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BIOCHIMIE, 1976, 58, 1417-1418. dans U tilisation du polydthyl6ne glycol pour la prdcipitation du complexe hormone-anticorps le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de Henri KERCRET el Jacques DUVAL. Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Equipe de Recherche associde au C.X.R.S. n ° 567, Aoenae du Gdnt'ral Leclerc, 35031 Rennes Cedex. (16-7-1976). rat. INTRODUCTION. La pr6cipitation du complexe hormone-anticorps dans les dosages radio-immunologiques est le plus souvent r6alis6e par la m6tho4e du double anticorps. Pour des raisons de moiudre coot, nons avons 6td amen6s h rechercher une m~thode qui permet le rein- placement du sdrum de mouton anti-~-globuline de lapin (SMAL) pal" un produit chimique peu coOteux : le poly6thyl6ne glycol. Nous avons adaptd la technique de Desbuquois et Aurbach [!1] au dosage des gonadotrophines de rat darts les milieux d'incubation d'hypophyses collect6s au 'tours d'expO'iences de p6riperfusion. MATERIEL ET METHODES. Dosage radioimmunologiqae. Nous avons utilis6 les kits LH et FSH du NIAMD etla technique recomman- d6e pour la formation du complexe hormone-anticorps. L'6tude des conditions les plus favorables pour l'utili- sation du poly6thylbne glycol a dt6 faite sur deux sdries de tubes eontenant soit l'hormone iodSc (FSH environ 30 000 dpm par tube) l'anticorps et la solution diluante, soil l'hormone iod6e etla solution di]uante. La premiere s~rie de tubes permet d'6vatuer l'ensemble de la radioactivit~ 'pr4cipitable par le polydthyl~ne glycol darts les conditions du dosage. La deuxi~me s~rie de tubes permet de connaitre ]a prdcipitation aspdcifique non imputable h la pr6cipitation du com- plexe antig6ne-anticorps. L'hormone (LH-I-4 on FSH-I-3) est iod6e par l'iode 125 (Amersham) par la technique recommandde par le NIAMD qui est proch,e de celle de Greenwood et coll. [2J, l'exc6s de chloramine T ~tant 61imin6 par le bisulfite. La solution diluante est constitude de tampon phos- phate 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M, merthiolate O,01 p. cent, albumine bovine 1 p. cent. Les solutions de poly4thyl6ne glycol (PEG 6000, Merck) et de sdrum de lapin normal sont faites darts du tampon phosphate 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M. A la solution eontenant le complexe h prdcipiter, on ajoute successivement le s6rum puis le PEG. La pr6cipitation par le polydthyl6ne glycol dure une nuit en chambre froide. Les tuhes sont centrifug6s 5_ 1 500 g pendant 30 minutes h tem.p~rature ordinaire, le surnageant est aspird et le culot est lavb par 1 nfl de la solution de PEG et centrifugal 'h nouveau. AprSs aspiration du surnageant de lavage, les tubes sont comptds au eompteur gamma (Intertechnique CG 301). Pdriperfusions. 4 demi-hypophyses de rat sont incu- bdes h 37 °dans une cellule de nGtre conception, selon un protoeole voisin de celui de Dowd et coil. [3i. Bri6vement, cette cellule est constitude h partir d'une seringue en plastique de 2,5 ml. Le milieu utilis6 pour la p6riperfusion esl dn liquide de Krebs-Ringer-bicar- bonate-glucose pH 7,5 (KRBG) gazd par un m61ange O,_,/COe (95 p. cent/5 p. cent). L'injection de ce milieu est r6alis6 h l'aide d'une pompe par l'embout de fixa- tion de l'aiguille tandis que la sortie a lieu grace h une aiguille traversant le piston; le volume de la chambre est ainsi maintenu h 0,4 ml. Le d~bit est de 12 ml/heure, les fractions 6tant recueillies toutes les 20 minutes. A diff6rents temps de la p6riperfusion, les TABLEAU I. Ddterminalion des conditions d'utilisation du poly- ethylene glycol poar le dosage de la FSH. Concentration S6rum de lapin lyophilis6 mg/ml 0,3 0,6 1,2 3,0 6,0 Pr6cipitation asp6eifique p. cent des cpm totaux 10,0 10,5 12,5 15,5 19,5 Poly6thyl~ne glycol p. cent en poids/volume 2,0 5,5 3,1 5,5 6,25 6,5 9,4 9.5 12,25 16,5 Complexe hormone anticorps pr~cipit6 p. cent des cpm totanx 38,5 41,0 42,0 39,0 36,0 0 0 7 31,5 38,0 Lots de l'~tude des concentrations de sdrum de lapin, le polyethylene glycol a (~td utilis~ h la concentration de 12,5 p. cent. Lors de l'~tude des concentrations de poly~thyl6ne glycol, le s6rum de lapin a ~t6 utilis6 h la concentra- tion de 3 mg/ml. Les pourcentages de pr6cipitation dn complexe hormone-anticorps correspondent aux valeurs obtenues avec la m~thode au double anticorps pour la m£qne dilution du NIAMD-A-Rat FSHS-6.

Utilisation du polyéthylène glycol pour la précipitation du complexe hormone-anticorps dans le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de rat

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BIOCHIMIE, 1976, 58, 1417-1418.

dans

U tilisation du polydthyl6ne glycol pour la prdcipitation du complexe hormone-anticorps le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de

H e n r i KERCRET el J a c q u e s DUVAL.

Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Equipe de Recherche associde au C.X.R.S. n ° 567, Aoenae du Gdnt'ral Leclerc, 35031 Rennes Cedex.

(16-7-1976).

rat.

INTRODUCTION.

La p r 6 c i p i t a t i o n du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s d a n s les dosages r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s es t le p l u s s o u v e n t r6a l i s6e p a r la m 6 t h o 4 e d u doub l e an t i co rp s . P o u r des r a i s o n s de m o i u d r e coot , n o n s a v o n s 6td a m e n 6 s h r e c h e r c h e r u n e m ~ t h o d e qu i p e r m e t le re in- p l a c e m e n t d u s d r u m de m o u t o n a n t i - ~ - g l o b u l i n e de l a p i n (SMAL) pal" u n p r o d u i t c h i m i q u e peu coOteux : le p o l y 6 t h y l 6 n e glycol .

N o u s a v o n s adap td la t e c h n i q u e de D e s b u q u o i s et A u r b a c h [!1] au dosage des g o n a d o t r o p h i n e s de r a t darts les m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n d ' h y p o p h y s e s col lect6s au ' t o u r s d ' expO ' i e nce s de p 6 r i p e r f u s i o n .

M A T E R I E L ET METHODES.

Dosage radio immunologiqae . N o u s a v o n s u t i l i s6 les k i t s LH et FSH du NIAMD e t l a t e c h n i q u e r e c o m m a n - d6e p o u r l a f o r m a t i o n du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s . L '6 tude des c o n d i t i o n s les p l u s f a v o r a b l e s p o u r l ' u t i l i - s a t i o n d u p o l y 6 t h y l b n e glycol a dt6 fa i t e s u r d e u x sdr ies de t u b e s e o n t e n a n t so i t l ' h o r m o n e iodSc (FSH e n v i r o n 30 000 d p m p a r tube ) l ' a n t i c o r p s et la s o l u t i o n d i l u a n t e , so i l l ' h o r m o n e iod6e e t l a s o l u t i o n d i ]uan te . La p r e m i e r e s~rie de t u b e s p e r m e t d ' 6 v a t u e r l ' e n s e m b l e de la r ad ioac t iv i t~ 'pr4cipi table p a r le p o l y d t h y l ~ n e g lycol dar ts les c o n d i t i o n s du dosage . La d e u x i ~ m e s~rie de t u b e s p e r m e t de c o n n a i t r e ]a p r d c i p i t a t i o n aspdc i f ique n o n i m p u t a b l e h la p r6c i p i t a t i on du c o m - p l exe a n t i g 6 n e - a n t i c o r p s .

L ' h o r m o n e (LH-I-4 on FSH-I-3) es t iod6e pa r l ' iode 125 ( A m e r s h a m ) p a r la t e c h n i q u e r e c o m m a n d d e p a r le NIAMD qu i e s t proch,e de celle de Greenwood et coll. [2J, l ' exc6s de c h l o r a m i n e T ~ t an t 61imin6 p a r le b i su l f i te .

La s o l u t i o n d i l u a n t e es t c o n s t i t u d e de t a m p o n p h o s - p h a t e 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M, m e r t h i o l a t e O,01 p. cent , a l b u m i n e bov i ne 1 p. cent .

Les s o l u t i o n s de p o l y 4 t h y l 6 n e g lycol (PEG 6000 , Merck) et de s d r u m de l a p i n n o r m a l s o n t f a i t e s darts du t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4, NaC1 0,15 M. A la s o l u t i o n e o n t e n a n t le c o m p l e x e h prdcip i ter , on a j o u t e s u c c e s s i v e m e n t le s 6 r u m p u i s le PEG.

La p r 6 c i p i t a t i o n p a r le p o l y d t h y l 6 n e glycol du re u n e n u i t en c h a m b r e f ro ide . Les t u h e s s o n t c e n t r i f u g 6 s 5_ 1 500 g p e n d a n t 30 m i n u t e s h t em.p~ra tu re o r d i n a i r e , le s u r n a g e a n t es t a sp i rd et le cu lo t es t lavb pa r 1 nfl de la s o l u t i o n de PEG et centr i fugal 'h n o u v e a u . AprSs a s p i r a t i o n du s u r n a g e a n t de l avage , les t u b e s son t c o m p t d s a u e o m p t e u r g a m m a ( I n t e r t e c h n i q u e CG 301).

Pdriperfusions. 4 d e m i - h y p o p h y s e s de r a t son t i ncu - bdes h 37 ° d a n s u n e ce l lu le de nGtre concep t ion , se lon u n pro toeo le vo i s i n de celui de Dowd et coil. [3i. B r i 6 v e m e n t , cet te ce l lu le es t cons t i t ude h p a r t i r d ' u n e s e r i n g u e en p l a s t i q u e de 2,5 ml . Le m i l i e u u t i l i s6 p o u r la p 6 r i p e r f u s i o n es l dn l i qu ide de K r e b s - R i n g e r - b i c a r - b o n a t e - g l u c o s e pH 7,5 (KRBG) gazd pa r u n m61ange O,_,/COe (95 p. c e n t / 5 p. cent ) . L ' i n j e c t i o n de ce m i l i e u es t r6al is6 h l ' a ide d ' u n e p o m p e pa r l ' e m b o u t de f ixa- t i on de l ' a i gu i l l e t a n d i s que la so r t i e a l ieu grace h une a igu i l l e t r a v e r s a n t le p i s t o n ; le v o l u m e de la c h a m b r e es t a i n s i m a i n t e n u h 0,4 ml . Le d~bi t est de 12 m l / h e u r e , les f r a c t i o n s 6 t a n t r ecue i l l i e s t o u t e s les 20 m i n u t e s . A d i f f6 ren ts t e m p s de la p 6 r i p e r f u s i o n , les

TABLEAU I.

Ddterminal ion des condit ions d 'ut i l isat ion du poly- e thylene glycol poar le dosage de la FSH.

Concentrat ion

S6rum de l ap in lyophil is6

m g / m l 0 , 3 0 , 6 1 ,2 3 , 0 6 , 0

Pr6cipitation asp6eifique

p. cent des cpm totaux

10 ,0 10 ,5 12 ,5 15 ,5 19 ,5

Po ly6 thy l~ne glycol p. cen t

en p o i d s / v o l u m e 2 , 0 5 , 5 3 ,1 5 , 5 6 ,25 6 , 5 9 , 4 9 . 5

12 ,25 16 ,5

Complexe hormone anticorps

pr~cipit6 p. cent des cpm

totanx

38 ,5 4 1 , 0 4 2 , 0 39,0 36 ,0

0 0 7

31 ,5 38 ,0

L o t s de l '~ tude des c o n c e n t r a t i o n s de s d r u m de l ap in , le p o l y e t h y l e n e glycol a (~td u t i l i s~ h la c o n c e n t r a t i o n de 12,5 p. cent .

Lors de l '~ tude des c o n c e n t r a t i o n s de p o l y ~ t h y l 6 n e glycol , le s 6 r u m de l ap in a ~t6 u t i l i s6 h la c o n c e n t r a - t i on de 3 m g / m l .

Les p o u r c e n t a g e s de p r 6 c i p i t a t i o n dn c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s c o r r e s p o n d e n t a u x v a l e u r s o b t e n u e s avec la m ~ t h o d e a u doub l e a n t i c o r p s p o u r la m£qne d i l u t i o n du N I A M D - A - R a t FSHS-6.

1 4 1 8 H . K e r c r e t e t J . D u r a l .

h y p o p h y s e s s o n t s t i m u l 6 e s p a r des i n j e c t i o n s b rbves (10 m i n u t e s ) de L H - R F (100 n g / m l ) qu i n o u s a 6t6 f o u r n i g r a c i e u s e m e n t p a r les L a b o r a t o i r e s Hoechs t . Les c o n t e n u s en LH et FSH de c h a q u e f r a c t i o n on t 6t6 d 6 t e r m i n 4 s .

3o,

o/e lie

20.

x x x x x

x x \ x

x x ~

ng de LH-RP- I ou de FSH~oR0P-I

FI6. 1. - - C o m p a r a i s o n des g a m m e s d '~ ta lonnage de L H et de F S H o b t e n u e s par la m d t h o d e du doub le an t i - corps et p a r la m S t h o d e au p o l y d t h y l ~ n e glycol .

Le s 6 r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n es t u t i l i s~ d i lu6 au d e m i avec du t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M pH 7,4 NaC1 0,15 M. La p r e c i p i t a t i o n d u r e 24 h e u r e s 4 ° C ; le eu lo t de p r 6 e i p i t a t i o n es t lay6 p a r 1 m l du t a m p o n pr~cSdent . - - m 6 t h o d e du doub l e an t i co rp s . ....... m ~ t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol .

D a n s le cas de la m 6 t h o d e au p o l y ~ t h y l b n e glycol , la c o n c e n t r a t i o n de s 6 r u m de l a p i n es t de 1 m g / m l , la c o n c e n t r a t i o n de p o l 6 t h y l b n e g lyco l es t de 11 p. cent .

sa~.

S 4 5 ~e raps heures

~ 2

Fro. 2. - - E f f e t s de s t i m u l a t i o n s cour les par le L H - R F s u r la l ib~rat io~ de L H et de F S H dosdes par la m ~ l h o d e au po lyd thy lOne glycol .

Les r ~ s u l t a t s p r6sen t~s c o r r e s p o n d e n t h l ' i n cu t ) a t i on de 2 a d ~ n o h y p o p h y s e s de r a t s ~g~s de 35 j o u r s , soi t e n v i r o n 10 m g de t i s s u .

Le dSbi t de p ~ r i p e r f u s i o n es t de 12 m l / h e u r e . L '~ lua t es t col lect6 p a r f r a c t i o n s de 20 m i n u t e s .

Les s t i m u l a t i o n s p a r le L H - R F (h la c o n c e n t r a t i o n de 100 n g / m l ) d u r e n t 10 m i n u t e s . Le ddbu t de c h a q u e s t i m u l a t i o n es t i n d i q u ~ p a r u n e fl~ehe.

[ ~ - - ~ LH. • • FSH.

R E S U L T A T S .

Les r 6 s u l t a t s p r~sen t~s d a n s le t a b l e a u I n o u s m o n t r e n t que l a p r e c i p i t a t i o n spdcif lque d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s es t tr&s pen affect4e p a r la q u a n t i t y de s ~ r u m de l a p i n p r~sen t e ; p a r cont re , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n s u p ~ r i e u r e h 1,2 m g / m l , la p r e c i p i t a t i o n asp~ei f ique d e v i e n t i m p o r t a n t e . La c o n c e n t r a t i o n m i - n i m u m de p o l y 4 t h y l + n e glycol n~cessair ,e p o u r o b t e n i r u n e b o n n e pr~ei 'p i ta t ion du c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i - corps , v o i s i n e de celle o b t e n u e h a b i t u e l l e m e n t avee le SMAL, s a n s e n t r a l n e r ui~e p r S e i p i t a t i o n aspSei f ique t r o p i m p o r t a n t e , es t c o m p r i s e e n t r e 9 et 12 p. cent .

D a n s les c o n d i t i o n s r e t e n u e s (1 m g / m l de s 6 r u m de l ap in , 11 p. cen t de PEG), les g a m m e s d ' 6 t a l o n n a g e ob ten t t e s a u s s i b i e n p o u r 1~ LH que p o u r la FSH (fig. 1) s o n t en b o n accord avee cel les o b t e n u e s aprbs p rSc ip i t a t i on du c o m p l e x e p a r le s ~ r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l ap in .

Les s t i m u l a t i o n s succe s s ive s de s~er~t ion de LH et de FSH p a r le L H - R F lors des e x p e r i e n c e s de p6 r ipe r - f u s i o n d ' h y p o p h y s e s s o n t 5 g a l e m e n t b i e n m i s e s en 6v idenee p a r ]es dosages r6a l i s~s h l ' a ide dn PEG (fig. 2).

DISCUSSION.

Les c o n d i t i o n s e x p b r i m e n t a l e s les p l u s j n d i e i e n s e s p o u r p r~c ip i t e r 1,e e o m p l e x e a n t i g + n e - a n t i c o r p s s o n t 1 m g / m l en s ~ r u m de l a p i n et 1I p. cen t en PEG 6 000. D a n s ces c o n d i t i o n s , les g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e cor res - p o n d e n t h cel les o b t e n u e s p a r la t e c h n i q u e e l a s s i q n e , la s e n s i b i l i t 6 ~ t a n t la m ~ m e d a n s t o u t ],e d o m a i n e de c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s a b l e s , t a u t p o u r LH que p o u r FSH. Les d o s a g e s r~al is~s darts des m i l i e u x d ' i n e u b a t i o n rgv&lent que la m g t h o d e a u PEG p e r m e t d ' g v a l u e r u n e s t i m u l a t i o n de s~crg t ion in v i tro .

N o u s a v o n s 6 g a l e m e n t eons t a t~ ( expe r i ences n o n dO- t a i l lges iei) que la p r g e i p i t a t i o n a u PEG p e r m e t de dose r ]es g o n a d o t r o p h i n e s d a n s des e x t r a i t s h y p o p h y - s a i r e s ; el le es t , p a r eon t re , i n u t i l i s a b l e dar ts nos con- d i t i o n s aetuell ,es p o u r d o s e r ees m ~ m e s h o m u o n e s d a n s le s~ rum, la c o n c e n t r a t i o n glev~e en y - g l o b u l i n e s p ro - v o q u a n t u n e p r g e i p i t a t i o n asp6e i f ique t r~s i m p o r t a n t e ,

Le p o l y g t h y l + n e glycol , p r o d u i t peu eof i teux, p e u t done r e m p l a e e r a v a n t a g e u s e m e n t le s g r u m de m o u t o n an t i - y - g l o b u l i n e de l a p i n p o u r le dosage de LH et FSH d a n s les h y p o p h y s e s et dan.s les m i l i e u x d ' i n c u h a t i o n .

R e m e r c i e m e n l s .

N o u s r e m e r c i o n s le Doc t eu r B lanc de I 'I .N.tl .A. (Nouzi l ly ) de n o u s a v o i r f o u r n i le s b r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l ap in . N o u s r e m e r e i o n s ~ g a l e m e n t les l a b o r a t o i r e s H o e c h s t p o u r l e u r don de LH-RF .

B I B L I O G R A P H I E .

1. D e s b u q u o i s , B. & A u r b a c h , G. D. (1971) J. Cl in. Endocr . , 33, 732-738.

2. Green 'wood, F. C., H u n t e r , W. M. ,~ Crover , J. S. (1963) B i o c h e m . J., 80, 114.

3. Dowd, A., B a r o f s k y , A. Z,, C h a u d h u r i , N., L loyd , C. W. & Weisz , J. (1975.) E n d o c r i n o l o g y , 96, 243-252.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.