Nouveaux essais de purification de la lipase pancréatique de porc

224 PRELIMINARY NOTES VOI 30 (1958)

Nouveaux essais de purification de la lipase pancr~tique de porc

N o u s a v o n s r ~ c e m m e n t purifi~ de fa~on tr~s no tab le la l ipase p a n c r r a t i q u e de porc I en s o u m e t t a n t les ex t r a i t s a q u e u x de p a n c r r a t i n e ~ u n e sr r ie de p rec ip i t a t ions f r ac t ionnres (SO4Ams, acr tone) et h une 61ectrophor~se de zone su r a m i d o n daBs u n t a m p o n M/4o en v r rona l p H 8.0 e t M/zoo en CaC1 v Le t a u x de pur i f ica t ion ob tenu , calcul6 pa r r a p p o r t a u x ex t ra i t s , 6 ta i t de 35 fois avec u n r e n d e m e n t de 3 ° % et de 63 lois avec u n r e n d e m e n t de 5 %.

La t e c h n i q u e de pur i f i ca t ion a 6t6 m a i n t e n a n t am61iorre grace ~ : (I) une meiUeure p r r p a z a t i o n de la p a n c r r a t i n e ; (2) l ' ad so rp t ion s r lec t ive de la l ipase sur p h o s p h a t e t r ica lc ique (adsorp t ion en so lu t ion aqueuse , 61ution pa r le p h o s p h a t e d isodique M/5o) et l '61iminat ion d ' i m p u r e t r s p ro t r iques p a r u n gel d ' a l u m i n e C 7 dabs le c i t r a t e M/io p H 5.5; (3) des 61ectrophor~ses de p lus longue du r r e (4 ° h) dabs u n g r a d i e n t de po ten t i e l p lus 61ev6 (7.8 V/cm) au sein d ' u n t a m p o n acide (acr ta te M[4o p H 5.25). DaBs ces condi t ions , le t a u x global de pur i f ica t ion d rpa s se 8.o lois (plus de 35o lois p a r r a p p o r t ~ la panc r r a t i ne ) avec u n r e n d e m e n t de 4 ° %. Au cours d ' u n e nouvel le 61ectrophor~se de 3 6 h ~ p H 8.o, les p r r p a r a t i o n s ainsi pur i f i res d o n n e n t u n pic u n i q u e e t s y m r t r i q u e , don t t ou t e s les f r ac t ions poss~den t la m ~ m e ac t iv i t6 sprcif ique.

Ces essais p e r m e t t e n t 6ga l emen t de m i e u x drf ini r les v r r i t ab le s s u b s t r a t s de la l ipase pan - c r r a t ique . U n e s imple perco la t ion ~ t r a v e r s l ' a m i d o n h p H 5.25 fai t d i spara i t re l ' ac t iv i t6 sur les so lu t ions de Tween-2o z et de b u t y r a t e de m r t h y l e alors qu 'e l le n 'a f fec te pas l ' ac t iv i t6 p r o p r e m e n t l ipas ique su r la tr ioMine en 6muls ion . L '61ectrophor~se ~ p H 8.0 ou 5.25 s rpa r e tr~s n e t t e m e n t la l ipase et les e s t r r a ses non sprc i f iques ag i s s an t sur les so lu t ions de b u t y r a t e de m r t h y l e ou d ' a c r t a t e de p - n i t r o p h r n o l a. P a r contre , A la fin d ' u n e 61ectrophor~se de longue du r r e g p H 5.25, les ac t i v i t r s su r les 6muls ions de b u t y r a t e , * l au r a t e et o l ra te de m r t h y l e , de l au ra te de p -n i t r oph rno l s, de t r i a c r t i ne* et de t r i b u t y r i n e se t r o u v e n t encore e x a c t e m e n t sous le pic de la lipase. N r a n m o i n s , ces ac t i v i t r s s o n t c o m p a r a t i v e m e n t faibles (2- 4 % de l ' ac t iv i t6 sur la tr ioMine en 6mulsion) , s au l dans le cas de la t r i a c r t i ne et de la t r i b u t y r i n e ( r e spec t ivement , 34 et I75 %).

De te ls r r s u l t a t s conf i rment la concep t ion 4 se lon laquelle la l ipase h y d r o l y s e e x c l u s i v e m e n t les es te rs en 6muls ion . Ils m o n t r e n t que : (I) C o n t r a i r e m e n t ~ ce que l 'on pense t r o p souven t , les es ters en so lu t ion (Tween-2o, a c r t a t e de p -n i t rophrno l , etc.) ne p e u v e n t en a u c u n cas ~tre cons id r r r s c o m m e des s u b s t r a t s l ipas iques . (2) La l ipase agi t f a ib l emen t su r les 6muls ions d ' e s t e r s de mono- alcools e t de phrno ls , la l ongueur de la cha ine acyle a y a n t b e a u c o u p mo ins d ' i m p o r t a n c e que l ' r t a t p h y s i q u e sous lequel se p r r s e n t e l ' es te r ( rmuls ion ou solut ion). (3) Les s u b s t r a t s c o n v e n a n t le m i e u x h l ' r t u d e de la l ipase s o n t les 6muls ions de t r ig lycrr ides , en par t icu l ie r de t r i b u t y r i n e et de t r ig lyc r r ides g longues cha~nes. T o u s l e s t r a v a u x c o n c e r n a n t la l ipase p r~ ten t A d iscuss ion 5 d~s que les p r inc ipes p r r c r d e n t s ne son t pas respec t r s .

L. SARDA Laboratoire de Chimie Biologique, Facult~ des Sciences, G. MARCHIS-MOuREN

Marseille (France) P. DESNUELLE

1 L. SAROA, G. MARCHIS-MouREN, M. J . CONSTANTIN ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Aaa, 23 (1957) 264-

s R. A. BOISSONNAS, Helv. Chem. Acta, 31 (1948) 1577. s C. HUGGINS ET J. LAPIDES, J. Biol. Chem., 17o (1947) 467 • 4 L. SARDA ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Acta, (sous presse). 5 M. M. NACHLAS ET R. BLACKBURN, J. Biol. Chem., 230 (1958) lO51.

Re9ue le 4 juillet , 1958

• Les 6muls ions d ' e s t e r s solubles son t p r rpa r6es en u t i l i san t p lus de s u b s t a n c e qu ' i l n ' en f au t p o u r s a tu r e r les so lu t ions .

• * La l ipase agi t A concur rence de 2 % sur la t r iac~t ine en solut ion. La n a t u r e t r iglyc~ridique du s u b s t r a t expl ique sans dou te ce t te excep t ion .