Caractérisation structurale d un régulateur transcriptionnel du « Quorum Sensing » chez Brucella...

Caractérisation structurale d ’un régulateur transcriptionnel du « Quorum

Sensing » chez Brucella abortus

Le « Quorum Sensing » des bactéries Gram-

« Le ‘Quorum Sensing’ est un phénomène par lequel l’accumulation d’une phéromone de faible poids moléculaire permet à la cellule individuelle de percevoir quand l’unité de population minimale ou ‘quorum’ de bactéries est atteint, pour initier une réponse concertée de l’ensemble de la population »

(Fuqua 1994)

Production de lumière chez la bactérie marine Vibrio fischeri

Haute densité cellulaire :

Autoinduction de la luminescence

Quorum Sensing Quorum Sensing chez chez Vibrio fischeriVibrio fischeri

• Lux I :Lux I :La synthétase de phéromoneLa synthétase de phéromone

• OHHL : OHHL : La phéromone ou La phéromone ou l ’autoinducteurl ’autoinducteur

• Lux R :Lux R :Le régulateur transcriptionnel Le régulateur transcriptionnel activé par OHHLactivé par OHHL

luxR luxI luxCDABE

OHHLOHHL

++

LumièreLumièreO

NH

O O

O

Caractéristiques structurales des régulateurs de la famille LuxR

• actifs sous forme d’un dimère• association à la membrane• organisés en deux domaines structuraux

N C

Liaison à la phéromone(HSL)

Liaison à l ’ADN via un motifHélice-coude-hélice

(HTH)

problèmes de purification structures 3D

Brucella abortus, notre organisme d ’intérêt

• Coccobacille Gram-négatifCoccobacille Gram-négatif

• Pathogène intracellulaire Pathogène intracellulaire

• Provoque une zoonose qui Provoque une zoonose qui atteint quelquefois l ’hommeatteint quelquefois l ’homme

Un système de « Quorum Sensing » a récemment été identifié chez cette bactérie et le régulateur transcriptionnel correspondant a été nommé BabR. C’est un homologue de LuxR (25% d ’identité selon l ’alignement donné par ALIGN).

OBJECTIF

Caractériser structuralement le régulateur transcriptionnel BabR de Brucella abortus à l’aide d’outils bioinformatiques .

Les différentes étapes suivies:

.Obtenir la topologie de BabR et de ses homologues les plus proches.Obtenir un modèle 3D du domaine C-terminal de BabR pour pouvoir analyser plus en détail le motif HTH..Obtenir le plus d’informations structurales possibles sur le domaine N-terminal de BabR

Obtention de la topologie de BabR et de ses homologues

1

BabRSéquence complète

Recherche de séquences similaires (BLAST)

Sélection des homologues les plus similaires ( E-value < à 0,01)

> à 30% d ’identité* avec BabR

> à 30% d ’identité*avec BabR + LuxR (prot.réf.)

Alignement multiple(Match-Box,ClustalW)

* pourcentage d ’identité déterminé par ALIGN

Alignement multiple(Match-Box,ClustalW)

Alignement multiple(Match-Box,ClustalW)

Toutes lesséquences

> à 30% d ’identitéavec BabR + LuxR (prot.réf.)

Méthodes de prédictions de structures secondaires pour déterminer la topologie de BabR et des différents homologues( PHD, PSIpred, PREDATOR, JPRED,PROF)

CONSENSUS des méthodes de prédictions de structures secondaires

Méthode utilisée pour réaliser le consensus

V F G L L S F V R S G P A L T P G E I S M BabR (partie)

β β β β β β β α α α α α α PHD

2 2 7 9 9 8 5 4 3 8 9 9 9 9 6 7 9 9 9 9 9

β β β β α α α α α α PSIPRED

8 2 0 3 5 6 4 3 8 8 6 1 0 2 0 8 9 9 9 9 9

α α α α α α α α α α α α α PROF

_ _ β β β β β β β _ _ _ _ _ _ _ _ α α α α PREDATOR

- β β β β β β - - - - - - - α α α α α α α JPRED

V F G L L S F V R S G P A L T P G E I S M BabR (partie)-1 -3 -3 -3 -3 -3 -2 2 3 3 3 3 3 PHD

-2 -3 -3 -2 3 3 3 3 3 3 PSIPRED1 2 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 PROF

-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 PREDATOR-1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 JPRED

1 0 -3 -5 -6 -6 -6 -3 -1 0 0 0 0 0 1 7 9 10 10 10 10 TOTALβ β β β α α α α α α CONSENSUS

: 7 10 = TOTAL à HELICE α -5 -10 = à BRIN β

Score PHD

Score PSIPRED

Consensus des différentes méthodes pour les 11 séquences (BabR et ses homologues ( en moyenne 240 a.a.))

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N

CDom. N-termDom. C-term

HELICE α

BRIN β

BabR

LuxR

HOMOL.

Obtention du modèle 3D du domaine C-terminal de BabR et analyse plus détaillée du HTH

2

Domaine C-Terminal de BabR

Recherche d ’homologues dans la banque de structuresPDB 1 résultat significatif:NarL (E-value=0,077)

Reconnaissance de « Fold »(3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK)

1 résultat significatif (4 méthodes sur 5):NarL

Détermination d’un consensus des alignements BabR-NarL fournis par différentes méthodes : • Alignements séquence-séquence • Alignements séquence-structure

ALIGNEMENT SEQUENCE-STRUCTURE OPTIMAL :

• 61 derniers résidus de BabR alignés de façon certaine avec NarL (dom. Cterm)• Les autres résidus: lien flexible et donc alignement incertain

Alignment BabR Cterm.-NarL final

------------------------------------------------------EPATILLIDDHPMLRTGVKQLISMAPDITVVGEASNGEQGIELAES NarL

--------------------------------------------------LDPDLILLDLNMPGMNGLETLDKLREKSLSGRIVVFSVSNHEEDVVTALK NarL

----------------TPGEISMLRRQLQMVTNLLHLSMYERVDVPAISC BabRRGADGYLLKDMEPEDLLKALHQAAAGEMVLSEALTPVLAASLRANRATTE NarL

IGDVSLTLREREILRWTSEGKTAEIIGTILNISTRTVNFHINNVLTKLVA BabRRDVNQLTPRERDILKLIAQGLPNKMIARRLDITESTVKVHVKHMLKKMKL NarL

VNKVQAVAKARTFGLL BabRKSRVEAAVWVHQERIF NarL

Le modèle du domaine C-terminal de BabR

Caractérisation plus détaillée du HTH

1. Analyse de 4 complexes ADN-protéine : -répresseur -répresseur LexA -répresseur P22 -répresseur Cro

Détermination des résidus de chaque HTH interagissantde manière spécifique avec l ’ADN

Visualisation des ponts H entre le HTH et les bases nucléotidiques de chaque complexe

COMPLEXE HTH-ADN (1QAA)

Détermination des résidus interagissant de manière spécifique avec l ’ADN

Struct. Sec. A. aminés Struct. Sec. A. aminés Struct. Sec. A. aminés Struct. Sec. A. aminés

THR ARG THR SERH GLN H GLN H ARG H GLNH THR H ALA H ALA H GLUH GLU H ALA H GLU H SERH LEU H LEU H ILE H VALH ALA H GLY H ALA H ALAH THR H LYS H GLN H ASPH LYS H MET H ARG H LYSH ALA H VAL T LEU H METT GLY T GLY T GLY T GLYT VAL T VAL T PHE T METT LYS T SER T ARG T GLYT GLN T ASN T SER H GLNH GLN H VAL T PRO H SERH SER H ALA H ASN H GLYH ILE H ILE H ALA H VALH GLN H SER H ALA H GLYH LEU H GLN H GLU H ALAH ILE H TRP H GLU H LEUH GLU H GLU H HIS H PHEH ALA H ARG H LEU ASN

GLY SER H LYSGLU H ALATHR H LEU

H ALAH ARGH LYS

GLY

3 CRO 1 LMD1 QAR

Monom. 1Monom. 1

1 QAA

Monom. 1 Monom. 1

Asn 215

His 212

Thr 208

Ser 205

2. Extrapolation au domaine HTH de BabR (d ’après l ’analyse HTH-ADN et l ’alignement avec LuxR)

Caractérisation structurale du domaine N-terminal de BabR

3

Domaine N-Terminal de BabR

Recherche de séquences similaires (BLAST):Aucun résultat significatif

Reconnaissance de « Fold »(3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK)

Pas de structure mais 1 topologiedonnée par plusieurs méthodes :Le « Rossman Fold »

Modèle topologique d ’une protéine de type « Rossman fold »

Structure 3D d ’une protéine adoptant une topologie de « Rossman fold »

Modèle topologique du domaine N-term. de BabR

L ’alignement BabR-LuxR permet de définir sur la topologie les résidus importants dans la liaison à l ’HSL et donc de localiser la région de liaison.

C N

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

• But d’un modèle = générer des hypothèses testables au laboratoire• Nous avons généré des hypothèses pour le domaine N-terminal et pour le domaine C-terminal. Nous avons pu caractériser structuralement une protéine de la famille LuxR.• Des résidus ont été prédits comme importants, soit dans la liaison à l’ ADN soit à la phéromone; ils pourront donc être testés par des expériences de mutagenèse dirigée.