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ENZYMOLOGIE

INHIBITIONS ENZYMATIQUES

Notes de cours

Casimir BLONSKI

Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay - UMR 8182

Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique

LabEx LERMIT

Université Paris-Sud 11

Orsay

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Inhibition enzymatique

• inactivation d’une enzyme (ralentissement de la

réaction enzymatique) par la liaison d’une petite

molécule

– différente que la dénaturation

Types d’inhibition

• réversible

– compétitive

– incompétitive

– noncompétitive

• irréversible

– par marqueur d’affinité

– par inhibition suicide

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Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten (1879-1960)

The kinetics of invertase activity

Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)

Saturation curve for an enzyme showing the relation between the

concentration of substrate and rate.

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Inhibition compétitive

• la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la

liaison du substrat

Exemple de l’inhibition competitive

l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la

déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :

S

Enz

SEnz

IEnz

I

E E•S E + P k1, S k2

E•I

ki, I

k-1

k-i

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Équations pour l’inhibition comp.

Graphique d’inhibition compétitive

[S]

Vit

esse

, v

Vm

ax /

2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

KMapp

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive

+⋅+

=

i

M

max

]I[1]S[

]S[

KK

Vv

6

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Graphique d’inhibition compétitive

1/[S]

1/v

0

pente = KM / Vmax

1 / Vmax

-1 / KM

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive

-1 / KMapp'

-1 / KMapp

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

Détermination de Ki (compétitive)

maxmax

M1

S][

1

]I[1

1

VV

KK

v

i+⋅

+

=

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Équation pour IC50 (compétitive)

• équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :

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Inhibition incompétitive

• l’inhibiteur est lié par le complexe E•S

Exemple de l’inhibition incompétitive

• inhibition de la phosphatase alkaline par la L-

phénylalanine:

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Équations pour l’inhibition incomp.

Graphique d’inhibition incompétitive

[S]

Vit

esse

, v

Vm

ax /

2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

KMapp

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive

Vm

axa

pp /

2V

ma

xa

pp' /

2

+

+

+

=

i

M

i

max

]I[1

]S[

]I[1

]S[

K

K

K

V

v

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Graphique d’inhibition incompétitive

Détermination de Ki (incompétitive)

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Équation pour IC50 (incompétitive)

• équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :

Inhibition non-compétitive

• l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe

E•S

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Exemple de l’inhibition non-comp.

• inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

Équations pour l’inhibition noncomp.

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Inhibition non-compétitive simple

• l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la

présence de substrat (i.e. Ki = Ki')

– KM n’est pas affecté

– Vmax est diminué par le facteur de

+

'

i

]I[1

K

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Graphique d’inhibition non-compétitive simple

[S]

Vit

esse

, v

Vm

ax

/ 2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple

Vm

axa

pp

' / 2

Vm

axa

pp / 2

M

i

max

]S[

]I[1

]S[

K

K

V

v+

+

=

Graphique d’inhibition non-compétitive simple

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Détermination de Ki (non-compétitive simple)

• équation pour la diminution de Vmax :

Inhibition non-compétitive mixte

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• l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat

(i.e. Ki ≠ Ki')

– Vmax est toujours diminué par le facteur de

– KM est affecté selon Ki et Ki'

Inhibition non-compétitive mixte

• lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble

à l’inhibition compétitive :

+

'

i

]I[1

K

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Inhibition non-compétitive mixte

• lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à

l’inhibition incompétitive :

Détermination de Ki' (non-compétitive mixte)

• équation pour la diminution de Vmax :

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Détermination de Ki (non-compétitive mixte)

• équation pour la variation de KM :

Équation pour IC50 (non-comp. simple)

• équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :

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Inhibition irreversible

• pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le Ki comme

un indice de l’efficacité de l’inhibition

• pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le kinact et le

KI

• il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :

– réactifs du site actif (marquage par affinité)

– inhibiteurs basés sur le mécanisme (substrats «

suicide »)

Marqueurs par affinité

• démontrent la spécificité envers un groupement

fonctionnel des acides aminés du site actif

– analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans

les site actif

– comprennent aussi un groupement réactif

(pharmacophore) – typiquement un électrophile qui

réagit avec un nucléophile dans le site actif

• possèdent un seul site saturable et réagissent de manière

stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)

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Marquage par affinité

• l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le

substrat (ou co-facteur)

• la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre,

parce que l’enzyme est consommée comme un réactif

pendant la réaction

• l’inhibition est accompagnée de la modification covalente

de l’enzyme :

– l’enzyme demeure inactive après la séparation de

l’excès de l’inhibiteur

– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou

filtration sur gel (ou sur membrane) même après la

dénaturation de l’enzyme

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Exemples de marquage par affinité

TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)

• ressemble un amide de la phénylalanine, mais le

groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de

la His57 de la chymotrypsine :

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)

• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de

sérine :

O

CH2

Cl

NH

S OO

CH3

N NH

Enz

N N

O

CH2

NH

S OO

CH3

Enz

Cl

H

Enz

HO

P

O

F

OO

Enz

O

P

O

OO

F

H

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PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)

• utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des

résidus de sérine :

Exemples de marquage par affinité

Enz

HO

F

H

CH2 S

O

F

O

Enz

O

CH2 S

O

O

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Analyse cinétique

• liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la

formation lente et irréversible d’un complexe inactif :

• la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la

concentration de I

• E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre

k1

k-1KI =

E I E•I E I+k1

k-1

kinact

complexe covalentinactif

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Mesure de kinact

• kinact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité

en fonction du temps (kobs) à différentes concentrations

d’inhibiteur :

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% a

cti

vit

é

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temps (min)

[I] = 0

[I] = 0.2 × KI

[I] = 0.5 × KI

[I] = 2 × KI

[I] = KI

constante de vitesse = kobs

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