TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN

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TECHNIQUES DE

CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :

DE LA FISH AUX PUCES A ADN

KARINE CORDIER-COURELXXème colloque ATCAix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour

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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE

Cytogénétique conventionnelle

Biologie moléculaire

Cytogénétique moléculaire

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DE LA FISH AUX PUCES A ADN

FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)• Principe• Différents types de sondes• Applications• Avantages et inconvénients

CGH (Hybridation Génomique Comparative)• Principe• Sensibilité

FISH et CGH : Limites des techniques Puces à ADN

• Définitions• Différents types de puces• CGH-array• Puces à SNP• Intérêts, applications, inconvénients

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FISH : Principe

FISH = Fluorescence In Situ Hybridization

Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et peintures

Détection de délétions, identification de translocations ou d’autres réarrangements chromosomiques

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FISH : Principe

CIBLESONDE

ADN double brin (mitoses ou

noyaux interphasiques)

ADN double brin marqué

T A A G G A T A A T T C C T A T

Dénaturation thermique

Hybridation complémentaire

37°C O/N

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FISH : Principe

LavagesElimination des

sondes non spécifiquement fixées

La sonde moléculaire se fixe sur sa cible

Pas de sonde fixée = délétion

Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)

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FISH : Différents types de sondes

Peintures chromosomiques

M-FISHSondes centromériques

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FISH : Différents types de sondes

Sondes télomériques

Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)

Sondes de BACsRP11-335E8 2p12

RP11-356H17 2p13.3

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FISH : Sondes de BAC

Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré

Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage bactérien

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FISH : Choix des BACs

Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène d’intérêt

Séquençage du génome humain

=> Cartographie des chromosomes => bases de données

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FISH : Choix des BACs

National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606

University of California Santa Cruz http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway

Ensembl Genome Browserhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html

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NCBIFISH : Choix des BACs

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NCBIFISH : Choix des BACs

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FISH : Fabrication de sondes de BAC

Sonde prête à l’emploi pour

la FISH

BAC

Culture bactérienne

Extraction de l’ADN bactérien

Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,

dNTP, dUTP*)

Technique « lourde » 6 à 8 jours

Amplification par PCR (dNTP, amorces,

ADN pol)

Extraction et fragmentation

de l’ADN bactérien

Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,

dNTP, dUTP*)

Technique rapide 3 à 5 jours

cot 1, AcNa, EtOH

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FISH : Applications

Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype Précision de points de cassure Origine des marqueurs, dm, hsr Détection des aneuploïdies Détermination du sexe Microdélétions Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle

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FISH : Avantages et Inconvénients

Avantages

Technique sensible (noyaux et métaphases)

Grand choix de sondes (commerciales ou « maison »)

Inconvénients Technique lourde nécessitant des

traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus)

Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier

3 cibles maximum par test

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CGH : Principe

ADN à tester

Co-hybridation

ADN de référence

nb copies ADN test > nb copies ADN de référence => amplification

nb copies ADN de référence > nb copies ADN test => délétion

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FISH et CGH : Limites des techniques

FISH

Etude cibléeRésolution = 100-300Kb

CaryotypeCGH

Analyse globale du génomeRésolution = 5-10 Mb

Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution?

Þ Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon?

Þ Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?

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PUCES A ADN : Définitions

Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées

Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-

arrays

BAC-array = sondes de BACs

DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes)

DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes)

puces « pangénomiques » = ensemble du génome

puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une pathologie

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PUCES A ADN : Différents types de puces

Il existe trois types de technologies :

CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence)

Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50-200Kb)

Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer)

Puces à SNP  ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie

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Extraction de l’ADN => quantification (A260nm)

=> pureté (A260nm / A280nm)

=> intégrité (migration sur gel d’agarose)

Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR

Marquage et Fragmentation

Hybridation

Lavages

Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par un scanner)

Numérisation par un logiciel spécifique

PUCES A ADN : Etapes techniques

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CGH-array : Principe

Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN)

Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)

Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier

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ADN test marqué en CYA3

ADN de référence marqué en CYA5

Dénaturation et hybridation sur puce à ADN

Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse)

SCANNER

Défaut d’ADN test

Excès d’ADN test

Lame de verre

CGH-array : Principe

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CGH-array : Capture et Analyse des résultats

Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®

DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence)

ratio T/R calculé

3 spots / clone

• 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre

• T/R < 0,8 => délétion

• T/R > 1,2 => amplification

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CGH-array: Exemple d’application

Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)

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Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)

Peinture du chromosome 5Peinture du chromosome 9

CGH-array: Exemple d’application

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Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®

9p21 - CDKN2A(p16),MTAP 1,13 9p11.2 - AFM137XA11 1,35 9q21 - D9S166 1,51 9q22.3 - PTCH 1,41 9q33.2 - DBCCR1 1,08

CGH-array: Exemple d’application

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Résultats analyse sur puce IntegraGen®

CGH-array: Exemple d’application

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Puces à SNP: Principe

Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la puce

Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN)

L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire fixée sur la puce

Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier

Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)

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Puces à SNP: Analyse des résultats

Puce SNP6.0 / Affymetrix ®

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Puces à SNP: Analyse des résultats

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Puces à SNP: Analyse des résultats

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Puces à SNP: Analyse des résultatsPuce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®

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Puces à SNP: Analyse des résultats

Allèle Différence

Copy Number state

Segments

Fishclones (BACs)

Genomic variants (polymorphismes)

Refseq (gènes)Idéogramme / règle

Log2Ratio

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Puces à SNP: Analyse des résultats

FISH CLONES (BAC)

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Puces à SNP: Analyse des résultats

Refseq (gènes)

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Puces à SNP: Analyse des résultats

Genomic Variants

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Puces à SNP: Analyse des résultats

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Puces à SNP : Résolution

SNP6.0 (Affymetrix)

Cytogenetics Array

(Affymetrix)

Copy Number Marker 1 878 785 2 761 979

SNP 945 806 400 103

RefSeq genes 12 093 (64,7%) 18 270 (97,7%)

Cancer genes 233 (73,3%) 318 (100%)

OMIM genes 8 068 (43,1%) 12 046 (97,6%)Average marker spacing

(bp) 1,629 1,086

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Puces à ADN : Intérêts

Pas de mise en culture des cellules à analyser

Analyse l’ADN de tout type de tissus

Technique hautement résolutive (< 150 Kb)

Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée préalable de chromosomes impliqués (# FISH)

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Puces à ADN : Applications

Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques

Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN )

Comparaison tumeur/tissu sain

Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques

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Puces à ADN : Inconvénients

Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet) Seuil de sensibilité, mosaïques faibles? Plateau technique onéreux

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CONCLUSION

C I B L E S S U P P O R T I N T E R E T S L I M I T E S

CARYOTYPE

5-10 Mb Génome entier MétaphasesRecherche d’

Anomalies chromosomiques

Technique longue

Peu sensible pour les anomalies cryptiques (mais technique de référence en cytogénétique)

FISH

5 Mb à100-300 Kb

Chromosomes entiers

Régions spécifiques

(sub-télomèriques, centromériques, loci,…)

Métaphases

Noyaux interphasiques

Coupes de tissus

Micro-remaniements

Points de cassuresMarqueursAneuploïdieSexeSuivi de maladie 

TK lourde et peu automatisable3 cibles / test

Recherche ciblée

CGH-ARRAY / PUCES ADN

10-300 Kb

Loci spécifiques

(BACs ou oligonucléotides de synthèse)

Génome entier

ADN ou ARN

Analyse detout type d’échantillon (sang, moelle, tissu sain, tumeur)

Détection de déséquilibres cryptiques non détectable par les autres techniques

Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées

PolymorphismesMosaïques faibles

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Remerciements

Département Génétique du Laboratoire

Equipe de R&D: Azarnouche Ardalan, Anne Bazin, Catherine Destigny, Hossein Mossafa

Françoise Allamy et son équipe de FISH

Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire