Caractérisation biochimique et propriétés interfaciales de deux phospholipases A2 de venins de...

Caractérisation biochimique et

propriétés interfaciales de deux

phospholipases A2 de venins de vipères

tunisiennes

Baïram, Douja

Laboratoire des venins et biomolécules thérapeutiques, IPT

Directrice de thèse: Pr Marrakchi Naziha

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Venin de serpents

Métalloprotéases

Désintégrines

Phospholipases A2

Sérines protéases Inhibiteurs

de protéases

Toxines three finger Léctines de type C

L-amino oxydases

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Phospholipase A2 des venins de serpents

S.V PLA2

GIIA

Ca2+ ++

120-125 résidus

13-14 kDa Structure conservée

40-99 % homologies

7 ponts S-S

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Propriétés pharmacologiques des svPLA2 • PLA2 du venin des Elapidae (Terra et al., 2015)

• PLA2 basique du venin de Daboia russelii (Tan et al., 2015) Neurotoxicité

• Myotoxines Asp49 et Lys49, Bothrops asper (Mora-Obando et al., 2014)

• ColTx-I, Crotalus oreganus lutosus (Almeida et al., 2016a) Myotoxicité

• La PA11, PLA2 du venin de Pseudechis australis (Du et al., 2016) Anticoagulante

• PLA2 du venin du serpent corail Micrurus fulvius (Arce-Bejarano et al., 2014) Hémolytique

• OHV A-PLA2 du venin de Ophiophagus hannah (Huang and Gopalakrishnakone, 1996) Cardiotoxique

• NN-XIb-PLA2, PLA2 acide du venin de Naja naja (Sudarshan and Dhananjaya, 2016) Antimicrobienne

• Lmr-PLA2 du venin de Lachesis muta rhombeata (Cordeiro et al., 2015)

• NnPLA2 du venin du cobra indien Naja naja (Dutta et al., 2015)

Inhibition de l’agrégation plaquettaire

• BthA-I-PLA2 du venin de Bothrops jararacussu (Roberto et al., 2004)

• BnSP-6, Lys49 PLA2, du venin de Bothrops pauloensis (Azevedo et al., 2016) Anti-tumorale

• BE-I-PLA2, PLA2 acide du venin de Bothrops erythromelas (de Albuquerque Modesto et al., 2006) Anti-angiogénique

• BthTX-I du venin de Bothrops jararacussu (Prinholato da Silva et al., 2015)

• BnSP-6 du venin de Bothrops pauloensis (Azevedo et al., 2016) Apoptotique

• Bleu TX-III du venin de Bothrops leucurus (Marangoni et al., 2013)

• ColTx-I du venin de Crotalus oreganus lutosus (Almeida et al., 2016) Pro-inflammatoire

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

MVL-PLA2 vs CC-PLA2

Macrovipera lebetina transmediterranea (Bazaa et al., 2009)

Cerastes cerastes (Kessentini-Zouari et al., 2009)

MVL-PLA2 CC-PLA2 Acides

~ 14 kDa

His48-Asp49

7 ponts S-S

~ 120 résidus

Anti-tumorales

Inflammation

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Objectif

Corrélation entre les activités pharmacologiques des PLA2 avec leur capacité à hydrolyser les phospholipides

?

Caractérisation de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2 sur le plan catalytique

Étude des propriétés interfaciales

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Propriétés cinétique et biochimique de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2

Activité catalytique optimale

[NaTDC]

[CaCl2]

T °C

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Effet de la température

CC-PLA2 active à 60 °C

MVL-PLA2 active à 37 °C

CC-PLA2

MVL-PLA2

13 333 U/mg

1473 U/mg

Max Activité 20 °C – 60 °C

Max Activité 20 °C – 45 °C

CC-PLA2 > > > MVL-PLA2

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Effet de la concentration en Ca2+

CC-PLA2 3 mM CaCl2

MVL-PLA2 1 mM CaCl2

Ca 2+ essentiel à l’activité catalytique de la CC-PLA2 et de la MVL-PLA2

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Effet de la concentration en NATDC

Sels biliaires non essentiels à l’activité des PLA2

CC-PLA2 0 – 3 mM NaTDC

MVL-PLA2 0 – 1 mM NaTDC

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Principe de la méthode du film monomoléculaire

Les produits de la réaction d’hydrolyse > solubles que le phospholipide

Dissolution des produits de la réaction Diminution de la pression de surface

Activité d’hydrolyse

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Propriétés interfaciales des PLA2

Forte affinité DLPC et DLPE

Forte affinité DLPG et DLPS

1,02 mol cm-2 min-1 M-1

25 mN m-1 avec le DLPC

1,66 mol cm-2 min-1 M-1

20 mN m-1 avec le DLPG

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Modélisation moléculaire de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2

PLA2 du venin d’Agkistrodonhalys Pallas Modèle de référence

Structure conservée Trois hélices α, deux feuillets β et un site de fixation de Ca2+

Superposition des structures Valeur RMSD = 2,7 Å

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Docking des PLA2 aux membranes lipidiques

H2/H3 Support structural du site catalytique

H1 Interface d’interaction avec les phospholipides

L18/Y19 CC-PLA et la L18/T19 MVL-PA2 Encrage de la protéine

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Distribution des charges de surface

Répartition des charges de surface différente

Les charges + (bleues) sont fortement groupées à proximité de l’hélice H1, essentiellement pour la CC-PLA2

Charge globale identique

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Le moment dipolaire des PLA2

μ MVL-PLA2 = 97 D μ CC-PLA2 = 470 D

Les calculs des moments dipolaires + des potentiels électrostatiques sont en corrélation avec les profils activités/pression de surface obtenus avec la technique de monocouche lipidique

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Conclusions

La MVL-PLA2 et la CC-PLA2 partagent de nombreuses caractéristiques

Multiples différences significatives ont été mises en évidence

CC-PLA2 est thermoactive Activité CC-PLA2 >>>>>>> Activité MVL-PLA2

Forte affinité de la CC-PLA2 aux phospholipides anioniques

Forte affinité de la MVL-PLA2 aux phospholipides neutres

Moment dipolaire Implication de l’anisotropie des charges électrostatiques dans la sélectivité et l’activité enzymatique de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2

Expériences supplémentaires Corréler ces caractéristiques avec les propriétés pharmacologiques des enzymes

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

Remerciements

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016

MERCI POUR VOTRE ATTENTION