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Anomalies des voies de
signalisation et SMP :
explorations au laboratoire
d’Hématologie
Eric Lippert eric.lippert@u-bordeaux.fr
LMC PV TE MFP
Les principaux syndromes myéloprolifératifs
Les « grands SMP » :
Les SMP « Philadelphie-négatifs »
Les SMP plus rares :
LPNN SHE / LCE
Ugo et al., Exp Hematol, 2004
Les syndromes myéloprolifératifs sont caractérisés par une
pousse autonome des progéniteurs hématopoïétiques
Pousse endogène (sans EPO)
de BFU-E dans une maladie
de Vaquez.
Méthyl-cellulose
La différenciation
érythroblastique terminale
requiert de l’EPO, sauf dans
les maladies de Vaquez
Ugo et al., Exp Hematol, 2004
Pour savoir où c’est activé, on peut inhiber
pharmacologiquement
Contrôle positif
Inhibiteur de JAK2 -> abolition totale
de la différenciation terminale
Inhibiteur de PI3K -> abolition totale
de la différenciation terminale
Inhibiteur de MAPK -> abolition partielle
de la différenciation terminale
Inhibiteurs de Src -> abolition partielle
de la différenciation terminale
WT allele
Mut allele 3’ 5’ T
3’
G
M A
Taq
Taq
C/A 5’ 3’
WT allele
Mut allele
3’ 5’ T
3’ 5’ G
Taq
C/A 5’ 3’
3’ 5’ G
Taq
5’ T
Taq
3’
G
d'après Blood, 2006(108):1865
100
80
60
40
20
0 Pou
rcen
tage
JA
K2V
617F
PV TE MP
La mutation JAK2V617F n’est pas exprimée de la même façon
dans les différents SMP
Kralovics et al., N Engl J Med 2005;352:1779-90.
TE PV
Scott et al., Blood. 2006 ;108(7):2435
Barbui et al., Blood 2012, 120:5128
IPSET-Thrombose : mutations JAK2 mais pas leucocytose
891 TE « OMS », rétrospectif
La mutation de JAK2 entraîne un sur-risque de thrombose
+ Campbell et al., Lancet 2005;366:1945
Impact pronostique de la mutation ? Oui : Campbell et al., Blood 2006;107:2098
Barosi et al.,Blood 2007;110:4030
Non : Tefferi et al., Leukemia 2008;22:756
Guglielmelli et al., Haematologica
2009;94:144
Impact pronostique de la charge
allélique ? Oui : Tefferi Leukemia 2008;22:756
Guglielmelli, Haematologica 2009;94:144
Le statut mutationnel JAK2 a une valeur pronostique plus
discutée dans la myélofibrose
De plus, fortes charges dans PV et TE favorisent la survenue de MF
JAK2 exon 14
FAM TAMRA
JAK2 exon 14
FAM TAMRA
JAK2 exon 14
FAM TAMRA
JAK2 exon 14
FAM TAMRA
A
B
C
D
AS-Forward
Forward
AS-Forward
Forward
Reverse
AS-Reverse
Reverse
AS-Reverse
probe
probe
probe
probe
• Importance de connaître la technique
– Sensibilité ?
– Faux-positifs ?
– Faux-négatifs ?
• Aucune technique parfaite
– La biologie clinique N’EST PAS une science exacte !
HRM in a slide
amplification melting
HRM principle
Melting + Annealing
Hétéroduplex melting
A
T
C
G
T A
C G
Homoduplex melting
Melting of referent sample
température
flu
ore
scen
ce
HRM
T A
C
G
C A
T G
C A
T G
-dF dT
Normalized and temperature shifted
difference plot
COST Training School, NÎMES, 2011 A. EVRARD, S. CARILLO
• Mutations de l’exon 12
– Phénotype de PV (EPO basse souvent)
– Pas toujours facile à mettre en évidence
– Rares
=> centres spécialisés
• Mutations de MPL
– Pas de phénotype spécifique (TE ou MF, pas PV)
– Pas toujours facile à mettre en évidence
• HRM
• Séquence (mais petits clones)
• PCR-AS : W515K, W515L (mais rate des mutations rares)
– Rares (mais exclusive des autres mutations)
JAK2VF
MPL
?
JAK2ex12 ?
JAK2VF
JAK2VF
MPL
?
Polyglobulie de Vaquez
Thrombocytémie essentielle
Myélofibrose
Autres : - TET2 - ASXL1 - EZH2 - SRSF2 - DNMT3A… D’après Chauveau et coll., hématologie
Exome sur 6 MFP 168 MPN 2-12 mutations /génome 2 à 32 mutations 1 seule mutation récurrente : gène CALR Cohortes de validation :
53%
7%
33%
7%
Polyglobulie de Vaquez (n=920)
Thrombocytémie essentielle (n=2156)
Myélofibrose (n=534)
58%
4%
23%
15%
JAK2V617F
Mutation MPL
Mutation CALR Triple Négatif
96%
2% 2%
MutationJAK2exon 12 PV JAK2 sauvage
D’après Chauveau et coll., hématologie
Pour qui ?
- suspicion TE ou MF - JAK2V617F -> CALR ex 9 si JAK2V617F neg -> MPL ex 10 si CALR neg - pas pour les polyglobulies - pas résolu pour - ARS-T (<2%), - thromboses splanchniques (plutôt non)
(Haslam & Langabeer, BJH 2014 : 0/144
Turon et al., J Hepatol 2014 : 4/209 mais ont SMP (3TE, 1MF))
Faut-il rechercher les mutations de CALR ?
Rumi et al., Blood 2014;123(10):1544-51
Finazzi et al., Blood 2014;124(16):2611-2
Mais ne modifie pas IPSET-thrombose
Les TE mutées sur CALR thrombosent moins
Klampfl et al., NEJM, 2013;369(25):2379-90
Les mutations CALR définissent un groupe favorable dans les
MF… mais ça dépend du type de mutation
Cabagnols et al., Leukemia. 2015 ;1:249-52
Exons 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Exon 9 3’ UTR
TGTCG
Délétions
Insertions TTGTC
A
B
Domaine N-terminal Domaine P Domaine C-terminal KDEL
Domaine N-terminal Domaine P
Domaine N-terminal Domaine P
C Protéine normale
Protéine après mutation de type 1
Protéine après mutation de type 2
Domaine C-terminal
Domaine C-terminal
Les mutations de CALR entraînent un décalage de phase
D’après Chauveau et coll., hématologie
Crt : 60 kDa, homologue Cnx Lectine, lie les GP avec un seul Glc Lie ions (Ca++, Zn…) Lie ERp57 (thiol oxydoreductase) Site lectine reconnaît Glc1 et Man
Zone liaison Ca++ hte affinité
Zone liaison Ca++ basse affinité (tamponne le Ca du réticulum)
Lynch & Michalak, BBRC 2003; 311: 1173
• Mutations de CALR
– Deuxième par ordre de fréquence pour TE et MFP
– Toujours changement de cadre => changement de taille
– Analyse de fragments, HRM, séquence (peu (pas ?) de faibles clones)
LMC PV TE MFP
Les principaux syndromes myéloprolifératifs
Les « grands SMP » :
Les SMP « Philadelphie-négatifs »
Les SMP plus rares :
LPNN SHE / LCE
Mécanisme physiopathologiques
Domaine HLH
La fusion augmente le profil d’expression du récepteur car soumet le gène au promoteur du partenaire
=>activité en conséquence
PDGFR Gène partenaire
5’
Promoteur Régulation
ADN 3’
Fusion ETV6-PDGFRB Fusion FIP1L1-PDGFRA
FIP1L1
Région JM
PDGFR
Transcription +++
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
10
100
Co
pie
s o
f P
DG
FRA
/10
0A
BL1
1 2 3 4 5
Categories of patients
A
0,1
1
10
100
1000
Co
pie
s o
f P
DG
FRB
/10
0A
BL1
B
1 2 3 4 5
Categories of patients
Hyperéosinophilies : intérêt du dosage quantitatif des 3’ PDGFRA et PDGFRB
LMC PV TE MFP
Les principaux syndromes myéloprolifératifs
Les « grands SMP » :
Les SMP « Philadelphie-négatifs »
Les SMP plus rares :
LPNN SHE / LCE
Kröger et al, Blood 2007 Lange et al, Haematologica 2013
Kiladjian et al, Blood 2008
Suivi de traitement : Interféron
Allogreffe
La quantification de JAK2 permet de suivre le traitement
Charg
e a
lléliq
ue (
%)
Temps (mois)
La quantification de CALR permet de suivre le traitement
Cassinat et al., N Engl J Med 2014; 371:188
Mansier et al., J Mol Diag, en révision
Conclusions
Depuis 10 ans, les SMP Philadelphie-négatifs sont entrés dans l’ère moléculaire Conséquences en termes de : • Physiopathologie (et développement de drogues) • Diagnostic (marqueur moléculaire pour plus de 80%) • Evaluation pronostique (scores pour greffe) • Suivi moléculaire
Murat, Blood (2002) 99:3066
Semenza, Blood (2009) 114:2015
Richmond, Trrends in Cell Biology (2005)15 :146
Physiopathologie
Partenaire de fusion
Domaine TK
Très grande variété de partenaire s de fusion
Domaine TK systématiquement conservé dans tous les réarrangements
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