FECONDATION Introduction Les gamètes Les gamètes Les spermatozoïdes Les ovocytes Les étapes de...

FECONDATIONFECONDATION

IntroductionIntroduction

Les gamètesLes gamètesLes spermatozoïdesLes spermatozoïdes

Les ovocytesLes ovocytes

Les étapes de la fécondationLes étapes de la fécondation

Fécondation : Rencontre et Fusion du

gamète mâle et du gamète femelle

LES SPERMATOZOIDES

Millions...Milliers

Centaines…Dizaines

Cellule haploïde

Cellule capacitée

Modifications membranaires

Hyperactivation

Trompe utérine

L’OVOCYTE

Métaphase de Méiose II

Globule polaire/Espace périvitellin

Trompe utérine

La fécondation : grandes étapes (1)

I. Maturation épididymaire du spermatozoïde

II. Capacitation du spermatozoïde

III. Hyperactivation du spermatozoïde

IV. Interaction spermatozoïde - cumulus oophorus

V. Interaction spermatozoïde - zone pellucide

VI. Acrosome et réaction acrosomiale

La fécondation : grandes étapes (2)

VII. Traversée de la zone pellucide

VIII. Fusion spermatozoïde – œuf

IX. Activation de l’œuf

X. Réaction corticale et blocage de la polyspermie

XI. Décondensation du noyau du spermatozoïde dans l’ooplasme

XII. Achèvement de la mitose, développement des pronuclei

Maturation épididymaire du spermatozoïde (fécondance du

spermatozoïde)• Où ?• Durée ? Question de temps• Comment ?• Acquisition de la mobilité• Membrane

– Redistribution des protéines : Répartition inégale des glycoprotéines sur la tête du spermatozoïde

– Cholestérol qui est incorporé dans la membrane du spermatozoïde (stabilisation de la membrane)

– Préparation à la réaction acrosomiale ?

• Dans certaines espèces, il y a de grosses modifications morphologiques et/ou biochimiques du spermatozoïde pendant la traversée épididymaire– matrice de l'acrosome– protamines– gaine fibreuse du flagelle, etc...

Capacitation

• Capacitation = sorte de "décongélation" de la membrane plasmique

• Hétérogénéité des spermatozoïdes– Tous ne sont pas capacités– Beaucoup meurent avant d’être

capacités– Faire la différence entre sénescence du

spermatozoïde et capacitation

• Certains spermatozoïdes de cobaye peuvent faire leur réaction acrosomiale sans incubation préalable ! Exception ?

RENCONTRE DES GAMETES

Ampoule-Isthme tubaire

• In vivo le rapport spermatozoïde / œuf 1:1 • Pas de rôle de dispersion du cumulus par de nombreux

spermatozoïdes (# in vitro)• Le spermatozoïde doit être capacités pour pénétrer dans le

cumulus• Le spermatozoïde ayant fait sa réaction acrosomiale se

colle mais ne pénètre pas dans le cumulus• On ne sait pas si le spermatozoïde humain a besoin d'être

capacité pour pénétrer le cumulus

Entrée du spermatozoïde dans le cumulus

Le cumulus oophorus

• Cumulus = Matrice + Cellules

– MatriceAcide hyaluronique polymérisé + protéines(collagène, laminine, fibronectine, tenascine-C, inhibiteur de l’inter trypsine,…)

– CellulesCD44 (principal récepteur à l’acide hyaluronique de la surface cellulaire) Intégrines

Corona radiata

• Cellules folliculaires au contact de la ZP

• Envoient des prolongements à la surface de l'ovocyte à travers la ZP

• Rapports variables entre corona radiata et cellules du cumulus

TRAVERSEE DU MASSIF DES CELLULES FOLLICULEUSES

DISSOCIATION OU RETRACTION

Mécanisme de la traversée

• Rôle de la hyaluronidase membranaire (?) : non essentielle mais facilitante

• Autres enzymes de surface : acrosine, -galactosidase,...

• D'où viennent ces enzymes de surface ?– Épididyme ?– Capacitation ?– Acrosome

• Le mouvement hyperactif sert à la traversée (si on retire les spermatozoïdes du cumulus, ils reprennent un mouvement hyperactif)

Wassarman,PM2005p95

Interaction spermatozoïde – zone pellucide

Wassarman,PM2005p95 (fig1)

Fig. 1. Binding of free-swimming mouse sperm to the ZP of ovulated mouse eggs (B) Transmission electron micrograph of a sperm head bound to the ZP of an ovulated egg. Zona pellucida (ZP), nucleus (n), acrosome (a), plasma membrane (PM).

Spermatozoïde de souris non réagi à la surface de la ZP

Origine et biosynthèse de la zone pellucide

• Produite exclusivement par l'ovocyte– des ovocytes en culture peuvent synthétiser

toutes les glycoprotéines de la ZP– Acide hyaluroniquue en surface

• La synthèse et la sécrétion débutent très tôt

RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (1)

Zone pellucide

Glycoprotéines ZP1-ZP2-ZP3

Spécifiques d’une espèce

Acide hyaluronique

• Wassarman,PM2005p95Fig. 2. Organization of ZP filaments. Diagrammatic representation of the organization of mouse ZP glycoproteins ZP1, ZP2 and ZP3 in the crosslinked filaments that constitute the egg ZP. Note the repeating (periodicity 15 nm) structure ∼within the filaments and the employment of ZP1 as a crosslinker of filaments.

Zone pellucide de souris

ZP 4 chez l’homme (ZP1)

Les ligands de la ZP

ZP3 = ligand primaire

• Se lie à la membrane plasmique du spermatozoïde au-dessus du capuchon acrosomial

• Avant la réaction acrosomiale

• • Chaîne oligosaccharidique

(Fixation du spermatozoïde)

Chaîne peptidique (Réaction acrosomique)

ZP2 = ligand secondaire

• Se lie à la membrane acrosomiale interne du spermatozoïde

• Après la réaction acrosomiale

RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (2)

Zone pellucide

ZP2 : chaîne oligosaccharidique (Fixation

du

spermatozoïde)

Deuxième site de fixation/Ancrage du

spermatozoïde

RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (3)

Spermatozoïde

Enzymes membranaires : Récepteurs

Galactosyltransférase (Homme, Lapin,

Taureau…)

-D-Mannosidase (Homme, Souris…)

Lectines

Membrane plasmique périacrosomique

Chaîne oligosaccharidique de la ZP3

RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (4)

Spermatozoïde

Cell Adhesion Molecules (CAM)

PH-20

Membrane plasmique post acrosomique

et membrane acrosomique interne

Chaîne oligosaccharidique de la ZP2

RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (2)

Point de fixation

Double fixation : ZP3 puis ZP2

Apex du spermatozoïde

Augmentation du nombre de sites de

fixation

Spermatozoïde couché sur la zone

pellucide

REACTION ACROSOMIQUE (1)

Libération des enzymes

contenues dans l’acrosome

Fusion membrane acrosomique

externe/membrane plasmique

REACTION ACROSOMIQUE (2)

Chaîne peptidique de la ZP3 : Ligand

Galactosyltransférase : Récepteur

spermatique

Interaction ligand-Récepteur:

-Protéine G

-Activation Phospholipase C : Calcium

REACTION ACROSOMIQUE (3)

1-Augmentation du calcium

intracellulaire

2-Augmentation du pH intracellulaire

3-Déstabilisation de la membrane

4-Exocytose du contenu de l'acrosome

ACROSINE

1-Fixation à la ZP (souris)

2-Non destruction de la ZP

3-Rupture liaison ZP2/ZP3

4-Fixation et franchissement de la ZP

(Non déterminant)

HYALURONIDASE

1-Aucun effet sur la corona radiata

2-Destruction de l'acide hyaluronique

de la ZP

3-Franchissement de la ZP

-N-ACÉTYLGLUCOSAMINIDASE

1-Franchissement de la ZP+++

2-Rupture liaison Spermatozoïde ZP2/ZP3

DISSOCIATION DE LA ZONE PELLUCIDE

1-Rétraction

2-Enzymes acrosomiques

3-Traversée de la zone pellucide

Mécanique (Flagelle)

Enzymatique (ZP2)

Bedford,JM1998p1275

• FIG. 7. Spermatozoa entering the zona in different unfertilized oocytes recovered from mated hamsters about 3 h after ovulation. A) A reacted spermatozoon tethered by acrosomal shroud (arrow) beginning to intrude into the surface of the zona. B) A reacted spermatozoon intruding further into the zona matrix. C) Here the penetrating sperm head has disappeared from view into the zona substance. Such interactions give no indication of local lysis of the zona surface during initial penetration. SEM 36000.

Hamster, 3 heures après l’ovulation

LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (2)

Fusion des gamètes

Activation de l’ovocyte

Réaction corticale

Achèvement de la 2ème mitose de la

méiose

Formation des deux pronoyaux

FUSION DES GAMÈTES

Reconnaissance des membranes

plasmiques

Ovocytes/Spermatozoïdes

Fusion des membranes plasmiques

RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (1)

Mécanismes moléculaires de fusion

Virus/Hôte

Protéines spécifiques

Deux domaines d’activité

Domaine de Fixation : Disintégrine

Domaine de Fusion : Protéase

RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (2)

Protéines spécifiques

Famille ADAM

A Disintegrin And Metalloprotease domain

deux sous-unités

: Fusion

: Fixation

RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (3)

Protéines spécifiques

Cobaye : Fertiline (PH30)

Deux sous-unités et

Précurseurs (deux domaines)

Disintégrine et Métalloprotéase

Transit épididymaire

: Coupure du domaine Disintégrine /FUSION

: Coupure du domaine Métalloprotéase/FIXATION

RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (4)

Protéines spécifiques

: Coupure du domaine Disintégrine /FUSION

Motif peptidique (Virus rubéole)

Fusion et pénétration de la membrane

plasmique ovocytaire

: Coupure du domaine

Métalloprotéase/FIXATION

Les Disintégrines

RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (5)

Protéines spécifiques

Homme

Fertiline

SP 10

PÉNÉTRATION DU SPERMATOZOÏDE

Fixation/Fusion

Segment équatorial

Membrane acrosomique interne

Membrane plasmique du spermatozoïde

Membrane plasmique ovocytaire :

Intégrines (Protéines de fixation)

Molécules du spermatozoïde et de l’oolemme participant aux interactions gamétiques

ACTIVATION OVOCYTAIRE (1)

Mise en marche du premier cycle

cellulaire

Modifications morphologiques

Pénétration du spermatozoïde

Formation des pronoyaux

Emission des granules corticaux

Redistribution des organites

ACTIVATION OVOCYTAIRE (2)

Modifications Moléculaires

Elévation du calcium libre intra-ovocytaire

Achèvement de la méiose II ovocytaire

ACTIVATION OVOCYTAIRE

Elévation du calcium libre intra-

ovocytaireFixation/Fusion

Protéine G

Inositol triphosphate (IP3)

Libération du Calcium séquestré (RE)

OSCILLATEUR CYTOPLASMQIQUE ET SES MODULATEURS

Facteur spermatique

Influx calcique trans-membranaire

Phase du cycle cellulaire

Sensibilité des récepteurs

Réserves en calcium intra-ovocytaire

MATURATION OVOCYTAIRE

Augmentation des réserves en calcium

intra-ovocytaire (RE)

Augmentation des canaux calciques

Réorganisation du RE

CYCLE CELLULAIRE

Phase M : Oscillateur+++Augmentation du calcium

Activation du MPF

ACTIVATION DE L’OSCILLATEUR

Interphase : Oscillateur -

MECANISMES D’ACTIVATION OVOCYTAIRE

Récepteurs membranaires ovocytaires

Facteurs solubles du spermatozoïde

Calcium

IP3

Protéine

« Oscillations calciques »

Santela,L2004p400

• Figure 2. Spatio-temporal changes of the inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3)-induced Ca2C release during oocyte maturation. Starfish oocytes are coinjected with the Ca2C dye Oregon Green 488 BAPTA-1 and InsP3, which is caged to inhibit its activity before photoliberation. The agonist is liberated by photoactivation at different times after application of the maturing hormone 1-methyladenine (1-MA). Shown are pseudocolored relative fluorescence images of the InsP3-induced increase in Ca2C. Blue corresponds to low Ca2C levels, whereas green and yellow correspond to higher Ca2C levels. After global photoactivation of InsP3, a Ca2C increase is detected in the animal hemisphere containing the nucleus of an oocyte matured for 12 min with 1-MA. A slightly higher Ca2C response after uncaging of InsP3 is detected in a different oocyte matured for 14 min with 1-MA. Note that at this time of maturation (14 min), the animal cortical region of the oocyte is much more sensitive to InsP3, which is liberated throughout the oocyte after UV. The area of higher InsP3 sensitivity then spreads towards the vegetal hemisphere and becomes global 30 min after the hormonal stimulation.

Spatio-temporal changes of the inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3)-induced Ca++ release

during oocyte maturation

Onde calcique

EMISSION DES GRANULES CORTICAUX

Exocytose des granules corticaux

Point de fusion du spermatozoïde

Contenu enzymatique

Imperméabilisation de la zone pellucide

ovocytaire

(Homme)

Imperméabilisation de la membrane plasmique

(lapin)

Berg LK, Wessel GM. Cortical granules of the sea urchin translocate early in oocyte maturation. Development. 1997, 24(9):1845-50.

• Timing of CG translocation.• (A-C) Immunolocalization of oocytes showing the

position of cortical granules as the oocyte matures.• (A) GV-staged oocyte;• (B) GVM;• (C) in vitro-matured oocyte. Cortical granules are

labeled with antibody to hyalin. (Bar, 50 mm).

Berg LK, Wessel GM. Cortical granules of the sea urchin translocate early in oocyte maturation.

Development. 1997 May;124(9):1845-50. (fig3)

Anticorps contre la hyaline des granules corticaux (oursin)

Ovocyte au stade vésicule germinale

Vésicules germinales matures

Ovcyte maturé in vitro

REDISTRIBUTION DES ORGANITES (1)

Mitochondries

paternelles : dégradation ou inactivation

maternelles : persistance dans l'œuf

Centrioles

Formation d’un demi-fuseau : spermaster

(centriole paternel)

Centrosome

Duplication des centrioles

REDISTRIBUTION DES ORGANITES (2)

Isolement des génomes

Pas de fusion des pronoyaux

Réplication de l’ADN

Isolement des chromosomes paternels :

-Zygote

-Blastomère

FORMATION DES PRONOYAUX

Perte de l’enveloppe nucléaire spermatique

Décondensation du noyau spermatique

(Protamines-Histones ovocytaires)

Reconstitution de l’enveloppe nucléaire

Pronucleus mâle

Achèvement de la Méiose II/Emission du 2ème

Globule polaire : Pronucleus femelle

Ward WS, Coffey DS. Biol Reprod. 1991 Apr;44(4):569-74.

DNA packaging and organization in mammalian spermatozoa: comparison with

somatic cells.

Hiiragi,T2004p360

• Figure 3 Relationship between cytoskeleton, chromosomes and first cleavage plane specification. a–f, Triple immunofluorescence staining of the embryo for microtubules (green), actin (red) and DNA (blue). Scale bar represents 20mm. a, Late interphase. b, The end of interphase. Arrowheads in a and b denote the small foci of microtubules. c, Prophase. Paternal and maternal chromosome aggregates (large and small arrow, respectively) are surrounded by masses of microtubules (arrowheads). d, Metaphase Metaphase plate with barrel-shaped spindle. e, Anaphase. Cleavage furrow is formed at the overlap of extended microtubules (arrowheads). f, Telophase. g, Time-lapse images of an embryo doubly recorded in DIC and fluorescence for DNA. Time is given in h:min after hCG injection. Scale bar represents 50mm. h, Schematic view of the process, summarized from a–g. Green, red and blue bars represent microtubules, maternal and paternal chromosomes, respectively.

Relationship between cytoskeleton, chromosomes and first cleavage plane specification.

La première semaine

Divisions de segmentation

Divisions des blastomères Migration dans la trompeMise en route du génome de l’embryon (4 cellules)

2ème jour : 4 cellules

4ème jour : Morula (64 cellules)

5éme - 6ème jour : Blastocyste (200 cellules)

La première semaine

Compaction de la morula (J4 - J5)

Jonctions serrées - Jonctions adhérentes

Adhésion des blastomères

Polarisation des blastomères périphériques (face libre / Face adhésive)

La première semaine

Formation du blastocyste (J5 - J6)

Jeune blastocyste

Blastocyste expansé Eclosion embryonnaire

Blastocèle

Trophectoderme* Placenta* Cellules polarisées* Jonctions serrées

La première semaine

Masse cellulaire interne (MCI)

Bouton embryonnaire (absence de contact avec l’extérieur)

* Embryon* Annexes : cordon - amnios

Cellules embryonnaires souches totipotentes (cellules ES)

Cellules non polarisées - Jonctions perméables (GAP junctions)

Fin de la première semaine

Eclosion embryonnaire (J6 - J7)

Expansion du blastocyste

Rupture de la zone pellucide

Implantation embryonnaire (J8)

Eclosion assistéeEclosion assistée

Eclosion assistéeEclosion assistée

Supersperm

LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (1)

Rencontre des gamètes

Traversée du massif des cellules

folliculeuses

Reconnaissance-Fixation à la zone

pellucide

Réaction acrosomique

Dissociation de la zone pellucide

LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (2)

Fusion des gamètes

Activation de l’ovocyte

Réaction corticale

Achèvement de la 2ème mitose de la

méiose

Formation des deux pronoyaux