IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER

EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"

Jean-Philippe Rosec - SCL

REGLEMENTATION EN MATIERE DE PRODUITS A BASE DE VIANDE ET D’IDENTIFICATION DES

ESPECES ANIMALES

(REVUE TRES PARTIELLE)

• Directive 2000/13/CE: étiquetage des produits alimentaires – ne pas induire en erreur le consommateur […] sur sa véritable nature et identité…

• Règlement (CE) 1760/2000 établissant un système d'identification et d'enregistrement des bovins et concernant l'étiquetage de la viande bovine et des produits à base de viande bovine (et modalités d’application dans R (CE) 1825/2000) → Carcasses et viandes à l’abattoir

«viande bovine»: tous les produits relevant des codes NC 0201, 0202, 0206 10 95 et 0206 29 91 + définition viande hâchée, viande découpée, chutes de parage

• Règlement (CE) 854/2004 fixant les règles spécifiques d'organisation des contrôles officiels concernant les produits d'origine animale destinés à la consommation humaine + R (CE) 853/2004 fixant des règles spécifiques d'hygiène applicables aux denrées alimentaires d'origine animale (→ définit VSM: exclues des viandes par Dir 2000/13/CE et R (CE) 1169/2011. Définit viandes hâchées, produits et préparations à base de viandes)

• Code des usages de la charcuterie, de la salaison et des conserves de viande

R (CE) 853/2004:

• Viandes = parties comestibles des animaux […] y compris le sang.

• Définit également les abats: viandes fraîches autres que celles de la carcasse, y compris viscères et sang

Code de la consommation:

• Viandes = Les muscles squelettiques (inclus diaphragmme et masséters, exclus cœur, langue, muscles de la tête autres que masséters, du carpe, tarse et queue) avec tissus naturellement inclusadhérents; avec teneurs max en MG et collagène définies.

Code des usages de la charcuterie:

• Définit précisément les abats; également le « Maigre » et les viandes déshydratées, le « Gras » (reprise textes et normes existantes)

• Définit de nombreuses préparations. Ex: Pâtés, mousses, terrines de (espèce): maigre, abats ou gras → au moins 20% de la masse nette du produit à la mise en œuvre, hors décor, substances d’enrobage, croûte, etc…

• Les moyens et les méthodes

→ Cibles protéiques

IsoElectroFocalisation (produits laitiers, poissons, uniquement produits non dénaturés) pas de quantification

Détection d’antigènes: Ouchterlony, immuno -histologie, ELISA, …

Spectrométrie de masse (QTof): gélatines porcines et bovines, développements?

IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

Actuellement: essentiellement les tests ELISA

• Les moyens et les méthodes

→ Cibles nucléiques

ADN nucléaires, ADN mitochondriaux (produits transformés): PCR et "dérivés" « (RFLP, puces à ADN, électrophorèse capillaire, …)

PCR en point final vs PCR en temps réel (dite "quantitative" car permettant de quantifier l’ADN)

IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

Actuellement:

Cible exclusive: ADN mitochondriaux

Toutes ces techniques sont employées pour l’identification

Pour la (semi) quantification (?): PCR en temps réel

ADN nucléaires

• rRNA 18S (gènes codant pour les ARN 18S)

• ADN satellites (profils mais aussi possibilitéd’amplifications spécifiques)

• gènes (K caséine, hormone de croissance, …)

→Spécificité, mais: sensibilité aux traitements (thermiques notamment), monocopies, problème de disponibilité des séquences, …

ADN mitochondriaux

• cytb

• rRNA 12S, cytochrome oxydase (COX)

→ Structure circulaire (résistance), multicopies, outils phylogéniques (disponibilité des séquences) mais: variabilité, taille des séquences. Possibilités de PCR spécifiques ou "universelles" (transvertébrés, …)

Test ELISA

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Principe

amorces

dNTP

Taq polymérase

ADN cible(ouvert par la chaleur)

La PCR - Rappels

Polymerase Chain Reaction ou Amplification en Chaîne par Polymérase(Vocabulaire de la génétique - JO 23/11/2006)

La PCR en point final

Produit PCR peut également être révélé en électrophorèse capillaire, ou après hybridation sur puce à ADN (avec sondes spécifiques),

100 ng/µl

10 ng/µl

1 ng/µl

0,1 ng/µl

La PCR en temps réel

ou PCR quantitative

Apparition du produit de PCR visualisée et mesurée par fluorescence au cours de la réaction. Fluorescence spécifique (sondes) ou non (agents intecalants)

ELISA vs PCR

(semi)-quantification

délicate voire impossible… ?

(semi)-quantification

possible …… ?

INCONVENIENTSAVANTAGES

Confirmation possible

par séquençage

(produits PCR > 100pb)

Manipulations délicates

(risques contaminations

croisées notamment)

Boîte noire: difficultés à

évaluer les performances

d’un kit (sensibilité,

inclusivité/exclusivité) d’un

lot à l’autre

Réalisation et

validation possible de

protocoles « maison »

Manipulations

relativement aisées

Matériel plus onéreux que

l’ELISA (PCR en temps réel)

Coût réactif /échantillon

important (ex: Cheval =

Coût/échantillon

relativement peu élevé

Matériel moins onéreux

que la PCR (en temps

réel)

Seuils de détection bas

(<1%, <0,1%, …)

Seuils de détection

relativement élevé (# 1%)

Seuils de détection bas

(<1%, <0,1%, …)

Seuils de détection

relativement élevés (#

1%)

Détection ADN: pas de lien

avec le tissu d’origine

Ne fonctionne pas sur

produits appertisés

Détection ADN, y

compris dans produits

appertisés

Détection des protéines

(pas ou peu

dénaturées)

PCRELISAPCRELISA

IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

oui(de l’ADN)

ouiPCR en temps réel

?oui (développement)

Spectrométrie de masse des

protéines (QTOF)

?oui+ électrophorèse

capillaire

nonoui+ PUCES à ADN

nonOui(variabilité + hétéroplasmie)

+ RFLP

nonouiPCR en point final

(oui)ouiImmunoenzymatiques

(ELISA)

QuantificationIdentificationMéthodes

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)

STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER

Matières premières (minerais, viandes hâchées, VSM, …)Produits transformés non appertisés

Produits appertisés

ELISA (Bovins, porcins, ovins, volailles, cheval)

PCR sur espèces non détectées par ELISA

PCR point final ou temps réel: porc, bœuf, âne, cheval, cerf, chevreuil, lapin, lièvre, chèvre, mouton. Toutes espèces sur viandes ou tissus non mélangés (cibles spécifiques ou "universelles" + séquençage

I

DE

N

TI

F

IC

A

TI

ON

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)

STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER

A

PP

RO

C

HE

Q

UA

N

TI

T

AT

I

VE

Approche par matrice

• Porc dans merguez (ELISA)

• Oie/canard dans foie et bloc de foie gras (PCR temps réel)

→ Gammes permettant des résultats semi-quantitatifs (Non détecté, <1%, 1% à 5%, 5% à 10%, 10% à 15%, >15%)

• Autres matrices (PCR temps réel) hors produits appertisés

→ Approche type seuil ou cut-off (ex: 1% viande de cheval). Les résultats de Cq (ou Ct ou Cp) sont comparés à un seuil 1% (viande type viande maigre). RESERVES! (voir cas de la crise viande de cheval)

→ Ordres de grandeur possibles à évaluer par comparaison avec gammes MAIS matrice par matrice… concrètement difficile voire impossible à réaliser sur échantillons complexes.

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"

Février 2013: Recommandation 2013/99/UE

→ Contrôles des denrées alimentaires commercialisées et/ou étiquetées comme produits contenant du bœuf: détecter les positifs >1% (en masse)

• Recherche du cheval selon méthode du laboratoire de référence de l’Union européenne pour la détection de protéines animales dans les aliments pour animaux: + addendum pour détermination du seuil de 1% (en masse) http://eurl.craw.eu/en/164/legal-sources-and-sops

• PCR temps réel (amorces peu spécifiques – spécificité par sonde d’hydrolyse)

• Pas de quantification mais seuil (cut-off) de 1%:

Echantillon: analyse en double

Témoin 1% = Mélange 1% cheval (viande) / 4 prises d’essai en triplicat / Cut-off = [moyenne des 12 mesures – 2 x écart-type] à comparer avec les 2 résultats de l’échantillon…

• Réserves sur la nature des matrices –et spécialement la teneur en MG- dont dépend la validité du seuil ainsi établi

Observations au SCL Montpellier

• Sur produits appertisés, notamment raviolis, chili con carne, sauces bolognaises et corned beef

→ Présence régulière d’ADN de cheval (prélèvements ciblés) souvent <1%, mais….

→ Présence d’ADN bovin également <1% (cut-off établi de façon similaire) y compris pour produits type Corned beef (viande bovine = 98% !)

→ La question de la fiabilité des analyses quantitatives, voire qualitatives, est posée:

Effets des traitements appliqués aux matières premières, des matrices complexes ?

Nature des matières premières: teneur en MG, teneur en ADN, définition(s) de ce que l’on appelle "viande" (cf. définitions règlementaires)… ?

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES

VERROUS TECHNOLOGIQUES

• (Semi)-Quantification délicate à mettre en œuvre dans les produits alimentaires (matrice dépendante)

• Difficultés rencontrées par l’analyse PCR sur certains produits appertisés

→ Identifier les causes = mieux connaître les matières premières mises en œuvre

→ Identifier d’autres voies analytiques

Jean-Philippe Rosec - SCL

MERCI DE VOTRE ATTENTION

Jean-Philippe Rosec - SCL