BIOCHIMIE, 1976, 58, 1417-1418.

dans

U tilisation du polydthyl6ne glycol pour la prdcipitation du complexe hormone-anticorps le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de

H e n r i KERCRET el J a c q u e s DUVAL.

Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Equipe de Recherche associde au C.X.R.S. n ° 567, Aoenae du Gdnt'ral Leclerc, 35031 Rennes Cedex.

(16-7-1976).

rat.

INTRODUCTION.

La p r 6 c i p i t a t i o n du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s d a n s les dosages r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s es t le p l u s s o u v e n t r6a l i s6e p a r la m 6 t h o 4 e d u doub l e an t i co rp s . P o u r des r a i s o n s de m o i u d r e coot , n o n s a v o n s 6td a m e n 6 s h r e c h e r c h e r u n e m ~ t h o d e qu i p e r m e t le re in- p l a c e m e n t d u s d r u m de m o u t o n a n t i - ~ - g l o b u l i n e de l a p i n (SMAL) pal" u n p r o d u i t c h i m i q u e peu coOteux : le p o l y 6 t h y l 6 n e glycol .

N o u s a v o n s adap td la t e c h n i q u e de D e s b u q u o i s et A u r b a c h [!1] au dosage des g o n a d o t r o p h i n e s de r a t darts les m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n d ' h y p o p h y s e s col lect6s au ' t o u r s d ' expO ' i e nce s de p 6 r i p e r f u s i o n .

M A T E R I E L ET METHODES.

Dosage radio immunologiqae . N o u s a v o n s u t i l i s6 les k i t s LH et FSH du NIAMD e t l a t e c h n i q u e r e c o m m a n - d6e p o u r l a f o r m a t i o n du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s . L '6 tude des c o n d i t i o n s les p l u s f a v o r a b l e s p o u r l ' u t i l i - s a t i o n d u p o l y 6 t h y l b n e glycol a dt6 fa i t e s u r d e u x sdr ies de t u b e s e o n t e n a n t so i t l ' h o r m o n e iodSc (FSH e n v i r o n 30 000 d p m p a r tube ) l ' a n t i c o r p s et la s o l u t i o n d i l u a n t e , so i l l ' h o r m o n e iod6e e t l a s o l u t i o n d i ]uan te . La p r e m i e r e s~rie de t u b e s p e r m e t d ' 6 v a t u e r l ' e n s e m b l e de la r ad ioac t iv i t~ 'pr4cipi table p a r le p o l y d t h y l ~ n e g lycol dar ts les c o n d i t i o n s du dosage . La d e u x i ~ m e s~rie de t u b e s p e r m e t de c o n n a i t r e ]a p r d c i p i t a t i o n aspdc i f ique n o n i m p u t a b l e h la p r6c i p i t a t i on du c o m - p l exe a n t i g 6 n e - a n t i c o r p s .

L ' h o r m o n e (LH-I-4 on FSH-I-3) es t iod6e pa r l ' iode 125 ( A m e r s h a m ) p a r la t e c h n i q u e r e c o m m a n d d e p a r le NIAMD qu i e s t proch,e de celle de Greenwood et coll. [2J, l ' exc6s de c h l o r a m i n e T ~ t an t 61imin6 p a r le b i su l f i te .

La s o l u t i o n d i l u a n t e es t c o n s t i t u d e de t a m p o n p h o s - p h a t e 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M, m e r t h i o l a t e O,01 p. cent , a l b u m i n e bov i ne 1 p. cent .

Les s o l u t i o n s de p o l y 4 t h y l 6 n e g lycol (PEG 6000 , Merck) et de s d r u m de l a p i n n o r m a l s o n t f a i t e s darts du t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M. A la s o l u t i o n e o n t e n a n t le c o m p l e x e h prdcip i ter , on a j o u t e s u c c e s s i v e m e n t le s 6 r u m p u i s le PEG.

La p r 6 c i p i t a t i o n p a r le p o l y d t h y l 6 n e glycol du re u n e n u i t en c h a m b r e f ro ide . Les t u h e s s o n t c e n t r i f u g 6 s 5_ 1 500 g p e n d a n t 30 m i n u t e s h t em.p~ra tu re o r d i n a i r e , le s u r n a g e a n t es t a sp i rd et le cu lo t es t lavb pa r 1 nfl de la s o l u t i o n de PEG et centr i fugal 'h n o u v e a u . AprSs a s p i r a t i o n du s u r n a g e a n t de l avage , les t u b e s son t c o m p t d s a u e o m p t e u r g a m m a ( I n t e r t e c h n i q u e CG 301).

Pdriperfusions. 4 d e m i - h y p o p h y s e s de r a t son t i ncu - bdes h 37 ° d a n s u n e ce l lu le de nGtre concep t ion , se lon u n pro toeo le vo i s i n de celui de Dowd et coil. [3i. B r i 6 v e m e n t , cet te ce l lu le es t cons t i t ude h p a r t i r d ' u n e s e r i n g u e en p l a s t i q u e de 2,5 ml . Le m i l i e u u t i l i s6 p o u r la p 6 r i p e r f u s i o n es l dn l i qu ide de K r e b s - R i n g e r - b i c a r - b o n a t e - g l u c o s e pH 7,5 (KRBG) gazd pa r u n m61ange O,_,/COe (95 p. c e n t / 5 p. cent ) . L ' i n j e c t i o n de ce m i l i e u es t r6al is6 h l ' a ide d ' u n e p o m p e pa r l ' e m b o u t de f ixa- t i on de l ' a i gu i l l e t a n d i s que la so r t i e a l ieu grace h une a igu i l l e t r a v e r s a n t le p i s t o n ; le v o l u m e de la c h a m b r e es t a i n s i m a i n t e n u h 0,4 ml . Le d~bi t est de 12 m l / h e u r e , les f r a c t i o n s 6 t a n t r ecue i l l i e s t o u t e s les 20 m i n u t e s . A d i f f6 ren ts t e m p s de la p 6 r i p e r f u s i o n , les

TABLEAU I.

Ddterminal ion des condit ions d 'ut i l isat ion du poly- e thylene glycol poar le dosage de la FSH.

Concentrat ion

S6rum de l ap in lyophil is6

m g / m l 0 , 3 0 , 6 1 ,2 3 , 0 6 , 0

Pr6cipitation asp6eifique

p. cent des cpm totaux

10 ,0 10 ,5 12 ,5 15 ,5 19 ,5

Po ly6 thy l~ne glycol p. cen t

en p o i d s / v o l u m e 2 , 0 5 , 5 3 ,1 5 , 5 6 ,25 6 , 5 9 , 4 9 . 5

12 ,25 16 ,5

Complexe hormone anticorps

pr~cipit6 p. cent des cpm

totanx

38 ,5 4 1 , 0 4 2 , 0 39,0 36 ,0

0 0 7

31 ,5 38 ,0

L o t s de l '~ tude des c o n c e n t r a t i o n s de s d r u m de l ap in , le p o l y e t h y l e n e glycol a (~td u t i l i s~ h la c o n c e n t r a t i o n de 12,5 p. cent .

Lors de l '~ tude des c o n c e n t r a t i o n s de p o l y ~ t h y l 6 n e glycol , le s 6 r u m de l ap in a ~t6 u t i l i s6 h la c o n c e n t r a - t i on de 3 m g / m l .

Les p o u r c e n t a g e s de p r 6 c i p i t a t i o n dn c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s c o r r e s p o n d e n t a u x v a l e u r s o b t e n u e s avec la m ~ t h o d e a u doub l e a n t i c o r p s p o u r la m£qne d i l u t i o n du N I A M D - A - R a t FSHS-6.

1 4 1 8 H . K e r c r e t e t J . D u r a l .

h y p o p h y s e s s o n t s t i m u l 6 e s p a r des i n j e c t i o n s b rbves (10 m i n u t e s ) de L H - R F (100 n g / m l ) qu i n o u s a 6t6 f o u r n i g r a c i e u s e m e n t p a r les L a b o r a t o i r e s Hoechs t . Les c o n t e n u s en LH et FSH de c h a q u e f r a c t i o n on t 6t6 d 6 t e r m i n 4 s .

3o,

o/e lie

20.

x x x x x

x x \ x

x x ~

ng de LH-RP- I ou de FSH~oR0P-I

FI6. 1. - - C o m p a r a i s o n des g a m m e s d '~ ta lonnage de L H et de F S H o b t e n u e s par la m d t h o d e du doub le an t i - corps et p a r la m S t h o d e au p o l y d t h y l ~ n e glycol .

Le s 6 r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n es t u t i l i s~ d i lu6 au d e m i avec du t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4 NaC1 0,15 M. La p r e c i p i t a t i o n d u r e 24 h e u r e s 4 ° C ; le eu lo t de p r 6 e i p i t a t i o n es t lay6 p a r 1 m l du t a m p o n pr~cSdent . - - m 6 t h o d e du doub l e an t i co rp s . ....... m ~ t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol .

D a n s le cas de la m 6 t h o d e au p o l y ~ t h y l b n e glycol , la c o n c e n t r a t i o n de s 6 r u m de l a p i n es t de 1 m g / m l , la c o n c e n t r a t i o n de p o l 6 t h y l b n e g lyco l es t de 11 p. cent .

sa~.

S 4 5 ~e raps heures

~ 2

Fro. 2. - - E f f e t s de s t i m u l a t i o n s cour les par le L H - R F s u r la l ib~rat io~ de L H et de F S H dosdes par la m ~ l h o d e au po lyd thy lOne glycol .

Les r ~ s u l t a t s p r6sen t~s c o r r e s p o n d e n t h l ' i n cu t ) a t i on de 2 a d ~ n o h y p o p h y s e s de r a t s ~g~s de 35 j o u r s , soi t e n v i r o n 10 m g de t i s s u .

Le dSbi t de p ~ r i p e r f u s i o n es t de 12 m l / h e u r e . L '~ lua t es t col lect6 p a r f r a c t i o n s de 20 m i n u t e s .

Les s t i m u l a t i o n s p a r le L H - R F (h la c o n c e n t r a t i o n de 100 n g / m l ) d u r e n t 10 m i n u t e s . Le ddbu t de c h a q u e s t i m u l a t i o n es t i n d i q u ~ p a r u n e fl~ehe.

[ ~ - - ~ LH. • • FSH.

R E S U L T A T S .

Les r 6 s u l t a t s p r~sen t~s d a n s le t a b l e a u I n o u s m o n t r e n t que l a p r e c i p i t a t i o n spdcif lque d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s es t tr&s pen affect4e p a r la q u a n t i t y de s ~ r u m de l a p i n p r~sen t e ; p a r cont re , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n s u p ~ r i e u r e h 1,2 m g / m l , la p r e c i p i t a t i o n asp~ei f ique d e v i e n t i m p o r t a n t e . La c o n c e n t r a t i o n m i - n i m u m de p o l y 4 t h y l + n e glycol n~cessair ,e p o u r o b t e n i r u n e b o n n e pr~ei 'p i ta t ion du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i - corps , v o i s i n e de celle o b t e n u e h a b i t u e l l e m e n t avee le SMAL, s a n s e n t r a l n e r ui~e p r S e i p i t a t i o n aspSei f ique t r o p i m p o r t a n t e , es t c o m p r i s e e n t r e 9 et 12 p. cent .

D a n s les c o n d i t i o n s r e t e n u e s (1 m g / m l de s 6 r u m de l ap in , 11 p. cen t de PEG), les g a m m e s d ' 6 t a l o n n a g e ob ten t t e s a u s s i b i e n p o u r 1~ LH que p o u r la FSH (fig. 1) s o n t en b o n accord avee cel les o b t e n u e s aprbs p rSc ip i t a t i on du c o m p l e x e p a r le s ~ r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l ap in .

Les s t i m u l a t i o n s succe s s ive s de s~er~t ion de LH et de FSH p a r le L H - R F lors des e x p e r i e n c e s de p6 r ipe r - f u s i o n d ' h y p o p h y s e s s o n t 5 g a l e m e n t b i e n m i s e s en 6v idenee p a r ]es dosages r6a l i s~s h l ' a ide dn PEG (fig. 2).

DISCUSSION.

Les c o n d i t i o n s e x p b r i m e n t a l e s les p l u s j n d i e i e n s e s p o u r p r~c ip i t e r 1,e e o m p l e x e a n t i g + n e - a n t i c o r p s s o n t 1 m g / m l en s ~ r u m de l a p i n et 1I p. cen t en PEG 6 000. D a n s ces c o n d i t i o n s , les g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e cor res - p o n d e n t h cel les o b t e n u e s p a r la t e c h n i q u e e l a s s i q n e , la s e n s i b i l i t 6 ~ t a n t la m ~ m e d a n s t o u t ],e d o m a i n e de c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s a b l e s , t a u t p o u r LH que p o u r FSH. Les d o s a g e s r~al is~s darts des m i l i e u x d ' i n e u b a t i o n rgv&lent que la m g t h o d e a u PEG p e r m e t d ' g v a l u e r u n e s t i m u l a t i o n de s~crg t ion in v i tro .

N o u s a v o n s 6 g a l e m e n t eons t a t~ ( expe r i ences n o n dO- t a i l lges iei) que la p r g e i p i t a t i o n a u PEG p e r m e t de dose r ]es g o n a d o t r o p h i n e s d a n s des e x t r a i t s h y p o p h y - s a i r e s ; el le es t , p a r eon t re , i n u t i l i s a b l e dar ts nos con- d i t i o n s aetuell ,es p o u r d o s e r ees m ~ m e s h o m u o n e s d a n s le s~ rum, la c o n c e n t r a t i o n glev~e en y - g l o b u l i n e s p ro - v o q u a n t u n e p r g e i p i t a t i o n asp6e i f ique t r~s i m p o r t a n t e ,

Le p o l y g t h y l + n e glycol , p r o d u i t peu eof i teux, p e u t done r e m p l a e e r a v a n t a g e u s e m e n t le s g r u m de m o u t o n an t i - y - g l o b u l i n e de l a p i n p o u r le dosage de LH et FSH d a n s les h y p o p h y s e s et dan.s les m i l i e u x d ' i n c u h a t i o n .

R e m e r c i e m e n l s .

N o u s r e m e r c i o n s le Doc t eu r B lanc de I 'I .N.tl .A. (Nouzi l ly ) de n o u s a v o i r f o u r n i le s b r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l ap in . N o u s r e m e r e i o n s ~ g a l e m e n t les l a b o r a t o i r e s H o e c h s t p o u r l e u r don de LH-RF .

B I B L I O G R A P H I E .

1. D e s b u q u o i s , B. & A u r b a c h , G. D. (1971) J. Cl in. Endocr . , 33, 732-738.

2. Green 'wood, F. C., H u n t e r , W. M. ,~ Crover , J. S. (1963) B i o c h e m . J., 80, 114.

3. Dowd, A., B a r o f s k y , A. Z,, C h a u d h u r i , N., L loyd , C. W. & Weisz , J. (1975.) E n d o c r i n o l o g y , 96, 243-252.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.