ENZYMOLOGIE (PACES) Pr S. Kamel Faculté de pharmacie Amiens Biologiste CHU Amiens

ENZYMOLOGIE

(PACES)

Pr S. Kamel

Faculté de pharmacie Amiens

Biologiste CHU Amiens

I - INTRODUCTION

3 caractéristiques pour une réaction chimique dans la matière vivante :

Rapidité

Température peu élevée

Spécificité

CATALYSEURS = PROTEINES = ENZYMES

Intérêt fondamental

Réactions du métabolisme (régulation ++ : production de métabolites)

Pharmacologie moléculaire (inhibiteurs d’enzymes = médicaments)

Alpha-galactosidase

- Site actif = ensemble d’ acides aminés (AA)

- Interaction substrat + AA (liaisons de faible énergie)

Rapprochement ++ des espèces moléculaires

Effet de voisinage (différence ++ avec la chimie : pas d’agitation moléculaire)

Equation de Michaelis et Menten

Km : affinité

Km : affinité

Km est indépendant de la concentration d’enzyme

Unité de l'activité enzymatique

L'activité enzymatique d'une solution est le nombre de mole de substrat qu'elle dégrade par seconde

Katal (Kat)L'unité officielle de la mesure de l'activité enzymatique.C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat par seconde

L'unité international (U.I)unité très usuelle C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat par minute

1UI= 16nKat.

DosageLa mesure de l'activité enzymatique d'une solution permet de doser une enzyme. Il faut faire la mesure dans des conditions définies de pH, de T°(souvent 37°), de [S], …)

Représentation de Lineweaver et Burk

pH optimal voisin de 7 (enzymes actives à pH acide ou alcalin)mesure de l’activité d’une E dans des conditions définies de pH et de T°

III- Les Effecteurs d’Enzyme Michaeliens

1 – Définition

Molécule chimique qui par sa liaison avec l’enzyme (ligand) module la vitesse de la réaction enzymatique :

- en l’accélérant = activateurs (ions divalents Zn++)

- en la ralentissant = inhibiteurs (applications pharmacologiques)

2 – Cas de l’inhibition irréversible

E + I E I

Liaison covalente

- DFIP = gaz neurotoxique- Autre ex : pénicilline (inhibiteur irréversible de la transpeptidase bactérienne)

3-2 Inhibition non compétitive

Inhibiteurs non compétitifs ≠ analogue structural

3-3 Inhibition uncompétitive (anticompétitive)

Autres exemples d’inhibiteurs enzymatiques

- Acyclovir : inhibiteur de la thymidine kinase virale

- Pénicilline : inhibiteur de la transpeptidase bactérienne

- Statines : inhibiteur de l’HMG coA réductase = hypocholestérolémiant

AcétylCoA

AcétoacétylCoA

Hydroxyméthylglutaryl CoA

(HMG CoA)

2 NADPH 2 NADP+ 2H+

CoA

Mévalonate

(HMG CoA) réductase

Statine (lovostatine)

-

- Membranes

- Acides biliaires

- Hormones Stéroides

...

cholestérol

IV – Les enzymes allostériques

1 – Allostérie : définition

Ex : Myoglobine et hémoglobine ≠ Enzymes

Myoglobine (Mb) : - O2 dans le cytoplasme- 1 chaîne polypeptidique (153 AA)- 1 molécule d’héme

Hémoglobine (Hb) : - O2 dans le sang (GR) - 4 chaînes polypeptidiques (tétramères)

2 et 2ß - 4 molécules d’Hème (4 O2)

Courbe de saturation en O2 de la Mb et de l’Hb :- Pour Mb : Hyperbole- Pour Hb : Sigmoïdes

Interprétation :

Mb : 1 chaîne polypeptidique cinétique de saturation michaélienne

Hb : 4 chaînes polypeptidiques = oligomère (structure quaternaire)

Fixation d’une molécule d’O2 sur une sous unité entraîne une modification conformationnelle d’une autre sous unité qui est alors capable de fixer une autre molécule d’O2 : effet de coopérativité positive = protéine allostérique (intérêt physiologique +++)

Allostérie : propriété de certaines protéines actives oligomériques (transporteurs, canaux, pompes, enzymes…) de changer de structure spatiale lorsqu’elles se lient à une molécule de ligand (substrat ou effecteur), cette liaison se traduisant par une modification d’activité.

Forme T (tendue)

Forme R (relachée)

Site actif impropre à la fixation du substrat

Site actif permettant la fixation du substrat

Transition allostérique

2 – La cinétique allostérique

3- Modèle d’interprétation

3-1 Modèle concerté de Monod, Wyman et Changeux

3-2 Modèle séquentiel de Koshland

4 – action des effecteurs allostériques

5 – Régulation des métabolismes in vivo par les enzymes allostériques

5-1 Définitions

Métabolisme : ensemble de réactions biochimiques permettant la synthèse ou la dégradation d’un métabolite (substrat)

Catabolisme : voie métabolique conduisant à la dégradation d’un métabolite (glycolyse : dégradation du glucose)

Anabolisme : voie métabolique permettant la biosynthèse d’un métabolite (glycogenèse : synthèse du glycogène)

Biosynthèse de X ou dégradation de A

A B C D….X

E1 E2 E3 E4

Rétro-inihibition (feedback négatif)

E1 = enzyme allostériqueX = métabolite terminal = inhibiteur allostérique (régule sa propre biosynthèse)

Ex : régulation allostérique de la glycolyse

Glucose glucose 6 P Fructose 6 P

Fructose 1-6 Bi P

Pyruvate

production d’ATP++

PFK Phosphofructokinase

Cycle de KrebsRétro-inhibition

AMP

+

[ATP] glycolyse

[ATP] (AMP ) glycolyse

V – Coenzymes et groupes prosthétiques

VI – Applications générales des enzymes

1 - Dosage des activités enzymatiques : intérêt en pathologie humaine

- Localisation cellulaire

LDH : lactate deshydrogénaseCPK : créatine phosphokinaseASAT : aspartate aminotransférase

Localisation tissulaire : organospécificité

- Créatine phosphokinase (CPK) : muscle squelettique, cœur- Lactate deshydrogénase (LDH) : foie, cœur- Aspartate aminotransférase (ASAT) : foie, cœur- Phopshatase alcaline (PAL) : foie, os, placenta- Gamma glutamyl transférase : foie, rein

- Méthode en point final : transformation totale