LE SEQUENCAGE. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces,

LE SEQUENCAGE

OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE

QUALITE DE LA MATRICE- Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP)

- Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …)- Traitement à l’ExoSAP

Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP)

- Plasmide : Purification - Kit de purification

- Quantification- Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille- Nanodrop


REACTION DE SEQUENCE- Instructions du fournisseur- Quantité d’ADN- Volume du mélange réactionnel- Quantité d’amorce- Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x

Volume total = 25 µlADN (PCR) = 5 ngAmorce = 3 pmolesTampon 5X = 2,5 µlKit Big Dye = 1 µlH2O = qsp 25 µl

Kit Big Dye contient :

- ADN Polymérase- Tampon- MgCl2

- dNTP- ddNTP*


PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur

- Précipitation éthanoliqueNaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95%

Lavage EtOH 70%

- Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

- Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

SEQUENCEUR CAPILLAIRE

LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE






POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ?

- A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante et en déduire la séquence protéique

- Trouver des homologies :- Au niveau des gènes d’une même famille- Au niveau d’un même gène dans différentes espèces

- Trouver des différences :- Polymorphismes- Mutations

Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)




EXON 9

Homozygote A/A

Homozygote G/G

Hétérozygote A/G

Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié(onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité)

16 et 17/02/2005 : 190_1L

Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantesMême tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié16 et 17/02/2005 : 190_1L

Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3Run 633, 191_13 et 31_13R

Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3Run 633, 191_13 et 31_13R

Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR :superposition des séquences sens et antisens.

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

- Mutation Faux-Sens Modifie l’acide aminé- Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé- Vérifier si la classe de l’acide aminé change

- Mutation Non Sens L’acide aminé est remplacé par un Stop- Stop prématuré production d’une protéine tronquée

- Mutation d’épissage- Au niveau du site donneur- Au niveau du site accepteur

- Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture- Stop prématuré production d’une protéine tronquée

- Mutation silencieuse Ne modifie pas l’acide aminé

- Mutation intronique


Mutation Faux-Sens

ATA GTA (IleVal) c.1336A>G p.I446V

CGA TGA (Arg Stop) c.2587C>T p.R863X

Production d’une protéine tronquée


Mutation Non Sens

Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23

Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCTSéquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT

Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC

GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA


Délétion/Insertion


Mutation d’épissage

Intron 12 - c.1828+2T>G

EXON INTRON%A 30 40 64 9 0 0 62 68 9 17 39 24%T 20 7 13 12 0 100 6 12 5 63 22 26%C 30 43 12 6 0 0 2 9 2 12 21 29%G 19 9 12 73 100 0 29 12 84 9 18 20 A G G T A A G T

SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE

http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html

Exon 9 Exon 10 Exon 11

AG AGGT GT


CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE


AG AGGT GT


LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR

- Mise en évidence de mutations

A G

Modification du site accepteurd’épissage

INTRON EXON%A 15 10 10 15 6 15 11 19 12 3 10 25 4 100 0 22 17%T 51 44 50 53 60 49 49 45 45 57 58 29 31 0 0 8 37%C 19 25 31 21 24 30 33 28 36 36 28 22 65 0 0 18 22%G 15 21 10 10 10 6 7 9 7 7 5 24 1 0 100 52 25 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y A G G

Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base)

SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE


AG AGGT GT


AG


GT AGGT

Exon 9 Exon 11

CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE

AG AG

Exon 9 Exon 11Exon 9 Exon 10


Mutation silencieuse

Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr

Homozygote G/G Hétérozygote G/A Homozygote A/A


Mutation intronique

Homozygote T/T

Hétérozygote T/C Homozygote C/C

Intron 2 – c.83-29G>A


-Vérifier la présence de la mutation chez les parents du malade et d’autres membres de la famille

- Mutation Faux-Sens - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé- Vérifier si la classe de l’acide aminé change

- Mutation Non Sens - Stop prématuré production d’une protéine tronquée- Vérification par Western Blot

- Mutation d’épissage- Vérification par RT-PCR

- Insertion/Délétion Décalage du cadre de lecture- Stop prématuré production d’une protéine tronquée- Vérification par Western Blot

- Mutation silencieuse ou intronique- Vérifier s’il s’agit d’un polymorphisme

- Répertorié dans les banques de données- Tester 50 à 100 individus contrôle


AG AGGT GT

Exon 9 Exon 11

Exon 9 Exon 11



50 pb 50 pb150 pb

250

100

250

???

250

N Ht Hm

250

???

???


AG AGGT GT


50 pb 50 pb150 pb


250

N Ht Hm

250

???

ANALYSE DE MARQUEURS MICROSATELLITES

LOGICIEL GENEMAPPER

Marqueur Microsatellite : Segment d’ADN contenant des répétitions en tandem de courts motifs de 2,3 ou 4 nucléotides. Très nombreux, dispersés sur tout le génome, ils sont le siège de variations à l’origine de polymorphismes multialléliques très informatifs

Analyse de marqueurs microsatellites

- PCR : une des amorces marquée par un fluorochrome (6FAM)- Produit de PCR fluorescent- Mélange du produit avec un marqueur de taille (35 à 350 pb) marqué par un autre fluorochrome- Séparation des fragments sur séquenceur capillaire- Détection des fragments fluorescents- Analyse des données

LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER


Exemple :

- Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 11 chez un patient par FISH

- Déterminer les bornes de la délétion par analyse des marqueurs microsatellites de la région- Choix de 5 marqueurs- Réalisation des PCR sur l’ADN du patient et de ses parents- Séparation des fragments sur séquenceur capillaire- Analyse par GeneMapper

D11

S413

5

D11

S414

7

D11

S135

4

D11

S179

5

AP001791

AP001984

AP003305

AP002797

AC023118

AP002751

AP002370

AP000773

AP003026

AP000446

D11

S873

D11

S177

5

D11

S418

7

D11

S130

6

AP000852

AP001825

AP000857

AP000639

AP003093

AP003095

AP002803

C T

D11S4187

D11S1775

D11S873

D11S4135

D11S4147

Exemple d’analyse de marqueurs microsatellites- Mise en évidence d’une microdélétion d’origine paternelle

CenD11S4187D11S1775D11S873

D11S4135D11S4147

Tél

278 - 282239 - 247173 - 178105 - 101236 - 236

289 - 278243 - 239 - 173105 - 105 - 236

275 - 289249 - 243178 - 196101 - 105238 - 242

P M

D


D11

S413

5

D11

S414

7

D11

S135

4

D11

S179

5

AP001791

AP001984

AP003305

AP002797

AC023118

AP002751

AP002370

AP000773

AP003026

AP000446

D11

S873

D11

S177

5

D11

S418

7

D11

S130

6

AP000852

AP001825

AP000857

AP000639

AP003093

AP003095

AP002803

C TNon Del Non Del

Del

Del

Non Inf

D11

S197

9

- D11S 4135 est délété- Tester D11S1795, D11S1354 et/ou D11S1979 pour déterminer la borne télomérique

Documents

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