Thèse effectuée sous la direction dHervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP) MODIFICATIONS

Thèse effectuée sous la direction d’Hervé Delacroix

Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC)

Collaboration : Annette Tardieu (LMCP)

MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET

INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION

Marina Casselyn

2

MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION

Présentation du virus

Modélisation par cryomicroscopie électronique

Interactions entre particules virales en solution

Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV

PRESENTATION DU VIRUS

Présentation du virusModélisation par cryomicroscopie électroniqueInteractions entre particules virales en solutionCristallisation et cinétique de nucléation du BMV

I

4

Le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) est particulier aux graminées.

Le BMV est produit au laboratoire par inoculation de plants d’orge. Le rendement est de 100 mg de virus pour 100 g de feuilles infectées.

100 nmcoloration négative

I

5

• capside « sphérique » de 270 Å de diamètre

• le virus n ’est pas enveloppé

• le centre du virus est creux

• génome à ARN simple brin tripartite (enzymes de réplication,

protéine de capside, protéine de mouvement)

• masse de 4,6 MDa

coque protéique

lumen

ARN

270 Å

Caractéristiques du BMV

I

6

protéines de mouvement

désassemblage co-traductionnel

pH < 7 pH > 7

protéines de capsideARN polymérases

Prolifération virale

I

7

(d’après Speir et coll., 1995)

La capside résulte de l ’auto-assemblage de 180 protéines identiques selon une symétrie

icosaèdrique.

A, B et C constituent l’unité asymétrique de la capside.

Le virus a un nombre de triangulation T=3.

Les protéines A, B et C ont des séquences identiques, mais des structures quasi-équivalentes.

Symétrie de la capside

A B C

I

8structure atomique du BMV (réf. PDB 1js9 – Lucas et coll; 2002)

Structure atomique du BMV

capsomères (hexamères et pentamères)

I

structure du CCMV(70% d’identité de

séquence avec le BMV)

modélisation par homologie de séquences

remplacement moléculaire

9

A

C

B

A

B

C-ter

C-ter

Stabilisation de la capside

interpénétration entre dimères fixation d’ions divalents à la surface

I

10

Stabilisation de

la capside

les 6 protéines B et C

forment un tonneau

l’ARN tapisse l’intérieur de la

capside

I

MODELISATION PAR CRYOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE

DES FORMES COMPACTE ET GONFLEE DU BMV A 30 Å DE

RESOLUTION

Collaborations : Nicolas Boisset (LMCP)

Célia Plisson (ICM)


II

12

Cryomicroscopie électronique

La vitrification à -180°C permet

• l’observation des macromolécules dans leur état natif

• une plus grande résistance des échantillons aux radiations

Reconstruction 3D (effectuée par C. Plisson, ICM)

• observation de l ’ARN viral, dont l ’organisation ne peut pas être déterminée par diffraction des rayons X

• étude de la structure du BMV à l ’état gonflé, car les particules virales ont des diamètres hétérogènes à pH 7,5 ce qui empêche la cristallisation

II

TECHNIQUES

13

forme compacte

pH 5,9

forme gonflée

pH 7,5

Diamètre des particules virales

à pH 5,9 : 280 Å

à pH 7,5 : 304 Å

II

Microscopie

14

270 Å

304 Å

à pH 7,5 :

à pH 5,9 : existence de pores au niveau des axes 5 et des pseudo axes 6.

- déplacement des capsomères

Gonflement de la capside

- apparition de pores au niveau

des pseudo axes 3

II

Reconstruction 3D

15

Réorganisation de l’ARN

l’ARN se plaque contre la paroi interne, et obstrue les axes 5.

120 Å

160 Å

ARN

II

16

(Speir et coll., 1995)

1- L’ARN serait libéré à travers des pores qui se

forment lors du gonflement du virus, au

niveau des pseudo axes 3

(Albert et coll., 1997)

2- Même si l’on empêche le gonflement de la capside, le virus prolifère. L’ARN serait libéré à travers les axes 5

icosaèdriques.

2 théories pour la libération de l ’ARN :

II

17

Suite à l’augmentation du pH, l ’ARN se positionne au niveau des axes 5 icosaèdriques.

La sortie de l ’ARN se ferait au niveau des pentamères, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’Albert et coll.

CONCLUSION

II

INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION

Collaborations : A. Tardieu (LMCP)

J. Perez, P. Vachette (LURE)

J. Witz (IBMC)


III

19

caractériser les interactions en solution d ’un nouveau modèle de macromolécule sphérique en fonction de différents paramètres physico-chimiques

établir les relations entre interactions et conditions de cristallisation

Objectifs des études

III

20

1

10

102

103

104

0 0.005 0.01 0.015 0.02

I(c,

s)

s(A-1)

Diffusion des Rayons X aux Petits Angles

L’intensité diffusée I(c,s) par une solution de concentration c, en fonction du vecteur de diffusion s=2 sin / , donne des indications sur:

- la nature des interactions entre particules en solution

- la forme et la taille des particules

0

5 103

1 104

1.5 104

2 104

0 0.005 0.01 0.015 0.02

I(c,

s)

s(A-1)

répulsion

attraction

III

21

Interactions intermoléculaires en solution

• les forces répulsives de volume exclu

• les forces de van der Waals

• les forces coulombiennes

• les forces attractives de déplétion, en présence de polymères

III

22

Modification de la charge des virus :

• variation du pH de 4 à 7,5

• ajout d ’anions. Les ions n’écrantent pas seulement les charges mais ont un effet différentiel sur les interactions en solution, l’effet Hofmeister

SO42-<HPO4

2- < CH3CO2- ~C6H5O7

3- < HCO3-< Cl- < Br- < NO3

-< ClO4-< SCN-

Induction d’interactions attractives de déplétion par ajout de polyéthylène glycol

Induction d ’un régime attractif

III

23

1

S(c

,s)

s (Å-1)

1

S(c

,s)

s (Å-1)

attraction

répulsion

I(c,s) = I(0,s) x S(c,s)

facteur de forme

signal diffusé par une particule unique

facteur de structure

caractérise la répartition des particules en solution

Par extrapolation du facteur de structure à l’origine, S(c,0), en fonction de la concentration, on accède au second coefficient du viriel A2 (mol.ml.g-2)A2 > 0

A2 < 0

1/S(c,0)=1+2MA2c

Quantification des interactions

I(0,

s)

s (Å-1)

I(0,

s)

s (Å-1)

/cRT=1+A2Mc+A3Mc2+…

III

24

8 103

2.4 104

4 104

5.6 104

0 0.004 0.008 0.012

pH7.5 pH5.9 pH5 pH4

I(c,

s)

s(A-1)

BMV 40mg/ml

4 104

5 104

6 104

0.001 0.0016

Effets de la variation du pH

L’augmentation du pH provoque une diminution des interactions répulsives. La valeur du second coefficient du viriel A2 passe de 2.10-6 à 7.10-7 mol.ml.g-2.

La variation du pH provoque un changement de structure du virus

III

25

modèlescourbes exp.

Conséquence de l’augmentation du pH :

Modèles de sphères creuses

la diminution du rayon interne du virus, correspondant à une réorganisation de l’ARN

III

26

Effets des sels

Le NaNO3 est plus efficace que l’AcNa pour diminuer les interactions répulsives : effet Hofmeister

III

27

La présence de sels provoque également une réorganisation de l’ARN

La valeur de A2 passe de 2.10-6 à 5.10-7 (mol.ml.g-2)

Effets du NaN03 (pH 4)

III

28

Conclusions sur les effets du pH et des sels

La variation du pH et l’ajout de sels en solution provoquent une réorganisation structurale du BMV

La variation de ces deux paramètres n’induit pas d’interactions attractives pouvant amener à la cristallisation du BMV

III

29

Effets du polyéthylène glycol (PEG)

(-CH2OCH2-)n

L’ addition de PEG induit une attraction entre molécules.

Il s’agit d’une « attraction de déplétion ».

Rg PEG 3000 : 23 Å

Rg PEG 8000 : 40 Å

Rg PEG 20000 : 70 ÅRg

2Rg

270 Å

III

30

- l’effet du PEG est relié à sa concentration

0

4 103

8 103

1.2 104

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

4% 6% 8% 10%

I(c,

s)

s(A-1)

BMV 40mg/ml

PEG 8000

- l’effet du PEG est relié à sa taille

Effets du PEG sur le BMV en solution

0

5 103

1 104

1.5 104

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

5mg/ml BMV10mg/ml BMV20mg/ml BMV40mg/ml BMV

I(c,

s)s(A-1)

PEG 20 000 4%

pics de diffractionpics de diffraction

III

- les précipités sont microcristallins

CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN

PRESENCE DE PEG


IV

PEG: diagrammes de phase et cristallisation

IV

33

0

10

20

30

40

50

60

0% 2% 4% 6% 8% 10% 12%

BM

V c

on

cen

tra

tion

(m

g/m

l)

% PEG 8000 (w/v)

Diagrammes de phase

200 µm

courbe de précipitation

courbe de solubilité

IV

les conditions de précipitation permettent de prédire les conditions de cristallisation

34

10 % PEG 8000, pH 4 200 µm

Diffusion de vapeur

MicrobatchCristallisation du BMV

4 % PEG 8000 , pH 4

8 % PEG 8000, pH 4(coll. C. Mayer, LMCP)

les cristaux sont obtenus de façon

reproductible, en présence de PEG seul

IV

Cinétique d’apparition et de croissance des microcristaux

Collaboration : S. Finet (ESRF)

IV

36

Ligne ID2 à l ’ESRF

détecteur 2D

échantillon

I(s)

s= 2sin

=1Å

stopped-flow

RX

- le « stopped-flow » permet le mélange rapide de l ’échantillon

- la première mesure est effectuée 180 ms après le mélange

- chaque mesure dure 50 ms

- le faisceau est coupé entre 2 mesures consécutives

IV

37

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10

B

% PEG (m/v)

BM

V (

mg/

ml)

Conditions étudiées

PEG 20000

PEG 3000

PEG 8000

2,5 à 20mg/ml de virus

2,5 à 10% de PEG

IV

38

Signaux caractéristiques des échantillons

échantillon précipité microcristallin

0.01

0.1

1

10

102

103

0 0.005 0.01 0.015

I(c,

s)

s(A-1)

a

échantillon non précipité

IV

39

I(c,s) = I(0,s) x S(c,s)

division par le facteur de forme

phase liquidephase solide

Obtention du facteur de structure

IV

40

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0 1 2 3 4 5 6

Va

leu

rs d

e s

(h2+k2+l2)

Indexation des pics de diffraction

L’espacement des pics de diffraction est compatible avec une maille cubique face centrée

a=b=c=390 Å4 virus dans la maille

IV

41

Caractérisation des pics de diffraction

largeur des pics

la croissance des pics est due principalement à la formation de nouveaux

microcristaux

la croissance des pics est due principalement à la

croissance des microcristaux existants

temps temps

t=0

t>0

t=0

t>0

nombre de microcristaux Nnombre de virus dans les microcristaux n2hauteur des pics

1/taille des microcristaux

IV

42

0

1000

2000taille des microcristaux

Ta

ille des m

icrocristau

x (Ang

strom

)

concentration

S(c

,s)

0

5

10

15

20

25

0.1 1 10 100 1000

hauteur du 3ème pic

temps (secondes)

largeur du pic

concentration

« 3ème pic »

PEG 3000 10%, BMV 20 mg/ml

800Å

1800 Å

tem

ps

IV

43

Il n’existe que deux espèces en solution : le virus soluble, et le virus cristallisé.

Les plus petits microcristaux ont un diamètre de 800 Å (de l’ordre de 20 particules virales)

Premières conclusions

IV

les noyaux de nucléation ont une structure cristalline, et un diamètre d’environ 800 Å

44

• Les pics apparaissent plus nombreux et mieux différenciés avec le PEG 20 000 qu ’avec le PEG 8 000

PEG 8000 10%, BMV 10 mg/ml PEG 20000 10%, BMV 10 mg/ml

• On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline

IV

45

Croissance des pics en fonction de la concentration en virus

La hauteur des pics est reliée à la concentration initiale en virus et au nombre de microcristaux.

IV

46

Conclusions

L’apparition des microcristaux est directement reliée à:

- la taille et la concentration du PEG

- la concentration en virus

La croissance des pics est principalement due à la formation de nouveaux microcristaux

L’apparition puis la croissance des pics de diffraction s ’effectue au cours des premières secondes après le mélange

IV

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

48

L’ARN se plaque contre la paroi interne du virus lors du

gonflement de la capside

La cristallisation du BMV a lieu dans des conditions

attractives, qui peuvent être prédites

Les noyaux de nucléation des

macromolécules sphériques auraient une

structure cristalline.

Déterminer la forme, sphérique ou plane, des noyaux de nucléation

- AFM

- cryodécapage

Déterminer la structure du BMV à partir des cristaux obtenus en

présence de PEG

49

50

TF

banque de “transformées

de Fourier polaires”

sélection des particules virales

« 2D »

sélection des particules

correctement orientées par rapport à la

banque de TFP

TF-1

Modèle de départ : virus de l’hépatite B

(Conway et coll., 1997)

projections 2D

TF-1

sélection des particules

correctement orientées par rapport au

nouveau modèle

TF-1

TF

P

conversion des coordonnées cartésiennes (x,y)

en coordonnées polaires (r,)

détermination de l’origine et de

l’orientation des particules sélectionnées

Technique de la Transformée de Fourier Polaire (TFP)

Baker et Cheng,1996

TF

sélection des particules virales

« 2D »

conversion des coordonnées cartésiennes (x,y)

en coordonnées polaires (r,)

détermination de l’origine et de

l’orientation des particules sélectionnées

Documents

Thèse effectuée sous la direction dHervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP) MODIFICATIONS