LE SEQUENCAGE. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR :...

LE SEQUENCAGE

OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE

QUALITE DE LA MATRICE- Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP)

- Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …)- Traitement à l’ExoSAP

Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP)

- Plasmide : Purification - Kit de purification

- Quantification- Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille- Nanodrop

OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE

REACTION DE SEQUENCE- Instructions du fournisseur- Quantité d’ADN- Volume du mélange réactionnel- Quantité d’amorce- Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x

Volume total = 25 µlADN (PCR) = 5 ngAmorce = 3 pmolesTampon 5X = 2,5 µlKit Big Dye = 1 µlH2O = qsp 25 µl

Kit Big Dye contient :

- ADN Polymérase- Tampon- MgCl2

- dNTP- ddNTP*

OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE

PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur

- Précipitation éthanoliqueNaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95%

Lavage EtOH 70%

- Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

- Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

SEQUENCEUR CAPILLAIRE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ?

- A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante et en déduire la séquence protéique

- Trouver des homologies :- Au niveau des gènes d’une même famille- Au niveau d’un même gène dans différentes espèces

- Trouver des différences :- Polymorphismes- Mutations

Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

EXON 9

Homozygote A/A

Homozygote G/G

Hétérozygote A/G

Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié(onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité)

16 et 17/02/2005 : 190_1L

Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantesMême tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié16 et 17/02/2005 : 190_1L

Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3Run 633, 191_13 et 31_13R

Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3Run 633, 191_13 et 31_13R

Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR :superposition des séquences sens et antisens.

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

- Mutation Faux-Sens Modifie l’acide aminé- Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé- Vérifier si la classe de l’acide aminé change

- Mutation Non Sens L’acide aminé est remplacé par un Stop- Stop prématuré production d’une protéine tronquée

- Mutation d’épissage- Au niveau du site donneur- Au niveau du site accepteur

- Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture- Stop prématuré production d’une protéine tronquée

- Mutation silencieuse Ne modifie pas l’acide aminé

- Mutation intronique

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Mutation Faux-Sens

ATA GTA (IleVal) c.1336A>G p.I446V

CGA TGA (Arg Stop) c.2587C>T p.R863X

Production d’une protéine tronquée

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Mutation Non Sens

Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23

Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCTSéquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT

Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC

GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Délétion/Insertion

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Mutation d’épissage

Intron 12 - c.1828+2T>G

EXON INTRON%A 30 40 64 9 0 0 62 68 9 17 39 24%T 20 7 13 12 0 100 6 12 5 63 22 26%C 30 43 12 6 0 0 2 9 2 12 21 29%G 19 9 12 73 100 0 29 12 84 9 18 20 A G G T A A G T

SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE

http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT

Exon 9 Exon 10 Exon 11

CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT

Exon 9 Exon 10 Exon 11

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR

- Mise en évidence de mutations

A G

Modification du site accepteurd’épissage

INTRON EXON%A 15 10 10 15 6 15 11 19 12 3 10 25 4 100 0 22 17%T 51 44 50 53 60 49 49 45 45 57 58 29 31 0 0 8 37%C 19 25 31 21 24 30 33 28 36 36 28 22 65 0 0 18 22%G 15 21 10 10 10 6 7 9 7 7 5 24 1 0 100 52 25 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y A G G

Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base)

SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG

Exon 9 Exon 10 Exon 11

GT AGGT

Exon 9 Exon 11

CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE

AG AG

Exon 9 Exon 11Exon 9 Exon 10

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Mutation silencieuse

Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr

Homozygote G/G Hétérozygote G/A Homozygote A/A

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

Mutation intronique

Homozygote T/T

Hétérozygote T/C Homozygote C/C

Intron 2 – c.83-29G>A

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

-Vérifier la présence de la mutation chez les parents du malade et d’autres membres de la famille

- Mutation Faux-Sens - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé- Vérifier si la classe de l’acide aminé change

- Mutation Non Sens - Stop prématuré production d’une protéine tronquée- Vérification par Western Blot

- Mutation d’épissage- Vérification par RT-PCR

- Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture- Stop prématuré production d’une protéine tronquée- Vérification par Western Blot

- Mutation silencieuse ou intronique- Vérifier s’il s’agit d’un polymorphisme

- Répertorié dans les banques de données- Tester 50 à 100 individus contrôle

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT

Exon 9 Exon 11

Exon 9 Exon 11

Exon 9 Exon 10 Exon 11

Exon 9 Exon 10 Exon 11

50 pb 50 pb150 pb

250

100

250

???

250

N Ht Hm

250

???

???

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT

Exon 9 Exon 10 Exon 11

50 pb 50 pb150 pb

Exon 9 Exon 10 Exon 11

250

N Ht Hm

250

???

ANALYSE DE MARQUEURS MICROSATELLITES

LOGICIEL GENEMAPPER

Marqueur Microsatellite : Segment d’ADN contenant des répétitions en tandem de courts motifs de 2,3 ou 4 nucléotides. Très nombreux, dispersés sur tout le génome, ils sont le siège de variations à l’origine de polymorphismes multialléliques très informatifs

Analyse de marqueurs microsatellites

- PCR : une des amorces marquée par un fluorochrome (6FAM)- Produit de PCR fluorescent- Mélange du produit avec un marqueur de taille (35 à 350 pb) marqué par un autre fluorochrome- Séparation des fragments sur séquenceur capillaire- Détection des fragments fluorescents- Analyse des données

LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER

LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER

Exemple :

- Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 11 chez un patient par FISH

- Déterminer les bornes de la délétion par analyse des marqueurs microsatellites de la région- Choix de 5 marqueurs- Réalisation des PCR sur l’ADN du patient et de ses parents- Séparation des fragments sur séquenceur capillaire- Analyse par GeneMapper

D11

S413

5

D11

S414

7

D11

S135

4

D11

S179

5

AP001791

AP001984

AP003305

AP002797

AC023118

AP002751

AP002370

AP000773

AP003026

AP000446

D11

S873

D11

S177

5

D11

S418

7

D11

S130

6

AP000852

AP001825

AP000857

AP000639

AP003093

AP003095

AP002803

C T

D11S4187

D11S1775

D11S873

D11S4135

D11S4147

Exemple d’analyse de marqueurs microsatellites- Mise en évidence d’une microdélétion d’origine paternelle

CenD11S4187D11S1775D11S873

D11S4135D11S4147

Tél

278 - 282239 - 247173 - 178105 - 101236 - 236

289 - 278243 - 239 - 173105 - 105 - 236

275 - 289249 - 243178 - 196101 - 105238 - 242

P M

D

LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER

D11

S413

5

D11

S414

7

D11

S135

4

D11

S179

5

AP001791

AP001984

AP003305

AP002797

AC023118

AP002751

AP002370

AP000773

AP003026

AP000446

D11

S873

D11

S177

5

D11

S418

7

D11

S130

6

AP000852

AP001825

AP000857

AP000639

AP003093

AP003095

AP002803

C TNon Del Non Del

Del

Del

Non Inf

D11

S197

9

- D11S 4135 est délété- Tester D11S1795, D11S1354 et/ou D11S1979 pour déterminer la borne télomérique