.
Il est à noter que certains phénols se décomposent rapidement en milieu alcalin. En présence de Al C1 3 ' il est indispensable de garder le pH entre4 et 6 afin d'éviter la cassure du·comp1exe métallique formé.
Comme toujours, on doit préparer dans les mêmes conditions la solutionde référence par rapport à laquelle le spectre est tracé.
- 29 -
b. Identification des produits résultant de l'hydrolyse: On étudie la res~s
tance de ces combinaisons aux hydrolyses acide alcaline et enzymatique. On caractérise ainsi la nature des liaisons intervenant dans chacune d'elles.
On opère dans les mêmes conditions que pour les hydrolyses des extraitsinitiaux mais avec des temps plus courts. L'identification de l'aglycone ne posepas de difficultés, il est extrait par l'éther éthylique éventuellement aprèsréacidification dans le cas d'une hydrolyse alcaline. L'extrait éthéré est misà sec repris par de l'éthanol et chromatographié dans les solvants spécifiquesdes aglycones. L'identification peut être complétée par la réalisation de sonspectre d'absorption en ultraviolet.
Pour identifier la fraction non phénolique intervenant dans la combinaison, il est indispensable d'éliminer l'acidité du milieu dans le cas d'unehydrolyse acide. Nous employons la méthode proposée par HARBORNE et SHERRAT (64).Ce procédé consiste à former le chlorhydrate de la di-n-octylméthylamine et àl'extraire par le chloroforme dans lequel il est soluble. Les sucres et l'acidequinique restent en solution aqueuse. L'amine est utilisée en solution aqueuseà 10 % dans le chloroforme. La couche aqueuse est purifiée deux à trois foisavec la solution chloroformique de l'amine, puis rincée une dernière fois avecle chloroforme. Cette couche aqueuse est trouble et il est nécessaire de la filtrer avant de la mettre à sec sous vide. Le résidu est repris par de l'eau etchromatographié.
Le butanol acétique, le mélange isopropanol 7, butanol l, eau 2, et lesystème isopropanol 6, ammoniaque 3, eau 1 ou celui contenant de l'éthanol del'ammoniaque et de l'eau (20, 1,4), sont utilisés dans la séparation de l'acidequinique.
La révélation de cet acide (26) est obtenue en pulvérisant d'abordune solution saturée de méta-périodate de sodium étendue de 2 volumes d'eau,pu~s après 20 minutes une solution constituée par le mélange suivant :
Nitroprussiate de sodium ....•Pip~razine .......•...........Eau .••.•.•••.•.•.•••.•...•.••Ethano 1 .
50 mg50 mg
2 ml10 ml.
Les taches apparaissent après passage du chromatogramme pendant 10 m~
nutes dans une étuve à 100 oC.
L'acide quinique donne une tache orangée.
Les sucres sont séparés dans le butanol acétique et le mélange acétate d'éthyle 2, pyridine l, eau 2.
La révélation des glucides peut se faire avec différents réactifs comme le phtalate d'aniline (106). Sa composition est· la suivante :
Aniline .Acide phtalique ..••••.•••••..n-butanol .Ether .Eau ..............•........•..
- 30 -
9,1516
490490
20
mlgmlmlml.
Les feuilles sont plongées dans ce mélange et mises à sécher à 110 Ocpendant 5 minutes. La sensibilité de la révélation est augmentée par examen deschromatogrammes en lumière ultraviolette. Pendant les opérations de chromatographie et d'élution, conduisant au produit pur, il peut y avoir entraînement àpartir du papier soit de sucres, soit de substances transformées en sucres parhydrolyse acide. Le nombre, la nature de ces sucres dépendent de la nature dupapier et du solvant. Les solvants contenant un acide minéral semblent conduireà une formation plus importante de sucres. Nous devons donc réaliser simultanément à ces manipulations les mêmes opérations mais à partir de papier blanc etcomparer les résultats obtenus.
Nous avons également utilisé un autre révélateur des sucres afin dedistinguer les pentoses des autres sucres réducteurs. La révélation s'effectueaprès trempage dans le mélange suivant :
1,3 ml d'aniline dans 50 ml d'acétone,Ot6 ml d'acide phosphorique dans 20 ml d'acide acétique et 30 ml d'acétone.
Les deux solutions sont mélangées au moment de l'emploi. Les colorations sont révélées par passage des chromatogrammes dans une étuye chauffée à100 oC.
Les pentoses apparaissent en brun-rouge sur fond jaune, tandis que lesautres sucres réducteurs apparaissent en brun jaune.
III - roSAGE DES CCMPOSES PHENOLlQUES.
A - P r i n c i p e s
Le dosage utilise la grande oxydabilité des substances phénoliques.Le réactif utilisé est un mélange de phosphomolybdate et de tungstate de sodiumqui est réduit lors de l'oxydation des phénols en milieu alcalin en un mélangede bleus de tungstène et de molybdène. La coloration produite (absorption~axi
male comprise entre 725 et 750 m~) est proportionnelle aux taux de composés phénoliques. La composition de ce réactif a été établie par FOLIN et DENIS (47)tpuis modifiée par FOLIN et CIOCALTEU (46). Cette méthode est également appliquéeaux composés séparés et purifiés par chromatographie sur papier. Dans tous lescas on compare à une gamme étalon préparée dans les mêmes conditions que le dosage proprement dit t ce qui nécessite l'utilisation de produits de référence.Pour l'estimation quantitative des phénols totaux t la courbe standard est établie avec de l'acide chlorogénique t ce composé étant quantitativement le plusabondant dans le tabac.
... 31 -
B - Dos age g lob a 1 d 8 S C 0 m p 0 s é s P h é n 0 l i que S
Cette méthode de dosage reposant sur le pouvoir réducteur des phénolsa été proposée et utilisée par un grand nombre d'auteurs comme ROSENBLAT etPELUSO (114), PRO (109), BRAY et THORPE (19), SMIT, JOSLYN et Lill(TON (129),JOHNSON et SCHAAL (78) et SWAIN et HILLIS (134). Certains utilisent le réactifde Folin et Denis, d'autres comme BRAY et THORPE celui de Folin et Ciocalteu.Nous avons préféré utiliser ce dernier car le réactif de Folin et Denis constitué par un mélange de tungstate de sodium et d'acidephosphomolybdi~ueprovo~ue
souvent la formation de précipités. Tl est alors nécessaire de filtrer et unepartie de la coloration se trouve perdue. Les résultats sont alors moins reproductibles.
1.- Les réactifs.
a. Réactif de Folin et Ciocalteu: Un mélange contenant 100 g de tungstatede sodium (Na 2W0 4- 2H20), 25 g de molybdate de sodium (Na 2Mo0 4- 2H 2 0) ,700 ml d'eau, 50 ml d'acide phosphorique à 85 % et 100 ml d'acidechlorhydri~ue concentré, est mis à bouillir sous réfrigérant à refluxpendant la heures. Après ce délai, 150 g de sulfate de li thi,um, 50 mld'eau et ~uelques gouttes de brome sont aj outés •. Le mélange est alorschauffé à 100 oC, de façon à éliminer l'excès de brome. La li~ueur
est mise à refroidir, diluée à un litre, puis filtrée. Elle est conservée au frigidaire dans une bouteille bien fermée.
b. Solution aqueuse de Na2 C0 3 : Elle est faite en dissolvant 20 g de Na2C03dans100 ml d'eau.
2.- Mode opératoire.
Une prise d'essai convenable de la solution à doser étant faite, oncomplète à la ml avec de l'eau. Après addition d'un ml du réactif de FolinCiocalteu, il est ajouté 3 minutes plus tard 2 ml de la solution aqueuse deNa2 C0 3 à 20 %. Après chaque réactif, il est nécessaire de bien agiter les tubesafin d'obtenir une solution homogène. La prise d'échantillon ne doit pas contenir plus de 0,5 ml de méthanol.
Les tubes sont mis au bain-marie b~uillant pendant une minute, puison laisse refroidir. Après avoir dilué à 25 ml avec de l'eau, les densités optiques sont mesurées à 725 m~ une heure après la fin des opérations avec unspectrophotomètre Unicam 500.
Les lectures sont faites par rapport à un blanc ou témoin, ne contenant que de l'eau additionnée des réactifs.
Les résultats sont établis à l'aide d'une courbe étalon obtenue en dissolvant 100 mg d'acide chlorogéni~ue dans un litre d'eau (100 ~g/ml). Cet acideest d'abord dissous dans un minimum d'éthanol. Les teneurs en phénols totauxsont alors exprimées en mg d'acide chlorogénique par 100 g de poids frais.
- 32 -
C - Dos age d e fi d i f f é r e n t fi C 0 m p 0 fi é fi a p r è s
fi é par a t ion e t pur i fic a t ion par
c h rom a t 0 g r a phi e sur p api e r
1.- Utilisation du réactif des phénols.
L'estimation quantitative des composés phénoliques au moyen du réactif de Folin et Ciocalteu après séparation et purification par chromatographiesur papier a été utilisée avec succès par KEITH et coll. (80» Mc CALLAetNEISH (95), YAMABA et CARDINI (149), VAN s~mRE (139» ASEN et EMSWELLER (5»RUNECKLES (117) et FELDMAN et HANKS (42).
On dépose 500 à 1000 ~l d'un extrait de tabac sur toute la largeurd'une feuille de papier Whatman nO 2. Après séparation dans un solvant convenable, la bande est repérée sous UV) découpée en petits carrés puis éluée avec del'éthanol à 80 %. Chaque éluat est filtré) concentré sous vide au moyen d'unévaporateur tournant. L'extrait est amené à sec) repris par un volume appropriéd'eau. C'est à partir de cette solution aqueuse que les prises d'essais convenables sont faites. Les opérations sont ensuite semblables à celles réaliséessur l'extrait direct.
La scopoline ne possèdant aucun hydroxyle libre ne réagit pas avec leréactif de Folin-Ciocalteu. Il est alors nécessaire de rompre par hydrolyse acide la liaison hétérosidique afin de libérer la scopolétine et de la doser. Unehydrolyse acide effectuée dans un milieu HCl N pendant 35 minutes à 100 Oc sousréfrigérant à reflux provoque l'hydrolyse totale du glucoside.
Les acides chlorogéniques) férulylquiniques et para-coumarylquiniquesont séparés dans le butanol éthanol. Le férulyl-l glucose subit deux purifications (une première dans le butanol éthanol et une seconde dans le butanol acétique). La rutine) la nicotiflorine et la scopolétine sont purifiées à l'aided'un solvant aqueux comme l'acide acétique à 2 %.
Le solvant peut extraire certaines des impuretés du papier, ces impuretés pouvant réagir avec le réactif des phénols. Pour éliminer ces interférences) on traite une feuille Whatman nO 2 comme un chromatogramme) mais sans déposer de solution. On obtient après élution une solution contenant les impuretésdu papier. Cet a~trait nous servant de blanc on y ajoute les réactifs et on dilue à 25 ml avec de l'eau. C'est par rapport à ce témoin que sont lues les densités optiques des éluats.
2.- Etablissement des courbes d'étalonnage.
Les témoins servant à établir les courbes étalons sont traités dansles mêmes conditions que les échantillons de tabac (chromatographie) élution,dosage). Ces témoins sont d'abord dissous dans une quantité minimum d'éthanol,puis dilués avec de l'eau à la concentration désirée (généralement 100 mg/l00ml) c'est-à-dire 100 ~g/IOO ~l). On dépose alors sur du papier Whatman nO 2 desvolumes croissants de solution témoin de 25 à 200 ~l représentant 25 à 200Ug deproduit pur. Les courbes sont linéaires jusqu'à la concentration de 200 ~g dans -
~ 33 -
25 ml (8 ~g/ml). Les blancs sont également constitués par des solutions contenant les impuretés du papier et dans lesquels on ajoute les réactifs et que l'ondilue à 25 ml avec de l'eau.
Les courbes standard obtenues in vitro et après élution des spotssont peu différentes (2 %), sauf pour la rutine. Avec cette dernière substancele rendement ne dépasse pas 70 % et semble due à la difficulté d'éluer ce polyphénol.
Tous nos résultats sont exprimés en fonction du poids frais, car nousavons remarqué que les variations de teneur en matière sèche n'étaient pas s~
gnificatives dans nos conditions expérimentales.
La figure 2 représente les courbes standard.
-.34 -
optiques
FIG. 2 COURBES D'ETALONNAG~
acide para_ ccuo'ëlrique.~ -.---.-
acide para _t:oumar~l_"3~---_.-
0.50
0:10
ï3C idE caFé~l_ 3t ---....
add2 ·férufyf_3tJ, ------.
qUJn\que
. .qUlnlque.
. .qum Ique
s conc.~ntrations en f9/m 1.
o~o
i')
5l:0pDlét:ine- ~-- ---
ruti ne..v
c:on~entrai:.ia~ en f 91 ml.
Cha pit r e 3
ETUDE,EVOLUTION QUALITATIVE DES COMPOSES
P H E NOL l QUE S DAN S LES Nicotiana xanthi N.C. l N F E C TES
A 20 Oc et 30 Oc PAR LEV l RUS DEL A M 0 SAI QUE
DU TABAC SOUCHE COMMUNE. EXAMEN DU
COMPORTEMENT DE
TABACS VIROSES
CES SUBSTANCES DANS
DEL A V A RIE T E samsun .
DES
. l - RESULTATS EXPERIMENTAUX.
Nicotiana xanthi n.c.
Ide n tif i c a t ionA -
p r
d e
é S 8 n t S dan s
d 8 S
1 8 S
pol y P h é
f 8 U i 1 1 8 S
n ols
sai n 8 S
1.- Dérivés de Z'acide cinnamique.
Les acides chlorogéniques dont l'ensemble constitue la majeure partiedes polyphénols présents dans les feuilles saines de tabac, peuvent être séparés en différents isomères (A, B, C) par chromatographie à deux dimensions surpapier Whatman nO l, en utilisant ~~ solvant organique comme le butanol acétique en première direction, et l'acide acétique à 2 % en seconde dimension.
La comparaison des Rf dans de nombreux solvants avec ceux des produits de référence, l'examen des fluorescences en lumière de Wood, la considération des spectres d'absorption en ultraviolet, et l'étude des produits provenant des hydrolyses acides et alcalines nous permettent de conclure à la présence de l'acide caféyl-3 quinique ou acide chlorogénique, de l'acide caféyl-5quinique ou acide néochlorogénique, et de l'acide caféyl-4 quinique ou "bande510" de SONDHElMER dans les feuilles non infectées de Nicotiana xanthi n.c.
... 35 -
Ces polyphénols sont d'abord séparés par une chromatographie linéairedans le butanol éthanol. Les bandes sont examinées sous la lumière de Wood,éluées avec de l'éthanol contenant 30 % d'eau, puis purifiées par chromatographie bidimensionnelle dans le solvant de PARTRIDGE et l'acide acétique à 2 %.
Leurs spectres établis avec un spectrophotomètre unicam 800, en milieuneutre et alcalin sont identiques, et présentent les mêmes maximums d'absorptionque les échantillons de référence (tableau VI, figure 3). Les composés absorbentdans deux deux régions du spectre ultraviolet; nous observons un premier maximum à 245 m~ et deux autres à 302 m~ et 328 m~. La double absorption dans cettedernière région est due aux deux isomères cis èt trans. Ces trois maximums, surtout ceux comprÏs entre 300 m~ et 330 m~, se déplacent vers les grandes longueursd'onde en milieu alcalin (380 m~). Leurs Rf et leurs fluorescences en lumièreultraviolette correspondent à ceux des marqueurs (tableau VI) .
Tableau VI - Rf' fluorescences et spectres d'absorptiondans l'ultraviolet des composés A, B et C.
Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol
Appellation , en UV +NH 3 .à .95 0. (mll) ..
BEW BAW BArn BPW+ KFW AA2""Àmax À-min L1À-max
(alcali)
A 36 45 1 26 35 62-77 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52B 40 50 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52C 42 57 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245,(302),328 265 + 52
---------------Marqueurs :
ide chlorogé-que (commerce) 42 57 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52
ide néochlo-,génique (café) 36 45 1 26 35 62-77 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52
nde 510"afé) 40 50 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52
Solvant$utilisés :
. BEW ~ butanol, éthanol, eau, 4,1,2 .• BAW = butanol, acide acétique, eau, 4,1,5 (phase organique).
BArn = butanol, ammoniaque 2N, l,l, (phase organique).BPW = butanol, pyridine, eau, 14,3,3.KFW = isobutyl méthylcétone, acide formique, eau, 14,3,2.ME = acide acétique à 2 %.
* Séparation des isomères cis et trans dans le solvant aqueux.+ Chromatographie en ascendant.
- 36 -
densi~é optiqu~)
6
4 I---------i-----+-----i------t------t------\-------i
2 I------!-----+-----+-----+------I-----+-----I
o I------+-----+------J-------+------f------t-------i
: y\ /V ,/1\ \.\, ~--- " \ \\\\" ,," '" '
'..... -', ",/, ,/
.2. I------+------+-----"""""=:---+ ~-'-='·-=-..c-=_=-=-=-'"""..:....-----t------\.----;-----\----""1
-~--f-- ~~ \,_,0 '-- -..L .L- --L ....!- L- -L.:',~ ~'w_
225 2.50 275 !OO 325 ~50 400 450
longueur d 'onde (m~)
FIG. 3_ SPECTRES D'ABSORPTION DU COMPOSE A
dans E. 't: OH 95- Et OH = éthano\--------- dans Et. OH 95'~ + Na OH
L'hydrolyse alcaline réalisée en milieu Na OH N pendant une heure àla température du laboratoire, et sous atmosphère d'azote, libère pour chaquecomposé les acides caféique et quinique (Tableau VII). Ces derniers produitssont également identifiés dans les hydrolysats acides effectués en milieu HCI N,sous réfrigérant à reflux à 100 oC, pendant 35 minutes.
Tableau VII - Caractéristique physiques des produitsdécelés dans les hydrolysats de A, B et C.
Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Coloration dans leen UV +NH 3 visible.
Aglycone BAW BEW TAW BzAW Naf AA2Réactif IP-nitranili-
d'Hoepfner +ne Na2
C0 3
de A 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brunde B 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brunde C 78 66 3 11 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brun
------------Marqueur
ide caféique 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brun
Rf .x 100 dans les solvants Coloration avecraction non nitroprussiate-pipérazinehénolique BAW IBW IAmW EAmw
. . . . . . . . ~ . . .. . . . . . ~ .
de A 20 17 65 56 Jaune-orangede B 20 17 65 56 Jaune-orangede C 20 17 65 56 Jaune-orange
-------------Marqueur
ide quinique 20 17 65 56 Jaune-orange
. . . . . . ~ .
Solvants utilisés :
TAW: =BzAW =Naf =IBWIAmW =EAmW =
toluène, acide acétique, eau, 4; 1,5 (phase organique).benzène, acide acétique, eau, 6,7,3 (phase organique).formiate de sodium, acide formique, eau, 10,1,200.isopropanol, butanol, eau, 7,1,2.isopropanol, ammoniaque, eau, 6,3,1.éthanol, ammoniaque, eau, 20,1,4.
.,. 37 -
L'identification de l'acide caféique est confirmée par l'analyse spectrale (figure 4) en milieu neutre et alcalin.
/ '\ -L/ :\ "
1 \
1 /\\
\
/1
\\
1 \,\
l'1 \
1 \, -~
..\
V/
\\, \, "
1\-- .... ) \.... \... /' ... " 1\ \J' ... ,,-- .... ..- \
\J..... _-..".
\....
.... ...,\
\\
\
\\~
"- \
N,450350 400
longUEur d'ondg tm r)3253002752.-50
)-022'5
cl En saé optiquE'L'O
'.2.
1·4
1·0
FIG. 4 5PE'E.TRE 0' ABSORPTION DE l'AGlYCONE DU COMPOSE A
...dans E. t. OH ~ 95°
dans E -\:. OH à 95<1 + NaDH
. - 38 -
2.- Flavonosides.
Le polyphénol quantitativement le plus abondant dans les feuilles deNicotiana xanthi n.c après les acides chlorogéniques semble être la rutine (FI)ou rhamnoglucoside-3 quercétine.
La substance repérée en lumière de Wood après développement linéairedans l'acide acétique à 2 % est éluée avec de l'éthanol à 80 %, puis purifiéepar développement bidimensionnel dans le butanol acétique et l'acide acétiqueà 2 %.
Après une hydrolyse acide réalisée sur le produit pur en milieu HCI Nà 100 Oc pendant 30 minutes, l'aglycone est extrait par de l'éther éthylique. Laphase éthérée est mise à sec, reprise par de l'alcool à 95°~ puis chromatographiée dans le Forestal ou elle donne un spot de Rf 0,42 correspondant à celui dela quercétine. Dans le butanol acétique le Rf est de 0,71. La couche aqueusechromatographiée dans le solvant de Partridge met en évidence du glucose (Rf =0,18) et du rhamnose de Rf = 0,37.
Deux autres flavonosides (F2 et F3 ) distincts de la rutine sont présents dans les extraits foliaires. Ces deux composés apparaissant bruns comme larutine en ultraviolet, ont donc leur hydroxyle en position 3 de l'hétérocyclecentral non libre.
Les méthodes de purification étant les mêmes que celles adoptées pourFI, la substance F2 donne par hydrolyse acide un aglycone dont les Rf dans leForestal et le butanol acétique sont respectivement de 0,58 et de 0;86 et coincident avec ceux du kaempférol. Les sucres apparaissant dans la phase aqueusesont le glucose et le rhamnose.
L'hydrolyse acide effectuée sur F3 libère de la quercétine et du glucose. Cette substance est rapidement scindée par la B-glucosidase (20 minutes),alors que les hétérosides FI et F2 résistent à une telle hydrolyse.
Les caractéristiques physiques des polyphénols FI' F2 et F3 ainsi quecelles des produits provenant de leurs hydrolyses acides sont résumées dans letableau VIII.
- 39 -
Tableau VIII - Propriétés chromatographiques des composés Fi, F2 et F3 ainsi quecelles des produits décélés dans leurs hydrolysats acides.
I. Rf x 100 dans les Fluorescences sous Fluorescences soussolvants •. ultraviolet. ultraviolet +AlC1 3
:traits initiauxBAW BEW .AA2 .Sans réactif . '. . -tNH 3 Seul .. .. +NH 3
Fi 42 55 35 Brun Jaurie Jaune JauneF2 52 64 41 Brun Vert Jaune VertF 3 59 70 22 Brun Jaune Jaune Jaune
~------------
1arqueur ..Itine 42 53 55 Brun Jaune Jaune Jaune
. . ...
2. Rf x 100 dans les Fluorescences sous Fluorescences sous
rdrolysats acides solvan ts. ultraviolet .ultraviolet +AlC1 3.phase éthérée BAW Forestal
sans +NH 3réactif Seul +NH 3
de Fi 71 42 Jaune- Jaune Jaune Jaunede F2 86 58 Jaune Vert Jaune Vertde F3 71 42 Jaune Jaune Jaune Jaune
------------------~arqueurs :
uercétine 71 42 Jaune Jaune Jaune Jauneaempférol 86 58 Jaune Vert Jaune Vert
Rf x 100 dans les solvants Colorations avec~phàse aqueuse'
BAW APW~ Phtalate d'aniline .Aniline .phosphorique
de ~ 18 28 Brun Brun-jaune1 37 49 Brun-;rouge Brun-jaune
de F2 18 28 Brun Brun-jaune37 49 Brun-rouge Brun-jaune
de F3 18 28 Brun Brun-jaune----------------arqueurs :
ucose 18 28 Brun Brun~jaune
amnose 37 49 Brun-rouge Brun-jaune. . . . , . ~ . • • • • , k • ... ........._. -' '.' '- "..... - "- 'o. - ~ - • .~ . . . . . . .
*APW = acétate d'éthyle, pyridine, eau, 2,1,2 ~phase organique).
- 40 -
Les mesures spectrales, comme le montre le tableau IX, établies surF2 et sur son aglycone ne permettent pas à la différence de FI et de F3 de mettre en évidence un déplacement bathochrome de la bande l après addition d'acideborique, ce qui confirme la structure monohydroxylée du noyau B.
Tableau IX - Analyse spectrale des flavonosidesprésents dans les feuilles de Nicotiana xanthi n.cen milieu neutre, puis après addition de sels minéraux.
Spectres dans éthanol à 95° (m]..!)
Appellation Milieu neutre +AlCl 3 L. +NaOAc. +H 3 B0 3 +NaOH1
Bande II Bande l Bande l Bande II Bande.I Bande II
avonosides :
FI 258 362 367,400 269 378 415F 2 267 354 347,396 272 354 400F 3 258 360 365,399 268 383 420
--------------
rqueur :
.tine 258 362 367,400 269 378 415
;lycone :
de F l 257 375 360,428 264 389 Instablede F2 2.68 368 348,419 276 368 Instablede F 3 257 375 360,428 264 389 Instable
---------------
lrqueurs :
lercétine 257 375 360,428 264 389 Instablelempférol 268 368 348,419 276 368 Instable
Les spectres d'absorption de FI et de F2 ainsi que ceux de leurs aglycones, enmilieu neutre, puis additionnés des différents sels minéraux, sont donnés parles figures 5,6,7 et 8.
CeS résultats nous permettent de conclure à la présence du rhamnoglucoside-3 kaempférol (F 2) ou nicotiflorine et de l'isoquercitrine (F 3) ou monoglucoside-3 quercétine, en plus de la rutine, dans les extraits de feuillessaines de N.tabacum xanthi n.c.
- 41 -
:lensiti cplique
....... "........... ,,"":\",
... fi of-
..... rl \. ~/ ~.-;
., • .;j-T '~.'Xx", .
T++- ,.+'f.'f. ••••'
........~ "t"toj.~'" , •••••••
'+' x.x""" ~~ .'.
'.
.;
!l
l'
". •••• u .
~ .-", "
f " .,~--, \., " \. " ..
1 ,. \ • v \/" " ' /.... ,
"1 • " i \,1 ! 1 •, ~
,1 : "
, ! \ ~ -...
\ ~ \' .... ; li . , , ~1 • ,--"1-
" / /,. , . , ,,. 1 ~ , ,
\ ... , \ ~1 • , 1.a,. , ___ ~ ,, \ \ ,
.' ' \, , 1 "
" 11 .\
r-x ..., \\ . , ,
\\~
\\, ,....... _.-. , ,,
\ , , ./ \ .\ " , \ 1.
\ " , .-'"' 1\, " . ~. "-.- .~.~_.- .....- \ \,\... - ",.
~'-'-'.;., --"" , \ ., ,-- .. "
,....... " \ '.---' Il,.\ \
\ \\, ..
\\\
\27'5 "500 752.5 ~50 400
1ongu~ ur d 'onde ( n't-)4-50
FIG.5 SPECTRES D'ABSORPTION DE F1
= dans E 't..DH 95°
---- -----= dans E -t. OH 95" .j. Al CJ~
-._0-0-.- = dans E.i.OH 95° + NaD Ac.
............. ,......... - dans E t. OH 95" 01- H~ B 03- N. DAc
--''ro.'''''--'1L,,'!-.lt'''''''''~''' = dans E i:. OH 96" + NaDH
1'0
. ",. ..'.
..•"..... ..•.•"
.....
....................•.... . ' .
•:l"·
\
0·'8
:/ .\. li \"
......... l ..... ......0l" .l·' .
0'4 1-------:H:.----I---+,..~.-+----.-.....7".. ~....+.....:.::....::::;....~...'_::::::____::~----+_--:r__l...................•.. .. .... \.••.\. .'/ ~~
0·2 l----:........-...-+------+-----..-....+.. ..;;.,...-....-...-..---+------f------+-----:\~
0·6
:;SSO 400 4'50
longueur cl 1 onde ~ m f-)~oo275250
/\ ..... -.--., "V\ ,- ""_. , \.
/ 'X \ V i \ "-,. l '. ,~"'-- ..... \i''. \
/j. , \ \,/ ,\
, 1 \,. '\• 1 \ ".-.... ..
\. ' ... 1 "'\ .' 1 \ " .........; '.'
\J._. ,\ \ / 1 ~-~
\. i1 , \ , , ,.
,.~.,
1 , , , ,.,. ~ \
~1 i, ,
\ 1, \, ,-
\ .' ,..\5{ 1 1
\' \ 1 ". \. \ \,
~...'.. ,, .. '. ... ,---..... ",.~·-·_·_·r·-· ....... ,' ............ ",,," .. ..,"':::". ,".~ -.. -._.-.-. --
\\
1·2
0·02.2.5
0·2,
1'0
0·6
FIG.G.5PI:CTRE5 D'ABSORPTION DE L'AGLYCONE DE F1 EN MILlEU NEUTRE.
PUIS ADDITIONWE DES OIFFERENTS SELS MINERAU~
---- = dans. Et 0 H 95·
--- ------. - dans Et. OH 95/1+ Al C13
_._.-.-.-.- = délns Et OH 95°+ Na 0 Ac.
...................... = d2>ns EtOH 9i D+H 3 B0 3 _NaDAc.
den si t~ op t ique.1·2
'.\
\.
.:.•................. ....
.'..••.
.......'.
......'
, ..•..••.....'........'......-"
.............
........... ~.,... ••••• • •••••• oj....op 'K",,,, pel"""
......... +.0 ......."'"..."f... ......• J'0- + ..,.+
......... ..f"-f"..............t".... Jr)C"lC'ti-'1-~~
0'4 r-----1-----t---.-+~~.::-.-+-----l------l------1
1'0
06
0·2. r------t-----+-----f-----+-----...j.------l------I
o.Q L..------L. .l-- 1. ...!- .-1. -'- -L
'.5S0 400 450
longueur d'onde ( m}4)3002752.50
~ / "\ .'0-',!
1' .. //- X
\, .' ,--,.\ , \
.... ' ! ,,' ...~
" \ ....... 1 1\ .... \ ...... .', \ ...
1 ' 1. , ....
" i ' '. \.... .-.-!~' \ ...
\ . i :. \' /, ,
\..., , 1 , . , ,
./\ ,, " . , l ,
,\ ...
... . 1 ,
/,
"' \\ '. " , \ , , .
\
\ '. . \ , .,' \. , '. , ,\
,'\
• ".' 1 ' \, .' ,,.. \ - ..-. 1 " '\, _.--,.'
~1
\///' .-'-'-' ,
\\, ., ...... .' ,
.' , \'\ , .". ... ". .'
.\
'\ , , '.... , ~< , ,' .._,'
, , \ \'\ ,.... " \ '\
' ...._-, '\
\'\
~0,0
22.5
0'4
0·2
D·6
D'S
1·2
1'0
F\G. 7 SPECTRES D'ABSORPTION DE F2.
= dlln5 Et. OH 95"
--------- = dans Et OH 95 U + AI CI3
_ .. _e_,_._"_ = dAlnS E't DH g,l:+ Na CAt
...... H •••• • ... •••• ..•• •• = clans Et OH 95 D + H J BOl - Na OAc..... .... LI ...,..11 .L .. 1 ..... J""lIll.LJ
den5ité optique
.....
".....'......'"..........
............•...••....
".
'....
.........: ".
/
L-.- -+ +- -+ +- j------,~..:::.-.,.,.-__.-+- _r- ••••• 0,........
•,:" 1.
\'"
..... ",
~ \..'.... \.,.'
0A I-----+------+---+---+--.....:---+-----t-----+----'::-----I.....
.... . ............. .-
O·S
0·6
1-0
0·2,. 1-----+------I--------I-----t------t-----+---1--j"" ..•.,\
.'.....0'0 , ---L ...1.- ---l ....L.... ---' -!- .....;..,
1,2.
1'0
Q''Zl
0,6
V\./' .....".'-.
rA, .",. -""
/ ;\ \, , , ,. \. ,,.l ..., ,
... \ ...... . \.l , ...... i 1 ~ ,, \, V / /\ . .. V,/,- ,. ,
~"'\.. 1"\\ \ .., . , ... Il
,''1 J , . \ ,, , '" '.' , . ... ,....' , ". \ /
, .' ---,'".~.:_---,.~' 1'-.- .. '. \ 1 .'
\' /1 ,
\,, , 1 ,
... \ , ,. ,. , ,l' ,
'. , 1
./.., , , ,
;. , ,, ,. , 1
~10", ,, ,
\.........--,"-........_" ."."... ,.,......-.-._.- .. -.--. ."
........
~oo275250 ::S'50 40 0 450
longueur d'onde tml"J
FIG.8_sPECTRES D'ABSORPTION DE: L'AGLYCONE DE: F2 EN MillEU NEUTREPUIS ADDITlO~NE DES DIFFERE"NTS .sELS MINERAUX.
O'Q2'lS
---- = dar'\s E i: OH c3 g'5"
_0_.-"- .. -.- =
6ë1h~ EtOH~Cj5· + A1C1S
dans E 't. OH ;;; <;J;" of- Na OAc.
.................... : dans Et'OH à95°+ H:sB03_NaOAc.
3.- Conclusions.
Les principaux polyphénols présents dans les feuilles de Nicotianaxanthi n.c sont les acides chlorogéniques et la rutine ou rhamnoglucoside-3quercétine. Les acides chlorogéniques sont au nombre de trois: l'acide caféyl3 quinique ou chlorogénique, l'acide caféyl-4 quinique ou "bande 510", et l'acide caféyl-5 quinique ou néochlorogénique. Les feuilles de ces tabacs renfermentégalement d'autres flavonosides comme la nicotiflorine (rhamnoglucoside-3 kaempférol) et l'isoquercitrine (glucoside-3 quercétine). Ces composés se retrouventdans les feuilles saines de Tabacs de la variété samsun.
Il y a cependant une différence concernant un dérivé du cinnamiquela scopoline (monoglucoside-7 scopolétine). Cette coumarine dont nous reviendronssur la détermination dans le paragraphe suivant, est toujours décelée dans desextraits de feuilles des Tabacs de la variété samsun, mais est absente ou enquantité extrêmement faible dans ceux des Tabacs de la variété xanthi n.c.
Les formules des principaux polyphénols identifiés dans les feuillessaines des Tabacs des variétés xanthi n.c et samsun sont données dans le tableauX.
La figure 9 représente un chromatogramme à deux dimensions (butanoléthanol, acide acétique à 2 %) d'un extrait de feuilles saines de Nicotianaxanthi n.c.
B - E v 0 l u t i 0 n q u a l i t a t i v 8 d 8 S C a m p 0 s é s
P h é n a l i q U 8 S d a n s l 8 S f 8 U i l l 8 S
n é c r 0 s é 8 S d 8 Nicotiana xanthi n.c. i n f 8 C t é S à
2D.°C P a r l 8 V i r u S d 8 l a m a S a i q U 8 d u
T a b a c S o u c h 8 C 0 m m u n 8.
Le simple examen sous ultraviolet d'un chromatogramme réalisé à partir d'un extrait initial de feuilles nécrosées à 20°C de N.xanthi n.c, montreque, l'hypersensibilité de ce Tabac à l'égard du virus de la mosaique du Tabac,s'accompagne d'une énorme accumulation, et d'une importante production de'composés phénoliques (135).
Etant donné la diversité des combinaisons apparaissant lors de la formation des lésions locales nécrotiques dans les feuilles virosées à 20 oC, nousavons préféré commencer l'étude de ces substances par l'identification des aglycones libérés par des hydrolyses acides, alcalines et enzymatiques.
- 42 -
TABLEAU XFORMULE5 OES PRINCIPAUX [OMP05E5 PHENOllOUE5
rD ENTI FIES DANS LES FHlill ES SAINES DE JIiCDtiana I:abarum.VARIETES Xanthi TI.C. et: Jam.5un
1/ dérivés. de t'acide c.innamique
HO CH=CH-COO
acide chtorogéniqueou
ac.ide caféyl- 3 QuiniquE'
acide néoc.hlorogéniQueou
acide c.afÉyl-5 quinique HO~-
HO
4
HO sCH==CH-COO
HO
HO4
CH== CH-COO
H
bande_"510'/ou
acide cafévL 4 qUlnlque
2. _ Flavonoside5
HO
OH
HO OH..
R:OH; rutine cu rhamnoglucoside_3 quercétine
R =H nicotif-lDr'ln~ ou rhamnc91ucoside _3 k~mpféro\
R
OH
j,oquerci trinQ ouglu (oside _ 3 querrétine
obCHsOH
1
OH
LEGENDE
A acide caféy\_ 5 quiniqLlE' ou néochlorogénique
B acide caféyl _4 qUlnJque ou bande \\510"
C acide caf2~1 -:5 qUlnlque ou chlorogéni9ue
Ft; rhamnogluCD5"ide _:3 quercÉl:ine DU rutine
F2.: rhamnoglucoside _ 3 kaempFérol ou nicoriflor',ne
F3: rnonoqlucoside _ 3 quercél:ine ou iSDqufrcitrine
----------------------- -- ---- - - - -------- ------- - --
1
0.1
1
t 0·1spol: dQ. c{epa"t
AA~__--'7~
r:IG.9~CHROMATOGRAMr..,E'A DEUX DIMEN!!lIQN5 (I;!UTANOl EH..IANOL_ACIOf
A CET 10 UE A 2. "'/" ) D' UNE XTRA(T DE FEU ILL fS 5 AIN. ES DE
N/cotiana Xanl"hi ". c.
1.- Identification des aglycones présents dans les hydrolysats d'extraitsinitiaux de feuilles de N.xanthi n.c virosées à 20 oC.
La considération des Rf avec ceux des produits de référence dans dessolvants comme le toluène acétique, le benzène acétique, le butanol acétique,le formiate de sodium, et l'acide acétique à 2 %, l'examen des fluorescences enultraviolet et des colorations dans le visible après pulvérisation de réactifsspécifiques, ont permis d'identifier dans les hydrolysats acides de feuilles nécrosées de N.xanthi n.c, 108 heures après inoculation par le VMT : les acidescaféique, férulique, para-coumarique, ortho-coumarique, vanillique, mélilotiquela scopolétine, l'esculétine et des flavonols comme la quercétine et le kaempférol.
Les acides para-hydroxybenzoique, gentisique, sinapique et la coumarine sont également détectés sur les chromatogrammes réalisés à partir de telshydrolysats, mais cependant en moins grande quantité. Ces phénols ne sont qu'àl'état de traces (exceptions faites pour l'acide caféique, l'esculétine, la quercétine et le kaempférol) dans les hydrolysats des Tabacs sains correspondants.Les hydrolyses acides sont faites en milieu HCI N, sous réfrigérant à reflux,à 100 Oc durant une heure.
Les hydrolyses enzymatiques réalisées à l'aide d'une préparation commerciale de S-glucosidase et effectuées à la température ambiante pendant 6 heures sur des extraits de feuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c, libèrent lesacides caféique, férulique, ortho-coumarique, sinapique, mélilotique, vanilliquepara-hydroxybenzoique, gentisique, la scopolétine, la coumarine, l'esculétine etla quercétine.
La coumarine décelée sur les chromatogrammes pourrait provenir de laforme cis de l'acide ortho-coumarique (acide coumarinique). Cet acide possèdantun OH en ortho de la chaîne carbonée se cyclise spontanément en coumarine de lamanière suivante :
COOH
ac.ide 0_ cDumarlqu r
COOH
aride cDumarmlque c.Dumarlne
Sur la plupart des chromatogrammes faits à partir d'hydrolysats acideset enzymatiques apparaissent des substances non encore identifiées (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10). Un certain nombre d'entre elles (2,3,4,5,6,7) prennent des fluorescences en lumière de Wood, et des colorations dans le visible après pulvérisation
- 45 -
des réactifs des phénols, comparables à celles données par les acides féruliqueet sinapique. Ces composés ne sont jamais décalés dans les hydrolysats d'extraitsinitiaux de plantes saines.
La substance que nous avons appelé 1 n'est détectée que dans quelqueshydrolysats acides d'extraits foliaires de N.xanthi n.c, en particulier dans ceuxdes Tabacs ayant séjourné à 20 Oc entre 108 heures et 156 heures. Ce produits'isomérise dans un solvant aqueux en deux isomères cis et trans, et présente lesmêmes caractéristiques que celles données par l'acide caféique, en particulier ildonne une coloration rouge brique avec le réactif d'Hoepfner. Nous avons identifié un composé semblable dans les hydrolysats acides de grains de café des variétés robusta et arabica.
L'hydrolyse alcaline n'apparaît libérer que les acides caféique, férulique et para-coumarique. Les hydrolysats basiques renferment également de lacoumarine; cette dernière substance peut provenir de l'acide ortho-coumarique.La cyclisation doit se produire lors du passage en milieu acide, par additionde HCl 2N.
Les Rf dans les différents solvants, les fluorescences en lumière deWood, et les colorations produites après pulvérisation de réactifs, des nombreuxaglycones identifiés dans les hydrolysats, sont résumés dans le tableau XI.
Les figures 10,11, représentent des chromatogrammes à deux dimensionsdans le benzène acétique et le formiate de sodium, d'hydrolysats acide et enzymatique de feuilles nécrosées de N.tabacum variété xanthi n.c infectés à 20 Ocpar le virus de la mosaïque au Tabac.
A la suite de ce travail, nous pouvons penser que de nombreux aglycones doivent être liés au glucose par une liaison f3, et que certaines des combinaisons existantes dans les extraits non hydrolysés de feuilles nécrosées deN.xanthi n.c soient des O-glucosides.
- Essai d'identification du composé 1
Cette substance ne peut être considérée comme un produit de transformation de l'acide caféique car il n'apparaît pas dans tous les hydrolysats ou cedernier acide est détecté. Il peut être cependant considéré comme un ortho-diphénol dérivé de l'acide cinnamique car il donne une réaction positive avec le réactif d'Hoepfner et isomérise dans un solvant aqueux en deux formes cis et trans.
Si l'on considère la migration des acides benzoiques ortho-dihydroxylés comme l'acide protocatéchique (acide dihydroxy-3,4 benzoique) et l'acideortho-pyrocatéchique (acide dihydroxy-2,3 benzoique), dans le benzène acétiqueet le formiate de sodium (74), il est à noter que c'est l'acide possèdant deuxhydroxyles adjacents en position ortho du groupement carboxyle (acide ortho-pyrocatéchique) qui possède le Rf le plus élevé dans le benzène acétique. Les vitesses de migration sont semblables pour les deux acides dans le formiate de sodium.
-46 -
Tableau XI - Caractéristiques chromatographiques des acides -phénols et des coumarinesdétectés dans les hydrolysats acides et enzymatiques de N.xanthi n.cvirosés à 20 oC.
. . . . . .
Rf x 100 dans les solvants Fluorescences Colorations avec
Appellationen UV + NH 3
BAW BEW TAW BzAW NaF M2 p-nitraniline p-nitraniline Réactif+Na2 CO 3 d 'Hoepfner.
Icide caféique 78 66 3 11 32-66 30-63 Vert-jaune Jaune-vert Brun RougeLcide férulique 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Rose Bleu-vert Jàune~cide p-coumarique 88 75 10 31,50 42-70 42-70 Violet Jaune Bleu Vert~cide sinapique 80 70 24 60 20-68 35-65 Vert Rose Bleu-gris Jaune~cide O-coumarique 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violet~cide mélilotique 88 80 50 52 79 75 Jaune Violet~sculétine 75 70 1 7,5 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge:;copolétine 83 75 35 38,5 31 47 Violet Jaune Bleu-gris Orange;oumarine 90 75 80 81 75 75 Jaune" Violet\cide vanillique 88 80 34 62 56 62 Jaune-orange Violet Jaune\cide?-hydroxybenzoique 90 83 6 31 63 66,50 Jaune-Vert Rougekide gentisique 80 66 2 15 69 65 Bleu-vert Gris Gris-blanc Brun
86 10 29 33-67 34-60 Vert-Jaune Jaune-brun Brun Rouge
2 79 17 41 56 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange
3 81 26 43 56 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange
4 81 47 34,50 50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange
5 71 15 3,50 4,50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange
6 71 32 4 4,50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange
7 88 32,55 Vert-Bleu Jaune Gris-bleu
8 82 85 70 70 Violet Jaune
9 85 80 60 75 Violet Jaune Brun-rouge
10 39 59 Violet Jaune
..........
- 47 -
en po', n l:.iHéE'n hac.huré
. LEGENDE
dé rivés. de \ 1ae:" de c..'Jnnamiquedérivé'i de l'acide be.nzoïque
sc. 0.: Sc.opo'É1:. i nl~es; ::. E'~c.ulétine
c = ac.ide caféïQu~.co = coumarine
ae ide..
pc: :: pëlra.coumartque
F - ~c.ide f~l"'ul ique.-;;lc..ide
. .s = .5tnaplque
oc .::. ac.ida ortho _c:oumariqur?me = acide mélilol::iqueva :: acide van't1lique.pah::: acid~ para _ bydro"X~ benzoïquege. .::. acide ge nt i li ique
(Ie.~ isomèrQ.s cis e-t trans dES acidec:. cinnamiquE?s 51?
sépara.nL dan:) le formiate: de sodium)
.- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
G GG
G
.. 0.11Spoc de. dâpart:..
No..F
FIG.10 CHROMPtTOGRAMME A DEUX Olr-1ENSION~ (BE.N~ÉNE At:ËïIOUE_
fORMIATE DE SODIUM) D'UN HYDRDLY.5AT ACIDE DE FEUILLES Vl\\OS~ECf>A 20" C DE N/ctJé/ana Xanthi n.c. ( X.V.MT. "DS h à 2..0·C )
_ _____________________ '_ _ _ _ _ _ _ _ 4
G GG
GG
. 1
No..F• 0.1
l'OpOt de. de':part
FIG.11- CHROMATOGRAMME A DEUX DIMENSIONS (BENZËNE ACtTICJUE -FORMIATE DE SODIUM) D'UN HYDROLY5AT ENZYMATIOUE
Cf3_GLUCOSIDASE) DE FEU\llES VIROSËES A 2.0 o C OC NicaCt"elna Xanthi n.'
(X.V.MT. 10~hà200[)
COOH
dei de pro~ocatéchique
COOH
OH
acide o. pyrocatéchique
L'application de ces données à nos deux substances ortho-dihydroxylées(composé 1, acide caféique) peut nous permettre d'envisager deux structures possibles pour le composé 1 (structure a, structure b).
OH
sf:.rud:.ure ( a)
COOH
H
OH
structure ( b)
COOH
Le tableau XLI nous donne la structure des principaux acides-phénolset coumarines dans les hydrolysats de feuilles virosées à 20 Oc de N.xanthi n.c.
2.- Etude des combinaisons (hétérosides et esters) apparaissant dans Les feuiLLes nécrosées de Nicotiana xanthi n.c infectés à 2DoC par Le virus de Lamosaique du Tabac.
L'infection à 20 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c par le virus de la mosaique du Tabac, se traduit par une importante augmentation des acides chlorogéniques (chlorogénique, néochlorogénique,"bande 510") et des flavonosides (rutine,nicotiflorine, isoquercitrine), et conduit à une accumulation et à une productiond'un grand nombre de composés phénoliques.
- 48 -
V\R05E A 20 0( PAR LE' VIRUS DE LA HOSAIQUE ou TABAC 50UCHE' COMMUNE.
su b~l::anc.es
nonphéno lique.~
COUMARINES
~~)=o coumarine
ACIDES BEN20ïtiJUE5 ACIDES CI N NAMlQU E~
rnonohydroxy\6es'acidep. hydroX''y ben zoi'gue
~C.OOli
~OH acide. o_tDumarique
~COOH
1 ~ acide m~1 i la\: iqueOl-i
~C.OOH
l'toM at:Ïete p- toumarique.
HO~
HO~O1Z5~ulétine
di hydroxy\ées
H'f)COJ" "scapol étineHO h =0 ~
:~~1 • • •~ aCIde gEnt 151qUe.
HOM~ cOOH
1 .....::: aclde caréiqueHO
trihydrox)I\ -Ifesacide. .sinapique
a. Dérivés de l'acide cinnamique L'utilisation de solvants comme le butanoléthanol, le butanol pyridine et le butanol ammoniaque, permet de mettreen évidence dans des extraits de feuilles nécrosées, la présence d'acides cinnamiques sous forme de dérivés du glucose et de l'acide quinique.
Accumulation des acides férulylquiniques, production de férulyl-l,glucose et à un moindre degré de férulyl-I gentiobiose.
Les bandes qui correspondent à ces substances sont séparées après développement dans le butanol éthanol, puis éluées avec de l'éthanol à 70 %. Unepurification finale est obtenue par chromatographie à deux dimensions avec lecouple de solvants de base (butanol acétique-acide acétique à 2 %).
La formation des lésions locales nécrotiques fait apparaître pour l'acide férulique deux types d'esters: un ester de l'acide quinique (D), et des esters du glucose comme le férulyl-I glucose (G) et le férulyl-I gentiobiose (H).
Les spectres d'absorption sont similaires et présentent trois maximums:le premier entre 235m~et 24Om~et les deux autres à 295m~et 33Om~ (Tableau XIII) •Leurs mobilités très différentes dans le butanol éthanol, le butanol pyridine etle butanol ammoniaque permettent de bien les distinguer. Les isomères cis ettrans sont séparés par un solvant aqueux. Le composé D est en réalité comme lemontre le tableau XIII, un mélange de trois isomères (D, D'et DI!) ; le plus important étant D. La co-chromatographie de ce dernier avec de l'acide férulyl-3quinique n'a donné qu'un seul spot dans les différents solvants. Par "analogieavec les acides monocaféylquiniques, il est probable que D' soit l'acide férulyl4 quinique et DI! l'acide férulyl-5 quinique. L'hydrolyse alcaline de ces depsideseffectuée dans les mêmes conditions que celle adoptée pour les acides chlorogéniques libère les acides férulique et quinique (Tableau XIII) .
Le produit G dont le comportement chromatographique est le même que celui du férulyl-I glucose isolé de Petunia hybrida, est scindé en acide féruliqueet en glucose par une hydrolyse réalisée en milieu NaOH N, à la température dulaboratoire, pendant une heure. L'aglycone et le sucre sont identifiés après traitement du composé avec une préparation commerciale de S-glucosidase. Le tempsd'hydrolyse est de deux heures.
Les composés phénoliques (D,G) peuvent être également rompue par unehydrolyse réalisée en milieu Hel N durant 30 minutes, à 100 oC, sous réfrigérantà reflux.
L'acide férulique et le glucose sont aussi décelés dans les hydrolysatsalcalins ou acides de la substance H. Les conditions d'hydrolyse sont les mêmesque celles utilisées pour D et G. Les données spectrales, l'examen des fluorescences en lumière de Wood et des produits détectés dans les hydrolysats, mais surtout l'étude des valeurs des Rf dans les nombreux solvants, nous permettent avecUne assez grande précision d'attribuer à ce phénol une structure de férulyl-Igentiobiose.
Les Rf, les fluorescences, et les spectres d'absorption en milieu neutre et alcalin des dérivés de l'acide férulique, ainsi que les caractéristiquesphysiques de leurs produits d'hydrolyse sont réunis dans le tableau XIII.
Les spectres d'absorption des composés D et G et de l'aglycone apparaissant dans leurs hydrolysats alcalins sont donnés par les figures 12, 13 et 14.
- 49 -
Tableau Xill. - Caractéristiques chromatographiques et spectroscopiquesdes composés D, G, li et de leurs produits d'hydrolyse.
I. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol à 95 0ünjJ)
Extraits en UV + NH 3Initiaux BEW BAW BArn BPH KFH AAE À max À min 6À max
(alcali)
D 49 65 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46D' 46 60 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46Dl! 44 58 3 32,5 48 70-81 VertG 69 55 19 62 30 65-75 Vert 240, (300) ,330 263 + 50H 34 29 - 15 23 70-82 Vert 235, (300) ,327 263 + 53
------------
rqueurs :
ide férulyl-3inique (café) 49 65 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46rulyl-1 glu-se (Petuniabrida) 69 55 19 62 30 65-75 Vert 240, (300) ,330 263 + 50
2. Rf x 100 dans les solvants Colorations Spectres dans éthanol 95 0
rdrolysats. (m )aglycone BAW BEW TAW BzAW NaF AA2 UV + NH
IP-nitrani-line + 6À maxlNa2 C0 3
À max À min (alcali'.
de D 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de D' 84 72 40 64 28-70 38-65 Eleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de Dl! 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert ,
"
de G 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de H 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert,---------
queur :
deulique 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18
Fractions non Rf x 100 dans les solvants Colorations
phénoliques BAW APW IB\-l IArnW EAmW Nitroprussiate Phtalate Anilinepiperazine d'aniline phosphorique
de D 20 17 65 56 Jaune-orangede D' 20 17 65 56 Jaune-orangede D" 20 17 65 56 Jaune-orangede G 18 28 Brun Brun-jaunede H 18 28 Brun Brun-jaune
--------------lueurs ~
le quinique 20 17 65 56 Jaune-orange:le glucose 18 28
1
Brun Brun-jaune-
)
"350 400 450
"ongueur d'onde ( m fA);soo2752.50
/ 1\ ...-.., ".. ,
/ \ ",,
1\
1 \1 \
/' 1 \,
/ /\\,,, \
~\\
\', ~ /, .,
~\
~~ ...-, , \, ," ....
",
\.......- .' ... .....
"1- ........ ,.'" ........ _- \.... _--, \
~\ ,
\ ,,,"
1·6
0·022.5
0.1.
0'6
densité. opl:i qUE?2:0
1·'2.
1·0
FIG _ 12 SPECT R E5 0" ABSOR.PT ION OU CDMPO St D
== dAll\s
----: dans E -t:. OH .95"
E. -\;. OH 9," + Na OH
cl'è!osité opb'que
2.75 300 ~25 '3'50 400 4'50longueur d J ond2 ~ mjA )
SPECTRES D'ABSDRPT\ON DE' LA SUBSTANCE G-
/ ~ ,'-- ...",'" ,
~ \ ",
, ,, ,
/, ,, ...,
", ,
/;;,
1'\ ......-- ...... '\....~,
,. ..--... ... ,,'","\
~ \,..
~,,'", ,
... ,... "--------
~"
0·9
C'b
1·0
0-2.
0.+
0·02.25 2.50
____ = déln~ Ek OH 95°
--------= dans El:: OH 9~o+NélOH
'550~oo275 400 450longueur d'onde (MjA)
FIG.14.sPEtTRE'5 O'A5,SORPTION DE L' Ar,LYCON~ DES COMPOSf$ D ET G
\, r,\,
\ ,.'- .....,,,
LJ '\,
\, ", "\\ \,
/', \
\ ,,
//,
\ ", .." ,'\
,----, \,..
~,1 \
\\-.., \
""" V 1
\'\'\ ,
'\ , \,~
, \
1'.. \, \.., ,- , \, J' \, ,,'
'\'--' \\. """
"-
)·2
::>·022'5'
dgnsH:é optique1'0
---- = dans Et OH 95°
-- -------- ""' dans Et OH 95° + Na OH
Les vitesses de migration des différents esters de l'acide féruliquedans le butanol éthanol et l'acide acétique à 2 % sont illustrées par la figure15.
- Accumulation d'acide para-coumaryl-3 quinique
Les nécorses d'hypersensibilité s'accompagnent de l'accumulation d'uncomposé E, qui fluoresce en violet sous la lumière de Wood après exposition auxvapeurs ammoniacales, et dont les Rf et les maximums d'absorption (23Om~, 292m~
et 312m~) dans le spectre ultraviolet correspondent à ceux de l'acide para-coumaryl-3 quinique (tableau XIV) .
Les méthodes de purification employées, sont les mêmes que celles utilisées dans l'isolement des acides chlorogéniques ou férulylquiniques.
Tableau XIV - Rf' fluorescence, spectre d'absorptionen ultraviolet du composé E.
Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (m]J)
ppellationen UV + NH 3
BEW BAW BArn BPW KFW M2 À max À min M max(alcali)
E 54 72 9 39 56 68-80 Violet 230,(292) ,312 250 + 50-----------rqueur :
idecoumaryl-3inique 54 72 9 39 56 68-80 Violet 230,(292) ,312 250 + 50DIurne)
Par hysrolyse alcaline, nous mettons en évidence de l'acide para-coumarique etde l'acide quinique (voir tableau XV).
- 51 -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _..- - -- .-. .... -.. ,.-..- - ~
AA fJJ --------;;>--
0.1
Î ().-1
,=>poc. de, de.parc-
FIG.15 VITESSE'5 DE MIGRATION DES DIFFE.RE.NTS e.5TE"RS UE L:'ACIDEFERUL\QUE DANS lE BUTANOL ETI-lANOL ET L'ACIDE ACETIOUE A 2·,.
o : dtide férul!Jl_ 3 quiniqueD': ar.ide! férulyl _4 q uiniqul?0": ëlcide f-prul\)I_5 quiniqll~
G: férufyl_1H: féru 1~1_1
glucosegen ~ iD biDS~
Tableau XV - Caractéristiques physiques des produitsdécelés dans l'hydrolysat basique de E.
Rf x 100 dans les solvants Coloration Spectres dans éthanol 95° (mjJ)Aglycone en UV + NH 3
BAW BEH TA\J BzAW NaF ME À max À min 6À max(alcali)
de R 88 75 10 31 ,5 42-70 42-70 Violet 228, (292) ,310 247 + 25------_._---
,rqueur ··idecoumar~que 88 75 10 31,5 42-70 42-70 Violet 228, (292) ,310 247 + 25
Rf x 100 dans les solvants Coloration avec'raction non phénolique
BA\o1 IBW IAmW EAmW Nitroprussiate-pipérazine
de E 20 17 65 56 Jaune-orange-----------------------
.rqueur ··ide quinique 20 17 65 56 Jaune-orange
Les spectres d'absorption du composé E et de son aglycone sont donnés par lesfigure 16 et 17.
- Apparition de l'acide ortho-coumarique sous formede combinaisons avec le glucose (esters, glucoside),production d'un dérivé de l'acide mélilotique.
Les propriétés chromatographiques et spectroscopiques comparées à celles données par HARBORNE et CORNER (63), et l'examen des substances détectéedans les hydrolysats nous permettent d'envisager dans des feuilles virosées à20 Oc de Nicotiana xanthi n.c l'existence de l'ortho-coumaryl-l glucose, del'ortho-coumaryl-l gentiobiose et du mélilotoside(S-glucoside de l'acide orthocoumarique).
L' ortho-coumaryl-l glucose (1) et l' ortho-coumaryl-l gentiobiose (J)ont des Rf dans le butanol éthanol respectivement de 0,74 et de 0,57 et prennentune fluorescence jaune au contact des vapeurs d'ammomiaque (voir tableau XVI).
Les produits (T, J) sont isolés et purifiés par développement linéairedans le butanol éthanol suivie d'une chromatographie bidimensionnelle dans le bu-
- 52 -
/"\ .... -"",
/ 1\,,
\
~1 ,
1 ,1 ,
1 \1
, -\"'/v_~X'
\......... _- "",'
\
" \
" \...... ~ ..... IJ8_ .... , \' ...... ' ...... \
...-~.,.
...
\-------\\
~,
...
d e.nsi té oyt ique·0
'40
25'0 '2.75 300 350 400 4501angueur d'ande (m14)
r=ïG:16 5P Eer RE S D' ABSOR PTiON OU C.OMPO'E E
____ ... dan4i E + OH 9':i-
dans E + 0 H 95" +- ~J., DH
.
V\ ... -'".. ..., "-,
/ ,\,
"...,----_#
f\ '\,,\, ,
V,
\,, \
~,
1
' ... ,, ... ,1 ...
, \
l " /,
\, ,"- ,,
"-l',~ ,,'
"'\,
t-"", _ ...... ~ .......-.-- ~ ",. ... ...
FIG .iT.sPEeTRES
350 400 -q·SO
longuE'ur d'onde (ml-'-)DU COMPOSE E
525:soo2.75
O' Ae"SDRPTION DE L'AC,LYCONE
den si té opflque
-02.25 2.S'O
·fO
.2,
·0
·6
---- - dans E i:. OH 950
----- - --- = dan5 E t OH g~. +- Né! OH
tanol éthanol et l'acide acétique à 2 %.
L'hydrolyse acide étant réalisée sous réfrigérant à reflux, en milieuH Cl N pendant 30 minutes à 100 oC, l'aglycone est extrait par de l'éther éthylique. La couche éthérée mise à sec, reprise par de l'éthanol puis chromatographiéedans les solvants spécifiques des acides-phénols révèle un spot qui correspondà celui de l'acide ortho-coumarique. Ces combinaisons sont rompues par une hydrolyse enzymatique (B-glucosidase). Le traitement est effectué sur une période de5 à 6 heures. Le rendement est meilleur dans le cas d'une hydrolyse enzymatique,le milieu acide favorisant la transformation de l'acide ortho-coumarique en coumarine.
Nous avons pu mettre en évidence la présence d'une substance (K) dontle Rf dans le butanol éthanol est approximativement de 0,65 et celui dans l'acide acétique voisin de 0,66. Ce produit invisible en lumière de Wood même aprèspulvérisation des réactifs spécifiques des phénols, est très rapidement hydrolysé (20 minutes) par la B-glucosidase.
Le Rf de ce glucoside dans l'acide acétique à 2 % coïncide avec celuidonné par KLEINHOFS et coll. (82) pour le mélilotoside (S-glucoside de l'acideortho-coumarique). La considération de toutes ces données et le fait que cettesubstance a dans le butanol éthanol un Rf intermédiaire entre ceux de l'orthocoumaryl-I glucose et de l'ortho-coumaryl-I gentiobiose (valeurs que nous pouvons comparer et rapprocher de celles données par HARBORNE et CORNER (63) pourles dérivés similaires de l'acide caféique et du glucose), nous permettent depenser que nous sommes là, en présence du S-glucoside de l'acide ortho-coumarique.
Sur de tels chromatogrammes, il apparaît un composé L invisible en lum1ere ultraviolette, très rapidement scindée (30 minutes) par le B-glucosidase,en acide mélilotique et en glucose. Le Rf de L dans le butanol éthanol se situeentre 0,60 et 0,70 et est proche de 0,70 dans le solvant aqueux.
Le tableau XVI, rassemble les propriétés physiques de ces diversescombinaisons ainsi que celles des produits détectés dans leurs hydrolysats.
La figure 18 schématise un chromatogramme à deux dimensions (butanoléthanol, acide acétique à 2 %) de ces nombreuses combinaisons.
- Production de caféyl-I glucose.
Sur certains chromatogrammes réalisés à partir d'extraits de feuillesprésentant des lésions locales nécrotiques, 108 heures ou 144 heures après inoculation, il apparaît un composé (M) dont la .fluorescence en lumière de Wood vire au jaune après exposition aux vapeurs anmoniacales.
Ce corps isolé par chromatographie dans les solvants cités plus haut(butanol éthanol, butanol acétique, acide acétique à 2 %), se comporte de la même façon que le caféyl-I glucose isolé de Petunia hybrida.
Le composé absorbe dans deux régions du spectre ultraviolet ; nous observons un premier maximum à 250m~ puis deux maximums à 305m~ et 334m~ . L'acidecaféique et le glucose sont identifiés dans les hydrolysats (acides alcalins etenzymatiques).
53 -
Tableau XVI - Propriétés des substances I~ J, K~ Let des produits décelês dans les hydrolysats.
1. Rf x 100 dans les solvants Fluorescences Spectres dans éthanolExtraits Initiaux en UV + NH
395° (m )
BEW BAW BArn BPW KFW MEAppellationÀmax Àmin f',Àmax
alcali
l 74 72 35 69 33 71-79 Jaune-vert 230, 327 260 + 60J 57 - 14 34 33 86 Jaune-vertK 65 - - - - 66 -L 70 - - - - 70
-------------------aleurs données par dansARBORNE-CORNER l'eau-coumaryl-l glucose 76 75 40 - - 79 Jaune 228, (277) ,325 - + 62
-coumaryl-l gentio-iose 55 45 12 - - 87 Jaune 230, (277) ,327 - + 62
aféyl-l glucose 63aféyl-l gentiobio- 46l.ose-glucoside du 55aféïque
2. Rf x 100 dans les solvants ColorationsHydrolysats
a-aglycones BAW BEW TA\i BzAW NaF ME UV +NH3
p-nitraniline p-nit rani line+ Na
2C0 3
- .
de l 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde J 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde K 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde L 88 80 50 52 79 75 - Jaune Violet
-------------------
arqueurs :
cide O-coumarique 85 77 35 45 58 55 Jaune-vert Jaune Violetcide riiélilotique 88 80 50 52 79 75 - Jaune Violethydrolysats deiptery:;c odorat)
b- Fraction non Rf x 100 dans les solvants Colorations.
phénolique BAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique
de l 18 28 Brun Brun-jaunede J 18 28 Brun Brun-jaunede K 18 28 Brun Brun-jaunede L 18 28 Brun Brun-jaune
-------------------arqueur :
lucose 18 28 Brun Brun-jaune
~...
;'::-':1:"".:)( ..:;.:~ ..
1
Af\:L -----..lJI..>.. 1
t.. 0.11Spot de d~pad:.
FIG.18 VITESSE'S DE MIGRATION DE'i DERIVES DU GLUCD~E DES AI:\DE'S
O.C:OUMARIQUE ET MELILDTIQUE DAN5 LE BUTANOL ETHANOLET L'ACIDE ACEÎIOUE A 2.%
o.
1: o. cOllmoryl_ -1 glucose. r. . n . r n 1\ m ;;;\ r vi _ 1 0 ~ nt jobi0 S !?
K: fi -glucoside de \'ë7c.'tde o. coumarique.L:;3 - cdur.osiae de !'-ac.ide melilotique
Toutes ces données réunies dans le tableau XVII, et illustrées par lafigure 19, correspondent à. celles. du caféyl-l glucose.
Tableau XVII - Rf' fluorescences, spectres d'absorption du dérivéde l'acide caféique et du glucose, et caractéristiqueschromatographiques de ses produits. d'hydrolyse.
1. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95°Extraits en UV + NH 3 (m )
InitiauxBEW BAW BArn BPW KFW ME
Àrnax Àmin 6Àmax(alcali)
M 63 50 8 54 20 60-70 Jaune-vert 250,305,335 265 + 66._---------------[arqueur :
:aféyl-l glucose 63 50 8 54 20 60-70 Jaune-vert 250,305,335 265 + 66:Petunia hybrida)
.
2. Rf x 100 dans les solvants Colorations
Hydrolysats BAW BEW TAW BzAW NaF M2 UV+NH p-nitrani- p-nitrani- Réactifa. aglycone line line d'
+ Na CO Hoepfner
de M 72 66 3 11 32-65,5 30-63 Ver~-jaune Jaune-brun Brun Rouge------------
Marqueur :
Acidecaféique 72 66 3 11 32-65,5 30-63 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge
Rf x 100 dans les solvants Colorationsb.· Fraction non
phénoliqueBAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique
de M 18 - 28 Brun Brun-jaune----------------
Marqueur :
Glucose 18 28 Brun Brun-jaune
- 55 -
~ ;--". ...
/ , "
/ " "\,/,,,,,
\
/ '/\~ ~X-'" ...,. ... ......~ , ... ---, --... ,;
----", ,~
,
\, ,,,. , ,,, ,."... ......- ---_ ..
. \1"-.
2·0
1·6
1·0
OG
cl !Znsi t é op t ique
2S0 2.75 ~oo ~50 400 44,)0
Jongut?ur d' onde ( mJA')
FIG. 19 SPECTRES D'AB50RPTION DE LA SUBSTANCE M
----::;---- ---- =
dans
- Apparition de dérivés de la coumarine
L'examen de chromatogrammes d'extraits de feuilles virosées à 20 Ocde Nicotiana tabacum variété xanthi n.c, révèle la présence d'une substance appelée N qui f1uoresce en violet en lumière de Wood, et dont les produits d'hydrolyse (acide et enzymatique) sont la scopo1étine et le glucose. Ce glucoside, trèsrapidement hydrolysé par la B-g1ucosidase (30 minutes), a dans son spectre d'absorption en ultraviolet deux maximums importants à 227mw et 338~, et deux autres maximums secondaires à 25Om~et 287 m~. Les Rf dans les différents solvantsenvisagés correspondent à ceux donnés par HARBORNE (61). Il s'agit surement dela scopo1ine ou glucoside-7 scopo1étine.
La scopo1ine est la plupart du temps accompagnée d'une substance (0)apparaissant en violet en lumière ultraviolette et qui donne du glucose et de lascopo1étine par hydrolyse acide ou enzymatique. L'hydrolyse enzymatique réaliséeà l'aide d'une préparation de 6-g1ucosidase est effectuée à la ternpérature ambiante durant 4 heures.
La substance 0 absorbe dans deux régions du spectre ultraviolet à226m~ et 34Om~ et possède un épaulement à 29Om~. La considération de toutes cesdonnées nous permet de conclure à l'identité de ce composé avec le gentiobiose7 scopo1étine.
Les propriétés chromatographiques et spectroscopiques de ces dérivésde la scopo1étine sont rassemblées dans le tableau XVIII et illustrées par lesfigures 20 et 21.
- 56 -
Tableau XVIII - Rf' fluorescences et spectres d'absorptiondans l'ultraviolet des substances N et 0s'accumulant dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c virosés à 20 oC.
I. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (mll)Extraits en UV ._-
Initiaux BEW BAW BAm BPW KFW AA2 À max À min 6À max
,ppellation (alcali)
N 56 47 35 45 15 77 Violet 227,250,287,338 306 + 40 30 24 - 10 20 86 Violet 226,290,340 307 + 4
2. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (mll)lydro lysa t s en UV
aglycone BAW BEW TAW BzAW NaF AA2 À max À min 6À maxl. (alcali)
de N 83 75 35 38,5 31 47 Violet 229,253,300,346 307 + 46de 0 83 75 35 38,5 31 47 Violet
.._-----------
farqueur :
;copolétine 83 75 35 38,5 31 47 Violet 229,253,300,346 307 + 46. -
Rf x 100 dans les solvants Colorationsl. Fraction non
phénolique BAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique
de N 18 28 Brun Brun-jaunede 0 18 28 Brun Brun-jaune
.._--------------
farqueur :
aucose 18 28 Brun Brun-jaune
- 57 -
densité optique2.-0
1·'0 +-----+------t------jr-------t------j-----t-----
1·6
V \/ ~
~/ \
1·2..
r\1-0
\O·~
\Q-G
\ / - \o, 4- I----+-----\\-j--h'--V--t--+---+----'t--\_+___0·2-
\~O·Q 1.-- ~ ___'-:-- :-+- _.L ____=:__"__---__:_::_-:::-=''''---_:_:12205 2.50 275 300 325 '3'50 400 4~
,long UEur d onde (mft)
FI G. fO SPECTRES D'ABSORPTION DE LA .5UB5TAf\JCE N
dans E t OH 95 D
denslb? optique
'350 400 L.
longueur d/on~2 ~ mt-t)300. 2752.50
n ,.- ...
/' " '\
\, ,,
\,, \, \
'/ ,/\ \\\
\ \\\
\ / I\J,
\ \'"/ \,\,
'",
", \,........... v /,
\ 1
,, ,, ,...... ,--... ,-- ,C\.-.. ,~ " \,. ,....... ,..... ,.""'------
\~0-0
225
1·0
2,0
1·4
1·6
0·2,.
FIG. 21 SPl";,(ïRE'::l D'ABSORPTION Of l'AGLYCONE DU COMPOSE N
____ = dan5 E ~ OH 95 0
--- --- - = dans Et OH 91)° -1- N!) DH
Un corps de fluorescence vieux rose que nous avons appelé P, virantau Jaune ivoire avec les vapeurs ammoniacales visible à la lumière de Wood surles chromatogrammes, est scindé en esculétine et en glucose par une hydrolyseacide ou enzymatique. Les Rf et les fluorescences de ce produit sont totalementdifférents de ceux de l'esculine (glucoside-6 esculétine) du commerce, mais coincident avec ceux donnés par HARBORNE (61) pour la cichoriine ou glucoside-7 esculétine. Tous ces résultats correspondent aux caractéristiques physiques de lacichoriine et sont rassemblés dans le tableau XIX et la figure 22.
Tableau XIX - Caractéristiques physiques du composé P.
Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (m]J))pellation en UV + NH
3BEW BAW BArn BPW KFW AA2 À max ~ min /:,~ max
(alcali)
P 56 46 8 45 12 68,50 Jaune-ivoire 228,255,290,345 310 + 50
Rf x 100 dans les solvants Colorationsrdrolysats
aglycone BAW BEW BzAW NaF AA2 UV + NH p-nitraniline p-nitraniline Réactif+ Na 2 C0 3 d'Hoepfner
de P 75 70 7,50 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge-brique-----------
lrqueur :
;culétine 75 70 7,50 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge-brique
Fraction non Rf x 100 dans les solvants Colorations
phénolique BAW APWPhtalate d'aniline Aniline phosphorique
de P 18 28 Brun Brun-jaune---------------Lrqueur :
.ucose 18 28 Brun Brun-jaune
- 58 -
"350 400 4-50\ongu!?ur d'onde (mp)
~oo2.752.50
densité oÇ)tique
,.-' ,
h-,,~ r /' \\
1\1 ,
1 \, \, \ '\ V ,X\, \,
\, ,, \... / \
~... "--/
,
\\
ÎIl\ ,,' \, ,,
\
~"",.
\,,," \
~, ,
\1
t>< ,,', ,,
\.......... --_...
...... -----...._--
\~0-0
22.'5
O·S
0·6
O·l.
1-2.
2.·0
1·6
F'lCi.2.2. .sPEC.TRE~ 0' ABSORPTION DU COMPOSE P
----= daM é 1. OH 95 U
-------- = dans E 1: OH 9'.5° ... NaCH
b. Dérivés de l'acide benzoïque: Un composé appelé Q dont les Rf comme letableau XX, dans le butano1 éthanol et l'acide acétique, sont approximativement de 0,65 et de 0,85 et qui renferme dans ses hydro1ysats acides et enzymatiques de l'acide vani11ique et du glucose est présentsur les chromatogrammes d'extraits de feuilles nécrosées de N.xanthin.c. Ce produit hydrolysé en 30 minutes par une préparation commerciale de 8-g1ucosidase ne peut être mis en évidence par les réactifs desphénols. Nous pensons qu'il pourrait s'agir là du S-glucoside de l'acide vinillique.
L'acide gentisique provient en grande partie d'un composé que nousavons nommé R, dont la vitesse de migration de l'ordre de 0,30 dans le butano1éthanol est approximativement de 0,85 dans l'acide acétique à 2 %. Du glucoseest identifié dans la phase aqueuse de ses hydro1ysats acides.
Tableau XX - Propriétés des dérivés des acides benzoïqueset du glucose identifiés sur des chromatogrammesd'extraits de feuilles de N.xanthi n.c virosés à 20°C.
Extraits Initiaux 2. Hydro1ysats
Rf x 100 dans a. b. Rf x 100 dansles solvants Ag1ycones Rf x 100 dans les solvants Fraction non les solvants
phéno1iquepellation BE~.;r ME BAIV' BEW BzAW NaF AAE
BAW APW
Q 65 85 de Q 88 80 52 79 75 de Q 18 28R 30 85 de R 80 66 15 69 65 de R 18 28
------------- ------------Marqueurs : Marqueurs
Acide Glucose 18 28vanillique 88 80 52 79 75Acidegentisique 80 66 15 69 65
La substance Q a été mise en évidence de façon fortuite par é1utionaprès développement linéaire dans le butano1 éthanol d'une zone située sur leschromatogrammes entre la bande contenant le féru1y1-1 glucose et celle renfermant la scopo1ine. Le dérivé de l'acide gentisique est situé sur un tel chromatogramme entre la ligne de départ et le féru1y1-1 gentiobiose. Les différentsé1uats sont alors chromatographiés en utilisant du butano1 éthanol en premièredirection et de l'acide acétique à 2 % en seconde dimension. Sur ces chromatogrammes divers secteurs sont découpés, é1ués puis hydrolysés. Par ces diverstatonnements nous sommes arrivés à délimiter les zones approximatives de migra-
- 59 -
tian de ces substances dans les solvants organique et aqueux.
c. Substances non encore identifiées apparaissant sur les chromatogrammesréalisés à partir d'extraits de feuilles nécrosées: La formation de lésions
locales nécrotiques s'accompagne également d'une production importantede substances fluorescent en ultraviolet après exposition aux va-peurs ammolùacales, ou après pulvérisation d'une solution aqueuse à10 % de carbonate de sodium.
Les principaux composés appelés (S, T, V, W, X et Y) sont d'abord séparés par une chromatographie linéaire dans le butanol éthanol, puis subissentune dernière purification par une chromatographie bidimensionnelle dans le butanol éthanol et l'acide acétique à 2 %.
Les divers produits donnant une réaction positive avec le réactif deFolin-Ciocalteu, sont réductrice, et doivent posséder au moins un hydroxyle phénolique libre.
Le composé S s'isomérise dans un solvant aqueux en deux substances SIet S2 (SI~ Si), absorbe à 225m~ et 32Om~ dans l'ultraviolet, il n'est attaqué nipar la B-glucosidase ni par la soude. Les produits apparaissant dans les hydrolysats acides n'ont pu être identifiés avec une grande certitude. Notons la grande mobilité du composé Sdans un solvant organique comme le butanol ammoniaque(migration similaire à celle observée pour la scopoline).
La substance T se transforme partiellement et d'une façon irréversibleen V. La réaction est spontanée et se produit d'une manière identi~que pour laconversion de V en W. Ces réactions interviennent également après hydrolyse acide ou enzymatique des produits.
Quant aux composés X et Y décelés sur les chromatogrammes il proviennent d'une hydrolyse acide ou enzymatique (B-glucosidase) de W, et par conséquentdes substances T et V.
Le tableau XXI rassemble leurs Rf dans les solvants et leurs fluorescences en ultraviolet ainsi que leurs colorations dans le visible après révélation avec des réactifs comme la p-nitraniline et le nitrite de sodium.
Tableau XXI - Caractéristiques chromatographiquesde S, T, V, W, X et Y.
Rf x 100 dans les solvants Colorations
)ellation BEW BAW BAW BPW KFW BzAW NaF AAE UV+NH p-nitraniline Réactifd'Hoepfner
60 57,5 40..
45 33 60-82S - 58-80 Bleu - -T 65,5 55 - - - - 64 62 Bleu - -V 58,5 50 20 53 18,5 - 30 26 Bleu - -W 77 80 60 82 - 15 4,50 3 Bleu Bleu-gris OrangeX 81 81 74 85 - 47 35 50 Bleu Bleu-gris Orangey 85 84 82 85 - 26 44 56,50 Bleu Bleu-gris Orange
- 60 -
Les pos~t~ons des composés (8, T, V, W, X et Y) sur un chromatogrammeà deux dimensions dans le butanol éthanol et l'acide acétique à 2 %, sont illustrées par la figure 23.
Les Rf des produits W, X et Y dans le benzène acétique et le formiatede sodium montrent que ces derniers correspondant aux composés 2,3,4,5, et 6identifiés dans les hydrolysats acides ou enzymatiques d'extraits initiaux defeuilles nécrosées à 20 Oc de Nicotiana xanthi n.c.
3.- Conclusions.
La formation de lésions locales nécrotiques s'accompagne d'une accumulation de flavonosides (rutine, nicotiflorine et isoquercitrine), d'acides chlorogéniques (acides caféyl-4 quinique, caféyl-5 quinique, caféyl-3 quinique), d'acide para-coumaryl-3 quinique, d'acides férulylquiniques tout particulièrementd'acide férulyl-3 quinique. Ces derniers composés ne sont qu'à l'état de tracesdans les Tabacs sains de la variété xanthi n.c. L'hypersensibilité se traduitpar la production de caféyl-I glucose, d'ortho-coumaryl-I glucose mais surtoutde férulyl-I glucose et de scopoline (glucoside-7 scopolétine). Elle conduit àla formation de substances renfermant du glucose et dont la partie phénoliqueest soit un acide benzoïque (acides vanillique, gentisique, para-hydroxybenzoïque) soit un dérivé de l'acide cinnamique (acides sinapique, mélilotique et orthocoumarique). L'acide ortho-coumarique semble être présent dans les feuilles nécrosées sous la forme de l'ortho-coumaryl-I glucose, de l'ortho-coumaryl-I gentiobiose et du mélilotoside (B-glucoside de l'acide ortho-coumarique). La formation des nécroses d'hypersensibilité fait également apparaître des phénols commela cichoriine (glucoside-7 esculétine), le férulyl-I gentiobiose, le gentiobioside-7 scopolétine et des composés non encore identifiés mais présentant entreeux des analogies de structure, et qui possèdent certaines des propriétés des acides férulique et sinapique.
Les formules des principaux dérivés de l'acide quiniqueet du glucose,caractéristiques de l'infection virale à 20 Oc du Nicotiana tabacum variétéxanthi n.c, sont illustrées par le tableau XXII.
La figure 24 schématise un chromatogramme à deux dimensions dans lebutanol éthanol et l'acide acétique à 2 %, d'un extrait de feuilles de N.xanthin.c virosées à 20 oC, par le virus de la mosaïque du Tabac souche commune.
Nicotiana xanthi
pol Y p h é n 0 l sC - E t u d e des
N.C v i r 0 s é s à
dan s
30 Ocdes
par l 8
v i rus d e l a m 0 sai q u 8 d u T a bac .
L'infection du N.xanthi n.c à 30 Oc par le virus de la mosaïque duTabac souche coramune, conduit à une diminution importante des acides chlorogéniques et des flavonosides. Elle ne s'accompagne ni d'une accumulation des acidespara-coumaryl et férulylquiniques, ni de la production des dérivés faisant intervenir une ou plusieurs molécules de glucose et une molécule d'acide cinnamique ou benzoïque apparaissant lors de la formation des nécroses d'hypersensibilité. Les substances 8, T, V, W, X et Y dont les structures n'ont pu être détermi-
- 61 -
G
GG G
f spo~ de ~'~rl:-.FI G.~3_V1TE5SESDE MI()RATIOt~ DANS LE BUTANOl E'THANOL ~T L'ACIDE.
ACFTI OUE' A II % OES SUB5TAN Cf5 1N[ONNUE5 DEC[ LE ES DAN 5 onEXTRAITS DE fEUIllES \/IQOSFES A 20"C DE N.Xanthl n.c.
R
TABLEAU AXlL
FOR MULES DES PR\NCIPAUX DfF\IVE5 DE L'AC.\ DE <;lU 1NII;7UE ET DU 6LUC05E
':" ACCUMULAtiT DRN5 LES fEUillES VIROSEES A 2.0° Co DU NiC'otiana xanfhi o.c.
V dérivt?s de l'ac·lde qui nique
HO CH==CH-COO
R::: H - acide parël_coumaryL 3 qLliniquE'R :: OCH 3 aci de férulyL 3 quiniquQ
2) dérivés du gl u case~) coumari ne~
5
R == OH cichnriimz ou glucoside_7 esculetineI=? = OCH 3 scopoiine ou g\uco,!)ide -7 scopolétine
oCH-t OH
OH
(,
~--OCH~...
H
genl:iobioside -7 s;copofétine
b) d~rivé.s. de ,'acide c.innamique
H
CH~OH
OHR=-OCH 3 FÉrulyl_1 glucoseR :::. 0H_ caféyL 1 glucos;:
o. c:oul11ëlryL1 gluCOSE!
OH
OH
13. glucc~ide de l'ac.ide o.coumar·lque
OH
fi. g\ucDside de l'acide mé\ i loUque
CH~OH
OCHa
OH
__---'~ F~ rulyl_ 1 gEnflobios"O-CO-CH==: CH
r-----OCH~
OH
OH
C) dérIvés da l' .a1c.ide benzoïque
o CüOH
R:: H.ft - g\uco5",de de \'adde p.hydroxy0l:!nzoïl
R= OCI1 3°1'. gluco!;ld\? de ('acide vanilliqul!
OH
LEGENDE
en pointillé': dérivés- d2 l'e>cide cinnamique.en hachuré: Flavonosides
A atide c.aféyl_S QUlnlQue ou néochlorogéniqueB ,;)cide caF élJL4 qU"1n ique ou ->ban de 510"
c : acide c:aFéyl_ '3 qUlnlQue ou chlorogénique0": acidE' férul~l_ 5 qui niqu e'
0.1: ë)cide férulyl_4 qUlnlque
D :ëJcide férutyl_5 quiniqul:?o :l3cid~ Férui~I_3' qUlnlqul?E : Cll:ide para_ c.oumaryl_ 3 qUlnique
M ": caféyl _ 1 gluCOSE?G : férulyl- 1 glucose1 : ortho_ cQumary 1_1 glucos e
H : f~rul'Yf_1 genHDbios2
J : Drl:ho_ cDumaryl_1 gentiobioseK : j3.qluc.oside de l'acide ortho_coumarique.L =;3.glucoside de l'ac.ide mélilot"lqueN : glucoside _ 7 scopolétin2' ou scopoline.p : gfutoside_7 I?sc:ulétine ou cil:hor'line
o : gentiobias"lde -7 scapatétineol\J :fj- g\ucosidlZ de Vdcide vanÎ !liqueR : glucoside de ['acide gent.isiquliF1 : rhamncglu cos ide _:5 que rcéc·\ ne ou rut ineri : rhômhDglucos i dl2 _ 3 kaem pférol ou "nÎcotifl orin e
F3 : monog\ucoside - 3 qUl?rcétine cu isoquercitrine
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - -- - ---
(@"'i':d" '.':~::
gG8
1
Î 01spoE:. 00 d~t-.
,p-'p..~ ---------=;>-~
Flû.24-.CHROMAT0l3RAMME A DEUX DtMENSI ONS (BUTANDL ÉTHANOL - AriDE ActTq
A 2 %) D'UN EXTRAIT DE r:'EUILlES VIROSÉES A 20°C DE Nlcotiaha Yanl
(x. V. M T. 1DB h à !.o· c) n.
nées, ne sont jamais décelées sur les chromatogrammes d'extraits de feuilles v~
rosées à 30 Oc de N.xanthi n.c.
0 - E v 0 l u t i 0 n q u a l i t a t i v 8 d 8 S C o m p 0 s é s
P h é n 0 l i q U 8 S d a n s l 8 S f 8 U i l l 8 S i n 0 c U ...l é 8 S d 8 Nicotiana xanthi n.c s 0 u m i s à d 8 S
t r a n s f 8 r t s t h 8 r m i q U 8 S .
1.- Transfert thermique d? 20 Oc à 30 oC.
Nous avons constaté que lorsque des feuilles nécrosées sont soumisesà un transfert thermique de 20 Oc à 30 Oc ce qui permet la généralisation du virus, il y a une baisse énorme des acides caféyl, para-coumaryl, férulylquiniquesde tous les flavonosides, et une disparition brutale des substances comme lascopoline, le férulyl-] glucose, l'ortho-coumaryl-l glucose, le férulyl-l gentiobiose, le gentiobioside-7 scopolétine, le caféyl-l glucose, l'ortho-coumaryl-lgentiobiose et de tous les glucosides renfermant un acide-phénol. Les produitsS, T, V, W, X et Y disparaissent progressivement au cours du séjour à 30 oC.
2.- Transfert thermique de 30 Oc à 20 oC.
si la plante est inoculée à 30 oC, laissée 36 heures ou 48 heures àcette température puis transférée à 20 oC, nous voyons apparaître des lésionslocales de 5 à 6 mm sur la feuille inoculée. Les Tabacs sont alors capables d'accumuler les acides chlorogéniques, para-coumaryl et férulylquiniques, les flavonosides, et de synthétiser les nombreuses substances caractéristiques de l'hypersensibilité (glucosides et esters du glucose. de.s dérivés des acides cinnamiqueet benzoique).
E - E t u d 8 d 8 S c 0 m p 0 S é s P h é n 0 l i q U 8 a dan s.
d 8 S f 8 U i l l 8 S v i r 0 S é 8 S d 8 Nicotiana tabacwn
var i été samsun.
Comme MARTIN (90) l'avait déjà souligné, l'infection de cette variété de Tabac par le virus de la mosaique du Tabac, se traduit par une augmentation des teneurs en acides chlorogéniques et à un moindre degré en scopoline.
L'infection virale s'accompagne également d'une accumulation de tousles flavonosides (rutine, nicotiflorine, isoquercitrine) et de l'acide paracoumaryl-3 quinique.
Nous n'avons jamais observé sur les chromatogrammes d'extraits defeuilles virosées de Nicotiana samsun, la présence des nombreuses substancescaractéristiques des nécroses d'hypersensibilité à 20 Oc du Nicotiana xanthin.c.
- 62 -
La figure 25 représente un chromatogramme réalisé à partir d'un extrait de feuilles virosées de Nicotiana tabacum variété samsun.
II - DISCUSSION.INI'ERPREI'ATlOO DES RESULTATS.
Il apparaît à la suite de ces exper~ences que, d'une part la multiplication du virus, d'autre part la température, affectent le rnétabo1isme desphénols dans les feuilles de Nicotiana xanthi n.c. Une température de 30 Oc enmême temps qu'elle supprime la résistance d'un hôte hypersensible inhibe la synthèse des composés phéno1iques.
A l'examen des résultats, il nous semble également que le métabolismedes composés phéno1iques dans un N.santhi n.c virosé à 30 Oc est différent decelui existant dans un Nicotiana samsun inoculé avec le virus de la mosaique duTabac. Ces deux Tabacs pourraient réagir différenment à l'égard du virus dans lecas d'une infection systémique. Les observations cytologiques faites à l'aidedu microscope électronique (123) montrent que l'infection à 32 Oc d'un Tabac hypersensible semblent provoquer des altérations cytologiques comparables, maisavec deux différences : le Nicotiana tabacum xanthi n.c renferme plus de virionsintranucléaires et les altérations des noyaux des jeunes feuilles infectées sontmoins durables que chez le Tabac de la variété samsun. La multiplication viralepourrait être plus importante dans le cas du Nicotiana xanthi n.c virosé à 30 Ocpar voie de conséquence l'utilisation des système métaboliques de l'hôte, cequi entraînerait une accumulation moindre en phénols.
Les perturbations qui interviennent dans les diverses étapes de lasynthèse aromatique doivent être plus importantes dans les feuilles infectéesà 20 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c que dans celles d'un Nicotiana samsun, puisqu'elles se traduisent dans les premières par l'accumulation et la productionde substances jamais décelées dans les feuilles virosées d'un Tabac de la variété samsun.
La biogénèse des composés aromatiques apparaissant comme fortementstimulée durant la réaction d'hypersensibilité du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c à l'égard du virus de la mosaique du Tabac, il est indispensable de résumer brièvement cette voie biosynthétique. D'abord élucidée par DAVIS dans lesmicro-organismes (36) puis établi chez les végétaux supérieurs (50,51,52) elles'est révélée être identique dans les deux cas et à permis de mettre en évidencele rôle fondamental des sucres dans l'élaboration du noyau aromatique.
Les substances phéno1iques peuvent provenir de la dégradation du glucose par deux voies: celle de l'acide shikimique, celle de l'acétate. La plusimportante paraît être celle de l'acide shikimique. Elle tire son origine de lacondensation d'un composé à 4 atomes de carbone appartenant au cycle oxydatif desphospho-pentoses (érythrose-4 phosphate) et d'une unité à 3 atomes de carbone
- 63 -
---'-,-,--'_._-------_.- --'---- -- - -- - -- - "- - - - -~--,_._.,----- - -- - - - - -
1
1]
~...
::~W'."". ~'.'..
l:--~ 01lspd:. de. &hdrt:
FIG.25.C.HROMATOGRAMME' BIDIMENS!DNNEl (bUTANOL E·!1·1ANOt._ .c, .. p·.'.
ACETlOUE A 20/.) D'UN EXTRAIT DE FEUILLEeS VIRDSEES DEN/coéiana SatnstJn
Erylhrose-4- P
Acide cél:o-~
désoxY-3 phO~phO-7 glucoheptonic
t___~ ~Q::H(, ." H
0"'" H'OHA 'cl ..J~h d6H ..CI e Ut:. y 1\)-5 qum'qu~
liOOH
~OOH
-o-P ------------......H:ù
G\ucose NF\OPH~ TABLEAU XXflL NADPt-l~
t NADP~ NADPG\ucose-S-P '- ~6-P-~lvconolactone._--?>Acide 6-P-~luconique.- -~~I:,-__-7'"Pen\:.o:
l ~-G.~Rah., 6'.p_~~énabe. J.~ck~~l'\.o.-.>""
Frud.ose-6-P
At~P..Qno\ pyruvique.
lAcide
pyrwique.
l.AciEyl-Co A }
1 ~Acide~Maltnyl-Co A .. benzoïques
Acide'Ohydrollycinnamiques. ,..Li~nine,
cO\Jn,,~,Jes ~Acid% benwïqu<>s
NHt.1
CH~..-CH-c.oOH CHa,-CO-eOOH
O~OPhènylalanine Acide
phènylpyruvique
Acide':) H v H~
benzoïgue~ !H~ O~:CH
Ac.ide déhydro-5 shikimiqueNADPH~-.jt
NADP~Ieoot{
~fA>~~~~pHo~J~ cH~
J...Acide shikimiqœ ~cide. pho~?
\ €no\pynJVI~\
V
J?OH Jt~~ COOH'c/
Hy: )rHHC'c~H, dH
Acide préphéniqLleVOIES BIOSVNTHETICU E. S PROBA BLES CON DUI5ANT AUX COMPOSES
PHENOllQU~S t:HEZ LE.S VEGETAUX SUPERIEUR~
CH=CH-COOH
O~~----Acide.
cinn;;lmique.
Flavonoïcles.
formée à partir de la voie glyco1ytique (acide phospho-éno1pyruvique) (50,51,152). Il Y a formation de l'acide déhydroshikimique qui est réduit en acide shikimique. Par divers intermédiaires dont l'acide préphénique (voir tableau XXIII)l'acide shikimique donne la phénylalanine (52, 94). Par désarnination de ce substrat (83), il y a formation des nombreux acides hydroxycinnamiques (95,98,111,119,120), du noyau B et des atomes de carbone de l'hétérocyc1e central des f1avonoïdes (29,56,57,58,137). La voie acétate interviendrait pour fournir le noyauA des f1avonoïdes (17,56,138) et pour la synthèse de certains acides benzoïques.Il y aurait utilisation de l'acéty1-coenzyme A et du ma1ony1-coenzyme A commeintermédiaires. Dans ce cas, la synthèse des phénols rappe1erait celle des acidesgras. Les coumarines dérivent des acides cinnamiques par cyc1isation d'un métabolite intermédiaire possédant un hydroxyle situé en position ortho de la chainecarbonée (6,21,22,23,131,132). La plupart de ces auteurs ont montré que les coumarines sont synthétisés sous forme de glucosides, et que les produits hydroxycinnamiques, intermédiaires dans leurs biosynthèses, existent sous forme de glucosides de phénols.
Ainsi, les différentes réactions conduisant à la formation de la scopo1ine (glucoside-7 scopo1étine) dans les feuilles de Tabacs de la variété Hicks(132) sont résumées par le schéma suivant:
- 64 -
mél:hy\at'Ion glucos-.Fica~ion
\-\o~"COO~>CH'O~,COOl<1;'O~" COOH~yla\anine, ..,~ I/:I./. 1~
He HO R-O1 lI. lIt
t- hydroxlJlat ion
R=glucose~ trans _ c:is~ isomèris~tion
CH~O:rcol' "
R-o .....:: 0 ..:0"V
lac.;de ca Fi ique liacide f~ru lique m ëH: ide tral1i_ 91 ucos'ldnFpru liquel'Sl acide crans. hydro"y_2,glucosl?_4- / mé.~hD'X~_5 / cinnamlqueV sc.opDline /"ill ~co po IGl: ine .
Le processus de formation de la scopolétine dans des tissus de Tabaccultivés in vitro et proposé par FRITIG (49) est différent du précédent. Pource dernier, la synthèse préalable et rapide de la scopolétine exclut l'intervention d'un glucoside intermédiaire comme l'acide trans-glucosido-férulique, Lascopoline proviendrait de la glucosidification de la scopolétine libre, D'autrepart, la méthylation précède la cyclisation et doit se faire lorsque les substituants sur le noyau aromatique sont en place,
Les feuilles et les tissus de Tabac cultivé in vitro peuvent avoirpour la scopoline des voies biosynthétiques différentes.
Les acides benzoïques pourraient être également synthétisés à partir del'acide shikimique ou provenir d'une B-oxydation des acides cinnamiques correspondants (9).
- 65 -
La stimulation de la biosynthèse des composés phénoliques dans lesfeuilles nécrosées de Nicotiana tabacum variété xanthi n.c se présente surtoutcomme l'activation des réactions de glucosidification) de méthylation et orthohydroxylation.
l'infection virale à 20 Ocxanthi n.c est l'accumulationd'esters du glucose. Cet apportà des enzymes utilisant comme(34,149). De telles réactionsdésintoxication car l'adminisleur rapide conversion en ces
Glucosidification Une des caractéristiques ded'un Tabac hypersensible de la variétéde phénols sous forme de glucosides etde glucose pourrait être réalisé grâce
glucose de l'uridine diphosphate glucoseêtre considérées comme des mécanismes dede phénols aux plantes saines) résulte endu glucose (18)63)117)118).
donneurpeuventtrationdérivés
Par ailleurs, il a été montré (116) que les esters du glucose commele cinnamyl-l glucose et le para-coumaryl-l glucose peuvent être considérés dansles feuilles de Nicotiana tabacum variété Delcrest comme des intermédiairesdans la biosynthèse des acides para-coumaryl et caféylquiniques. Ces dérivés duglucose sont plus facilement incorporés dans les depsides du quinique que lesacides libres (acides cinnamique,para-coumarique).
Méthylation: La formation des lésions locales nécrotiques s'accompagne également d'une stimulation des réactions de méthylation (production desdérivés de la scopolétine, des acides férulique sinapique et vanillique). Ce phénomène doit être la conséquence dé l'activation de la mé-
thyltransférase. Cet enzyme assurerait le transfert du groupement méthyle probablement sous forme de la S-adénosylméthionine (43,44)69,79,71).Les réactions de méthylation pourraient se dérouler de la manière suivante :
ATP 'fo Méthionin2..S-Ad~nosylméthionine+ Phosphate + Pyrophosphate
S_Adéna.ylmé~hianine... ArOHI.~L Adi?nasylhomory,tpÎno-tArOCH3
Mé thy/transférase.
AT P -= Adénosine tripho.sp hate
Ar :oN oyau benzénique
- 66 -
Ortho-hydroxylation: La présence de composés ortho-hydroxylés (acides orthocoumarique, mélilotique) dans les feuilles nécrosées de Nicotianaxanthi n.c montre que l'hydroxylation de l'acide cinnamique peut sefaire également et exclusivement en position ortho de la chaîne carbonée.
Les données relatives à la biosynthèse de ces substances (20,24,39,73,81) peuvent être résumées selon la séquence suivante
R=g/ucos.e
1lIII.
1 acide trans_cinnëlmOlque IIacide o_cDumariquE' ID" fi.glucoside de
l'acide D. cDumarique lSJ.fio g\uccs'Idt" de \'adde coumarom·,que
V iJcide cou marinique . VI coumarine VJIac.ide cis_c.innamique.
\œIdihydrocD.um.,rine lXacide méliJotique Xj3.glucoside dl'
l'acide mélilotique
- 67 -
Cette augmentation d'activité dans la synthèse des phénols, n'est qu'une conséquence de l'activation du cycle des phospho-pentoses, c'est-à-dire dela stimulation des enzymes appartenant à ce cycle, en particulier des deux déshydrogénases spécifiques (glucose-6 phosphate, 6-phosphogluconate déshydrogénase). Cette voie oxydative fournirait l'érythrose-4 phosphate et le NADPH2(nicotinamide adénine, dinucléotide phosphate) nécessaires à l'élaboration desnoyaux benzénique et indolique. Le coenzyme est nécessaire à la réduction del'acide déhydro-5 shikimique en acide shikimique et à la transformation de lacoumarine en dihydrocoumarine.
Si l'on considère les mécanismes contrôlant la biosynthèse des phénols,ceux-ci sont communs à toutes les voies biogénétiques et font intervenir deuxprocessus; d'abord la répression ou l'induction des systèmes enzymatiques, puisl'inhibition des activités enzymatiques par des métabolites de la chaîne biosynthétique. Dans ce dernier type de régulation, il y a intrication d'inhibitionssuccessives par des produits de la réaction (68,83,155) assurant une auto-régulation par un contrôle dit !là réaction" (feed-back control). L'accumulation denombreux phénols dans les tissus virosés à 20 Oc du N.xanthi n.c pourrait êtreprovoquée par la perte des propriétés régulatrices de ces enzymes allostériquesinvoqués dans leur chaîne biosynthétique.
- 68 -
Cha p ~ t r e 4
Nicotiana xanthi
LE VIRUS
EVOLUTION
TEMPS DES
QUANTITATIVE EN FONCTION DU
COMPOSES PHENOLIQUES DANS DES
N.C l N F E C TES A 20 Oc E T 30 Oc PAR
DE LA MOSAIQUE DU TABAC.
l - RESULTATS EXPERIMENTAUX.
Nous avons vu dans le chapitre précédent que l'hypersensibilité duNicotiana xanthi n.c à l'égard du virus de la mosaïque du Tabac souche commune,s'accompagne d'une accumulation de phénols, tout spécialement d'acide férulyl3 quinique, et de la production de nombreux dérivés du glucose en particulierde férulyl-l glucose et de scopoline.
L'inhibition par la température de la réaction nécrotique d'hypersensibilité permettant au virus de se généraliser dans la plante hôte, se traduitégalement par la disparition de ces substances.
Les travaux entrepris dans le laboratoire ont montré que l'arrêt dela multiplication du virus à 20 Oc n'était pas dû comme on le croyait antérieurement à la formation d'une barrière de cellules mortes, mais bien à un arrêtdes processus métaboliques qui conduisent le~ cellules vivantes à produire denouveaux virions ; en plaçant les plantes à 30 Oc on lève donc ce pouvoir inhibiteur de la multiplication virale.
Il nous a donc paru intéressant de rechercher les liens, s'il en existe, entre métabolisme des phénols, répression de la synthèse virale et température. Nous avons alors procédé en fonction du temps à une estimation quantitative des phénols totaux, puis à des dosages séparés des principaux phénols purifiés par chromatographie sur papier (acide chlorogéniques, rutine et nicotiflorine, acide para-coumaryl-3 quinique, acide férulylquiniques, férulyl-l glucose, scopoline) dans les feuilles saines et virosées à 20 Oc et 30 Oc des Tabacs de la variété xanthi n.c.
Les méthodes expérimentales ont été décrites dans le chapitre deux.
- 69 -
Les résultats sont donnés en mg par 100 grammes de poids frais pourles phénols totaux, et en ~g par gramme de poids frais pour les diverses substances séparées et purifiées par chromatographie. Enfin, précisons que nos résultats sont également exprimés pour les phénols totaux, les acides chlorogéniques et les flavonosides en % de la teneur du témoin.
Par exemple, pour l'acide chlorogénique nous aurons
teneur en acide chlorogénique de la plante maladex 100
teneur en acide chlorogénique de la plante sa~ne
A - E v 0 l u t i 0 n d.8 5 t 8 n 8 urs 8 n p h é n 0 l 5
t 0 t a u x 8 t 8 n p r i n C i p a u x p h é n 0 l 5 a u
C 0 urs d 8 l,
i n f 8 C t i 0 n v i r a l 8 à 20 Ocd u Nicotiana xanthi n.c
1.- Phénols totaux.
L'infection à 20 Oc du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c par le virus de la mosaïque du Tabac conduit à une augmentation des composés phénoliquestotaux (tableau XXIV, figures 26, 27). L'accroissement est considérable lors deséjours compris entre 60 heures et 120 heures à 20 oC. Ce phénomène diminue progressivement et à partir d'un temps de 204 heures à 20 oC, les plantes sainestémoins renferment plus de phénols totaux que lés Tabacs infectés correspondants(136).
2.- Principaux phénols.
a. Acides chlorogéniques Comme nous le voyons (tableau XXV, figures 28, 29)les Tabacs virosés qui séjournent à 20 Oc entre 60 et 144 heures aprèsinoculation, ont des teneurs en acides chlorogéniques beaucoup plusélevées que les Tabacs sains correspondants (elles peuvent être plus
du double 108 heures après inoculation). A partir d'un temps de 168 heures à20 oC, l'augmentation est moins importante, et les mesures établies sur dès Tabacs récoltés en février 1968 ont montré que ces acides subissaierlt une certainediminution par rapport aux mêmes substances contenues dans les plantes sainestémoins.
b. Rutine, nicotiflorine: Les courbes enregistrées avec la rutine et la n~co
florine (tableau XXVI et figures 30,31) sont similaires à celles établies pour les acides chlorogéniques. L'accumulation est considérablepour des Tabacs ayant séjourné à 20 Oc entre 60 heures et 120 heures.
Les teneurs en ces flavonosides peuvent être le double 72 heures après inoculation dans les feuilles virosées à 20 Oc de N.xanthi n.c.
c. Acides para-coumaryl et férulylquiniques: Le Nicotiana xanthi 'n.c inoculéavec le virus de la mosaïque du Tabac, réagit à 20 oC, en accumulant
- 70 -
l'acide para-coumaryl-3 qu~n~que mais surtout les acides férulylquiniques tout particulièrement l'acide férulyl-3 quinique.
Après examen des résultats rassemblés dans le tableau XXVII et illustrés par la figure 32, la teneur en ce dernier acide paraît être maximale aucours d'un séjour de lOS heures à 20 Oc après inoculation (120 ~g par grammede poids frais), elle décroît ensuite tout en restant relativement élevée (70 ~g
par gramme de poids frais).
L'acide para-coumaryl-3 quinique semble surtout s'accumuler dans lesfeuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c ayant séjourné à 20 Oc entre 60 etlOS heures après inoculation, puisqu'il atteint une teneur voisine de 100 ~g pargramme de poids frais (tableau XXVIII et figure 33).
d. Férulyl-l glucose et scopoline: Le férulyl-1 glucose et la scopoline nesont jamais détectés dans les extraits de feuilles saines de N.xanthin.c. Le férulylglucose commence à apparaître (tableau XXIX et figure34), dans les Tabacs virosés ayant passé 72 heures à 20 Oc après ino-
culation par le virus, c'est-à-dire lorsque les lésions locales sont très nettement apparentes. La scopoline est synthétisée un peu avant, car elle est identifiée dès 4S heures après l'inoculation (voir tableau XXX et figure 35).
La teneur en férulylglucose augmente régulièrement et est maximalepour des séjours à 20 Oc compris entre 120 et 156 heures (75 ~g par gramme depoids frais). Quant à la scopoline, son maximum semble être atteint dans uneplante malade ayant passé lOS heures à 20 Oc après inoculation (50 ~g par grammede poids frais).
- 71 -
EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET EN PRINCIPAUX PHENOLS AU COURS DE
L~INFECTION VIRALE A 20 Oc DUNicotiana xanthi n.c.
- Phénols totaux (tableau XXIV, figures 26 et 27) ;- Acides chIorogéniques (tableau XXV, figures 28 et 29) ;- Flavonosides (rutine, nicotiflorine) (tableau XXVI, figures 30 et 31)- Acides férulylquiniques (tableau XXVII, figure 32) ;- Acide para-coumarylquinique (tableau ~III, figure 33) ;- Férulyl-l glucose (tableau XXIX, figure 34) ;- Scopoline (tableau XXX, figure 35).
En trait plein
En pointillé
plantes saines • • février 1968, 0 0 avril 1968.
plantes virosées ~----Â février 1968,x-------x Avril 1968.
X.V.S.
X.V.M.T.
Nicotiana xanthi n.c, sain, à l'état gégétatif.
Nicotiana xanthi n.c, virosé, à l'état végétatif.
- 72 -
TABLEAU XXIV
Evolution des teneurs en phénols totaux au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en mg d'acide chlorogénique par 100 grammes de poids frais).
Février 1968 Avril 1968~
XVS - 24 h à 20 Oc 100 71 ,25XVMT - 24 h à 20 Oc 78,75 62,50
XVS - 30 h à 20 Oc 71,25XVMT - 30 h à 20 Oc 77 ,50
XVS - 36 h à 20 Oc 71,25XVMT - 36 h à 20 Oc 87,50
XVS - 48 h à 20 Oc 78,75 71,25XVNT - 48 h à 20 Oc 100 95
XVS - 54 h à 20 Oc 71,25XVMT- 54 h. à 20 Oc 100
XVS - 60 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVl1T - 60 h à 20 Oc 150 100
XVS - 66 h à 20 Oc 71,25XVMT- 66 h à 20 Oc 100
XVS - 72h à 20 Oc 115 71 ,25XVMT - 72h à 20 Oc 153,75 107,50
XVS - 84 h à 20 Oc 95 75XVMT - 84 h à 20 Oc 132,50 115
XVS - 96 h à 20 Oc 93,75 75XVMT - 96 h à 20 Oc 128,75 115
XVS - 108 h à 20 Oc 86,25 75XVMT - 108 h à 20 Oc 128,75 118,75
XVS - 120 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVMT - 120 h à 20 Oc 128,75 107,50
XVS - 132 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVMT- 132 h à 20 Oc 118,75 100
XVS - 144 h à 20 Oc 78,75 71,25XVMT - 144 h à 20 Oc 102,50 90
XVS - 156 h à 20 Oc 78,75 75XVMT- 156 h à 20 Oc 90 90
XVS - 168 h à 20 Oc 75XVMT- 168 h à 20 Oc 90
- 73 -
(suite du tableau XXIV)
xvs - 180 h à 20 Oc 107,50 75XVMT- 180 h à 20 Oc 118,75 87,50
XVS - 192 h à 20 Oc 90 75XVMT - 192 h à 20 Oc 93,75 80
XVS - 204 h à 20 Oc 75XVMT- 204 h à 20 Oc 65
XVS - 216 h à 20 Oc 107,50 75XVMT- 216 h à 20 Oc 71,25 67,50
- 74 -
Pheno\s totaux
Q ~n mg I~OO 9 dE poidc; fra', s.
.... --_...,, ,l "
l ,
" , 'A-I --- ..-- --A-- --A...
1 ......1 .....
l ' ...
" ,,,Y.- --_x ~----x-- --x----x, ' .... ,A ,l(--)(- 'K ',A" ,-.......... :>' .... ..... "" ........... """ '''X---~''''1~~--
50
14-4 . 1b& 192 'l.16
temps e.n heures à 20 0 c1209671.4-8
të1pparition macro~c.opiQuE' de la n~c.rol)e
o
FI G.2.6. E VaLU TIaN OES TENEURS EN PHEt-lOL S TOTAUX AU COURS DE
L' 1NfECTION. VIRALE A 20 0 C. DU NicotÎana Xanthi n.c.PAR LE VIRUS DE LA MDSA'Ù~UE" DU TABAC
,,'
,phénols: totaux
[
teneu r 'i'.m~ \ade.
sam
"X"." ,/ "1 ~ /"
1 \, -)(- - - -)C' ",, \ ,x- - - ,""-, Je ...1 \, ".......
:')(.--)li; --.,..(, ... A- ,," " ....x,",y..','" 'a...............- ....Â" ""Â.... ",
,.' , '... "~"," ~& ' .....~ ........ '- x~~ .. ~
,j; l " ~... - ---lt-_, , " --x...1 " • )i ... __ ..........
j.. La b ac - ....1,/ l:. 5; ë)l n .............. _---l,10{l+;,'--:"/'--------------------------~=---____',J~,"---
1 " "J l '~,,__ ---lC
T/' Ç',
.~ "",
a.
o 21- 48 7f. 961
-'I/ff -'lbS -192. 2.16I:lZmps en heur&!s j lO°c.
FIC·2.7 TENEUR EN PHENOLS TOTAUX DES Tl;'SU.s MALADE'S/ EXPRIMEE
EN POUCENTAGE DE LA TENEUR DU TEMOIN.
TABLEAU XXV
Evolution des teneurs en acides chlorogéniques au cours de l'infectionvirale à 20 Oc deNicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g pargramme de poids frais).
Février 1968 Avril 1968
XVS - 24 h à 20 Oc 145 100XVMT - 24 h à 20 Oc 107,50 85
XVS - 30 H à 20 Oc 95XVMT - 30 h à 20 Oc 120
XVS - 36 h à 20 Oc 95XVMT - 36 h à 20 Oc 125
XVS - 48 h à 20 Oc 150 95XVMT - 48 h à 20 Oc 215 137,50
XVS - 54 h à 20 Oc 100XVMT- 54 h à 20 Oc 150
XVS - 60 h à 20 Oc 165 95XVMT - 60 h à 20 Oc 320 170
XVS - 66 h à 20 Oc 95XVMT - 66 h à 20 Oc 185
XVS - 72h à 20 Oc 200 95XVMT - 72h à 20 Oc 350 207,50
XVS - 84 h à 20 Oc 130 100XVMT- 84 h à 20 Oc 292,50 232,50 _
XVS - 96 h à 20 Oc 130 95XVMT - 96 h à 20 Oc 270 215
XVS - 108 h à 20 Oc 145 100XVMT- 108 h à 20 Oc 300 250
XVS - 120-h à 20 Oc 122,50 95XVMT - 120 h à 20 Oc 230 215
XVS - 132 h à 20 Oc 115 100XVMT- 132 h à 20 Oc 200 192,50
XVS - 144 h à 20 Oc 100 100XVMT - 144 h à 20 Oc 165 180
XVS - 156 h. à 20 Oc 130 100XVMT- 156 h à 20 Oc 180 150
XVS - 168 h à 20 Oc 100XVMT- 168 h à 20 Oc 130
XVS - 180 h à 20 Oc 130 100XVMT- 180 h à 10 Oc 115 122,50
- 75 -
(suite du tableau XXV)
xvs - 192 h à 20 Oc 122,50 95XVMT- 192 h à 20 Oc 100 120
XVS - 204 h à 20 Oc 95XVMT - 204 h à 20 Oc 115
XVS - 216 h à 20 Oc 122,50 95XVMT - 216 h à 20 Oc 87,50 107,50
- 76 -
9 En fL9 1 9 de poids frai~
,Ac:ide~ c:hlorogl2niquE's
11
111111111 .
11
1,.i1,
11,,
11
11,
11
11
11
11
1 .-1 ,.-.'
l 'lt"l ,
1 1
11
,"<>--o-~CY,11
•, 1
" 1, \, \,, \, \" \1. \1 \ ,1 \1 \1 \ ,~
\ , \Il,, 1 \
, " \" 1 \
" \
''If \\\\
K \, \ \1 \ \
l , \
1 -",'(, 1 \ ...l' , \ \,
l ',,' \ \, , 1 \ ,
, ~ )4 ,, , ,~ " \, , ,
, , Al , \
l 'x \l '~
\' ..., 'X. ..
\ ' ",' \\ \, \
~\ \
\ '., \)(. ," \, ,
" \, ,
50 ·cI·
mac.ro!iCopiqUl2 de la n~crose'
o
iëlppcJrition
48 S6 1iO 144 '\6e ,\Q'l ~\G
temps en h e.ure.s ~ 20°C.
FIG.28 EV 0 LU TID N DES TENEUR S E.N ACt DES CHLORO()ENIQLlE5 AU[OURS DE L'INFECTION VIRALE A iD°c. DU Nicatiana 'X_nthi n. C.PAR LE \JI RU & DE LA MOSAIQUE DU TABAC.
[
teneur % ~mal~dE 100
sain .
, x---_*" _--x"
Ac.ides chlarogéniqLle'S:
X 1
VÂ
,l',, ,, , .l ,
.... ')( ......... ~ // "/'... ')c. ~
" r-,,/-" '1 , \, 1 .. ,'l'' \1 l '6---.., "
" l ',\
lA,/, " ',~,," 1 .....
1 " , " ........1 J.. " .... )(.
(' ~ '. '1 1 ..... "1 1 ..... ,
1 l , \1 1 \ \, , , \
1 )/, , )(,1 / ' ,.' , ,,,;Y: 'A., "
.. , 'j..-- l " ')(,_)(:' 1 -1 l '
1 l '1 1 • "
1 " 1= lilb ac sai n '\-r00+-f/--:.I----------------------------=':..--------1 1
1 ,,
Sn
macroc;caplqUl&J de ta nécro'il!
o 48 , 72 96 120 144 "1&8 19ïre.mpli en hQur<zs
FIG. 29 TENEUR EN ACIDES CHLDR06ENIQUES DE.S il55U5 MALADE~
EXPRIMEE E.N POURCENTAGE DE LA TENEUR DU TEMOIN.
TABLEAU XXVI
Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine au cours de l'infectionvirale à 20 Oc du" Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en Vg par gramme de poids frais).
Février 1968 Avril 1968
xvs - 24 h à 20 Oc 68,75 46,25XVMT - 24 h à 20 Oc 46,25 35
xvs - 30 h à 20 Oc 43,75XVMT - 30 h à 20 Oc 48,75
XVS - 36 h à 20 Oc 43,75XVMT - 36 h à 20 Oc 48,75
xvs - 48 h à 20 Oc 53,75 41,25XVMT - 48 h à 20 Oc 75 57,50
XVS - 54 h à 20 Oc 43,75XVMT - 54 h à 20 Oc 71 ,25
XVS - 60 h à 20 Oc 62,50 41,25XVMT - 60 h à 20 Oc 107,50 80
XVS - 66 h à 20 Oc 41,25XVMT- 66 h à 20 Oc 80
XVS - 72h à 20 Oc 90 . 43,75XVMT - 72h à 20 Oc 213,75 90
xvs - 84 h à 20 Oc 62,50 43,75XVMT- 84 h à 20 Oc 151 ,25 98,75
XVS - 96 h à 20 Oc 62,50 43,75XVMT- 96 h 0 20 Oc 151 ,25 90
XVS - 108 h à 20 Oc 57,50 43,75XVMT - 108 h à 20 Oc 151 ,25 102,50
XVS - 120 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT- 120 h à 20 Oc 90 80
XVS - 132 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT- 132 h à 20 Oc 85 71 ,25
XVS - 144 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT - 144 h à 20 Oc 75 71 ,25
XVS - 156 h à 20 Oc 48,75 46,25XVMT - 156 h à 20 Oc 62,50 73,76
XVS - 168 h à 20 Oc 43,75XVMT - 168 h à 20 Oc 53,75
- 77 -
(suite du tableau XXVI)
xvs - 180 II à 20 Oc 48,75 43,75XVMT - 180 hà 20 Oc 53,75 48,75
xvs - 192 II à 20 Oc 53,75 43,75XVMT - 192 II à 20 Oc 50 48,75
xvs - 204 h à 20 Oc 43,75XVMT - 204 h à 20 Oc 48,75
XVs - 216 h à 20 Oc 57,50 43,75XVMT - 216 h à 20 Oc 46,25 43,75
78 -
tl,, \, ,; \ Rutine/~ficot\florine, \
1 \, ,l ,l ,
l ', \
/ ~----.----A, ,: \l ,l ,
l ,/ ,: ,, ,. \
,li. \_ _ ~__ J'JI" \
... - " \;,,"Itr ........"'X,,,/ , •
,. , - ........-,X -A,
............ .... .............x Â, ... --X',- - - -X;-.......... '
" '.'-~""50 'x-- ::~- _~/~~-~....-o---er---1I)---o---o----o------e)---o---=:!====o:==:j;::=..::-:..:-~~t::;.=-,:-.:-.;-.;--=--=-~
/ - -'x
mac.roscop\que de \anÉc.ro~e
EVOLUTION DES TENEUR.~ EN RUT1NE ET NICOTIFLDR\NE" DE
AU COURS DE LOINFECTtON VIl\ALE A "l.O°c. DU Nit:otiana.....rt3nch/ noc 0 PAR LE VI~US DE LA MOSAïQUE. DU TABAC.
H iapparition
f: 1G. 30
49 96 19.0 144 "ôe, 19t 2\6tpmp5 en heures d 20°C
[
I:~neur % ]mal~d[? 100sain
..; \
, 1/ 1, ,
...""L A' "1 J\ 1
, .1l ,"', l '\1
1 '''' 1 ..1 /' , l ,.1, ',1 , \1 / 'y.I l '"1;1. l,
1 ' l ,1!0--+ 'II l ,1 1 \ ,
1 1 l ,1 1 l ,
1 1 l '
:~ ~ \~/ -',~----)C----)C/1 , ,
~ ... ," ... ,'1 ... ,~ ... \
,:.. '&, \
" ''6... 'I~' .............~,
/1 ...........
" ~vAy..--1., Labac' '~-_.X---...)(l , l: =sai n ... " ..... "
J " "'X
~- -" ........... -.......l '
l 'l '1
1 11
~'•
100
60
"144. 16B 19i. ~16
tempç en heUT~S :a 2.0°C"l'La967i.48i
appari t'IO n mac:roscop Ique dG' la nécrosl?
()
FIC:; • 31 TENEUR EN RUTINE ET EN NICOT1'flORtNE DES "15SU~
MALADE~, E"PRIMEE EN POURCENTAC:>E DE LA TENEUR OU TEMOIN
TABLEAU XXVII
Evolution des teneurs en acides férulylquiniques au cours de l'infection virale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs expriméesen ~g par gramme de poids frais).
Février 1968 Avril 1968
xvs - 24 h à 20 Oc 7,50 10XVMT - 24 h à 20 Oc 25 23,75
xvs - 30 h à 20 Oc 10XVMT- 30 h à 20 Oc 40
xvs - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 20 Oc 40
xvs - 48 h à 20 Oc 10 10XVMT - 48 h à 20 Oc 55 53,75
xvs - 54 h à 20 Oc 10XVMT - 54 h à 20 Oc 63,75
xvs - 60 h à 20 Oc 10 10XVMT- 60 h à 20 Oc 70 n,50
xvs - 66 IL à 20 Oc 10XVHT - 66 h à 20 Oc n,50
xvs - 12 h à 20 Oc 10 10XVMT - 12 h à 20 Oc 80 82,50
xvs - 84 h à 2.0 Oc 10 10XVMT- 84 h à 20 Oc 80 87,50
xvs - 96 h à 20 Oc 10 10XVMT- 96 h à 20 Oc 85 87,50
xvs - 108 h à 20 Oc 10 10XVMT- 108 h à 20 Oc 120 110
xvs - 120 h à 20 Oc 10 10XVHT - 120 h à 20 Oc 90 92,50
xvs - 132 h à 20 Oc 10 10XVMT - D2 h à 20 Oc 73,75 92,50
xvs - 144 h à 20 Oc 10 10XVMT - 144 h à 20 Oc 70 92,50
xvs - 156 h à 20 Oc 10 10XVMT - 156 h à 20 Oc 67,50 82,50
XVS - 168 h à 20 Oc 10XVMT - 168 h à 20 Oc 82,50
- 79 -
(suite du tableau XXVII)
xvs - 180 h à 20 Oc 13,75 10XVMT- 180 h à 20 Oc 62,50 77,75
XVS - 192 h à 20 Oc 10XVMT- 192 h à 20 Oc 77 ,50
XVS - 204 h à 20 Oc 10XVMT - 204 h à 20 Oc 77 ,50
XVS - 216 h à 20 Oc 13,75 10XVMT - 216 h à 20 Oc 62,50 77 ,50
- 80 -
Ac i des ~ru l ':} Iqu'miques
Qe.n fi9/9 de poicl~ frais
,Ii..l '
1,'1"\'/ " \
/, ...." ./1 '1---~ - - -x,
_--x----x'/ " .............." .... )(.- " '" x-----x.................
... " ... 4 &- ""'lC.- )( ---4<-----x,,'1. ......... ----4~ ... - ----. _
~' ....... 4 .... A" ........,l:: ...........
~o #~~'
"/0.--:)'/1 .
1 .-
=~=~~=~o f4 48 72 96 -120 1+4 -168 192. 2-16
apparitiol1 m;acro5cDpique de la nÉcrQs;e
~IG.32, EVOLUTION DES TENEURS EN ACIDES FERULY1.QUINIÇUES
AU COURS DE L'INFECTION VIRALE A 2.0·' DUN/"Cocian~ J(.;>nthin.cPPtR LE' '1IRUS OE LA MOSA/'OUE DU rABAC
TABLEAU XXVIII
Evàlution des teneurs en acide para-coumarylquinique au cours de l'infection virale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g
par gramme de poids frais).
Février 1968 Avril 1968
xvs - 24 hà 20 Oc 7,50 12,50XVMT - 24 hà 20 Oc 27,50 22,50
XVS - 30 h à 20 Oc 12,50XVMT - 30 h à 20 Oc 31,25
XVS - 36 h à 20 Oc 12,50XVMT - 36 h à 20 Oc 50
XVS - 48 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 48 h à 20 Oc 63,75 65
XVS - 54 h à 20 Oc 12,50
lfVMT - 54 h à 20 Oc 76,25'1
XVS - 60 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 60 h à 20 Oc 81,25 82,50
XVS - 72 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 72 h à 20 Oc 93,75 100
XVS - 84 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 84 h à 20 Oc 81,25 100
XVS - 96 hà 20 Oc 10 12,50XVMT - 96 h à 20 Oc 75 100
XVS - 108 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 108 h à 20 Oc 81,25 106,25
XVS - 120 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 120 h à 20 Oc 63,75 88,75
XVS - 132 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 132 h à 20 Oc 57,50 76,25
XVS - 144 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 144 h à 20 Oc 57,50 76,25
XVS - 156 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT- 156 h à 20 Oc 52,50 76,25
XVS - 168 h à 20 Oc 12,50XVMT - 168 h à 20 Oc 70
XVS - 180 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 180 h à 20 Oc 52,50 70
~ 81 -
(suite du tableau XXVIII)
xvs - 192 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 192 h à 20 Oc 46,25 65
XVS - 204 h à 20 Oc 12,50XVMT - 204 h à 20 Oc 65
XVS - 216 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 216 h à 20 Oc 46,25 65
- 82 -
· Acide p_coumar~/_3 qUlnlquE.
Qen )J- 9 tg de poid, frais
- -l(...-- -lC----X
...........-- - - - -- ......
1 1~44 ~69 19i 216lemp5 Qn h~ures à 20°C
-1îO1
96724Bf~ iapp arÎ bon mac.roscoplque de \a nécrose
EVOLUTION DES TE'NEUR5 EN ACIDE PARA._COUMARYL_3 ÇUIN\QUEAU [OURS DE L'INFECTION VIRALE A 2..0o C DU Nicot.iana xant.hin.
e
PAR LE V/RU':! DE LA MOSA\QUE DU TABAC
TABLEAU XXIX
Evolution des teneurs en férulylglucose au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g par gramme depoids frais) .
Février 1968 Avril 1968
XVS - 24 h à 20 OcXVJ.vIT - 24 h à 20 Oc
XVS - 48 h à 20 OcXVMT - 48 h à 20 Oc
XVS - 60 h à 20 OcXVMT - 60 h à 20 Oc 10
XVS - 72h à 20 OcXVMT - 72h à 20 Oc 25 25
XVS - 84 h à 20 OcXVJ.vlT - 84 h à 20 Oc 37,50 40
XVS - 96 h à 20 OcXVMT - 96 h à 20 Oc 43,75 56,25
XVS - 108 h à 20 OcXVHT - 108 h à 20 Oc 52,50 68,75
XVS - 120 h à 20 OcXVMT - 120 h à 20 Oc 62,50 72,50
XVS - 132 h à 20 OcXVMT - 132 h à 20 Oc 67,50 72,50
XVS - 144 h à 20 OcXVMT - 144 h à 20 Oc 70 72,50
XVS - 156 h à 20 OcXVMT - 156 h à 20 Oc 75 68,75
XVS - 168 h à 20 OcXVMT - 168 h à 20 Oc 62,50
XVS - 180 h à 20 OcXVMT - 180 h à 20 Oc 62,50 58,75
XVS - 192 h à 20 OcXVMT - 192 h à 20 Oc 62,50 56,25
XVS - 216 h à 20 OcXVMT - 216 h à 20 Oc 52,50 56,25
-,83 -
Q~n f-S/g de. poids frais
50
-:JC )(_---~ __ - Â __
~~ ... -- _-4---- - --x...._:: ... _,',Â-- -x-_ -4----40__
, ,. --x- --y..' " ---)(-- --)(~--X" .~ --a
'" -,," ,"" .... ';'~ ..,.'
k"',~,
, '"/f... '/,
~'
Iv"'""'~/
o 24 1 4B 72. 96 -12.0
apparition macroscopiquE de la nécrose
1
144 168 1~2. 216
te.mps Q. n heures à 20° C.
FIB.34 EVOLUTION DES TENEURS EN FERULYL _1 GLUCOSEAU COURS DE L'INFECTION VIRALE A.2DoC DUNicot/ana ){anCh/n.e.. PAR lEVIRUS DELAMD5AïoUEDU TABAC. •
TABLEAU XXX
Evolution des teneurs en scopoline au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g par grammede poids frais).
Avril 1968
xvs - 36 h à 20 OcXVMT - 36 h à 20 Ocxvs - 48 h à 20 OcXVMT - 48 h à 20 Oc 13,75
xvs - 54 h à 20 OcXVMT - 54 h à 20 Oc 15
xvs - 60 h à 20 OcXVMT - : 60 h à 20 Oc 17,50
xvs - 66 h à 20 OcXVMT - 66 h à 20 Oc 20
xvs - 72h à 20 OcXVMT- 72h à 20 Oc 25
xvs - 84 h à 20 OcXVMT - 84 h à 20 Oc 35
xvs - 96 h à 20 OcXVMT - 96 h à 20 Oc 35
xvs - 108 h à 20 OcXVMT - 108 h à 20 Oc 47,50
xvs - 120 h à 20 OcXVMT - 120 h à 20 Oc 45
xvs - 132 h à 20 OcXVMT - 132 h à 20 Oc 45
xvs - 144 h à 20 OcXVMT - 144 h à 20 Oc 45
xvs - 156 h à 20 OcXVMT- 156 h à 20 Oc 37,50
xvs - 168 h à 20 OcXVMT - 168 h à 20 Oc 35
xvs - 180 h à 20 OcXVMT - 180 h à 20 Oc 32,50
xvs - 192 h à 20 OcXVMT - 192 h à 20 Oc 32,50
- 84 -
(suite du tableau XXX)
XVS 204 h à 20 OcXVMT - 204 h à 20 OcXVS 216 h à. 20 OcXVMT - 216 h à 20 Oc
- 85 -
32,50
32,50
9·Q.n f9 1 9 d2. poids fra·ls.Scopoléti ne..
50...Jl-----x - -- -l( -- --li",," ,
~~ ~"~----_v".,)( W ,..----)(---->c----,)(----l(
,1'.... 'li'''''
lI-_ll.--lC.--
",,"
()
f~ i 48 . 7L d \ .96 ..
apparition macroscoplqul1 e a necrose
1Z0 144 -168 -192 216
te.mps e.n heures; ~ 20"'c
EVOLUTION DE.S TENEURS eN S(OPDL~ï/NE' AU COURS DE L'INfECTIONVIRALE A 2.0'" Co DU NI'coL"iana ;XéJncni n.c.. PAR LE V/RUS DE..LA MQSA/DUE DU TABAC..
3.- Conclusions.
L'accumulation et la production de composés phénoliques dans les feuilles des Tabacs de la variété xanthi n.c virosées à 20 Oc par le virus de la mosaïque du Tabac souclle commune semblent être postérieures, à l'apparition de lanécrose. Celle-ci commence à apparaître dès 36 heures après inoculation dans nosconditions expérimentales. Les différences à 20 Oc entre plantes saines et malades deviennent importantes quand les symptômes sont nettement apparents, c'està-dire quand la synthèse du virus est pratiquement achevée, et que l'hypersensibilité est acquise. Ces variations maximales entre 60 heures et 156 heures tendent ensuite à s'estomper pour la plupart des composés phénoliques.
B - E v 0 l u t i o n d e 5 t 8 n e urs e n p h é n o l s
t o t a u x e t e n p r i n c i p a u x P h é n 0 l 5 a u
c o u r 5 d e l • i n f 8 C t i o n v i r a l e à 3D Ocd u Nicotiana xanthi n.c
1.- Phénols totaux.
Après exàmen des résultats résumés dans le tableau XXXI et illustréspar les figures 36, 37, 38 et 39, nous constatons que l'infection virale à 30 Ocdu N.tabacum variété xanthi n.c conduit à une importante diminution des teneursen phénols totaux. Cette réduction (de 10 à 30 %) est surtout observée dans desTabacs malades ayant séjourné à 30 Oc entre 36 heures et 156 heures après inoculation. Ce phénomène diminue progressivement, et, à partir d'un temps de 180heures à 30 oC, la plupart des plantes virosées ont des teneurs en phénols totaux supérieures à celles des Tabacs témoins.
2.- Principaux phénols.
L'infection ne fait apparaître ni le férulyl-1 glucose ni la scopolineet ne s'accompagne pas de l'accumulation des acides para-coumaryl et férulylquiniques.
Les courbes obtenues avec les acides chlorogéniques (tableau XXXII,figures 40, 41, 42, et 43) et les flavonosides (tableau XXXIII, figures 44,45,46, et 47) sont semblables, et mettent en évidence une diminution considérabledes teneurs en ces polyphénols dans les plantes malades lors de séjours à 30 Occompris entre 36 et 156 heures.
La baisse que nous observons pour les acides caféylquiniques dans unNicotiana xanthi n.c virosé à 30 Oc et ayant passé 72 heures à 30 Oc à cette température après inoculation, atteint par rapport à la plante saine témoin une valeur voisine de 40 %. Dans les mêmes conditions, la diminution que nous constatons pour les flavonosides est sensiblement de même ordre (30 à 40 %).
A partir d'un temps de séjour de 204 heures à 30 Oc après inoculationpar le virus, les Tabacs malades renferment des quantités d'acides chlorogéniques
- 86 -
et de flavonosides plus élevées que les plantes saines correspondantes (tauxd'augmentation pouvant atteindre 20 %).
Les dosages établis en mai 1969 ont également mis en évidence une certaine diminution des acides chlorogéniques mais surtout des flavonosides (rutineet nicotiflorine) dans les plantes saines témoins au cours d'un séjour à 30 oC.
87 -
EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET EN PRINCIPAUX PHENOLS AU COURS DE
L'INFECTION VIRALE A 30 Oc DUNicotiana xanthi n.c.
- Phénols totaux (tableau XXXI, figures 36,37,38 et 39) ;- Acides chI orogéniques (tableau XXXII, figures 40,41,42, et 43)- Flavonosides (tableau XXXIII, figures 44,45,46, et 47).
En trait plein
En pointillé
plantes saines. • mai 1969, 00 février 1970"
plantes virosées .À.-- .À. mai, 1969 )(-----xfévrier 1970
- 88 -
TABLEAU XXXI
Evolution des teneurs en phénols totaux au cours de l'infection viraleà 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g d'acide chlorogénique par 100 grammes de poids frais).
Mai 1969 Février 1969
xvs - 30 h à 30 Oc 90XVMT - 30 h à 30 Oc 90
xvs - 36 h à 30 Oc 96,25 70XVHT - 36 h à 30 Oc 96,25 66,25
xvs - 48 h à 30 Oc 96,25 53,75XVMT - 48 h à 30 Oc 78,75 46,25
xvs - 54 h à 30 Oc 92,50 53,75XVHT- 54 h à 30 Oc 78,75 45
xvs - 60 h à 30 Oc 101 ,25 80XVHT - 60 h à 30 Oc 83,75 61,25
xvs - 72 h à 30 Oc 103,75 61,25XVMT - 72 h à 30 Oc 82,50 53,75
xvs - 84 h à 30 Oc 83,75 61,25XVHT- 84 h à 30 Oc 70 41,25
xvs - 96 h à 30 Oc 95 66,25XVMT - 96 h à 30 Oc 76,25 42,50
"xvs - 108 h à 30 Oc 87,50 75XVMT - 108 h à 30 Oc 57,50 55
xvs - 120 h à 30 Oc 85 66,25XVHT- 120 h à 30 Oc 67,50 53,75
xvs - 123 h à 30 Oc 96,25XVHT- 123 h à 30 Oc 71,25
xvs - 144 h à 30 Oc 87,50 71 ,25XVMT - 144 h à 30 Oc 82,50 58,75
xvs - 156 h à 30 Oc 82,50 75XVHT - 156 h à 30 Oc 82,50 63,75
xvs - 168 h à 30 Oc 83,75 53,75XVMT - 168 h à 30 Oc 90 53,75
xvs - 180 h à 30 Oc .91,25 70XVHT - 180 h à 30 Oc 103,75 58,75
xvs - 192 h à 30 Oc 82,50 61,25XVHT- 192 h à 30 Oc 98,75 80
- 89 -
(suite du tableau ~XI)
XVS - 204 h à 30 Oc 71 ,25 66XVMT - 204 h à 30 Oc 90 70
XVS - 216 h à 30 Oc 71 ,25 53,75XVMT - 216 h à 30 Oc 96.25 53.75
XVS - 240 h à 30 Oc 80XVMT - 240 h à 30 Oc 90
XVS - 288 h à 30 Oc 70XVMT - 288 h à 30 Oc 75
XVS - 336 h à 30 Oc 98,75 52,50XVMT - 336 h à 30 Oc 90 53,75
XVS - 384 h à 30 Oc 96,25 62,50XVMT - 384 h à 30 Oc 110 68
XVS - 408 h à 30 Oc 87,50XVMT - 408 h à 30 Oc 80
XVS - 432 h à 30 Oc 92.50XVMT - 432 h à 30 Oc 90
XVS - 456 h à 30 Oc 82,50 62,50XVMT - 456 h à 30 Oc 95 63,75
.,... 90 -
phénols totaux
-', ....... _- .............•
Q en mgl10D 9 de poids frais
1 ~.,- """ ~"----6
.... "6--"" ''-'-, ..-"_~' ......- ., ,
" ,,1Jt'", ...~... '"
50
50
-l'Le9&---.---~----'-__r--~-.__-'r_-_._-_.___-___.-_.-~-____,-_.,r_-._-_.__-_._-~-_, 2-16
temps en heures à 30°C.
FIG.36 EVOLUTION DE~ TENEURS rN PHENOL!) TOTAUX AU COURS DE L'INFEtTlON
VIRALE A 30° C DU Nicoêian;l Xélnthln~PAR LE" VIRUS DE LA MD5Aïlf}UE'
DU TABAC.
[tEneur 0/., J
malade 100s.ain •
50
204· 42. 110-,2.16
144 l::.amps En h Q.ures à 3D' C
~I G. 37 TENEUR FN PHENOLS TOTAU~ DES TISSUS MALADES EXPRIMEE
EN POURCENTA6E DE' LA TENEUR OU TEMOIN
Q en mg/100 g dE' poids frais ph éno\ s totëlux;À
,,' \" ," ,,
50
50
,.X,-- _
o 4 El 81
-1~ ~emps e.n jours à 30°C
FIG.3S EVOLUTION DES TENEURS EN PHE NOL5 TO'Hm" AU COUBIi DE' L'INFECTIONVIRALE A .30" C DU N/t:()l"iana Xanrhi n.~. PAR. lE' VIRUS
DE LA MaSAI QUE' ou TABAl:..
[l:eneur % 1
m-al.iëlde 100sain
So
o,.---...-I---,...---,-----.--.---.-----.------r---.--,-----,------.------r--,-----,r--,---,---,--,
"19
FIG.39 TENEUR EN PHENOLS TOTAUX DES TISSUS MALADES EXPRIMËE
EN POUR.CENTA&E DE LA ïENEUf.\ DU TEMDIN.
TABLEAU XXXII
Evolution des teneurs en acides chlorogéniques au cours de l'infectionvirale à 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en llg pargramme de poids frais).
Mai 1969 Février 1969
xvs - 30 h à 30 Oc 75XVMT - 30 h à 30 Oc 75
XVS - 36 h à 30 Oc 75 85XVMT- 36 h à 30 Oc 52,50 78,75
xvs - 48 h à 30 Oc 81,25 78,75XVMT - 48 h à 30 Oc 50 53,75
xvs - 54 h à 30 Oc 65 83,75XW'rr - 54 h à 30 Oc 43,75 55
XVS - 60 h à 30 Oc 65 75XVMT - 60 h à 30 Oc 43,75 42,50
xvs - 72 h à 30 Oc 61 ,25 87,75XVMT- 72 h à 30 Oc 40 50
XVS - 84 h à 30 Oc 57,50 75XVMT - 84 h à 30 Oc 41,25 50
XVS - 96 h à3Ù Oc 57,50 82,50XVMT - 96 h à 30 Oc 32,50 50
XVS - 108 h à 30 Oc 60 87,50XVMT - 108 ft à 30 Oc 33,75 58,75
xvs - 120 h à 30 Oc 56,25 66,25XVMT - 120 h à 30 Oc 37,50 50
XVS - 123 h à 30 Oc 57,50XVMT - 123 h_ à 30 Oc 28,75
XVS - 144 h à 30 Oc 46,25 75XVMT- 144 h à 30 Oc 37,50 50
XVS - 156 h à 30 Oc 56,25 82,50XVMT - 156 h à 30 Oc 52,50 60
XVS - 168 h à 30 Oc 50 83,75XVMT - 168 h_à 30 Oc 46,25 87,75
- OcXVS - 180 h à 30 48,75 71 ,25XVMT- 180 h à 30 Oc 46,25 55
XVS - 192 h à 30 Oc 50 71 ,25XVMT - 192 hà 30 Oc 60 85
- 91 -
(suite du tableau XXXII)
xvs - 204 h à 30 Oc 52,50 67,50XVMT - 204 h à 30 Oc 45 87,75
XVS - 216 h à 30 Oc 52,50 67,50XVMT - 216 h à 30 Oc 57,50 \02,50
XVS - 240 h à 30 Oc 45XVMT - 240 h à 30 Oc 52,50
XVS - 288 h à 30 Oc 57,50 71 ,25XVMT - 288 h à 30 Oc 57,50 87,75
XVS - 336 h à 30 Oc 46,25 67,50XVMT- 336 h à 30 Oc 56,25 85
XVS - 384 h à 30 Oc 46,25 71 ,25XVMT - 384 h à 30 Oc 53,75 82,50
XVS - 408 h à 30 Oc 45XVMT - 408 h à 30 Oc 53,75
XVS - 432 h à 30 Oc 50XVMT - 432 h à 30 Oc 60
xvs - 456 h à 30 Oc 57,50 76,25XVMT - 456 h à 30 Oc 60 87,75
- 92 -
Acides chlorogéniquesde poi ds f rai'iQ en
\\\50 10- __ .....
'_-4~__ ....... __ -......
......... --~:10 - __...- - \
50
~ 1, /
\ 1~ 1
\\ ~'lt--" ",'" '" J',....... ",'"
',,,.,x----.;c.----x,,.. ..... x---------)C'~'" ,";.
\ ,\ /
, 1, /
'"
,.-_--X----k1
1
12.091>7248--,----,---''--r--.....----.----..-----.--.----.....----.----..-----.--.-----.----.----.---y-----, 216
ce.mps en heures à 30"C
FIG.+O EVOLUTION OES TENEURS EN ACIDES CHLOrOGENIQUES P.U COURSDE L'INFECT/ON VIRALE' A 30°C. DU N/collana Xanthi n.c. ...PAR LE' VIRUS DE LA MOSA/QUE" DU TA6AC.
[ceneur % ]malade! -100
sain
50
;~.----)(
","A/
/ .,, , ,\:abaC .sai n /,' , "•.100 )C, ,1 ,,, "
1 ....\~---------------------------i-/~\ -~,'~,-I---~-'.\--/~
" " 1 6 ~ __Ai , '""' 4- -../- -" , 1
\ \ ..,.' 1 \, A'\ " "A" " " "\ " " 1 l(A.. ' A _--;K-- ~" ~ __ ll
... li ......... - ..,.-- " _-)1,-- 6 ~--,,-;-' ... '~ ---6- ..,.''''-~ _- ... ' l ,.... " ...... ",,,,,' ...-:,--- ",,"" \ ""'----'X .... - -....... \"~"
24 4B 72 96 1~O
1 1 1 l , ,216temps en heures à. 30"e,
FIG.41.TENEUR EN ACIDES CHLDROGENIOUES DES il5Stl5 MALADE.SEXPRIMEE EN POURCENTAGE DE' LA TE'NE'UR DU TEMDIN
~.-
Ad de~ chi orogén iqU2S
Q.gn JJ9/g. d~ poids set
\11\\
50 Â---a'.......
'-..--Â,.
" ....-~....- ,,,...
. Â.----A
-- - ---Â- -- - - - --IJ.----..... ~"".",
50
>(.- -,,- -)<- - - - - - - - - - - - )(- - - - - - - ~- Y-I" -------X------------,,
FIG .4-2.
1
19111098754i i i
-1'}. 13 14 1S -16 11 .-\8
temps en jours à 30 D C
EVOLUTION DES TENEURS EN ACIDES CHLDRDGENIDUES AU COllR':> DEL' INt='E'CTIDN VIRAl~ A 3D" C DU N/cofJùnêl :Xanthi n.c'. PAR
LE VIRUS DE LA MOSAïQUE:. DU TABAC.
t1o
[I:e n. f.?lIr %J
ma l,ad E ,of 00.5à ln
50
1" ,'fr-lI.-- _
",,/ --- - -.l(-- - - - --~:.;_-_- __.- A,~, ... .Â...... .",' ~__- ....... - ,
tabac sa"ln )(,,Ji '. ,.../ -- .-'-- -x------------';::~oo :----- --,,~..---,J'....;.,'-LI--/..(-----.........:..:-~..~,,:----------------=-
" .~_~ 1 l,\~ ~-r· \' \,Il "', l' ~1 1 Â' .:1 \ 1 1 Y.À \ ... 'Ji..,,~~a... " .. l ",""" ' .... At' ':'1-.\ .,,)C. .. , ~;"
'a: " " ",'K )(~... i'"..--< ..--If}f
o 1 2.
FI G. 43
;, 4 5 6 1 8 9 10 -11 -ft -13 14- " ..H., Il '?itemps en j ours. a 30 c c..
TENEUR E.N ACIDES CHLOROGENIÇ.>UE.5 DES TISSUS MALADf5
EXPRIMEE EN POURC.ENTAGE DE LA TE.NEUR DU TE'MOIN.
TABLEAU XXXIII
Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine au cours de l'infection virale à 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g
par gramme de poids frais).
Mai 1969 Février 1969
xvs - 30 h à 30 Oc 75XVMT- 30 h à 30 Oc 75
xvs - 36 h à 30 Oc 82,50 45XVMT- 36 h à 30 Oc 63,75 30
xvs - 48 h à 30 Oc 78,75 43,75XVMT - 48 h à 30 Oc 53,75 37,50
xvs - 54 h à 30 Oc 67,50 40XVMT- 54 h à 30 Oc 43,75 30
xvs - 60 h à 30 Oc 67,50 38,75XVMT - 60 h à 30 Oc 36,25 30
xvs - 72h à 30 Oc 55 53,75XVMT - 72h à 30 Oc 33,75 32,50
xvs - 84 h à 30 Oc 56,25 43,75XVMT - 84 h à 30 Oc 36,25 30
xvs - 96 h à 30 Oc 51,25 43,75XVMT - 96 h à 30 Oc 32,50 27,50
XVs - 108 h à 30 Oc 51 ,25 l.5XVMT - 108 h à 30 Oc 28,75 35
XVS - 120 h à 30 Oc 51,25 37,50XVMT- 120 h à 30 Oc 32,50 22,50
xvs - 123 h à 30 Oc 55XVMT - 123 h à 30 Oc 32,50
xvs - 144 h à 30 Oc 43,75 42,50XVMT - 144 h à 30 Oc 37,50 30
xvs - 156 h à 30 Oc 42,50 47,50XVMT - 156 h à 30 Oc 40 36,25
xvs - 168 h à 30 Oc 43,75 38,75XVMT - 168 h à 30 Oc 40 38,75
xvs - 180 h à 30 Oc 42,50 42,50XVMT - 180 h à 30 Oc 42,50 36,25
xvs - 192 h à 30 Oc 40 40XVMT - 192 h à 30 Oc 46,25 47,50
- 93 -
(suite du tableau XXXIII)
xvs - 204 h à 30 Oc 33,75 36,25XVHT - 204 h à 30 Oc 37,50 43,75
XVS - 216 h à 30 Oc 40 40XVHT - 216 h à 30 Oc 43,75 38,75
XVS - 240 h à 30 Oc 32,50XVMT - 240 h à 30 Oc 36,25
XVS - 288 h à 30 Oc 41,25 40XVMT - 288 h à 30 Oc 41 ,25 40
XVS - 336 h à 30 Oc 42,50 38,75XVMT - 336 h à 30 Oc 50 38,75
XVS - 384 h à 30 Oc 40 47,50XVMT - 384 h à 30 Oc 40 53,75
XVS - 408 h à 30 Oc 33,75XVMT - 408 h à 30 Oc 41 ,25
XVS - 432 h à 30 Oc 33,75XVHT - 432 h à 30 Oc 36,25
XVS - 456 h à 30 Oc 32,50 45XVMT - 456 h à 30 Oc 40 55
-,94 -
50
Rutine., Nicoéiflorine
''--...............~
,'-.,'... -ê----'6 .._---- --- ...... ---4----• .6------
.".-""", _-x.... _.........""--- ......----".,.,--)t'"- .... x- -~---- -X,- - - -~- ,,_,,- ......... __ -}4.--
""" ---'x---
5
48 72 120 144 1GB 19! 2ibt\!mps en hfure~ a 30° C
FIG.44 EVOLUTION DES TENEUR~ EN RUTINE ET NICOTIFLDRINE" AU COURSDE L'INfECTION VIRALE A 3D· C OU N/cot"iana Xanthi n.c.PAR LE VIRUS DE LA M05l~ïQVE OU TA6/~C. '
[ ; ]teneur 0/..
ma~ade 100sam
tabac
i
48 72.i
961
120, 1
144 16B -192. tl6temps en neure5 à. 30·C
Fr G. 45 TE'N EUR EN RUTlNE ET NtCOTIFLDRINE DES TI5!1U5 M ALADE~'E XPR 11'1 EE EN POU RC.E rJTAGE DE LA TEN~UR OU TE.i"lD1 N
"u~ine, Nicotiflorine
Qe.n ""9 Ig de ~oids. frais
.-..---;:;-O...-...;;.----:::..-,:o--i_Ak_ _ -À__
----~--
_)( - - - - -)1,
_--~---_~-~------------o
<> .., 2 ~ 4- 5 Ei 7 8 \) 10 11 12 A~ .,4-. "Ir; A{, 11 18 19temps en Jours ~ 30°(:
FIG.46 EVOLUTION DES TENEURS E.N RUTINE E.T NlrOTIFLORINE AU COURS
DE L'INFECTION VIRALE A 30°C. DU Nic'Dtiana X~nt;,i n. C.
PAR LE VIRUS DE LA MQ~A'l9UE DU rA~AC
[
!:.Q.ne ur ~ 'Jma~ôdE' 100sam
1 !
FIG. 47
1 4- 5 c; 7 Q 9 w .." 12. '1'3 14 '5 16 1'7 18
temps en jours à 30 0 C.
TENE.UR EN RUTINE ET NIC01"lF'LORINE DE~ TIS5US MALADE..5
EXPRIMEE EN POURCENTAGE DE L A TENEUR OU TEMOIN
\9
3.- Conclusions.
L'inhibition de la synthèse des polyphénols (acides chlorogénique,flavonosides) dans les feuilles virosées à 30 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c aucours d'une période de temps comprise entre 36 et 156 heures après inoculationsemble liée à une production importante de particules virales.
L'évolution de la quantité de virus dans un hôte hypersensible à 30 Oca été étudié en particulier par MARTIN et GALLET(90). Ces derniers ont montré queles 96 premières heures correspondent à une synthèse abondante de virus dans lafeuille inoculée. Nos expériences semblent montrer que lorsque cette dernièreest terminée, la formation des pol)~hénols reprend et est même stimulée puisqueles teneurs en ces substances dans les feuilles malades sont supérieures à cellesdes feuilles saines témoins. Il n'y a cependant jamais production ou accumulationdes nombreuses substances apparaissant lors de la formation des lésions localesnécrotiques.
Au cours de sa multiplication, le virus doit détourner à son profitles métabolites qui interviennent directement ou indirectement dans la biosynthèse des phénols ; lorsque le taux de virus atteint son maximum dans les feuilles infectées, les métabolites de l'hôte peuvent être de nouveau utilisés dansla chaîne de réaction menant aux composés phénoliques
c - E v 0 l u t i 0 n q u a n t i t a t i v e d e s c o m p 0 5 é s
p h é n 0 l i q u e 5 d a n s d e s T a b a c s v i r 0 s é s
d 8 l a V a r i é t é xanthi n.c s oum i s à d e s
t r a n s f e r t s t h e r m i q u e s .
1.- Transfert thermique de 20 Oc à 30 oC.
Après un séjour à 20 Oc qui permet le déclenchement de la réactionnécrotique d'hypersensibilité, les plantes sont placées dans une enceinte à 30 Occe qui amène l'extension du virus dans la feuille inoculée à partir des particules virales situées dans les cellules périphé~iques aux cellules nécrosées.
Des dosages effectués en fonction du temps à partir du transfert à30 oC, montrent que l'inhibition par la température de la réaction d'hypersensibilité, permettant au virus de se généraliser dans la plante hôte, se traduitaussi par une baisse de tous les phénols accumulés ou produits dans des Tabacsde la variété xanthi n.c virosés à 20 oC.
En effet, les résultats obtenus dans ce type d'expérience mettent enévidence lors du transfert à 30°C : une diminution du contenu des phénols totaux(tableaux XXXIV, XXXV, figures 48, 49, 50, et 51), une baisse considérable desteneurs en acides chlorogéniques (tableaux XXXVI, XXXVII, figures 52,53,54, et55) et en flavonosides (tableau XXXVIII, figures 56, et 57), une chute spectaculaire des acides para-coumarylquiniques (tableaux XXXIX, XL, figures 58, et 59),
- 95 -
des acides férulylquiniques (Tableaux XLI, XLII, figures 60 et 61), et une diminution rapide de la scopoline et du férulylglucose (tableaux XLIII, XLIV, XLV,figures 62, 63, et 64).
Le férulyl-I glucose n'est plus décelé qu'à l'état de traces dans desTabacs nécrosés de la variété xanthi n.c subissant un transfert de 84 heures à30 Oc après une inoculation et un premier séjour de 108 heures à 20 oC. L'évolution est similaire pour la scopoline.
Les feuilles de Tabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc etprésentant après 108 heures à cette température 100 à 150 lésions locales voient leurs teneurs en acides caféylquiniques et en flavonosides décroître de 40 %par rapport aux plantes saines témoins, au cours d'un transfert de 144 heuresà 30 oC.
De tels Tabacs renferment des quantités d'acides para-coumaryl et férulylquiniques voisines de 30 vg par gramme de poids frais, alors qu'elles s'élèvent respectivement à 137,50 et 81 Vg par gramme de poids frais dans un Nicotiana xanthi n.c inoculé à 20 Oc et laissé 108 heures à cette température. Labaisse observée dans les teneurs en tous les phénols se manifeste dès un transfert de 48 heures à 30 oC. Elle est d'autant plus importante que le séjour àcette température est plus long, et doit correspondre à une synthèse accéléréede particules virales (cette dernière étant déclenchée par le transfert à 30 OC).
Ces résultats ne font que confirmer ceux obtenus lors de l'infectionvirale à 30°C du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c.
~ 96
EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET, EN PRINCIPAUX PHENOLS DANS DES N.xanthi
N.C INFECTES A 20 Oc PUIS SOUMIS AUN TRANSFERT THERMIQUE A 30 oC.
- Phénols totaux (tableaux XXXIV, XXXV, figures 48,49,50 et 51) ;- Acides chlorogéniques (tableaux XXXVI, XLXVII, figures 52,53,54, et 55)- Flavonosides (tableau XXXVIII, figures 56 et 57) ;- Acides p-coymarylquiniques (tableaux XXXIX, XL, figures 58 et 59)- Acides férulylquiniques (tableaux XLI, XLII, figures 60 et 61) ;- Scopoline (tableaux XLIII, XLIV, figures 62 et 63) ;- Férulylglucose (tableau XLV, figure 64).
0------.00
En trait plein plantes saines • • Tabacs témoins laissés 72 h à 20 Ocpuis transférés à 30 Oc (janvier 1969)
Tabacs témoins laissés 108 h à 20 Ocpuis transférés à 30 Oc (février 1969).
En pointillé plantes virosées A ---Â
x----- ---x
- 97 -
Tabacs inoculés et laissés 72 h à 20 Ocpuis transférés à 30°C (janvier 1969)
Tabacs inoculés et laissés 108 h à 20°Cpuis transférés à 30°C (février 1969).
TABLEAU x.x.,'{IV
Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs exprimées en mgd'acide chlorogénique par 100 grammes de poids frais).
Janvier 1969
XVS - 72 h à 20 oc 73,75XVHT - 72 h à 20 oC 107,50
xvs - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 72,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 95
XVS - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oc 72,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 97,50
XVS - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 82,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 91,25
XYS - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 82,50XV1'1T - 72 h à. 20 oC puis 60 h à 30 OC 93,75
XVS - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 73,75À"VHT - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 80
r:vS - 72 h à 20 oC puis 84 h à. 30 oC 82,50XVET - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 91,25
xvo' - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 78,75, û
XVHT - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 57,50 ..
XVS - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oc 86,25XVMT- 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 60
XVS - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 86,25XVNT - 72 h à 20 cC puis 120 h à 30 oC 57 ,50
XVS - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 75XVNT - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 50
- 98 -
oen mg 1 100 9 . poids Fra',s
Phénols f:-ci:aux
\\
\\ .à.---..----.t.--------.
1
4-81
71.i 1 1
9& 120 14~
I:.emps Qn heure., il 30(lC 1
:aprés. un sejour de. 72 heures à 20°C
FIG.4S. E:VOLUTION DES T~NE'URS EN PHE.NOLS TOrAUX DANS LES TABAC~
DE LA VARIETE :J..anfhl n.c. INOCULE.S A 2.0°C ET LAISSES 7!. HEURESA [EiTE TEMPERATUR.E PUIS TRANFERE5 A 30°C
[teneur 0/. Jrnclade ~OO
s:aln
Phénols ~ol:au:x
---- ---- ----....-- --.,\\\\ 6.
tabac sain'... ' \\
\\ ,&, ,,",
~' """ 'A_
- -4-- _4 ..6
48 96 -1to 144temps en neureli. à 30°(,apnb un séjour de 72 fleurec; à 20° C
FI G. 49. TENEUR EN PHE"NOLS T01'AU" DES TISSUS MALADES, EXPRIMEE
EN POUR.CENTAGE.. DE LA TEN.EUR DU TEMOIN,
TABLEAU XJ:YiV
Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs exprimées en mgd'acide chlorogénique par 100 grammes de Poids frais).
l"évrier 1969
xvs - 108 h à 20 oC 91 ,25XVHT - 100hà20 oc 142,50
xvs - 108 h à 20 oC puis 48hà30 oC 90XVhT - 108 h à 20 oC puis 48 11 à 30 oc 125
ms - 108 h à 20 oC puis 60hà30 oC 96,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 60hà30 OC 113,75
xvs - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 100XVl1'f - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 103,75
ms - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 96,25XVMT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 96,25
ms - 108 h à 20 oC ptûS 96 h à 30 oC 100XVHT - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 80
xvs - 10S h à 20 oC puis 10811à30 oC 92,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 CC 70
ms - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 96,25À"VHT - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 67,50
x.vs - 108 h à 20 oC puis 132 h à. 30 oC 96,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 67,50
xvs - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 92,50À\n'Œ - 108 11 à 20 oC puis 144 h à 30 oC 65
xvs - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 92,50XV11T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 53,75
xvs - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 91 ,25XVHT - 10S h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 53,75
- 99 -
Qen mg /"100 g_ poids frais
--- --- ---Phénols totaux
---x................
x............ ....
x ...
so
.... ............
lt ............ .... 'l(.- __
-,c,- - - -)(,- - -"'1(........
........ l(- - --x
FIG.50
48 7E. g6 110 1.q..q 168
temps en neure~ ~ 30·C aprés unséjour de 10Bheurt') .32.0-(.
EVOLUT10rv DES TENEUR~ EN PHEN DLS TOTAUX DANS DES TABAC.SDE LA VARIE1E Xanthi n.c. INOCULES A ~OoC ET LAISSE'5 108 HEUIŒSA CETTE TEM Pl:RATURE PUIS TRAN5FfRE5 A 3 DOC ..
Phénols totaux...... .... ....... ... ...........
...... .......................
~ x- ..... __"")C,,
5D
l:abëlc sam10C +--------------'~,,-----------------
",)(_---x ..........
"'''X-- -oi'---~,
............. x----iC. .........'-x-.
............. )(
Î. -106 h à 20"e
48 72. 9& no 1lfJt \68
temps en neure'i à 3Q"c.. dprés un séjour de '1oaheure< à 10·C.
TE NEUR EN Pt1ENC LS TOTAUX DéS T 15 SUS MA LADES ~XPR\ NEEEN POURCFNTAG.E DE LA TENEUR DU TEHOIN.
TABLEAU xxxn
Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g pargramme de poids frais).
Janvier 1969
XVS - 72 h à 20 oC 97,50XVET - 72 h à 20 oC 195
XVS - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oC 103,75xvur - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 135
XVS - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 10"1,25XIIE'!' - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 128,75
xvs - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 105XVN'I' - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 107,50
XVS - 72 h à 20 oc puis 60 h à 30 oC 105À"Vl'l'l' - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 OC 110
XVS - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 101,25XVI1T - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 93,75
xvs - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 103,75XVNT - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 80
l.'VS - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 96,25XVNrr - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 53,75
xvs - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 OC 105XVHT - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 46,25
Y:VS - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 OC 112,50XVNT - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 46,25
XVS - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 101,25XVKrr _ 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 46,25
- 100 -
Q. e.n fA- 9 / g. poids ~ra·'t
J", , , , , , ,
",""",
"...............
\\
\
\....~~
50
Acides chlorogénique.s
""'... ........
"'.""\ ,,,~ ...
...... ..,...---..--- - --.
EVOLUTI1"'J DES TENEUP.5 E:N A.C.IDE5 CHLDROGENIOUES DANS LES
TA~ACS DE LA VARIETE xanthI fIl.c. 1NOCULES A 2D°C. ET LAISS,EÇ72 HE'URES A EErTE TEMPER.ATURE POI~ TRANSFERËS A :30° C
t12 h à 20D C
J="J G.52
1f. 96 1~O 14~
te.mps -Qn heures à 30°Co)prés un séjour de. 72 heure<:. à 20°C.
Acides; chlorogéniques
.........." ...
"...."",
"...'A.. ... ... .
....~- --" ------..--
[
l:.eneur ~ Jmë1l.a de 100
SëJrn
,"""",
"\
","",,,,,,
".----.\\
\\
~ .....
50
I:abac:.
.sai n
48 72. 96 1~o 1«-l::~mps en heures à 30" c..apr e~ un sejour de 72heurec; à 20°C.
FIG.53. TEN.EUR. EN AClDE~ CHlDR OGEN IÇlUF:.5 DE.5 TI55U5 NAlADJ::SJEXP RIMEE EN POURCENTA~E DE LA TE'NEU R DU TEMOI N
TABLEAU XXXVII
Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g pargramme de poids frais).
Février 1969
xvs - 10S h à 20 oC 142,50XVHT - 10S h à 20 oC 355
r:vs - 108 h à 20 oC puis 4S h à 30 oC 152,50XVhT - 108 h à 20 oC puis 48 h à 30 OC 215
XVS - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 142,50XVliT - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 173,75
xvs - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 152,50XVMT - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 167,50
ms - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oc 150mNT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 110
ms - 108 h à 20 OC puis 96 h à 30 OC 160XV1~T - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 112,50
ms - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 150XVET - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 107,50
ms - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 152,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 107,50
ms - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 OC 160XV1,~ - 10S h à 20 oC puis 132 h à 30 OC 85
xvs - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 OC 152,50À'WlT - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 96,25
riS - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 152,50XV1~T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 71,25
riS - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 160XV~T - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 38,75
- 101 -
Q~n p. gl 9 pO'lds frais
,\
\\
\\
\\
\\
\\
\\
\\
\ ,,,\
\\
\\ ,
\\
\,\
\
~\
\\\
\,\
\X..
..........~\,
50
Acide"!l ch[or0.9~niques
\\\\\\\\\x----"?l.- .. _
-x-- - -'l(.,,, ,:y,. .
" """ '" "'x--'" """")(
\\
\
"\\
~
t'10Bh à îO'C.
48 7! 96 no 144 165
temp~ en heure~ ~ 30·C avri'ï un ~éjour de 109 hE'ure~ 8 ~DoC
EVOlur ION DE') TE NEUR ~ EN ACIDES CHlOROGE NI QUFS
DANS DES TABACS DE' LA VARIETE xant.hi n.c.. iNOCULESA 20° C ET lAlSSE5 -108 HEURES A CETTE" TEMPERATUI,EPUIS TRANSFERES A 30°C..
ceneur %
[ mal~de 10~ .sain ~
Acides c.hlorogÉ'niqu~s
60
\
"\
""""""""""\ ,""",,,
\
",,"")c,,
",')(,,
.....
100 -+-__l:_8_b_a_c._.f;_O_I_n '_x.....' .--- _
"""\ ,,x- - _ -')( )( )(
"" .....x,"... ,')C" .....')(
""",")(
49 72. Q6 '1'20 n4 168temp~ en heures if 30-C aprés un séjour de IOBhFure~ à !.O-c,
FI G .55 TENEUR EN ACIDES CHlOROGENfQUE5 DE5 TISSUS MALPrDE~
EXPRIMEE [: N. POURCENTAGE DE LA TENEUR DU 1É~DlN •
TABLt1\U XXXVIII
Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heuresà cette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en~g par gramme de poids frais).
Février 1969
XVS - 108 h à 20 oC 52 ,50XVHT - 102 h à 20 oC 82,50
XVS - 108 h à 20 oC puis 48 h à 30 oc 50XVHT - 108 h à 20 oC puis 48 h à ::SO oc 58,75
A'/S - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 50XVi:iT - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 55
XVS - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 46,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 40
A'/S - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 OC 52,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 OC 46,25
rvs - 108hà20 oC puis 96 h à 30 OC 42,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 32
rvs - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 40XVilIT - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 30
x.vs - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 42,50~1T - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 30
rvs - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 42,50J0n1~ - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 26,25
A'/S - 108 h à 20 oC puis 144hà30 oC 40XVKT - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 26,25
A'/S - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 OC 50XV1~T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 28,75
x:vs - 108hà20 oC puis 168 h à 30 oC 52,50XVPIT- 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 26,25
- 102 -
9e.n }L 9 1 g da poid s frais
Ru èine J Ni cob flori ne
'-x-.--"X...
!iD1------o--ô~~__" "..,--)(,
')('"" ","x- -- -"l(-- - -"~-- __ )1-- __ )Ç - 1(-- __-'j(
Î-10B h à 2.0"c.
FIG.56
46 Tl q6 IZU \4~ lU
tempe; r:nheure'i ~ '30·c. ëlprés un~éjour dt -loBheurt5 à '2.0-e.
EVOLU1'ION DE,5 'TENGURS E'N. RUTINE: ET NICOTlflORlNE DAN5DES TABACS DE LA VARIETE xanthi n.c_ INOCULES A 2DoG
ET LAISSES -1De HEURES A CETTE TEMPERATURE purs TR~~SFERES A 30"C
teneur %
[mal,ade 100lsain .:J
Rul:ine. 1 Nicotiflorine
... ~"X,,,
"tabac sa'in 'x- __
1 ca 1- -_"'X_-----"~----------~---,,,,, x__ --x_ -- -x-- - -x-- --1(...
..........~---""
sa
Flu.57
49 72. _ qo J lIa nif 16 'iltemps lm he.ure~ a 30· c. apn s un séjour à~ 108 neurps ë) 2.0· C.
TE N.EUR EN RUT \ NE ET NICOTIFLORINE DES Tl SSU5 MALADESEXPRIMEE ~~ POURCENTA6E. DE LA TENEUR DU TEMOIN.
TABLE/I.U XXXIX
Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés72 heures à cette température. puis transférés à 30 Oc (teneursdonnées en vg par gramme de poids frais).
Janvier 1969
1.'Vs - 72 h à 20 oc 14XVhT - 72 h à 20 oc 87,50
XVS - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 14XV{'lT - 72 h à 20 oC l-'Uis 36 h à 30 OC 75
xvs - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 14XVHT - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 OC 70
X:VS - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 15XVNT - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 55
iCVS - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 15XV1·1T - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 55
ms - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 14XVlViT - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 52,50
xvs - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 14XVMT- 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 50
x.vs - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 14À'lNT - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 40
x.vs - 72 h à 20 oc puis 108hà30 oc 15À-vr;IT - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 40
xvs - 72 h à 20 oC puis 120hà30 oC 15}.'VHT - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oc 36,25
ms - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 OC 14XVNT - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 30
- 103 -
QQn f9 1 g. poids Fra"5
---Acide p_coumsr!:JI_:3 qu'miqu2
- -- ----..----à\
\
---4----A----Â.......
... ~Â_--- .._---4--------..
4B n 96 -1~O 144-
l:-e.m~s en heures à 30° C. J _ 0
C1pres un séjour de 72 hl!.vres a 20 c..
FIG. 58 EVOlUilQti DES TEKEURS EN ACIDE P. COUMARYl_"3 Ç1UI NIÇJ LIE DANS LESTABACS DE LA VARIETE "Xanchi n. c .IN OC ULES A ~O·c. ET LAISS ES
72 HEUR.~S.Pt t:.ETTE TEMPERATURE PUIS TRAl\lFERE~ A '50"c..
TABLEAU XL
Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés lOSheures à cette température, puis transférés à 30 Oc (teneursdonnées en ~g par gramme de poids frais).
Février 1969
XVS - lOS h à 20 Oc 16,25XY'MT - lOS h à 20 Oc SI,25
XVS - lOS h à 20 Oc puis 4S h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc
pu~s 48 h à 30 Oc 63,75
XVS - lOS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 46,25
XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 72h à 30 Oc 16,25
XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 72h à 30 Oc 46,25
XVS - lOS h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 36,25
XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 16,25
XVMT- lOS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 36,25
XVS - lOS h à 20 Oc puis lOS h à 30 Oc 16,26XVMT- lOS h à 20 Oc
pu~s lOS h à 30 Oc 36,25
XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 16,25
XVHT - lOS h à 20 Oc pu~s 120 h à 30 Oc 36,25
XVS - lOS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 16,25XVMT - lOS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 36,25
XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 16,25
XVMT- lOS h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 27,50
XVS - lOS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 27,50
XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 16,25
XVMT- lOS h à 20 Oc puis 16S h à 30 Oc 27,50
- 104 -
Ar:ide.. p_coumaryL -3 quiniqu~
QE?n Jl-9/9 poidli fraÎ')
~~~~~ --..........- ....
-- .... - .... x
""""')C- - - )C..,. ... ....... )C...: - --)1- - - -x- - --)t- - --)C .. ....
'lC- - - -x- - - l(
FI G. 59.
4B 7l. QI) {~O 144 1b&temps ILn h~url1s à 30"Co apré~ un séjour de '""'08 h&Ure5 a 2.0-c:.
EVOLUTION DES TENËUR5 EN ACIDE P_ COUMARVL _3 QUINI~UE
OANS DES TABACS DE LA VARIETE: xanthi n.c.. INOCULES A !D"C.ET LAISSES 10BHEURES A CnTE TEMPERA1URE PUIS TRANSFERESA 30" c..
TABLEAU XLI
Evolution des teneurs en acides férulyl-quiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures àcette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g
par gramme de poids frais).
Janvier 1969
XVS - 72 h à 20 Oc 14XVMT - 72h à 20 Oc 85
XVS - 72h à 20 Oc puis 36 h à 30 Oc 16XVMT- 72h à 20 Oc
pu~s 36 h à 30 Oc 77 ,50
XVS - 72h à 20 Ocpu~s 48 h à 30 Oc 16
XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 48 h à 30 Oc 66,25
XVS - 72h à 20 Ocpu~s 54 h à 30 Oc 16
XVMT - 72h à 20 Oc puis 54 h à 30 Oc 62,50
XVS - 72h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 16
XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 62,50 .
XVS - 72 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 16XVMT- 72 h à 20 Oc
pu~s 72h à 30 Oc 62,50
XVS - 72h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 16XVMT- 72 h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 62,50
XVS - 72h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 16XVMT- 72h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 46,25
XVS - 72 h à 20 Ocpu~s 108 h à 30 Oc 20
XVMT - 72 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 46,25
XVS - 72h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 20
XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 42,50
XVS - 72 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 16
XVMT- 72 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 32,50
- 105 -
AcidQc; féru ly Lqui ni qUl2s
--- --- ----4 .... .... ................._.A.........
......... _--.... -- ..... -4_ --....----
._---....~_._._.-_.-~.__.....---. •
---.---+8 T~ 9b ~~o 14+
temp!:l e.n heure~ à '50 tl C 1
apréli un séjour de 12 hr..urgs à 20°C
FIG. 60. E\10lUTION DES TE.NEURS EN Atl DES FERULYU;,1UINIÇUE:5DANS DE.S TAt;ACS DE'LA VARIETE Xanchi n.c.. II'\lOCULE'S A
20°C. ET LA\ SSES 72. HEU"E~ A CETTE TEMPERATU RE PUISTRANSFr;zRE5 A 3C"C.
TABLEAU XLII
Evolution des teneurs en acides férulylquiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heuresà cette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données ~g
par gramme de poids frais).
Février 1969
XVS - 108 h à 20 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc 137,50'
XVS - 108 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 17,50XVMT - IDS h à 20 Oc puis 4S h à 30 Oc 106,25
XVS - IDS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc
pu~s 60 h à 30 Oc 70
XVS - 108 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc
pu~s 72h à 30 Oc 67,50
XVS - 108 h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 15XVMT- IDS h à 20 Oc
pu~s S4 h à 30 Oc 52,50
XVS - IDS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 16,25
XVMT- IDS h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 47,50
XVS - 108 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 16,25XVMT- 108 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 42,50
XVS - 108 h à 20 Oc puis 120 h à 30 Oc 16,25XVMT - IDS h à 20 Oc
pu~s 120 h à 30 Oc 42,50
XVS - IDS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 20XVMT - 108 h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 40
xvs - 108 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 20
XVMT- 108 h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 30
XVS - 108 h à 20 Ocpu~s 156 h à 30 Oc 20
XVMT- IDS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 27,50
XVS - 108 h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 21,25
XVMT- 108 h à 20 Oc puis 168 h à 30 Oc 21,25
- 106 -
Qen f9 19 pDids Frais
........ .........Acides Férulylquiniques
6'0
........ ,.........
'x\
\\
\\
\\
\x__--x
" ..." 'x .... , .... _)(
-- -. ~- - - -)(.- - --l(......
....... x- __ -v
~--
EVOLUTION DES TENEURS EN AC1DE~ fERUL'{LQUIN1~UE5
DANS Of5 TABACS DE: LA VARIETE Xanthi n.c.. INOCULESA 2.0 0
[ ET LAISSES 106 HEURES A [ETTE TEMPERP\TURE'PUIS TRAt\\5FERES A 3D" C
Î-100 h à 20° C
FIG. 61
7'l.1
96 110 14-4 1&9
remps en hE'lJre~ à '30"c.oapre'i un séjour dl! '1DBh~urt:"~ ~ fO"C
TABLEAU XLIII
Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cette température puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g par grammede poids frais).
Janvier 1969
XVMT - 72h à 20 Oc 22,50
XVMT - 72h à 20 "c puis 36 h à 30 Oc 18,75
XVMT - 72 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 16,25
XVMT- 72 h à 20 Oc puis 54 h à 30 Oc 16,25
XVMT- 72 hà 20 Oc PU1S 60 h à 30 Oc 15
XVMT- 72 h à 20 Oc puis 72 h à 30 Oc 15
XVMT- 72 h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 13,75
XVMT- 72h à 20 Oc PU1S 96 h à 30 Oc 12,50
XVMT- 72h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 12',50
XVMT- 72 h à 20 Oc PU1S 120 h à 30 Oc 12,50
XVMT- 72h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 12,50
- 107 -
SCDp~line
50
----------- - --)l;- - - -)(,- -l(- -1(- -'- -x-- --.c- -- -l!o- - - -~- -- -Il.----l(,-- --'li,
t72.h.à 2.0"C
48 96 -1~O 144temps en he.ure~ cl 30'" C, 0
aprés UI\ séjour de 72heures à ~D C.
FIG. S2. EVOLUTION DES TENEURS EN SC.OPOLtNE DANS Dr;S TABACS
DE LA VARIETE X::Jhthl· n.f.. INOCULES A 2.0 o C ET LA\S5E~
'72. HEURf5 A CETTE TEMPER"TUR~ PUIS TRAN5FERE5 A 30°c..
TABLEAU XLIV
Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés lOS heures à cette température t puis transférés à 30 Oc (teneurs données en Vg par grame de poids frais).
Février 1969
XVHT - lOS h à 20 Oc 60
XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 4S h à 30 Oc 43 t 75
XVl1T - lOS h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 33 t 75
XVHT - lOS h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 27 t 50
XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s S4 h à 30 Oc 26 t 25
XVHT- lOS h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 23,75
XVHT - lOS h à 20 Oc puis lOS h à 30 Oc 23,75
XVHT - lOS h à 20 Oc puis 120 h à 30 Oc 23,75
XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s 132 h à 30 Oc 22,50
XVHT- lOS h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 22,50
XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s 156 h à 30 Oc 21 ,25
XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 16,25
- lOS -
Scopoline
Qen J-L9 19 poids fra"5
50--- ------ -- -......x""'.....
......"'x...
.......... - ----->t- ~ --K---*----x_
--~---~----~-..._~
t10Bh. à fO"C
49 9& 100 -144 168temps en heure~ ~ 30·Co
aprés un c;;~jour de 1osheurl!<) ~ lO·C
FI G. S3 EVQlU1101\l DES l"t=NEUR5 EN S[OPDLlNE DANS UF5 TABACSDE LA VAR IETE" Xanth i n. c.. 1N O(UlES A 2D 17 C ET LAI S5 ES108 HEURES A CElTE TE MPE RATURE PUIS TRANSFERES A 30° C
TABLEAU XLV
Evolution des teneurs en férulylglucose dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés ]08 heures à cette température,puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g par gramme de poidsfrais).
Février 1969
XVMT - 108 h à 20 Oc 75
XVMT - ]08 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 57,50·
XVMT - 108 h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 30
XVMT - 108 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 27,50
- 109 -
9e.n fl9 1 9 . poids frais
EVOLUTION DES TENEURS EN FERULYL _1 GLUCOSE DANS LES TABACSDE LA VARIETe Xanth/ n.c. INOCULES A ~o·c ET LAISSES 10BHEUREc.iA CETTE TEMPERATIJRt: PUIS TRAN5FERE~ A 30°C. •
------ -- --5'0
trfOBhà fO"e.
F[G.64
---x...,,,,x_---,c,
... ... ,... ...
48 96 120 144 ~GB
temps Qn heures à .30°c.aprés un séjour de 10B hfVre~ à 20°C
2.- Transfert thermique de 30 Oc à 20 Oc
Après avoir été inoculés à 30 Oc et laissés 36 heures ou 48 heures àcette température, ce qui permet l'extension de l'infection à partir du pointd'inoculation, les N.xanthi n.c sont transférés à 20 oC. Nous voyons alors apparaître des lésions locales ainsi qu'un début de nécrose de la feuille inoculée.La réaction d'hypersensibilité est déclenchée lors du passage des plantes inoculées à 20 Oc ; elle intéresse d'un seul coup la majorité des cellules infectéeset apparaît à un moment faeilement repérable. La nécrose commence à se manifester dans ces conditions expérimentales après quelques heures de séjour à 20 Oc(de 8 à 12 heures).
Pour ce type d'expérience, il est nécessaire que le nombre de pointsd'entrée du virus n'excède pas la centaine, afin que lors du transfert à 20 Ocla feuille présente encore des plages de tissus vivants entre les nécroses quiapparaissent à cette température).
Nous constatons d'après les résultats, résumés dans les tableauxXLVI, XLVII, XLVIII,XLIX, L, LI, LII, et exprimés sous forme de graphiques (figures 65,66,67,68,69,70,71,72,73 et 74) que le transfert à cette température entraîne une rapide augmentation des phénols totaux, des acides chlorogéniques etdes flavonosides (rutine et nicotiflorine).Il s'accompagne aussi d'une accumulation des acides para-coumaryl et férulylquiniques (teneurs situées entre 70 et 80 ~g par gramme de poids frais), et enfind'une production de férulyl-l glucose (35 à 40 ~g par grarr@e de poids frais) etde scopoline (20 ~g environ par gramme de poids frais). Ces valeurs concernentun Tabac malade transféré 72 heures à 20 oC.
Ces réactions se manifestent dès un transfert de 36 heures à 20 oC.
Les N.xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 heures à cette température puis séjournant à 20 Oc durant une période de temps de 36 heures voientleurs teneurs en acides chlorogéniques subir une augmentation de 40 %, et cellesdes flavonosides s'élever de 30 %, par rapport aux plantes saines témoins.
La synthèse des acides chlorogéniques et des flavonosides paraît êtreplus importante dans un Tabac infecté ayant passé 36 heures à 30 Oc puis transporté à 20 oC, que dans celui inoculé et laissé 48 heures à 30 Oc avant le passage à 20 oC. Ce phénomène est logique puisque dans le dernier Tabac les feuilles virosées comportent une plus grande proportion de tissus nécrosés, donc decellules mortes .', Ces, feuilles urésentant moins de tissus intacts ont donc un métabolisme amoindri par rapport à celui existant dans les feuilles d'un Nicotianaxanthi n.c laissé seulement 36 heures à 30 oC.
De même le séjour préalable de 36 heures à 30 Oc d 'u~ Tabac de la va':::'--:riété xanthi n.c avant son transfert à 20 Oc provoque pour les a.cides caféylquiniques une plus rapide stimulation de synthèse que celle se produisant dans uneplante infectée et laissée à 20 oC. Les symptômes nécrotiques étant plus étenduset apparaissant plus précocement dans le premier Tabac, il est normal que nous yobservions une plus rapide accumulation de ces acides.
- 110 -
Ces résultats viennent confirmer ceux que nous avions obtenus lors dedosages effectués en fonction du temps sur des feuilles saines et nécrosées à20 Oc de N.xanthi n.c. Il indiquent que l'accumulation et la production des nombreuses substances phénoliques dans les Tabacs de la variété xanthi n.c inoculésà 30 Oc puis transférés à 20 Oc sont déclenchées après l'apparition des lésionslocales nécrotiques, c'est-à-dire une fois l'hypersensibilité acquise.
En effet, dans ces conditions, la nécrose est nettement apparenteaprès 12 heures de séjour à 20 oC, or, les différences que nous observons lorsdu transfert à cette température deviennent importantes entre 36 et 72 heures.
- 111 -
EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET, EN PRINCIPAUX PHENOLS DANS DES TABACS DE
LA VARIETE xanthi N.C. INFECTES A 30 OcPUIS SOUMIS A UN TRANSFERT THERMIQUE A
20 Oc (Janvier 1970).
- Phénols totaux (tableau XLVI, figures 65 et 66) ;- Acides chlorogéniques (tableau XLVII, figures 67 et 68)- Flavonosides (tableau XLVIII, figures 69 et 70) ;- Acide p-coumarylquinique (tableau XLIX, figure 71)- Acides férulylquiniques (tableau L, figure 72) ;- Férulylglucose (tableau LI, figure 73)-Scopoline (tableau XLII, figure 74).
• • Tabacs à 20 oC.
trait plein plantes saines 0 "Tabacs laissés 36 h à 30 Oc
En puis transférés à 20 oC.
0Tabacs laissés 48 h à 30 Oc
0transférés à 20 oC.PU1S
A-----..A Tabacs à 20 Oc
En pointillé plantes virosées x- - ----X Tabacs ·inoculés et laissés 36 h à 30 OcPU1S transférés à 20 oC.
11-----8 Tabacs inoculés et laissés 48 h à 30 OcPU1S transférés à 20 oC.
- 112 -
,TABLEAU XLVI
Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures à cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs exprimées en mg d'acide chlorogénique pour 100 grammes de poids frais).
Janvier 1970
XVS - 36 h à 30 Oc 71,25XVMT - 36 h à 30 Oc 67,50
XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 75XVMT - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 111 ,25
XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 73,75
XVMT - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 96,25
XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 86,25
XVMT - 36 h à 30 Oc pUJ_s 60 h à 20 Oc 116,25
XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 72 h à 20 Oc 82,50
XVMT - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 100
XVS - 48 h à 30 Oc 78,75XVMT- 48 h à 30 Oc 66,25
XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 71,25
XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 71,25
VXS - 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 82,50
XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 96,25
XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 78,75
XVMT- 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 82,50
XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 73,75
XVMT - 48 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 82,50
XVS - 36 h à 20 Oc 71 ,25XVMT - 36 h à 20 Oc 93,75
XVS - 48 h à 20 Oc 82,50XVHT - 48 h à 20 Oc 111,25
XVS - 60 h à 20 Oc 90XVMT - 60 h à 20 Oc 131 ,25
XVS - 72h à 20 Oc 82,50XVMT- 72h à 20 Oc 125
- 113 -
~~~AÂ~~
~~,
,K',,",
50
'Bppèlri t'ion macrOSCD piqueâ~ la nécrose
qlm mg IAOD 9 poidS Fraiç
,...." ...." .../ 'a---~
-- ----50
ëI/7par"\tion maao;copiQu~dQ!~ nécr05e
4e 72.hm ps e.n h~ure~
~ 20·C
48 72-temp!i en heures
à ~O" C.t 48
temps en heurl?~
48hà30 0 C ~20"'c..
7i
361\ à 30"[ puis à 20°C 48 h à 3DOC puis à 2.Q''' C.
FI G. 65 EVOLUTIDN DES TENEUR5 EN PHENOLS TO't'AUl DANS DES TABAC.S
DE LA VARIETE Xanthi n,r-. INOC.ULESA 30°C ETLAlSSE"S '3bnu 48 Heurec; A CETT E. TEMPERATURE PUIS TRANSFERES Pt 20°c..,
Phénols tol:.aux
teneurmaladesain
%
100J
400tOlba! ~ain
....------. / -~
1oo+-t_a_b_a_c_s_a_m~.",-~_/ _~--
...--
apparil:.ion macrosCDpique.de la néc..rose
appar',tioo rnatroscopiquede la néc.rosQ.
35 h à :3O·C pui~ à 2.0-c.
49 7'l
tempJ en heure~a 2.0· C
49 h à 30"'C
48 h à :?lODe pui~ à czo"c.
48 72temv) en heUfPt;
ël20·C.36 h à 30"'C:
49 71tempten heorPs
êJ 2.0 0 C.
Fla.66. Tf.=NEUR· EN PHENOLS TOTAUX DES TISSUS MALADES EXPRIMEEEN PDtJRCENTAG.é: DE LA TENEUR DU TEMOlN
TABLEAU XLVII
Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heuresà cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs données ep~g par gramme de poids frais).
Janvier 1970
XVS - 36 h à 30 Oc 107,50XVMT - 36 h à 30 Oc 71 ,25
XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 107,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 180
XVS - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 100XVMT - 36 h à 30 Oc pU1.S 48 h à 20 Oc 171 ,25
XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 117,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 307,50
XVS - 36 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 92,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 262,50
XVS - 48 h à 30 Oc 110XVMT - 48 h à 30 Oc 65
XVS - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 90XVMT- 48 hà 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 146,25
XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 107,50XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 200
XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 107,50XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 200
XVS - 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 85XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 72 h à 20 Oc 167,50
XVS - 36 h à 20 Oc 90XVMT - 36 h à 20 Oc 128,75
XVS - 48 h à 20 Oc 117,50XVMT- 48 hà 20 Oc 175
XVS - 60 IL à 20 Oc 107,50XVMT - 60 h à 20 Oc 257,50
XVS - 72 h à 20 Oc 117,50XVMT - 72 h à 20 Oc 257,50
- 114 -
Acides c:.hlorogéniques
O~n 1l9/ g ooid!" frais Qen f 9 Ig. Doids frais
B---", ,1 \
l ,1 \, \
l '1 ~
11
11,
11
11
11
/1
1
If,
"1 \1 \, \
1 \, \, \1 \, \
1 )',11,,,,
1,1,
111,
11
)L,. 11 .......... ,
1 ... j(1
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11,
.&----4111
11,
11111
1111
11
,6,,,,,,,,1
1
50
4B 72temps pn heures
à iD· C
apPëlri tian macroHDpiqul?dE' la nécrose
appar'ltion méltroslopiquede la nécr05e
l4~ 72-
tfmps en heurtSà 20°C.
FI Ci. 67 EVOLU.T ION DES TENEUR ~ EN ACIDES CHLORD 6ENI QUE5.DANS ilES TABACS DE LA VAR1E.TE Xoenth/ n.c. INOCULESA . 30° C ET LAISSES 36 DU 48 I+EURES A CErTE TEMPERATURE
PUIS TRANjp."ERES A 2.D°C.
~cldes ~hlorcgéniques
....1 ...1 .......11
11
11
11
11
11
tabac sain-\00-+-----
so
teneur ~.,
[m,.lade ~ojsaIn
~/
//
/,)(11~
111
1,1
11
11
111
1
--1.')(--1
1
11
11
11
11
11
1
/ tab ac: sain'100+---+-----------
11
11
11
AO
apparition macrOSCQplqueC\(. 1a n é(r 0 ç e
teneur %
[~al'de ..,o~
sam
..........---./,/,
11...
11
11
11
11
11
11
1 tabac sainil 00+-_---'-:...-- _1
1
11
11
1
5"D
avvari tion macro~copi que.de la nétrosE'
46 72.tEmps" en hlure~
à ~o·c.
46 7fremp' _en heures
a 20"c..
36 h ~ 30" C pUIS cà 2.0· C
FJG.68 TENEUR EN ACIDES CHLDROGENIQUE5 DES TlS5US MALADES,EXPRIMEE EN POURCENTAGE. DE LA TENEUR DU "TEMOIN.
TABLEAU XLVIII
Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures àcette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs données en ~g
par gramme de poids frais).
Janvier 1970
xvs - 36 h à 30 Oc 50XVMT - 36 h à 30 Oc 40
xvs - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 55XVMT - 36 h à 30 Oc
pu~s 36 h à 20 Oc 78,75
xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 55
XVMT- 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 78,75
xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 40
XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 70
xvs - 36 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 55XVMT - 36 hà 30 Oc puis 72h à 20 Oc 73,75
xvs - 48 h à 30 Oc 52,50XVMT - 48 h à 30 Oc 42,50
xvs - 48 hà 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 57,50
XVMT - 48 hà 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 70
xvs - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50XVMT- 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 70
xvs - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 42,50XVMT - 48 h à 30 Oc
pu~s 60 h à 20 Oc 65
xvs - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 40
XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 48,75
xvs - 36 h à 20 Oc 46,25XVMT - 36 h à 20 Oc 52,50
xvs - 48 h à 20 Oc 52,50XVMT - 48 h_ à 20 Oc 66,25
XVs - 60 h à 20 Oc 57,50XVMT - 60 h à 20 Oc 96,25
XVS - 72 fi- à 20 Oc 52,50XVMT - 72 h à 20 Oc 103,75
- 115 -
411 71.temps ~n heure'i
à 2.0" C
QQ.n P.Q/Q poids frais
50
4-B 71temn en hl?uret;
a 20"C
A 20 CI C.
Rul:ine, Nicot:iflorine.
Q(211)1-9/9 poids frils
... /1.- - - )(,_... _;')(// .........x--...
./,~o..b.-_...~",~-_-o---Q,
...,
apparition mël(ro~(Opiquede \a nac.ro se
t3Ghà 30°C
36 ha 300( puis à 2.0"(
....-- .....~",;--' ...... -.iI,
,.".," " , ,•
apparitiol'\ mëH.ro,;co piqueda Id nl2cro<;e
4i "72.te.mtH en hl?ureç
à 7.0· C
FIG.69 EVOLUTION DES TEN~UR5 EN RUTI NE eT NICOTI FLDR\ NE DAN"> DES TA~ACS
DE LA'JARISTt=. .;yanth/ n.'-. INOrUL~<; A 30"(. ET LA\SSES 36 H~ures
A CETTE TE'MPERA1URE PUIS TRAN~FERE5 A .f.O"c. ,
teneur %m'a/.adQ"'DD
sain
Rul:ine 1 NicociFlorine
tL~r7E.'ur ~
YY\ al,;} de 1DO'èln
tœnEur%
mal,ade ~nosain
'100
... Â..........1
11
11
1,1
1,1,
11
....6..../...
-100
I~l ,
l ,l ,
1 \l ,
l ,
/"'----v:. \," ~,,,,,,
,,/ tabèc. Si.:l\n '100'+---~-------
50 50
apparition matyoscoli'iqul1de la nl?croe;,e.
50
apparition ma[rD~c.opl~u2de 1" nécrose
4B 12.rpmP2 En heureç
è 2.0· C
48 11tem R.~ en n2UrQC;
a 2.0"c.t
48 h à 30 6 C
46 71b2mp,; en heurQ.C5
~ J.o"c,
~6 h à 3D D C puH à 2.D"[
FIG. 7.0 'TE.NEUR EN RUTINE ET EtJ N1CClT\FU~RINE DES T\SSU5 MALADESEXPRIMEE "EN POURCE.NTAGE DE LA TENEUR DU TEMDlN
TABLEAU XLIX
Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c, inoculés à 30 Oc et laissés36 ou 48 heures à cette température, puis transférés à 20 Oc(teneurs données en ~g par gramme de poids frais).
Janvier 1970
XVS - 36 h à 30 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc
XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 36 h à 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 55
XVS - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 70
XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 12XVMT - 36 h à 30 Oc puis 60 h il 20 Oc 88
XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 72 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 90
XVS - 48 h à 30 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc
XVS - 48 hà 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 12XVMT - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 46,25
XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 50
XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 70
XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 12XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 75
XVS - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 20 Oc 55
XVS - 48 h_ à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 20 Oc 68
XVS - 60 h à 20 Oc 12XVMT - 60 h à 20 Oc 88
XVS - 72 h à 20 Oc 10XVMT - 72 h à 20 Oc 90
- 116 -
Acide p _ coumaryL 3 quinique
·r,
Q~n J-L9/ 9 pO'ld!o frais Qen}lq 1g poids frais Qen ~ 9 1 9 poids Fra'ts
,,,....,..
O---:,;-L-'-----G--o-- --a -0,
50
r
".-----.,,,,,~
","
"
: : :49 72
tEmps en heurelià 2. 0' C
50
".x-----x,..,,
,'1.',....,
,..y.,',.. 50,,,..,,
4B 72tempe en heures
li .2..0 oc
'apparition macrosco,iquede L~ n Qcro se
,..,,..48 7'1.
temp§ en heu re~a 2..0°c..
al' pari tian macros cop iquedl! la n~cr~se
A 2.0° C
3Gh à 30"C
3bh à 3DOC puis à. 20°C.
46 h à "30°c..
48 h à 30U C. pui~ a20·C.
FIG. 71 EVOLUTI 0 ri DE5 TENEURS EN AC.t DE P_ CQUNARYL _3 t;TU1N1QUEDAMS DES TABACS DE LA VARIETE X,anthl n.c.. INOC.UU:S A "30°C:ET LAt5~ES 36 ou 4-e HEURES A L.ETTE fiMPERATORE PUIS TRANSFEREe;A 2.00'C.
TABLEAU L
Evolution des teneurs en acides ffru1y1quiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48heures à cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs données en ~g par gramme de poids frais).
Janvier 1970
xvs - 36 h à 30 Oc 15XVMT - 36 h à 30 Oc
xvs - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 42,50
xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 10
XVMT- 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50
xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 15
XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 87,50
XVS - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 75
xvs - 48 h à 30 Oc 15XVMT - 48 h à 30 Oc
xvs' - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 43,75
xvs - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50
xvs - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 58,75
xvs - 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 66,25
xvs - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h. à 20 Oc 31,25
xvs - 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 20 Oc 58,75
xvs - 60 h à 20 Oc 15XVMT- 60 h à 20 Oc 78,75
xvs - 72 h à 20 Oc 10XVHT - 72 h à 20 Oc 91,25
- 117 -
9an }'9'9 p~ld~ fra\c;
Acide.s FÉrul~lqu'Jn\que5
Qen fig / 9 poIds fraie; Qen fg/9 poids frais
50 bo
X...1 ......
1 .../ 'x
11
11
/~ 50
/,~--'~--r--.---r--'--'
4B 72-temp~ ~n heures
d ~O .. C.
Clpparition ma(ro~(apiql.l\!
de la néc::ro51l
-", ........ ",
.~
".... ....../
..l'
'",'"/
'"/,/
'"4e 7'-
temps.... eJ\ heur~ ~a sto°e.
êlpparitian mac.rascopiQue. dE' la né crQ~ e
A 2.0'" c:.
F/G.7.2 EVOLUTION DES TENEUR5 EN AC.IDES FERULYLIjlUINltfUESDA~S DES TABACS DE LA VARIETE >éanthi n.~. INOCUL.ES A 30·C,ET LAISSES 36 OU 4B HEURE.S A CETTE TEMPERATURE PU\S TRANSFERESA 20° C .
TABLEAU LI
Evolution des teneurs en férulylglucose dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heuresà cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs donnéesen ~g par gramme de poids frais).
Janvier 1970
XVMT- 36 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 20
XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 40
XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 20
XVHT - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 35
XVMT - 72 h à 20 Oc 30
- 118 -
9Q. n }l9'9 pÔld~ fraica
'50
•"'""/"""
tœru1yl_1g' UC.OS2
oe.n fl9'9 poids fra,ç
50",:JI.
'"",",y..
"",-
'"
QenJl9 '9 poids frais50
48 71.temp5 ':,V\ heufI!s
.;J !i!.O·C
+8 71~emp~ en hwret:.
.à 2.0" C
apparition rnacfascov'lquede fa n~Cr05l!
48 7'-b/.mp5 ~n he\}re~
8 2.0"c:.
ëlppdri tionrrrt1c.roscopiqul!de la nÉl.roc:.e
48h à '30f1C
FJG·73 EVOLUTION DES TENeURS EN F'ERUlYL_1 GlUCOSE DANS DESTABACS DE LAVARIETE xanthi (\.t. INOCULES A 30°C. ET LAlSSE'i36 OU 48 HEURES A CErTE TEM PE ~ATURE PU!'; TRANSFERECi A 20"c.. ..
TABLEAU L11
Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures à cettetempérature, puis transférés à 20 Oc (teneurs données en ~g pargranme de poids frais).
Janvier 1970
XVMT- 36 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 12,50
XVMT - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 13,75
XVMT - 36 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 15
XVMT- 36 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 22,50
XVMT - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 15
XVMT- 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 16,25
XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 21,25
XVMT- 48 hà 30 Ocpu~s 72 h à 20 Oc 15
XVMT - 48 h à 20 Oc 12,50
XVMT- 60 hà 20 Oc 17,50
XVMT- .72 h. à 20 Oc 26,25
- 119 -
Sc:opofine
Qan J-Lg 1 9 poids fral~ Qen~9/q poids frais
5"0 50
9en J!g tg poids frai~
50
48 71t.emps en heures
cl 9..0"C
A 2.0° C.
__~x- ---'j(-- --y----------49 7!
~~mps _en heùreçoB w· c.
apparition macro!)c.ap'iquede. fa néc.rosQ
3éh à 30"C. pui~ à 20"(
-_ ........ ,---.----- ' ....-------45 72.
temp~ en heure.c,a 2.0 D c
appêlri tion ma CT.Oli c.opiqu ede la necrose
48 h à 30°C.
FIG.74 EVOLUTION De~ rENEUR~ EN SCOPOLlNl.: DANS DES TABACSDE. LA 'VARIETE Xanthi' n.c. INOCULf~ A3Do C ET LAIsses 36 ou---4BHE"URE5 A (ET1E TEMPERATURE PUIS TRANSFERES A xo~c.
II - DISCUSSI~~.
INTERPREmTION DES RESULTATS.
Les dosages des composés phénoliques effectués en fonction du tempssur des feuilles saines et vi rosées à 20 Oc de Nicotiana xanthi n.c, ont permisde résoudre le problème du rôle de ces substances dans la formation des lésionslocales nécrotiques. Il n'y a pas accumulation ou production de phénols avantl'apparition des symptômes nécrotiques. Les différences à 20 Oc entre plantessaines et malades deviennent importantes lorsque la synthèse du virus est pratiquement achevée et que l'hypersensibilité est acquise. Ces variations maximalesentre 60 et 156 heures après inoculation pour un N.tabacum variété xanthi n.cinfecté à 20 oC, tendent ensuite à s'estomper pour la plupart des composés phénoliques.
Les substances phénoliques ne sont pas respondables de la formationdes nécroses, donc de la réaction d'hypersensibilité. La synthèse phénoliquen'apparaît stimulée que par suite d'effets secondaires de l'infection virale.
Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par CABANNE et coll.(25) concernant l'ac tivité de la polyphénoloxydase, chez le Nicotiana xanthin.c infecté à 20 Oc par le virus de la mosaique du Tabac. Ces auteurs ont en effet montré que l'augmentation de l'ac_ tivité enzymatique est postérieure à lanécrose. Ils en concluent que l'augmentation de la polyphénoloxydase n'est pasresponsable de la mort des cellules mais doit être plutôt considérée comme uneréaction secondaire.
L'augmentation de l'activité polyphénoloxydasique et l'accumulationet la production de substances phénoliques sont plutôt les conséquences que lescauses de ce processus. La synthèse de l'oxydase pourrait être déprimée par uninducteur, ce dernier pouvant être l'un des substrats de l'enzyme.•
L'hypothèse suivant laquelle des quinones toxiques résultant de l'oxydation des phénols par la polyphénoloxydase seraient capables de tuer les cellules malades (41) et ainsi d'arrêter l'infection virale ne semble pas vérifiée •.
Si les composés phénoliques ne peuvent être considérés comme intervenant directement dans le blocage de la replication de l'ARN viral, il est toutefois possible que l'inhibition pouvant intervenir dans l'activité de l'ARN re~
plicase soit cependant lié au cycle oxydatif des phospho-pentose. L'accumulationdes phénols n'est qu'une conséquence de la stimulation de cette voie.
Les résultats obtenus par SCALLA et coll. (124) sur la pertubation dumétabolisme du phosphore dans le Nicotiana tabacurn xanthi n.c virosé à 20 Ocont montré que l'apparition des symptômes de la réaction d'hypersensibilité, estprécédée par une diminution de l'incorporation de l'ion.phosphate dans les estersphosphoriques à la lumière et à l'obscurité. Ce ralentissement des phosphorylations ne peut-être causée par une accumulation des produits d'oxydation des phénols. Or, la voie des phospho-pentose n'est pas spécialement une voie énergétique comme la glycolyse ou le cycle de Krebs, mais elle assure une réserve d'hydrogène sous une forme active de NADPH 2 utilisable dans des réactions de synthèse. Il n'est donc pas certain que le cycle des pentoses soit lié à des phospho-
- 120 -
rylations oxydatives, le NADPH pourraît être également réoxydé par certains processus non phosphorylants qui fonctionneraient dans les tissus du N.xanthi n.cvirosés à 20 oC.
CROOK et MORGAN (35) ont m~s en évidence chez le chou-fleur, un enzymecatalysant la réduction de l'acide déhydroascorbique par le glutathion réduit.Cet enzyme a été retrouvé chez le pois par 11APSON et GODDARD (89) et dans lesplantules de blé par CONN et VENNESLAND (30). Ces deux dernières équipes de chercheurs ont également démontré l'existence d'une NADPH 2 -glutathion réductase synthétisant la réduction de glutathion oxydé par le NADPH 2 • ANDERSON et coll. (3)ont démontré la large répartition de ces deux enzymes. Enfin, de très nombreuxvégétaux possèdent une acide ascorbique-oxydase (enzyme catalysant l'oxydationdirecte de l'acide ascorbique). Le transfert des électrons du NADPH 2 à l'oxygènemoléculaire pourrait se faire selon la séquence d'oxyda-réduction suivante:
NASPH + H+ glutation acide acide
C~p+)( OXYdé) déhydro- ascorbique
c:~o2H glutathion ascorbique oxydase
réductase réductase
Jglutathion acideréduit déhydro-
ascorbique
Les observations faites au microscope électronique (125) sur des chloroplastes de Nicotiana tabac~~ xanthi n.c au cours de la réaction d'hypersensibilité montrent que ces organites possèdent un système lamellaire désorganisé.Ces observations sont en accord avec la diminution de l'intensité de la photosynthèse observée par OWEN (104) dans le cas d'une infection locale et nécrotique. Elles correspondent également à une baisse des photophosphorylations. Ladésorganisation au niveau des chloroplastes doit entraîner une baisse dans laformation du ribulose-I,5-diphosphate à partir du ribulose-5 phosphate (catalysée par la phosphoribulokinase localisée dans les chloroplastes), et ainsï permettre la complète utilisation de ce métabolite dans la voie des phospho-pentose.
- 121 -
Résumé Conclusions Générales
On sait que chez les végétaux,et tout particulièrement chez le genreNicotiana, l'infection par un virus (virus de la mosaïque du Tabac: V.M.T.)peut provoquer une infection généralisée (cas du Nicotiana tabacum variété samsun) ou une réaction dite "d'hypersensibilité" (cas du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c) se traduisant par des lésions locales nécrotiques au voisinagedirect des points de pénétration du virus.
Les travaux entrepris dans le laboratoire montrent que l'arrêt de lamultiplication virale (V.M.T.) chez un hôte hypersensible comme le Nicotiana tabacum variété xanthi n.c, n'est pas dû à une barrière de cellules mortes, caril existe du virus biologiquement actif dans les cellules vivantes situées audelà de la nécrose, mais à une autre barrière que nous ne sommes pas encore enmesure de définir, telle que ces cellules sont incapables de répondre complètement à l'information génétique que possède l'acide ribonucléique viral. L'élévation de température lève cette incapacité.
Les examens au microscope électronique dans certaines conditions descellules vivantes avoisinant les lésions nécrotiques à 20 oC, ne permettent pasd'y mettre en évidence des particules virales complètes. Par contre, il est observé très fréquemment un matériel de structure irrégulière de nature encore inconnue. Lors du retour à 30 Oc ce matériel a tendance à disparaître, et on observe de nombreux bâtonnets (V.M.T.), ainsi que des structures qui seraient des formes incomplètes de virus.
Il doit exister dans les cellules infectées à 20 Oc un mécanisme bloquant l'une ou l'autre des différentes étapes conduisant au virion complet. Laperturbation pourrait se situer au niveau de l'ARN replicase. La mise hors-circuit de l'enzyme proviendrait soit de la répression de sa synthèse, soit de l'inhibition de son activité. Ce processus pourrait être réalisé grâce à un métabolite produit par le Nicotiana tabacum xanthi n.c virosé à 20 oC. Cette substancepourraît être thermolabile, ou sans être sensible à la température l'enzyme nécessaire à sa synthèse serait inhibé ou détruit aux températures supérieures à29 oC.
Les composés phénoliques étan~ selon certains auteurs impliqués dansles processus biochimiques conduisant à l'expression du phénomène d'hypersensibilité au virus, il nous a paru digne d'intérêt d'analyser d'une façon préciseles variations subies par ces substances au cours de l'hypersensibilité, et devoir s'il existe un lien entre métabolisme des phénols, hypersensibilité et température.
- 122 -
Dans une première partie nous avons tenté de faire un inventaire aussipreC1S que possible des composés phénoliques présents dans les Tabacs. Nous avonsainsi montré que les principaux phénols identifiés dans les feuilles saines deNicotiana xanthi n.c (20 Oc - 30 OC) sont les acides chI orogéniques et la rutineou rhamnoglucoside-3 quercétine. Les acides chlorogéniques sont au nombre detrois: l'acide caféyl-3 quinique ou chlorogénique, l'acide caféyl-5 quinique ounéochlorogénique et l'acide caféyl-4 quinique. Les feuilles de ces Tabacs renferment également d'autres flavonosides comme la nicotiflorine (rhamnoglucoside3 kaempférol) et l'isoquercitrine (monoglucoside-3 quercétine). Ces différentscomposés se retrouvent dans les feuilles de Nicotiana tabacum variété samsun. Ily a cependant une différence concernant la scopoline : ce glucoside de la scopolétine (glucoside-7 scopolétine) est toujours décelé dans des extraits de feuilles de Nicotiana tabacum samsun, mais est absent ou en quantité extrêmement faible dans ceux des Tabacs de la variété xanthi n.c.
Les principales modifications métaboliques affectant CEScomposés peuvent se résumer ainsi :
1.- La formation de lésions locales nécrotiques, se traduit par l'accumulationde flavonosides (rutine, nicotiflorine), d'acides chlorogéniques, d'acide para-coumaryl-3 quinique, d'acides férulylquiniques tout particulièrement d'acide férulyl-3 quinique. Ces derniers composés ne sontqu'à l'état de traces dans les Tabacs sains de la variété xanthi n.c.L'hypersensibilité s'accompagne de la production de caféyl-l glucose,
d'ortho-coumaryl-l glucose, mais surtout de férulyl-l glucose et de scopoline.Elle conduit à la formation de substances renfermant du glucose et dont la partiephénolique est soit un acide benzoique (acide vanillique, gentisique, para-hydroxybenzoique) soit un dérivé de l'acide cinnamique (acides sinapique, mélilotiqueortho-coumarique). L'acide ortho-coumarique semble être présent dans les feuilles nécrosées sous la forme de l'ortho-coumarique-l glucose, de l'ortho~coumaryl
1 gentiobiose et du mélilotoside (hétéroside de l'acide ortho-coumarique et duglucose). La formation des nécroses d'hypersensibilité fait également apparaîtredes phénols comme la cichoriine (glucoside-7 esculétine), le férulyl-l gentiobiose, le gentiobiose-7 scopolétine), et des substances non encore identifiées présentant entre elles des analogies de structures et qui possèdent certaines despropriétés des acides férulique et sinapique.
2.- Des dosages effectués en fonction du temps sur des feuilles saines et nécrosées de Nicotiana tabacum xanthi n.c à 20 Oc montrent que l'accumulation des phénols est postérieure à ·1 'apparition de la nécrose. Celleci COMuence à apparaître dès 36 heures après l'inoculation dans nosconditions expérimentales. Les différences à 20 Oc entre plantes saines et malades deviennent importantes quand les symptômes sont nette-
ment apparents, c'est-à-dire quand la synthèse du virus est pratiquement achevéeet que l'hypersensibilité est acquise. Ces variations maximales entre 60 et 156heures après inoculation, tendent ensuite à s'estomper pour les acides chlorogéniques et les flavonosides. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus parCABANNE et coll. concernant l'activité de la polyphénoloxydase chez le Nicotianatabacum variété xanthi n.c infecté~20 Oc par le virus de la mosaique du Tabac.Ces auteurs ont montré en effet une augmentation de l'activité enzymatique aprèsl'apparition des lésions locales. Il en concluent que l'augmentation d'activité
- 123 -
de la po1yphéno1oxydase n'est pas responsable de la mort des cellules, malS doitêtre une réaction secondaire postérieure à celle-ci.
L'augmentation de l'activité po1yphéno1oxydasique et l'accumulationphéno1ique sont donc plutôt les conséquences que les causes de ce processus. Lasynthèse de l'oxydase pourrait être déréprimée par un inducteur, ce dernier pouvant être l'un des substrats de l'enzyme.
L'hypothèse suivant laquelle des quinones toxiques résultant de l'oxydation des phénols par la po1yphéno1oxydase, seraient capables de tuer les cellules malades et ainsi d'arrêter l'infection virale ne semble pas vérifiée.
3.- L'infection du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c à 30 Oc conduit à unedinlinution très importante des teneurs en acides ch1orogéniques et enf1avonosides. Elle ne s'accompagne ni d'une accumulation des acidespara-coumary1 et féru1y1quiniques, ni de la pr~duction des nombreusessubstances caractéristiques de l'hypersensibilité. Cette baisse estsurtout importante pour des Tabacs virosés ayant séjourné à 30 Oc entre 36 et 156 heures après l'inoculation. A partir d'un temps de 204
heures à 30 oC, les plantes malades renferment des quantités d'acides ch1orogénlques et de f1avonosides plus élevées que les plantes saines correspondantes.
Au cours de sa multiplication, le virus doit détourner à son profitles métabolites qui interviennent directement ou indirectement dans la biosynthèse des phénols ; lorsque le taux de virus atteint son maximum dans les feuilles infectées, les métabolites de l'hôte peuvent être de nouveau utilisés dansla chatne de réaction menant aux composés phéno1iques.
Il semble également que le séjour à 30 Oc entraîne chez le Nicotianaxanthi n.c sain, une certaine diminution de la teneur en acides ch1orogéniquesmais surtout en f1avonosides (rutine et nicotif1orine).
Nous avons constaté que si des feuilles nécrosées sont soumises à untransfert thermique de 20 Oc à 30 oC, ce qui permet la généralisation du virus,il y a une baisse importante de tous les composés phéno1iques et une disparitionbrutale des substances comme la scopo1ine , le féru1y1-1 glucose et l'ortllo-coumary1-1 glucose. L'inhibition de synthèse des substances phéno1iques doit correspondre à une production accélérée de particules virales (cette dernière étantdéclenchée par le retour à 30 OC).
Si la plante est inoculée à 30°C et laissée 36 heures à cette température puis transférée à 20 oC, nous voyons apparaître des lésions locales de5 à 6 mm sur la feuille inoculée. Les Tabacs sont alors capables d'accumulerles composés caractéristiques de l'infection virale à 20 oC. Les dosages établisen fonction du temps sur de telles plantes confirment ceux obtenus à partir desN.xanthi n.c virosés à 20 oC. Ils indiquent que l'accumulation et la productiondes phénols sont postérieures à l'apparition des symptômes nécrotiques c'est-àdire à la réaction d'hypersensibilité.
Il apparaît donc que d'une part, la multiplication du virus, d'autrepart, la température, affectent le métabolisme des phénols dans les feuilles deNicotiana tabacum variété xanthi n.c.
- 124 -
4.- Le Nicotiana tabacum samsun bien qu'accumulant au cours d'une infection par.le virus de la mosaïque du Tabac, les acides chlorogéniques, les flavonosides et l'acide p-coumaryl-3 quinique ne produit ni les acides férulylquiniques, ni les très nombreux composés apparaissant dans un Nicotiana tabac~~ variété xanthi n.c virosé à 20 oC. Nous avons aussiconstaté que l'accumulation en scopoline est moindre que dans un Tabacde la variété xanthi n.c.
Le métabolisme des composés phénoliques dans le Nicotiana tabacum xanthi n.c virosé à 30 Oc est différent de celui existant dans le Nicotiana tabacumvariété samsun. Ces deux Tabacs pourraient réagir différemment à l'égard du virusde la mosaique du Tabac dans le cas d'une infection systémique.
Les observations cytologiques faites à l'aide du microscope électronique montrent que l'infection à 32 Oc d'un Tabac hypersensible et celle d'un Tabac sensible semblent provoquer des altérations cytologiques comparables, maisavec deux différences : le Nicotiana tabacum xanthi n.c renferme plus de virionsintranucléaires et les altérations des noyaux des jeunes feuilles infectées sontmoins durables que chez le Nicotiana tabacum variété samsun. La multiplicationvirale pourrait être plus importante dans le cas du Nicotiana tabacum xanthi n.cvi rosé à 30 oC, donc l'utilisation des systèmes métaboliques de l'hôte, et parconséquent cela entraînerait une accumulation moindre en phénols.
La stimulation de synthèse des phénols étant un phénomène accompagnantl'infection virale à 20 Oc du Nicotiana tabacum xanthi n.c, on peut penser quela formation de lésions locales nécrotiques s'accompagne de l'activation ducycIe des phospho-pentoses, c'est-à-dire, de la stimulation des enzymes appartenant à ce cycle, en particulier des deux déshydrogénases spécifiques (glucose-6phosphate, 6-phosphogluconate déshydrogénases). Cette voie oxydative fourniraitl'érythrose-4 phosphate et le NADPH2 (nicotinamide, adénine, dinucléotide phosphate) nécessaires à l'élaboration des noyaux benzénique et indolique. Le coenzyme est nécessaire à la réduction de l'acide déhydro-5 shikimique en acide shikimique. La dégradation du glucose se ferait préférentiellement par cette voieau dépens de la glycolyse. L'intensité de ce shunt, c'est-à-dire son utilisationpourrait être réglée soit par la vitesse avec laquelle certains termes intermédiaires seraient susceptibles d'être utilisés dans un métabolisme propre, soitplutôt par les possibilités de réoxydation du NADPH 2 • Parallèlement à cela, ilpourrait s'effectuer des inhibitions enzymatiques de la voie d'Embden-Meyerhofpar certains produits de réaction du cycle des pentoses.
Il n'est pas certain que ce cycle des phospho-pentoses soit lié à desphosphorylations oxydatives, le NADPH2 produit pourraît être réoxydé par certainsprocessus non phosphorylants qùi fonctionneraient dans les tissus du Nicotianatabacum variété xanthi n.c, virosé à 20 oC.
La voie des phospho-pentoses n'est pas spécialement une voie énergétique comme la glycolyse et le cycle de Krebs, mais elle assure une réserve d'hydrogène sous une forme active de NADPH2 utilisable dans les processus des bioxynthèses réductives.
L'intervention du cycle des pentoses au dépens d'un métabolisme énergétique dans la réaction d'hypersensibilité n'est pas en opposition avec les résultats obtenus par SCALLA et coll. sur la perturbation du métabolisme du phos-
- 125 -
phore dans le Nicotiana tabacum variété xanthi n.c virosé à 20 oC. Ces auteursont montré que l'apparition des symptômes de la réaction d'hypersensibilité estprécédée par une diminution de l'incorporation de l'ion phosphate dans les esters phosphoriques à la lumière et à l'obscurité. Le ralentissement des phosphorylations ne peut être causé par une accumulation de produits d'oxydation desphénols. Les observations faites au microscope éLectronique sur des chloroplastes de Nicotiana tabacum xanthi n.c au cours de la réaction d'hypersensibilitémontrent que ces organites possèdent un système lamellaire désorganisé. Ces observations sont en accord avec la diminution de l'intensité de la photosynthèseobservée par OWEN dans le cas d'une infection locale et nécrotique. Elles correspondent également également à une baisse des photophosphorylations. La désorganisation au niveau des chloroplastes doit entraîner une baisse dans la formationdu ribulose-1,5-diphosphate à partir du ribulose-S phosphate (catalysée par laphosphoribulokinase localisée dans les chloroplastes), et ainsi permettre la complète utilisation de ce métabolite dans la voie des phospho-pentoses.
si les composés phénoliques ne peuvent être considérés COIT@e intervenant directement dans le blocage de la replication de l'ARN viral, il est toutefois possible que l'inhibition pouvant intervenir dans l'activité de l'ARN replicase soit liée à ce cycle oxydatif des pentoses, l'accumulation des phénolsétant postérieure à la stimulation de cette voie.
Une des conséquences de l'infection virale à 20 Oc du Tabac hypersensible est l'accumulation de phénols sous forme de glucosides et d'esters du glucose. Cet apport de glucose pourrait être réalisé grâce à des enzymes utilisantcomme donneur glucose de l'uridine diphosphate glucose. De telles réactions sontconsidérées comme des mécanismes désintoxifiants, car l'administration de phénols aux plantes résulte en leur rapide conversion en ces dérivés du glucose.
L'hypersensibilité entraîne également l'activation des réactions deméthylation (production des dérivés de la scopolétine, de l'acide férulique, del'acide sinapique et de l'acide vanillique). Ce phénomène doit être la conséquence de la stimulation de la O-rnéthyltransférase. Cet enzyme assurerait letransfert du groupement méthyle probablement sous forme de la S-adénosylméthioni-ne.
La présence de composés ortho-hydroxylés (acides ortho-coumarique, mélilotique) dans les feuilles nécrosées à 20 oC, montre que l'hydroxylation del'acide cinnamique peut se faire dans ce cas aussi bien en position ortho ,queparL' de la chaîne carbonée.
Les mécanismes contrôlant la"biosynthèse des phénols sont communs àtoutes les voies biosynthétiques. Ils font intervenir deux processus: d'abordla répression ou l'induction des systèmes enzymatiques, puis l'inhibition des activités enzymatiques par des métabolites de la chaîne biosynthétique. Dans cedernier type de régulation, il y a intrication d'!Ï:nhibitions successives par desproduits de la réaction, assurant une auto-régulation par un contrôle dit !làréaction" (feed-back control). L'accumulation de nombreux phénols dans les tissus virosés à 20 Oc de Nicotiana tabacum variété xanthi n.c, pourrait être provoquée par la perte des propriétés régulatrices de ces enzymes allostériques invoqués dans leur chaîne biosynthétique.
- 126 -
Références Bibliographiques
1. AKAIKE (S.) - 1955 - Isolation of sorne coumarin, polyphenolic compoundsand new nicotine combined substances from yellqwleaf tobacco (filltano Tob.Expt.Station, Japan Special Bull., 7).
2. AKAZAWA (T.), URITANI (1.) et KUBATA (H.) - 1960 - Isolation of ipomeamarone and two coumarin derivatives from sweet patata roots injured by thethe weevil cycas Formicarius eZegantuZus. (Arch.Biochim.Biophys., 88,
pp. 150-156).
3. ANDERSON (D.G.), STAFFORD (H.A.), CONN (E.E.) et VENNESLAND (B.) - 1952 The distribution in higher plants of triphosphopyridine nucleotide linkedenzyme system capable of reducing glutathione (Plant Physiol., 27,pp. 675-684).
4. ANDREAE (W.A.) - 1948 -The isolation of a blue fluorescent from greenMountain patata tubers infected with leaf roll virus. (Canad.J.Res., 26,pp. 31-34).
5. ASEN (S.) et EMSWELLER (S.L.) - 1962 - Hydroxycinnamic acids and their glucose esters in hybrids of LiZium species and their relation ta germination. (Phytochemistry, 1, pp. 169-174).
6. AUSTIN (D.J.) et }ŒYERS (M.B.) - 1965 - Studies on glucose intermediatesin umbelliferone biosynthesis (Phytochemistry, 4, pp. 255-262).
7. BALTIMORE (D.), BECKER (Y.) et DARNELL (J.E.) - 1964 - Virus-specifie double stranded RNA in poliovirus infected cells.(Science, 143, pp. 10341036) .
8. BALTIMORE (D.), et FRANKLIN (R.M.) - 1962 - Preliminary data on a v~rus
specifie enzyme system responsible faT the synthesis of viral RNA.(Biochem.biophys.Res.Communic., 9, pp. 388-392).
9. BASYOUNI (El. S.Z.), CHEN (D.), IBRAHIM (R.K.), NEISH (A.C.) et TOWERS(G.H.N.) - 1964 - The biosynthesis of hydroxy benzoic acids ~n higher
plants. (Phytochemistry, 3, pp. 485-492).
10. BATE-SMITH (E.C.) - 1948 - Paper chromatography of anthocyanins and related substances in petaI extracts.(Nature, 161, pp. 835-838).
Il. BATE-SMITH (E.C.) - 1954 - Leuco-anthocyanins. I.Detection and identification of anthocyanidins formed from leuco-anthocyanins in plant tissues(Biochem. J., 58, pp. 122-125).
- 127 -
12. BATE-SMITH (E.C.) - 1954 - Ferulic sinapic and related acids in leaves.(Chem. and Industry, pp. 1457-1458).
13. BATE-SMITH (E.C.) - 1964 - Paper chromatography of phenolics.(in Methods ~n
Polyphenol chemistry, Pridham J.B., Pergamon Press, pp. 73-79).
14. BATE-SMITR (E.C.) et WESTALL (R.G.) - 1950 - Chromatographie behaviour andchemical structure. I.Some naturally occurring phenolic substances.(Biochem.biophys.Acta., 4, pp. 427-440).
15. BEST (R.J.) - 1936 - Studies on a fluorescent substance present in plants.I.Production of the substance as a result of virus infection and some applications of the phenomenon.(Austral.J.Exper.Biol.med.Sci., 14, pp. 199213) .
16. BEST (R.J.) - 1944 - Studies on a fluorescent substance present in plants.2.Isolation of the substance in a pure state and and its identificationas 6-methoxy-7-hydroxy 1:2 benzopyrone (Austral.J.exper.Biol.m.Sci., 22,pp. 251-255).
17. BIRCR (A.J.) et DONOVAN (F.W.) - 1953 - Some possible route to derivationof orcinol and phloroglucinol.(Aust.J.Chem., 6, pp. 360-368).
18. BLAND (D.E.) et LOGAN (A.F.) - 1967 - ~ignification in EucaZyptus. Themetabolism of phenylalanine and cinnamyl compounds. (Phytochemistry.,6, pp. 1075-1083).
19. BRAY (H.G.) et THORPE (W.V.) - 1954 - Analysis of phenolic compounds ofinterest in metabolism. (in Methods biochem.Anal., D.GLICK, 1, pp. 27-57).
20. BROWN (S.A.) - 1962 - Biosynthesis of coumarins. IV. The role of glycosidesin the formation of coumarin by HierochZoë odorata. (Canad.J.Biochem.Physiol., 40, pp. 607-618).
21. BRO~m (S.A.) - 1963 - Biosynthesis of the coumarins. IV.The formation ofcoumarins and herni, arin in lavender. (Phytochemistry., 2, pp. 137-144).
22. BROWN (S.A.) - 1965 - Biosynthesis of the coumarins. Further studies onherniarin formation in lavender. (Canad.J.Biochem., 43, pp. 199-207).
23. BROWN (S.A.), TOWERS(G.H.N.) et CHEN (D.) - 1964 - Biosynthesis of thecoumarins. Pathways of umbelliferone formation in Hydrangea macrophyZla.(Phytochemistry., 3, pp. 469-476).
24. BROl~ (S.A.), TOWERS (G.H.N.) et WRIGHT (D.) - 1960 - Biosynthesis of thecoumarins. Tracer studies on coumarin formation in HierochZoë odorata ândMeZiZotus officinaZis. (Canad.J.Biochem.Physiol., 38, pp. 143-156).
25. CABANNE (F.), SCALLA (R.) et MARTIN (C.) - 1969 - Rôle de la polyphénoloxy-,dase dans le déclenchement du processus de nécrose chez le Nicotiana xanthi n.c infecté par le virus de la mosaique du Jabac. (C.R.Acad.Sci.,268, pp. 59-61).
26. CARTWRIGHT (R.A.) et ROBERTS (E.A.H.) - 1955 - Theogallin as a galloyl esterof quinic acid. (Chem-and Industry., pp. 230-231).
27. CARTWRIGHT (R.A.), ROBERTS (E.A.H.), FLOOD (A.E.) et WILLIAMS (A.H.) - 1955 The suspected presence of p-coumarylquinic acids in tea apple and pear.(Chem. and Industry., pp. 1062-1063).
- 128 -
28. CHARAUX (C.) - 1924 - (Bull.Soc.Chem.Biol., 6, p. 641).
29. COMTE (P.), VILLE (A.), ZWINGELSTEIN (G.) et MENTZE1t(C.) - 1960 - Sur labiogénèse de la catéchine. (Bull.Soc.Chem.Biol., 42, pp. 1079-1090).
30. CO}lli (E.E.) et VENNESLAND (B.) - 1951 - Glutathione reductase of wheat germ.(J.biol.Chem., 192, pp. 17-28).
31. CORSE (J.) - 1953 - A new isomers of chlorogenic acid from peaches.(Nature,172, pp. 771-772).
32. CORSE (J.), LUNDIN (R.E.) et WAISS (A.C.Jr.) - 1965 - Identification ofseveral compounds of isochlorogenic acid. (Phytochemistry., 4, pp. 527529).
33. CORSE (J.), SONDHEl}lliR (E.) et LUNDIN (R.) - 1962 - 3-feruloyl quinic acida 3-methyl ether of chlorogenic acid. (Tetrahedron., 18, pp. 1207-1210).
34. CORNER (J.J.) et SWAIN (T.) - 1965 - Enzymatic synthesis of the sugar estersof hydroxy-aromatic acids. (Nature., 207, pp. 634-635).
35. CROOK (E.M.) et MORGAN (E.J.) - 1943 - The reduction of dehydroascorbicacid in plant extracts. (Biochem.J." 38, pp. 10-15).
36. DAVIS (B.D.) - 1955 - Intermediates in amino-acid biosynthesis. (Adv. inEnzymol., 16, pp. 247-312).
37. DIETERMAN (L.J.), YANG (C.H.), NAKAGAWA (Y.) et WENDER (S.H.) - 1959 Identification of esculetin in tobacco and cigarette smoke.(J.org.Chem.,24, pp. 1134-1136).
38. DYMICKY (M.) et STEDMAN (R.L.) - 1959 - (Tobacco.Sci., 3, p. 60).
39. EDWARDS (K.G.) et STOKER (J.R.) - 1967 Biosynthesis of coumarin the ~so-
merization stage. (Phytochemistry., 6, pp. 655-661).
40. FARKAS (G.L.) et KIRALY (Z.) - 1962 - Role of phenolic compounds in thephysiology of plant diseases and disease resistance.(Phytopathol.Z., 44,pp. 105-110).
41. FARKAS (G.L.) et SOLYMOSY (F.) - 1965 - Host metabolism and symptom production in virus-infected plants. (Phytopathol.,Z., 53, pp. 85-93).
42. FELD}Uili (A.W.) et HAW~S (R.W.) - 1968 - Phenolic content in the roots andleaves of tolerant and susceptible citrus cultivars attacked by Radopholus simiZis. (Phytochemistry., 7, pp.~-12).
43. FINKLE (B.J.) et NELSON (R.F.) - 1963 - Enzyme reactions with phenolic compounds : a meta-o methyltransferase in plants. (Biochem.biophys.Acta.,78, pp. 747-749).
44. FINKLE (B.J.) et NELSON (R.F.) - 1963 - Enzyme reactions with phenolic compounds : effect of O-methyltransferase on a natural substrate of fruitpolyphenoloxydase. (Nature., 197, pp. 902-903).
45. FISHER (H.O.L.) et DAN GSCHAT (G.) - 1932 - Konstitution der chlorogensaüre.(Ber., 65 B, pp. 1037-1040).
46. FOLIN (O.) et CIOCALTEU (V.) - 1927 On tyrosi~e and tryptophane determi-nation in proteins. (J.biol.Chem., 73, pp. 627-650).
-.129 -
47. FOLIN (O.) et DENIS (W.) - 1915 - On phospl1otungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. (J.biol.Chem., 12, pp. 239-243).
48. FREUDENBERG (K.) - 1920 - Ueber gerbstoffe. III.Chlorogensaüre, der gerbstoff)artige Bestandteil der Kaffeebohnen. (Ber., 53 A, pp. 232-234).
49 •.FRITIG (B.), HIRTH (L.) et OURISSON (G.) - 1967 - La biosynthèse de la scopolétine et de la scopoline dans des tissus anergiés de Tabac cultivésin vitro. (Bull.Soc.fr.Physiol.vég., 13, p. 51-61).
50. GAMBORG (O.L.) - 1966 - Aromatic metabolism in plants. II.Enzymes of theshikimate pathway in suspension cultures of plant cells. (Canad.J.Biochem.44, pp. 791J 99).
51. GAHBORG (O.L.) - 1967 - Aromatic metabolism in plant. IV.The interconversionof shikimic acid and quinic acid by enzymes from plant cell cultures.(Phytochemistry., 6, pp. 1067-1073).
52. GAHBORG (O.L.) et NEISH (A.C.) - 1957 - Biosynthesis of phenylalanine andtyrosine in Young wheat and buckwheat plants. (Canad.J.Biochem.Physiol.,37, pp. 1277-1285).
53. GEISSMAN (T.A.) et HI~~EINER (E.) - 1952 - Theories of the biogenesis offlavonoid compounds. (Bot.Rev., 18, pp. 77-244, part. I).
54. GORTER (K.) - 1909 - Ueber die Verbreitung des chlorogensaüre ~n der natur.(Arch., Pharmakol., Dtsch, 247, pp. 184-188).
55. GRIFFITHS (L.A.) - 1962 - On the co-occurence of coumarin, O-coumaric acidand melilotic acid in Gliricidia sepium and Dipteryx odorata. (J.exper.Bot., 13, pp. 169-175).
56. GRISEBACH (H.) - 1958 - Uber die Herkfünft des ringes B. (Z.Naturforsch.,13 b., pp. 335-336).
57. GRISEBACH (H.) - 1962 - Die biosynthese der flavonoide. (Planta med., pp.385-397) .
58. GRISEBACH (H.) et BRANDNER (G.) - 1962 - Uber die bildung von 4,4', 6' trihydroxy 1 14C chalkon aus (3 14C) zintsaure in der kircherbse und die unwandlung des 4, 4', 6' trihydroxy-chalkon-4' (8 14C) glucosid in Zellfreinextrakten. (Biochem.biophys.Acta., 60, pp. 51-57).
59. HAMPTON (R.E.), SUSENO (R.) et BRUMAGEN (D.M.) - 1964 - Accumulation 'offluorescent compounds in tobacco associated with tobacco mosaLc virus;Hypersensitivity. (Phytopathology., 54, pp. 1062-1064).
60: lUŒBORNE (J.B.) - 1959 - The chromatography of the flavonoid pigments.(J.Chromatogr., 2, pp. 581-604).
61. HARBORNE (J.B.) - 1960 - Plant polyphenols. t.The coumarins of Solanumpinnatisectum. (Biochem.J., 74, pp. 270-272).
62. HARBORNE (J.B.) - 1964 - Ultraviolet spectroscopy of polyphenols (in Methodsin polyphenol chemistry., PRIDHfu~, J.B., ed. Pergamon Press., pp. 13-36).
63. HARBORNE (J.B.) et CORNER (J.J.) - 1961 - Plant polyphenols. 4.Hydroxycinnamic acid - sugar derivatives. (Biochem. J., 81, pp. 242-250).
- 130 -
64. liARBORNE (J.B.) et SHERRAT (H.P.A.) - 1957 - The identification of the sugars of anthocyanines. (Proc.Biochem.Soc., Biochem.J., 65, pp. 23-24).
65. liARUNA (1.), NOZU (K.), OHTAKA(Y) et SPIEGELNAN (S.) - 1963 - An RNA "rep licase" induced by and selective for a viral RNA : Isolation and properties(Proc.nation.Acad.Sci. U.S.A., 50, pp. 905-911).
66. liASEGAWA (H.) - 1931 - On the chemical properties of the flavone derivativecontained in tobacco leaves with special reference to the color and qualities of the cured leaves. (J.agric.chem.Soc.Jap., 7, pp. 1036-]049).
67. HASLAN (E.), HAWORTH (R.D.) et MARINSON (G.K.) - 1961 - Synthesis of 3-0p-coumarYlquinic acid. (J.chem.Soc., p. 5153-5156).
68. HAVIR (E.) et HANSON (K.R.) - ]966 - Purification and properties of thet-phenylalanine ammonialyase from potato tubers. (Feder.Proc., 25, p. 790).
69. HESS (D.) - ]964 - Nethionin ais methylgruppen donator für Zimtsaüren undAnthocyane. (Z.Naturforsch., 19 b, pp. 148-]50).
70. HESS (D.) - ]964 - Die methylierung von kaffeesaüre zu ferulasaüre durchenzym systeme aus hëheren Pflanzen. (Z.Naturforsch., B, 19 b, pp. 447449) •
71. HESS (D.) - 1965 - Die methylierung von 5-hydroxy-ferulasaüre zu sinapinsaüre in Zellfrein system. (Z.Pflanz.Physiol., 53, pp. 460-463).
72. HOEPFNER (W.) - 1932 - Zwei neue reaktionen für kaffeesaüre und chlorogensaüre.(Chemiker.Ztg., 56, p. 991).
73. HUISNAN (O.C.) et KOSUGE (T.) - 1970 - Conversion of O-(B-D-glucosyloxy)cinnamic acid to O-(S-D-glucosyloxy}-hydroxycinnamic acid in MeZiZotusaZba. (Phytochemistry, 9, pp. 131-137).
74. IBRr\HIM (R.K.) et TOWERS (G.H.N.) - 1960 - The identification by chromatography of plant phenolic acids. (Arch.Biochem.Biophys., 87, pp. 125-128).
75. JACOBSON (J.S.) - 1961 - The brown pigments of autolysed tobacco leaves.I.Isolation and charactêrisation. (Arch.Biochem.Biophys., 93, pp. 580590).
76. JEAN (J.) et REID (W.W.) - 1959 - The chlorogenic acids of tobacco. (Chem.and Industry., pp. 655-656).
77. JOHNSON (G.) et SCHALL (L.A.) - 1952 - Relation of chlorogenic acid to scabresistance in potatoes. (Science., 115, pp. 627-629).
79. JURD (L.) - 1962 - Spectral properties of flavonoid compounds. (in chem. flavonoid compounds., GEISSMAN T.A., ed. Pergamon Press., pp. 107-155).
80. KEITH (R.W.), LE TOURNEAU (D.) et NAHLUM (D.) - 1958 - Qualitative paperchromatographic dete~~ination of phenols. (J.Chromatogr., l, pp. 534-536).
81. KLEINTHOFS (F.A.) et HASKINS (F.A.) - 1967 - Trans O-hydroxycinnamic acidglucosylation in cell-free extracts of MeZiZotus alba. (Phytochemistry,6, pp. 13] 3-1318) .
82. KLEINHOFS (F.A.) et KASKINS (F.A.) et GORZ (H.J.) - 1966 - Ultraviolet-induced isomerisation of 8-D-glucosyl O-hydroxycinnamic acid on filter-papero (J.Chromatogr., 22, pp. 184-186).
- 131 ;;..
83. KOUKOL (J.) et CONN (E.E.) - 1961 - The metabo1ism of aromatic compoundsin higher plants. IV.Purification and properties of the phenylalaninedeaminase of Hardeum vulgare. (J.Bio1.Chem., 236, pp. 2692-2698).
84. KUC (J.), HENZE (R.E.), ULLSTRUP (A.M.) et QUACKENBUSH (F.W.) - 1956 Ch1orogenic and caffeic acids as fungistatic agents produced by potatoesin response to inoculation with Helminthosporium carbonum. (J.amer.ChemSoc., 78, pp. 3123-3125).
85. KURILO (J.) - 1937 - Le glucoside isoquercitrine dans les feuilles de tabac à fumer. (J.Pharm.Chim., 26, pp. 445-449).
86. LENTNER (C.) et DEATHERAGE(F.E.) - 1959 - Organic acids in coffee in relation to the degree of roast. (Food.Res., 24, pp. 483-492).
87. LIEBERMANN (M.), CRAFT (C.C.) et WILCOX (M.S.) - 1959 - Effect of chi11ingon the ch1orogenic acid and ascorbic content of Porto-Rico sweet potatoes(Proc.Amer.Soc.hortic.Sci., 74, pp. 642-648).
88. LOCHE (J.) - 1966 - Contribution à l'étude des po1yphéno1s de la plante detabac.(SEITA, Ann. de la direction des études et de l'équipement, 3,pp. 15-107).
89. MAPSON (L.W.) et GODDARD (D.R.) - 1951 - The reduction of glueathione byplant tissue. (Biochem.J., 49, p. 592-601).
90. MARTIN (C.), 1958 - Etude de quelques déviations du métabolisme chez lesplantes atteintes de maladies à virus. (Thèse de doctorat d'état, Parispp. 1-73.)
91. MARTIN (C.) et GALLET (M.) - 1966 - Contribution à l'étude de la température sur la réaction d'hypersensibilité de certains hôtes à l'égard duvirus de la mosaique du Tabac. (C.R.Acad.Sci., 262, pp. 646-649).
92. MARTIN (C.) et GALLET (M.) - 1966 - Hypersensibilité aux virus, température et induction florale chez les végétaux. (C.R.Acad.Sci., 262, pp. 9971000) .
93. MARTIN (C.), SCALLA (R.), MEIGNOZ (R.) et GALLET (M.) - 1969 - Etude aumicroscope électronique chez le Nicotiana xanthi n.c, des cellules vivantes situées au voisinage d'une lésion nécrotique d'hypersensibilitéau virus de la mosaique du Tabac. (C.R.Acad.Sci., 268, pp. 2183-2185).
94. Mc. CALLA (D.R.) et NEISH (A.C.) - 1959 - Metabo1ism of pheny1propanoidcompounds in Salvia. I.Biosynthesis of phenylalanine and tyrosine. (Canad.J.Biochem.Physio1., 37, pp. 531-536).
95. Mc. CALLA (D.R.) et NEISH (A.C.) ) 1959 - Metabolisun of phenylpropanoidcompounds in Salvia. II.Biosynthesis of pheno1ic cinnamic acids. (Canad.J.Biochem.Physio1., 37, pp. 537-547).
96. MIZUKAMI (Y.) - 1951 - Studies on the chemica1 constituents of the tobaccoplant. I.Evidence of the fluorescent substance in the tobacco plant tobe scopo1etine. (J.agric.Chem.Soc.Jap., 25, pp. 351-353).
97. MONTAGNIER (L.) et SANDERS (F.K.) - 1963 - Rep1icative forrn of encepha1omyocarditis virus ribonuc1eic acid. (Nature., 199, pp. 664-667).
98. NAIR (P.H.) et VINING (L.C.) - 1965 - Cinnamic acid hydroxy1ase in spinach(Phytochemistry, 4, pp. 161-168).
132-
99. NEUBERG (C.) et KOBEL (M.) - 1936 - Conversion of rutin by tobacco enzymesin to brown colouring matter and effect of tobacco enzymes on other polyphenols. (Enzymologia, 1, pp. 177-182).
100. ONISHI (1.), FUKUZUMI (T.), YAMAMOTO (K.) et TAKAHARA (H.) - 1961 - (Sei.Papers, Centr.Res.lnst., Jap.Monop.Corp., 103, p. 25).
101. ONISHI (1.), et YA~OMAMOTO (K.) - 1955 - Studies on the essential oils oftobacco leaves. Part.III.Phenol fraction. (Bull.agric.chem.Soc.jap., 19,pp. 148-152).
102. ONISHI (1.) et YAMAMOTO (K.) - 1956 - Studies on the essential oils of tobacco leaves. Part. IV. Phehol fraction.2. (Bull.agric.chem.Soc.jap., 21,pp. 70-73).
103. ONISHI (1.) et YA}~fOTO (K.) - 1857 - Studies on the essential oils of tobacco leaves. Part. XI.Phenol fraction.3. (Bull.Agric.chem.Soc.jap., 21,pp. 90-94).
104. O~lliN (P.C.) - 1958 - Photosynthesis and respiration rates of Nicotiana gtutinosa infected with tobacco mosaïc virus and of Nicotiana tabacum infected with potato virus X. (Ann.appl.Biol., 46, pp. 198-204).
105. PANIZZI (L.) et SCARPATI (H.L.) - 1954 - Constitution of cynarine, the active princip le of the artichoke. (Nature, 174, p. 1062).
106. PARTRIDGE (S.M.) - 1949 - Aniline hydrogen phthalate as a spraying reagentfor chromatography of sugars. (Nature, 164, p. 443).
107. PARTRIDGE (S.M.) et WESTALL (R.G.) - 1948 - Filter-paper partitiou chromatography of sugars. I.General description and application to the qualitative analysis of sugars in apple juice, egg white and foetal blood ofsheep. (Biochem.J., 42, pp. 238-250).
108. PICTET (G.) et BRANDENBERGER (li.) - 1960 - Substances polyPhenoliques desplantes, séparation des acides phénoliques du café vert et du café rôti.(J.Chromatogr., 4, pp. 396-409).
109. PRO (M.J.) - 1952 - Report on spectrophotometric determination of tanninin wines and whiskies. (J .Ass. ofLagric. Chemists., 35, pp. 255-257).
110. REID (W.W.) - 1956 - The polyphenols and polyphenolase of tobacco. (J.Sco.Leather Trades Chemists., 40, pp. 117-128).
Ill. REID (W.W.) - 1956 - Biosynthesis of scopoletine and caffeic acid inNicotiana tabacum. (Chem. and Industry., pp. 1439-1400).
112. ROBERTS (E.A.H.), CARTWRIGHT (R.A.) et WOOD (D.J.) - 1956 - The flavonolsof tea. (J.Sci.Food.Agric., 7, pp. 637-646}.
113. ROBERTS (E.A.H.) et WOOD (D.J.) - 1951 - The polyphenols and am~no acidsof tobacco leaf. (Arch.Biochim.Biophys., 33, pp. 299-303).
114. ROSENBLAT (H.) et"PELUSO (J.V.) - 1941 - Determination of tannins by pho~~colorimeter. (J.Ass.off.agric.Chemists., 24, pp. 170-181).
115. RUNECKLES (V.C.) - 1961 - Cichoriin in tobacco. (Chem. and Industry., p.893).
116. RUNECKLES (V.C.), - 1963 - Tobacco polyphenols, on the biosynthesis of chlorogenic acid. (Canad.J.Biochem.physiol., 41, pp. 2249-2257).
- 133-
117. RUNECICLES (V.C.) ~ 1963 - Tobacco polyphenols. III.The role of ferulic acidin the biosynthesis of chlorogenic acid. (Canad.J.Biochem.Physioh., 41,pp. 2259-2267).
118. RUNECKLES (V.C.) et WOOLRICH (K.) - 1963 - Tobacco polyphenols. I.The biosynthesis of O-glucosidesJand.O-glucose esters of hydroxycinnamic acids.(Phytochemistry., 2, pp. 1-6).'
119. SATO (M.) - 1966 - Metabolism of the chloroplasts. II.Conversion by isolatedchloroplasts of p-coumaric acid to caffeic acid. (Phytochemistry., 5,pp. 385-389).
120. SATO (M.) - 1969 - The conversion by phenolase of p-coumaric acid to caffeicwith special reference to the role of ascorbic acid. (Phytochemistry.,8,pp. 353-362).
121. SARGENT (J.A.) et SKOOG (F.) - 1961 - Scopoletin glycosides in tobacco tissue. (Physiol.Plant., 14, pp. 504-519).
122. SAVERY (J.T.) - 1 - (Pharm.J.Trans., (3), 14, p. 753).
123. SCALLA (R.), MARTIN (C.), MEIGNOZ (R.) et LHOSTE (B.), - 1969 - Modification de la structure nucléaire chez le Tabac infecté à 32 Oc par le virus de la mosaïque du Tabac Nicotiana tabacum variété samsun. (C.R.Acad.Sci., 269, pp. 586-588).
124. SCALLA (R.) et MEIGNOZ (R.) - 1967 - Quelques effets d'une infection parle virus de la mosaïque du tabac sur le métabolisme du phosphore chez leNicotiana xanthi n.c. (Ann.physiol., 9; pp. 383-396).
125. SCALLA (R.), MEIGNOZ (R.) NOIROT-TL~OTHBE (C.) et MARTIN (C.) - 1969 -Etude au microscope électronique des premiers stades des altérations deschlorophastes chez le Nicotiana xanthi-D.c au cours de la réaction hypersensible au virus de la mosaïque du Tabac. (C.R.Acad.Sci.~268, pp. 527530).
126. SCARPATI (H. L.) et ESPOSITO (P.) - 1963 - Neochlorogenic acid and "band 510"structure. (Tetrahedron Letters., 18, pp. 1147-1150).
127. SEQUElRA (L.) et KELMAN (A.) - 1962 - The accumulation of growth substancesin plants infected by Pseudomonas so~anacearum. (Phytopathology~ 52,pp. 439-448).
128. SHIROYA (A.M.), SHIROYA (T.) et HATTORI (S.) - 1955 - Studies on the ~rowning and blackening of plant tissues. IV.Chlorogenic acid in the leavesof N.tabacum. (Physiol. Plant., 8~ pp. 594-605).
129. SMITH (S.J.B.), JOSLYN (M.A.) et LUKTON (A.) - 1955 - Determination of tan~ins and related polyphenols in foods. (Anal.Chem., 27, pp. 1159-1162).
130. SONDHEIMER (E.) - 1958 - On the distribution of caffeic acid and the chlorogenic acid isomers in plants. (Arch.Biochim.Biophys., 74, pp. 131-138).
131. STECK (W.) - 1967 - Biosynthesis of scopolin 1n tobacco. (Canad.J.Biochem.,45~ pp. 889-896).
132. STECK (W.) - 1967 - Biosynthesis of scopolin 10 tobacco. (Canad.J.Biochem' L
45~ pp. 1995-2000).
- 134 .;..
133. SWAIN (T.) - 1953-- The identification of coumarins and re1ated compoundsby fi1ter-paper chromatography. (Biochem.J., 53, pp. 200-209).
134. SWAIN (T.) et HILLIS (W.E.) - 1959 - The phenolic constituents of Prunusdomestica I.The quantitative ana1ysis of pheno1ic constituents. (J.Sci.Food.Agric., 10, pp. 63-68).
135. TANGUY (J.) et GALLET (M.) - 1969 - Evolution qualitative de certains composés phéno1iques lors du déclenchement du phénomène d'hypersensibilitéau virus de la mosaique du Tabac. (C.R.Acad.Sci., 269, pp. 589-592).
136. TANGUY (J.) et GALLET (M.) - 1969 - Evolution quantitative en fonction dutemps des composés phéno1iques chez le Nicotiana xanthi n.c infecté à20 oC. (C.R.Acad.Sci., 269, pp~ 773-776).
137. UtIDERHILL (E.W.), WATKIN (J.E.) et NEISH (A.C.) - 1957 - Biosynthesis ofquercetin in buckwheat. Part.I. (Canad.J.Biochem. 35, pp. 219-228).
138. U1IDERHILL (E.W.), WATKIN (J.E.) et NEISH (A.C.), 1057 - Biosynthesis ofquercetin in buckwheat. (Canad.J.Biochem., 35, pp. 229-237).
139. VAN SUMERR (C.F.) - 1960 - Germination inhibitary in plant materia1.(inphenolics in plants in health and disease, PRIDHAM, J.B. ed. PergamonPress., pp. 25-34).
140. WADA (E.) - 1952 - Isolation of a kaempferol-3 rhamnoglucoside from flowers of N.sylvestris. (J.Agric.chem.Soc.Jap., 26, pp. 159-162).
141. WATANABE (R.) et vlliNDER (S.M.) - 1965 - F1avonoid and certain related phenolic compounds in parts of the tobacco flowers. (Arch.Biochim.Biophys.,112, pp. 111-114).
142. WEAVING (A.S.) - 1958 - The polyphenols of 'f1ue-cured tobacco, separationand identification of the majar polyphenols. (Tobacco. Sei., 2, p. 1-8).
143. ~ŒISSMANN (C.) - 1965 - Replication of viral RNA. VlI-further studies onthe enzymatic replication of M S 2 RNA. (Proc.nation.Acad.Sci., U.S.A.,54, pp. 202-207).
144. WEISSMA}TN (C.), BORST (P.), BURDON (R.H.), BILLETER (M.A.) et OCHOA (S.) - 1965 - Replication of viral RNA. III.Double-stranded replicative form of
M S ~ phage RNA. (Proc.nation.Acad.Sci., U.S.A., 51, pp. 682-690).
145. WEISSMANN (C.), SIMON (L.) et OCHOA (S.) - 1963 - Induction by an RNA phage of an enzyme catalysing incorporation of ribonucleic acid. (Proc.nation.Acad.Sci., U.S.A., 49, pp. 407-414).
146. WILKINSON (F.), PHILLIPS (M.) et BACOT (A.M.) - 1954 - Chlorogénic andcaffeic acids in certain standard grades of US type 12 tobacco. (J.Ass.off.agric.Chemists., 37, pp. 1004-1012).
147. ~rrLLIAMS (A.M.) - 1955 - Paperchromatography of cinnamic acid derivatives.(Chem.and Industry., pp. 120-121).
148. WILLIAMS (A.M.) - 1958 - A p-coumary1-quinic acid from app-le fruit. (Chem.and Industry., p. 1200).
149. YAMABA (T.), et CARDINI (C.E.) - 1960 - The biosynthesis of plant glycosi-'des. I.Monoglucosides. (Arch.Biochim.Biophys., 86, p. 127-132).
- 135 -
150. YANG (O.H.), NAGAKAWA (Y.) et WENDER (S.H.) - 1958 - Identification of scopoletin in cigarette tobacco and srnoke. (J.org.Chern., 23, pp. 204-205).
151. YANG (G.M.) et WENDER (S.H.) - 1962 - ~ree phenolic acids in cigarette srnoke and tobacco. (J .Chrornatogr., 8, pp. 82--89).
1 '+152. YOSHIDA (S.) et TOWERS (G.H.N.) - 1963 - Synthesis of shikirnic acid C
labelled cornpounds. (Canad.J.Biochern.Physiol., 41, pp. 579-586).
153. YU (L.M.) et Hk~TON (R.E.) - 1969 - Biochernical changes in tabacco infectedwith Colletotrichum destructivum and sorne associated enzymes. (Phytochemistry., 3, pp. 269-272).
154. ZANE (A.), STECK (W.) et ~~NDER (S.) - 1965 - Identification of 4-0-caffeoylquinic 'acid and related depsides in tobacco from cigarettes. (Tobacco,Sci., 9, pp. 85-87).
155. ZUCKER (M.) - 1966 - Inhibition of phendase by cinnamic acid and relatedphenols. (Feder.Proc., 25, p. 758).
- 136 -