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Eléments de microscopie optique et électronique

Marc Landry UFR SDV, Université Bordeaux Segalen

IINS, CNRS UMR 5297

Les échelles de grandeur

Microscope de Hooke (XVIIème siècle)

1. Bases de la microscopie

1.1. Dualité onde-corpuscule 1.2. Eléments d’un microscope

1.3. Formation d’une image en microscopie optique

1.4. Electron et rayonnement

1.1. Dualité onde-corpuscule

• Fréquence: n = c/l

• Energie: E = hn

•Ondes : diffraction, interférences

•Corpuscules : collision

De Broglie

1.2. Eléments d’un microscope Deux catégories de microscopes

Tout microscope est constitué : •d’une source de rayonnement

•d’un échantillon

•d’un détecteur de la vitesse et des directions des particules après collision

•Détecteur loin de l’échantillon: microscopie de champ lointain

•Pas de séparation entre source, échantillon et détecteur (sonde locale): microscopie de champ proche

1.2. Eléments d’un microscope Le microscope optique

•Observation en transmission

•Observation en réflexion

1.3. Formation d’une image en microscopie optique

1.3.1. Interaction onde-matière 1.3.2. Principe d’une lentille convergente

1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope

1.3.4. Limites de résolution 1.3.5. Anomalies des lentilles

1.3.1. Interaction onde-matière Absorption-Emission

1.3.1. Interaction onde-matière Réflexion-Réfraction

•Propagation différentielle selon le milieu traversé (déphasage et déviation)

•Caractérisé par un indice de réfraction n=c/v

•Propagation différentielle selon les longueurs d’onde

1.3.1. Interaction onde-matière Réflexion-Réfraction

1.3.1. Interaction onde-matière Diffraction

Step : Change from ground state S0 to excited state S’1 following light energy absorption hvex

Step : Energy of S’1 is partially dissipated S1 from which fluorescence emission originates

Step : A photon of energy hvem is emitted, returning the fluorophore to its ground state S0. Due to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower and therefore of longer wavelength than the excitation photon hvex.

S0 = Ground state S’1 S1 = Excited state

Simplified Jablonski diagram

S0

S’1

S1

hvex hvem

Wavelength (nm)

10-1

5 s

10-9

s à 1

0-7s

1.3.1. Interaction onde-matière Fluorescence

immunofluorescence AMCA ; Alexa Fluor 488, Alexa 568, Alexa 647, etc. ; Cy2 (Cyanine2), FITC, Cy3.5, TRITC,

lissamine rhodamine, Texas Red, Cy5

DNA Propidium iodide, YOYO, SYTO16 (vital), chromomycine A3 ou mithramycine (bases GC),

bisbenzimide Hoechst 33342 , DAPI, DRAQ5, YOPRO, TOTO3, TOPRO3

mitochondria Rhodamine123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (vital; post-fixation

possible)

membranes FM1-43, FM4-64, GFP-tagged probes

Endoplasmic reticulum (non specific) DiOC6(3) high concentrations ; GFP-tagged probes

Golgi apparatus Antibodies, GFP-tagged probes ; NBD-C6-ceramide (not for plants)

Cell wall Acriflavine Feulgen, Calcofluor (UV), aniline blue (sur callose), chromomycine or propidium

iodide(non spécific), FM1-43, FM4-64

pH carboxy-SNARF-1 and derivatives, BCECF

calcium Fluo-3 ou -4 (FF), Fura Red, CalciGreen ; Indo-1, Cameleon

viability fluoresceine di-acetate ; exclusion of propidium iodide ; Fluoro-Jade (Histo-Chem) and

morphology by differential interference contrast (DIC)

autofluorescent proteins BFP, CFP, GFP, YFP, DsRed, DsRed2, HcRed1, etc

miscellaneous

Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophyl

Important fluorochromes used in microscopy

Fluorescent proteins : Green Fluorescent Protein

Aequorea victoria (Shimomura et al., 1962)

Spectral characterization

Specific features

Advantadges Can be fused to other proteins of interest No substrate or cofactor No species specificity Stable (pH, T, denaturation, proteases, aldehydes)

Disadvantadges Non optimal excitation peak for the existing laser sources Cryptic intron in plants Need to obtain spectral variants

GFP variants

(Heim et al., 1994, 1995, 1996)

Red Fluorescent Proteins

Coral reef proteins from the Indian and pacific Ocean (Matz et al., 1999) Characteristics similar to GFP except for a slower maturation and the obligatory oligomerization

Mutation to generate fast maturing variants and monomers

18

Broad excitation/emission spectra

In

tens

ité

Longueur d’onde (nm)orange rouge

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

Longueur d’onde (nm)orange rouge

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

0

20

60

80

40

100

350 400 450 500 550 600350 400 450 500 550 600UV bleu vert

mRFP1

Longueur d’onde (nm)

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

400 450 500 550 600 700650UV bleu vert orange rouge IR

mRFP1

Longueur d’onde (nm)

HcRed

EYFPEGFPECFPEBFP DsRed

0

20

60

80

40

100

20

60

80

40

100

400400 450450 500500 550550 600600 700700650650UV bleu vert orange rouge IR

mRFP1

Ex (nm) Em (nm) ε (M-1. cm-1) F brillance (ε . UA) pKa Remarque wtGFP neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria

wtGFP phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria

EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl-1 DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata

mRFP1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible Heteractis crispa

fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3

Quantum Dot 405/605 605 2 400 000 0,40 1 000 000 à valider

Epi-fluorescence microscope

Arc lamp

Collector lens

Excitation filter

Objectif lens

Sample

Dichroic mirror

Ocular Lens

Emission filter

Long Pass filter Band Pass filter

Xenon Lamp (XBO) ● power 50 to 150W ● lifetime from 150 to 2000h ● homogenous light for all wavelength ● weak intensity in UV, strong intensity in IR

Light source spectral characteristics

Mercury lamp (HBO) ● power 50 to 100W ● lifetime from 150 to 300h ● good excitation in UV ● peak of intensity in the blue and green light

Reflected light

Transmitted Light Light source

0%

UV IR

Reflect Pass

% R

efl

ect

ion

Dichroïc mirror at 45°

510 Long Pass (LP)

Dichroïc mirror

wavelength

Sample

Detector

% T

rans

mis

sion

100%

100% 0%

Transmitted light Light source

575 nm Short Pass Filter

<575 nm UV IR

block pass

% T

rans

mis

sion

Fluorescence Filters

Light source Transmitted light

520 nm Long Pass Filter

>520 nm

UV IR

block pass

% T

rans

mis

sion

UV

block

pass

block

% T

rans

mis

sion

Transmitted light Light source

630 nm BandPass Filter

620 -640 nm Light IR

1.3.2. Principe d’une lentille convergente

2f>d>f

d>2f

1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope

1.3.4. Limites de résolution Tache d’Airy

D=0,61×l/nsina

Interférences constructives et destructives

La résolution résulte de : •La fonction de défocalisation en z

•La fonction d’étalement du point dans le plan focal (point spread function, PSF)

1.3.4. Limites de résolution Ouverture numérique

Numerical Aperture (NA) = n(sin m)

1.3.4. Limites de résolution Illumination

Focalisation de la lumière sur l’objet Le rôle du condenseur

1.3.5. Anomalies des lentilles

•Anomalie comatique

•Astigmatisme

•Anomalie chromatique (meilleure focalisation des longueurs d’onde courtes)

•Anomalie sphérique

1.3.5. Anomalies des lentilles Correction des objectifs

1.4. Electron et rayonement Longueur d’onde

•Equation de De Broglie

•Energie cinétique (charge e = 1,6.10-19 C; masse m = 9,11.10-28 g;

différence de potentiel V)

1 Joule = 107.cm2.g.s-2

Exemple : si V = 60 kV; alors l = 5.10-3 nm

V l (nm) v (•10-10 cm/sec) v/c

10,000 0.0123 0.593 0.198

50,000 0.0055 1.326 0.442

100,000 0.0039 1.875 0.625

1,000,000 0.0012 5.930 1.977!

•Correction relativiste

V l (nm) v (•10-10 cm/sec) v/c

10,000 0.0123 0.593 0.195

50,000 0.0055 1.326 0.414

100,000 0.0037 1.875 0.548

1,000,000 0.00087 5.930 0.941

1.4. Electron et rayonnement Vitesse des électrons

2. Elements d’un microscope électronique

2.1. Histoire de la microscopie électronique 2.2. Grands types de microscopes électroniques 2.3. Sources d’électrons

2.4. Lentilles électro-magnétiques

2.5. Détecteurs d’électrons 2.6. Microscopes à transmission et à balayage

2.1. Histoire de la microscopie électronique

2.1. Histoire de la microscopie électronique Comparaison optique-électronique

Similarités: •Système d’illumination: source de rayonnement + condenseur

•Echantillon

•Formation de l’image: lentille objectif + lentille projective

•Détection de l’image Différences: •Lentilles optiques et ferromagnétiques

•Grandissements obtenus par changement de lentilles objectifs ou de la distance focale de la lentille projective

•Profondeur de champ

•Nature du contraste

•Vide et déshydratation

2.2. Grands types de microscopes

Le microscope électronique simplifié

Ruska, 1931

2.3. Sources d’électrons

Source thermo-ionique

Source à effet de champ (Field Emission Gun)

½mv² = e(Vc-Va)

l = h/[2me(Vc-Va)] 1/2

v = [2e(Vc-Va)/m] 1/2 et l = h/(mv)

constantes h = 6,63.10-34 J.s (constante de Planck)

m = 9,11.10-31 kg (masse de l'électron)

e = -1,6.10-19 C (charge de l'électron)

c = 3.108 m/s (vitesse de la lumière)

Va-Vc (kV) v (m/s) l (10-1nm) 100 1,9.108 0,039 200 2,7.108 0,027

Filament de tungstène ou d’hexaborure de lanthane

2.4. Lentilles électro-magnétiques Focalisation des électrons

Le facteur d’excitation modifie l’intensité de la composante radiale du champ, donc la convergence de la lentille K = N2I2/V*

2.4. Lentilles électro-magnétiques Anomalies des lentilles

•Anomalie sphérique (d’ouverture)

•Pouvoir de résolution

2.5. Détecteurs d’électrons

Microscopie à transmission: Détecteur 2D

•Ecran fluorescent

•Emulsion photographique

•Détecteurs CCD et PDA

Microscopie à balayage: Détecteur simple

2.6. Microscopes à transmission et à balayage Colonne du microscope à transmission

2.6. Microscopes à transmission et à balayage Système de vide

2.6. Microscopes à transmission et à balayage Insertion de l’échantillon

2.6. Microscopes à transmission et à balayage Colonne du microscope à balayage

3. Formation des images en microscopie électronique

3.1. Interactions électron-matière 3.2. Contraste dans les structures amorphes 3.3. Contraste dans les structures cristallines

3.4. Contraste en microscopie à balayage

3.1. Interactions electron-matière

Microscopie électronique: Interactions électroniques •Diffusion élastique (contraste)

•Diffusion inélastique (microscopie analytique)

Microscopie optique: Variations d’absorbance

3.2. Contraste dans les structures amorphes Diaphragme de contraste

Contraste d’absorption

3.3. Contraste dans les structures cristallines Diffraction par un réseau

Champ clair Champ noir

3.4. Contraste en microscopie à balayage

P(R) = nZ S = image de la surface

4. Préparation des échantillons et exemples d’applications

4.1. Préparation des échantillons 4.2. Cytologie 4.3. Physiologie cellulaire

4.4. Immunohistochimie

4.5. Hybridation in situ 4.6. Biologie des virus 4.7. Autoradiographie

Si l'échantillon est inorganique •Polissage électrolytique (métaux et alliages) •Polissage chimique (presque tous les types de matériaux) •Amincissement sous bombardement d'ions primaires (presque tous les types de matériaux) •Polissage mécanique très doux sur un système dit "tripode" •Coupe par ultramicrotomie

Si l'échantillon est organique •Traitement de fixation (processus chimique ou physique). •Déshydratation par substitution à température ambiante de solvants organiques (alcool ou acétone) à l'eau. •Imprégnation dans différents types de résines, choisies en fonction de l'observation recherchée (polymérisation). •Le matériau est suffisamment résistant pour être débité sous forme de lames minces de 0,5 à 0,05 µm d'épaisseur en moyenne. (ultramicrotome : couteau de verre ou en diamant). •Pour améliorer le contraste entre les différents organites cellulaires, on expose souvent l'échantillon à un produit contenant des atomes lourds (acétate d'uranyle et citrate de plomb), afin que ces derniers, en diffusant à la surface des différentes structures cellulaires, les rendent visibles.

4.1. Préparation de l'échantillon

Préparation des échantillons en microscopie à transmission

Coupes ultra-fines

Cryofractures

Comparaison des images

Microscopie à transmission Microscopie à balayage

Visualisation 3D en microscopie électronique

• Tomographie électronique ou cellulaire

Organisation tridimensionnelle des épines

• Visualisation 2D

• Tomogramme

pccor10_img

• Visualisation 3D

• Reconstitution 3D

Réseau pré-synaptique

• Réticulation des vésicules synaptiques

• Vésicules “dockées”

4.2 Cytologie 4.2.1. Organelles 4.2.2. Cytosquelette 4.2.3. Noyau

4.2.4. Situations pathologiques 4.2.5. Artéfacts 4.2.6. Cryométhodes

4.2.1. Organelles

Synapse

Mitochondrie

Polyribosomes

Muscle

4.2.2. Cytosquelette

Coupe de cil

Coupes de microtubules

Coupes de microtubules

4.2.3. Noyau

Fuseau mitotique

Empreinte d’ADN

4.2.5. Artéfacts Artéfacts d’observation

Confronting cisterns

Membranes accolées

4.2.5. Artéfacts Artéfacts de fixation

Corps multivésiculé

Myelin-like body

4.2.6. Cryométhodes

4.3. Physiologie cellulaire Trafic intracellulaire

Pinocytose

Vésicules recouvertes de clathrine

4.3. Physiologie cellulaire Biologie du développement: Gastrulation

4.3. Physiologie cellulaire Biologie du développement: Neurogénèse

Tube nerveux Cône de croissance

Filopodia

4.3. Physiologie cellulaire Reconstructions tridimensionnelles

Mitochondries confluentes

Reticulum

4.4. Immunocytochimie Localisation

Marqueur enzymatique: Microscopie optique

Microscopie électronique

4.4. Immunocytochimie Localisation

Or colloïdal: Microscopie électronique

4.4. Immunocytochimie Physiologie cellulaire

Secrétion peptidergique Rôle de neurotransmetteur, Libération extrasynaptique

Pow and Morris, 1989

4.4. Immunocytochimie Marquages multiples

Différentes tailles de particules

4.4. Immunocytochimie Trafic intracellulaire

Bernard et al., 2003

4.5. Hybridation in situ Détection radioactive

4.5. Hybridation in situ Protocoles non radioactifs

ARNm Gal

4.6. Biologie des virus

4.7. Autoradiographie

Recapture de noradrénaline H3

Division cellulaire Thymidine H3

Conclusions

Sources d’informations irremplaçables Autres développements: microscopie analytique Préservation des structures Résolution améliorée: microscopie à force atomique