Thèse effectuée sous la direction d’Hervé Delacroix
Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC)
Collaboration : Annette Tardieu (LMCP)
MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET
INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION
Marina Casselyn
2
MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION
Présentation du virus
Modélisation par cryomicroscopie électronique
Interactions entre particules virales en solution
Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV
PRESENTATION DU VIRUS
Présentation du virusModélisation par cryomicroscopie électroniqueInteractions entre particules virales en solutionCristallisation et cinétique de nucléation du BMV
I
4
Le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) est particulier aux graminées.
Le BMV est produit au laboratoire par inoculation de plants d’orge. Le rendement est de 100 mg de virus pour 100 g de feuilles infectées.
100 nmcoloration négative
I
5
• capside « sphérique » de 270 Å de diamètre
• le virus n ’est pas enveloppé
• le centre du virus est creux
• génome à ARN simple brin tripartite (enzymes de réplication,
protéine de capside, protéine de mouvement)
• masse de 4,6 MDa
coque protéique
lumen
ARN
270 Å
Caractéristiques du BMV
I
6
protéines de mouvement
désassemblage co-traductionnel
pH < 7 pH > 7
protéines de capsideARN polymérases
Prolifération virale
I
7
(d’après Speir et coll., 1995)
La capside résulte de l ’auto-assemblage de 180 protéines identiques selon une symétrie
icosaèdrique.
A, B et C constituent l’unité asymétrique de la capside.
Le virus a un nombre de triangulation T=3.
Les protéines A, B et C ont des séquences identiques, mais des structures quasi-équivalentes.
Symétrie de la capside
A B C
I
8structure atomique du BMV (réf. PDB 1js9 – Lucas et coll; 2002)
Structure atomique du BMV
capsomères (hexamères et pentamères)
I
structure du CCMV(70% d’identité de
séquence avec le BMV)
modélisation par homologie de séquences
remplacement moléculaire
9
A
C
B
A
B
C-ter
C-ter
Stabilisation de la capside
interpénétration entre dimères fixation d’ions divalents à la surface
I
10
Stabilisation de
la capside
les 6 protéines B et C
forment un tonneau
l’ARN tapisse l’intérieur de la
capside
I
MODELISATION PAR CRYOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE
DES FORMES COMPACTE ET GONFLEE DU BMV A 30 Å DE
RESOLUTION
Collaborations : Nicolas Boisset (LMCP)
Célia Plisson (ICM)
Présentation du virusModélisation par cryomicroscopie électroniqueInteractions entre particules virales en solutionCristallisation et cinétique de nucléation du BMV
II
12
Cryomicroscopie électronique
La vitrification à -180°C permet
• l’observation des macromolécules dans leur état natif
• une plus grande résistance des échantillons aux radiations
Reconstruction 3D (effectuée par C. Plisson, ICM)
• observation de l ’ARN viral, dont l ’organisation ne peut pas être déterminée par diffraction des rayons X
• étude de la structure du BMV à l ’état gonflé, car les particules virales ont des diamètres hétérogènes à pH 7,5 ce qui empêche la cristallisation
II
TECHNIQUES
13
forme compacte
pH 5,9
forme gonflée
pH 7,5
Diamètre des particules virales
à pH 5,9 : 280 Å
à pH 7,5 : 304 Å
II
Microscopie
14
270 Å
304 Å
à pH 7,5 :
à pH 5,9 : existence de pores au niveau des axes 5 et des pseudo axes 6.
- déplacement des capsomères
Gonflement de la capside
- apparition de pores au niveau
des pseudo axes 3
II
Reconstruction 3D
15
Réorganisation de l’ARN
l’ARN se plaque contre la paroi interne, et obstrue les axes 5.
120 Å
160 Å
ARN
II
16
(Speir et coll., 1995)
1- L’ARN serait libéré à travers des pores qui se
forment lors du gonflement du virus, au
niveau des pseudo axes 3
(Albert et coll., 1997)
2- Même si l’on empêche le gonflement de la capside, le virus prolifère. L’ARN serait libéré à travers les axes 5
icosaèdriques.
2 théories pour la libération de l ’ARN :
II
17
Suite à l’augmentation du pH, l ’ARN se positionne au niveau des axes 5 icosaèdriques.
La sortie de l ’ARN se ferait au niveau des pentamères, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’Albert et coll.
CONCLUSION
II
INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION
Collaborations : A. Tardieu (LMCP)
J. Perez, P. Vachette (LURE)
J. Witz (IBMC)
Présentation du virusModélisation par cryomicroscopie électroniqueInteractions entre particules virales en solutionCristallisation et cinétique de nucléation du BMV
III
19
caractériser les interactions en solution d ’un nouveau modèle de macromolécule sphérique en fonction de différents paramètres physico-chimiques
établir les relations entre interactions et conditions de cristallisation
Objectifs des études
III
20
1
10
102
103
104
0 0.005 0.01 0.015 0.02
I(c,
s)
s(A-1)
Diffusion des Rayons X aux Petits Angles
L’intensité diffusée I(c,s) par une solution de concentration c, en fonction du vecteur de diffusion s=2 sin / , donne des indications sur:
- la nature des interactions entre particules en solution
- la forme et la taille des particules
0
5 103
1 104
1.5 104
2 104
0 0.005 0.01 0.015 0.02
I(c,
s)
s(A-1)
répulsion
attraction
III
21
Interactions intermoléculaires en solution
• les forces répulsives de volume exclu
• les forces de van der Waals
• les forces coulombiennes
• les forces attractives de déplétion, en présence de polymères
III
22
Modification de la charge des virus :
• variation du pH de 4 à 7,5
• ajout d ’anions. Les ions n’écrantent pas seulement les charges mais ont un effet différentiel sur les interactions en solution, l’effet Hofmeister
SO42-<HPO4
2- < CH3CO2- ~C6H5O7
3- < HCO3-< Cl- < Br- < NO3
-< ClO4-< SCN-
Induction d’interactions attractives de déplétion par ajout de polyéthylène glycol
Induction d ’un régime attractif
III
23
1
S(c
,s)
s (Å-1)
1
S(c
,s)
s (Å-1)
attraction
répulsion
I(c,s) = I(0,s) x S(c,s)
facteur de forme
signal diffusé par une particule unique
facteur de structure
caractérise la répartition des particules en solution
Par extrapolation du facteur de structure à l’origine, S(c,0), en fonction de la concentration, on accède au second coefficient du viriel A2 (mol.ml.g-2)A2 > 0
A2 < 0
1/S(c,0)=1+2MA2c
Quantification des interactions
I(0,
s)
s (Å-1)
I(0,
s)
s (Å-1)
/cRT=1+A2Mc+A3Mc2+…
III
24
8 103
2.4 104
4 104
5.6 104
0 0.004 0.008 0.012
pH7.5 pH5.9 pH5 pH4
I(c,
s)
s(A-1)
BMV 40mg/ml
4 104
5 104
6 104
0.001 0.0016
Effets de la variation du pH
L’augmentation du pH provoque une diminution des interactions répulsives. La valeur du second coefficient du viriel A2 passe de 2.10-6 à 7.10-7 mol.ml.g-2.
La variation du pH provoque un changement de structure du virus
III
25
modèlescourbes exp.
Conséquence de l’augmentation du pH :
Modèles de sphères creuses
la diminution du rayon interne du virus, correspondant à une réorganisation de l’ARN
III
26
Effets des sels
Le NaNO3 est plus efficace que l’AcNa pour diminuer les interactions répulsives : effet Hofmeister
III
27
La présence de sels provoque également une réorganisation de l’ARN
La valeur de A2 passe de 2.10-6 à 5.10-7 (mol.ml.g-2)
Effets du NaN03 (pH 4)
III
28
Conclusions sur les effets du pH et des sels
La variation du pH et l’ajout de sels en solution provoquent une réorganisation structurale du BMV
La variation de ces deux paramètres n’induit pas d’interactions attractives pouvant amener à la cristallisation du BMV
III
29
Effets du polyéthylène glycol (PEG)
(-CH2OCH2-)n
L’ addition de PEG induit une attraction entre molécules.
Il s’agit d’une « attraction de déplétion ».
Rg PEG 3000 : 23 Å
Rg PEG 8000 : 40 Å
Rg PEG 20000 : 70 ÅRg
2Rg
270 Å
III
30
- l’effet du PEG est relié à sa concentration
0
4 103
8 103
1.2 104
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
4% 6% 8% 10%
I(c,
s)
s(A-1)
BMV 40mg/ml
PEG 8000
- l’effet du PEG est relié à sa taille
Effets du PEG sur le BMV en solution
0
5 103
1 104
1.5 104
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
5mg/ml BMV10mg/ml BMV20mg/ml BMV40mg/ml BMV
I(c,
s)s(A-1)
PEG 20 000 4%
pics de diffractionpics de diffraction
III
- les précipités sont microcristallins
CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN
PRESENCE DE PEG
Présentation du virusModélisation par cryomicroscopie électroniqueInteractions entre particules virales en solutionCristallisation et cinétique de nucléation du BMV
IV
PEG: diagrammes de phase et cristallisation
IV
33
0
10
20
30
40
50
60
0% 2% 4% 6% 8% 10% 12%
BM
V c
on
cen
tra
tion
(m
g/m
l)
% PEG 8000 (w/v)
Diagrammes de phase
200 µm
courbe de précipitation
courbe de solubilité
IV
les conditions de précipitation permettent de prédire les conditions de cristallisation
34
10 % PEG 8000, pH 4 200 µm
Diffusion de vapeur
MicrobatchCristallisation du BMV
4 % PEG 8000 , pH 4
8 % PEG 8000, pH 4(coll. C. Mayer, LMCP)
les cristaux sont obtenus de façon
reproductible, en présence de PEG seul
IV
Cinétique d’apparition et de croissance des microcristaux
Collaboration : S. Finet (ESRF)
IV
36
Ligne ID2 à l ’ESRF
détecteur 2D
échantillon
I(s)
s= 2sin
=1Å
stopped-flow
RX
- le « stopped-flow » permet le mélange rapide de l ’échantillon
- la première mesure est effectuée 180 ms après le mélange
- chaque mesure dure 50 ms
- le faisceau est coupé entre 2 mesures consécutives
IV
37
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10
B
% PEG (m/v)
BM
V (
mg/
ml)
Conditions étudiées
PEG 20000
PEG 3000
PEG 8000
2,5 à 20mg/ml de virus
2,5 à 10% de PEG
IV
38
Signaux caractéristiques des échantillons
échantillon précipité microcristallin
0.01
0.1
1
10
102
103
0 0.005 0.01 0.015
I(c,
s)
s(A-1)
a
échantillon non précipité
IV
39
I(c,s) = I(0,s) x S(c,s)
division par le facteur de forme
phase liquidephase solide
Obtention du facteur de structure
IV
40
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0 1 2 3 4 5 6
Va
leu
rs d
e s
(h2+k2+l2)
Indexation des pics de diffraction
L’espacement des pics de diffraction est compatible avec une maille cubique face centrée
a=b=c=390 Å4 virus dans la maille
IV
41
Caractérisation des pics de diffraction
largeur des pics
la croissance des pics est due principalement à la formation de nouveaux
microcristaux
la croissance des pics est due principalement à la
croissance des microcristaux existants
temps temps
t=0
t>0
t=0
t>0
nombre de microcristaux Nnombre de virus dans les microcristaux n2hauteur des pics
1/taille des microcristaux
IV
42
0
1000
2000taille des microcristaux
Ta
ille des m
icrocristau
x (Ang
strom
)
concentration
S(c
,s)
0
5
10
15
20
25
0.1 1 10 100 1000
hauteur du 3ème pic
temps (secondes)
largeur du pic
concentration
« 3ème pic »
PEG 3000 10%, BMV 20 mg/ml
800Å
1800 Å
tem
ps
IV
43
Il n’existe que deux espèces en solution : le virus soluble, et le virus cristallisé.
Les plus petits microcristaux ont un diamètre de 800 Å (de l’ordre de 20 particules virales)
Premières conclusions
IV
les noyaux de nucléation ont une structure cristalline, et un diamètre d’environ 800 Å
44
• Les pics apparaissent plus nombreux et mieux différenciés avec le PEG 20 000 qu ’avec le PEG 8 000
PEG 8000 10%, BMV 10 mg/ml PEG 20000 10%, BMV 10 mg/ml
• On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline
IV
45
Croissance des pics en fonction de la concentration en virus
La hauteur des pics est reliée à la concentration initiale en virus et au nombre de microcristaux.
IV
46
Conclusions
L’apparition des microcristaux est directement reliée à:
- la taille et la concentration du PEG
- la concentration en virus
La croissance des pics est principalement due à la formation de nouveaux microcristaux
L’apparition puis la croissance des pics de diffraction s ’effectue au cours des premières secondes après le mélange
IV
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
48
L’ARN se plaque contre la paroi interne du virus lors du
gonflement de la capside
La cristallisation du BMV a lieu dans des conditions
attractives, qui peuvent être prédites
Les noyaux de nucléation des
macromolécules sphériques auraient une
structure cristalline.
Déterminer la forme, sphérique ou plane, des noyaux de nucléation
- AFM
- cryodécapage
Déterminer la structure du BMV à partir des cristaux obtenus en
présence de PEG
49
50
TF
banque de “transformées
de Fourier polaires”
sélection des particules virales
« 2D »
sélection des particules
correctement orientées par rapport à la
banque de TFP
TF-1
Modèle de départ : virus de l’hépatite B
(Conway et coll., 1997)
projections 2D
TF-1
sélection des particules
correctement orientées par rapport au
nouveau modèle
TF-1
TF
P
conversion des coordonnées cartésiennes (x,y)
en coordonnées polaires (r,)
détermination de l’origine et de
l’orientation des particules sélectionnées
Technique de la Transformée de Fourier Polaire (TFP)
Baker et Cheng,1996
TF
sélection des particules virales
« 2D »
conversion des coordonnées cartésiennes (x,y)
en coordonnées polaires (r,)
détermination de l’origine et de
l’orientation des particules sélectionnées