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VIRUS DE L’HEPATITE C& Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de RéférenceDes Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri MondorUniversité Paris XII
Créteil
VIRUS DE LVIRUS DE L’’HEPATITE CHEPATITE C& Marqueurs& Marqueurs
StStééphane Chevaliezphane Chevaliez
Centre National de RCentre National de RééfféérencerenceDes HDes Héépatites B, C et deltapatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Laboratoire de Virologie & INSERM U955HHôpital Henri Mondorôpital Henri MondorUniversitUniversitéé Paris XIIParis XII
CrCrééteilteil
Virus de l’Hépatite CI. Aspects VirologiquesVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite C
I. Aspects VirologiquesI. Aspects Virologiques
Virus de l’Hépatite CVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite C
•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
•• HHôte naturel : Hommeôte naturel : Homme
•• Tropisme : HTropisme : H éépatocytepatocyte
Virus de l’Hépatite CVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation GénomiqueOrganisation GOrganisation GéénomiquenomiqueVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Protéines structurales Protéines non structurales
Fonction des Protéines du VHCFonction des ProtFonction des Protééines du VHCines du VHCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines VHC Fonction
Capside Nucléocapside
F/ARF ?
E1 Enveloppe, domaine de fusion
E2 Enveloppe, liaison au récepteur
P7/NS1 Canal ionique Ca-dépendant
NS2 Autoprotéase NS2-3
NS3 Sérine protéase
NTPase/hélicase
NS4A Cofacteur de NS3
NS4B Inducteur de la formation du "membranous web"
NS5A Indispensable à la réplication, transactivateur?
NS5B ARN polymérase ARN-dépendante
Protéine de CapsideProtProtééine de Capsideine de CapsideVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Composant essentiel de la particule virale
(nucléocapside)
– Form é de deux domaines D1 et D2
– Interaction avec le m étabolisme lipidique
. Inhibition de la MTP et de la sécrétion des VLDL
. Interaction via le domaine D2 avec les gouttelettes lipidiques
– Rôle dans la pathogenèse
. Déterminant majeur des lésions hépatiques (stéatose, …)
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC génotype 1b
xyz
xy
z
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
Protéine NS3ProtProtééine NS3ine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)
. NTPase/hélicase (région C-terminale)
– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3
Inhibition de la Production d’IFN par NS3Inhibition de la Production dInhibition de la Production d’’IFN IFN par NS3par NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéine NS3ProtProtééine NS3ine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)
. NTPase/hélicase (région C-terminale)
– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3
– Cibles de molécules antivirales
. Telaprevir (VX-950, Vertex)
. Boceprevir (SCH503034, Merck)
. R7227 (ITMN191, Roche/Intermune)
OPM Database, University of Michigan, College of Pharmacy.
Site actifSite actif((His57, Asp 81, Ser139)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
R7227 (ITMN 191)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Days on treatment
Log
HC
V R
NA
red
uctio
n fr
om b
asel
ine
Baseline
Placebo (n=6)
Telaprevir 450mg q8h(n=10)
Telaprevir 1250mg q12h (n=10)
Telaprevir 750mg q8h(n=8)
-4,41
-0,21
-2,21
-2,37
Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
Activité Antivirale du TVRActivitActivitéé Antivirale du TVRAntivirale du TVRVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426.
Protéine NS5B: RdRpProtProtééine NS5B: RdRpine NS5B: RdRpVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Réplication
– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténaire de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Réplication ViraleRRééplication Viraleplication ViraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Analogues Nucléos(t)idiques– R7128 (Pharmasset)– IDX184 (Idenix Pharmaceuticals)
• Analogues non nucléosidiques– Filibuvir (Pfizer)– ANA598 (Anadys Pharmaceuticals)– GS 9190 (Gilead)– ABT-333 (Abbott)
Anti-polymérasesAntiAnti--polympolyméérasesrasesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
Cibles des Molécules AntiviralesCibles des MolCibles des Moléécules Antiviralescules AntiviralesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Site A (Thumb/fingertips)(JTK-109)
Mutants: 495, 496, 499
Site B (Thumb)HCV-371
Mutants: 419, 423, 482
Site C (Palm)(A-837093)
Mutants: 411, 414, 448
Site Actif(R7128)
Mutants: 282
Site D (Palm)(HCV796)
Mutants: 316
AA
BBCC
DD
EE
Site E (Finger, hypothetical )GS-9190
Mutants: 445,448,452
0
1
2
3
4
5
6
7
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Days
HC
V R
NA
(Lo
g IU
/mL)
TMA + + + + - - - - - - - - + +
LOQ (20 IU/mL)
MK-0608 at 1mg.kg -1 orally
- 4,6 - 4,1
wt S282R/T/I wt S282
Activité Antivirale du MK-0608ActivitActivitéé Antivirale du MKAntivirale du MK--06080608Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Modèle d’Entrée ViraleModModèèle dle d’’EntrEntréée Viralee Virale
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Maturation de la PolyprotéineMaturation de la PolyprotMaturation de la Polyprotééineine
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Structure des Protéines NSStructure des PStructure des Protrotééines NSines NS
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
"Membranous Web""Membranous Web""Membranous Web"
Huh7 naïves
Huh7 infectées(réplicon)
Gosert et al., J Virol 2003, 77(9): 5487-5492.
Cycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Virus de l’Hépatite CII. Modèles d’EtudeVirus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CII. ModII. Modèèles dles d’’EtudeEtude
Souris transgéniquesSouris SCID/uPA
Modèles AnimauxModModèèles Animauxles AnimauxVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Modèles CellulairesModModèèles Cellulairesles CellulairesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp)
• Réplicons g énomiques et subg énomiques
• Système productif (HCVcc)
Modèles AcellulairesModModèèles Acellulairesles AcellulairesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Modèles enzymatiques- Protéase NS3/4A- ARN polymérase ARN-dépendante (NS5B)- Cyclophyline B
Mesure de l’Activité Enzymatique de RDRpMesure de lMesure de l’’ActivitActivitéé Enzymatique Enzymatique de de RDRpRDRp
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
-- SimpleSimple-- SensibleSensible-- ReproductibleReproductible-- MiniaturisMiniaturis éé en microplaques 96 puitsen microplaques 96 puits
RdRpRdRp
Matrice ARN simpleMatrice ARN simple--brin homopolymbrin homopolyméériquerique
ARN doubleARN double--brinbrinRdRpRdRp
Agent intercalantAgent intercalant
PAS DE FLUORESCENCEPAS DE FLUORESCENCE
FLUORESCENCEFLUORESCENCEAgent intercalantAgent intercalant
A. Ahmed-Belkacen, 2007.
Virus de l’Hépatite CIII. Variabilité Génétique
Virus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CIII. VariabilitIII. Variabilitéé GGéénnéétiquetique
Dynamiques Virales du VIH, VHB et VHCDynamiques Virales du VIH, VHB et Dynamiques Virales du VIH, VHB et VHCVHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
HIV HBV HCV
Daily virion production 10 10 1012 - 1013 1012
Half-life of free virions (hr) 1 4 (<1) 2-3
Half-life of intracellular virions
Days Months Hours
Mutation rate Very high High Very high
Viral reservoir Integrated cDNA cccDNA No
Soriano et al., J Antimicrob Chemother 2008, 62: 1-4, Murray et al., Hepatology 2006, 44: 1117-1121; Dandri et al., Hepatology 2008, 48(4):1079-86.
• Erreurs au cours de la réplication– Fréquentes
. 10-4-10-4 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’ ⇒⇒⇒⇒5’("proofreading ")– Accumulation de mutations
• A l’origine de : – La diversification des types et des sous-types– La distribution en quasi-espèces
ARN Polymérase ARN-dépendanteARN PolymARN Polyméérase ARNrase ARN--ddéépendantependanteVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Diversification des GénotypesDiversification des GDiversification des Géénotypesnotypes
Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
7
Central Africa
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Répartition GéographiqueRRéépartition Gpartition Gééographiqueographique
1a,
Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis., 1997.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotypes en FranceGGéénotypes en Francenotypes en France
9,5%
G1 G3G2 G4 G5
1a
1b
1
60%19%
9,5%
2%
1a
1b
1
60%
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Intérêts de le Détermination des GénotypesIntIntéérêts de le Drêts de le Déétermination des termination des GGéénotypesnotypes
• Détermination systématique du génotype
– Facteur prédictif de la réponse au traitement
– Conditionne
. La dose de ribavirine
. La durée du traitement (24 vs 48-72 semaines)
Weiner et al., Virology 1991; 180:842-848; Martell et al., J Virol 1992;66:3225-36.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèceDistribution en QuasiDistribution en Quasi--espespèècece
• Dérive g énétique– Accumulation de mutations ponctuelles
• Glissement g énétique– Suite à la modification brutale de l’environnement
réplicatif
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Mécanismes d’Evolution de la Quasi-espèceMMéécanismes dcanismes d’’Evolution de la Evolution de la QuasiQuasi--espespèècece
• Joue un rôle dans le maintien de l’infection chronique
• Joue un rôle dans l’é chec des traitements antiviraux
• Joue un rôle dans la s évérité de la maladie
Farci P, 2000; Science, 288: 339-344; Lavillette D, 2005; Journal of Virology, 79(10): 6023-6034; Farci P, 2002; PNAS, 99: 3081-3086; Chambers TJ et al., 2005; 79: 3071-3083; Sullivan et al., JID 2007, 196: 239-248.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèceDistribution en QuasiDistribution en Quasi--espespèècece
Virus de l’Hépatite CIV. Exemples d’Application de la Variabilité Génétique
Virus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CIV. Exemples dIV. Exemples d’’Application Application de la Variabilitde la Variabilitéé GGéénnéétiquetique
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
7
Central Africa
Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
Diversification des GénotypesDiversification des GDiversification des GéénotypesnotypesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotype & Mode de TransmissionGGéénotype & Mode de Transmissionnotype & Mode de Transmission
52% 54%
63%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
3
1b
1a
Autres
Pawlotsky et al., J Infect Dis, 1995; 171(6): 1607-10.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
27%
39%
36%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
4
3
2
1b
1a
1nt
Payan et al., J Viral Hepat 2005;12: 405-13.
Génotype & Mode de TransmissionGGéénotype & Mode de Transmissionnotype & Mode de TransmissionVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
GGéénotype 3a notype 3a Chez les UDVIChez les UDVI
0.1 substitution per site
JK049TrKj
NE125NE048
HCV-3a
HCV-3fHCV-3c
HCV-3bHCV-3k
Australie
USA, Côte Ouest
Argentine
Brézil
France
USA, Côte Est
75
72
83
79
100
92
60
62
81
63
98
98
99
62
52
7195
56
Morice et al., J Med Virol 2006;78:1296-1303.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Mise en évidence d’une séroconversion VHC lors du dépistage et du suivi des patients hémodialysés en juillet 2005, à l’hôpital Henri Mondor
• L’ensemble des patients hémodialysés ont ététestés (anticorps anti-VHC et ARN viral)– Mise en évidence d’un 2nd cas au cours de la même période
• Analyses génétique et phylogénique
• Recherche du VHC dans l’environnement– Supports et surfaces inertes
Transmission Nosocomiale "Mondorienne"Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
� Identification de deux cas de séroconversion en 2004 au sein de l’unitéd’hémodialyse de l’hôpital Henri Mondor :
– Patient "1" infecté par un génotype 3a
– Patient "2" infecté par un génotype 1
Transmission Nosocomiale "Mondorienne"Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1h_FrSSD981h_98CM1521
1h_98CM13571f_FR21i_FR16
1i_QC771iQC181
1m_GUI171m_GUI11
1m_GUI241d_HC1N161d_BA107
1d_FR17Patient 81b_HCJ4
Patient 7Patient 6
Patient 5Patient 4
1b_HCP011b_HCVBK
1c_HCG91c_SR0311c_Khaja1
1l_M5186N1l_98CM14271l_98CM1457
1e_M4541N1e_CAM1078
1e_QC1721g_1382
1g_21521g_EG024
1a_HCV11a_HCVH
1a_HCJ11j_QC2
1j_QC891k_QC68
1k_QC82Patient 3Patient 2*Patient 2**
2a_HCJ65a_SA13
6a_EUHK2Patient 1
3a_NLZ14a_ED43
0.05
Genotype 4
Genotype 3
Genotype 6Genotype 5
Genotype 2
Genotype 1
100
100
100
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
G1
Analyse PhylogéniqueAnalyse Analyse PhylogPhylogééniquenique
Région NS5B (329 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)
5a_SA131b_HVR3812
Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)
Patient 3 (01/05)
1a_HCT27X52a_Q2B
3a_CB1a_HCT18X5
Patient 61b_AWV2C33
Patient 8Patient 4
Patient 74a_ED43
0.2
100
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogAnalyse Phylogééniquenique
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)
5a_SA131b_HVR3812
S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)
1a_HCT27X52a_Q2B
3a_CB1a_HCT18X5
Patient 61b_AWV2C33
Patient 8Patient 4
Patient 74a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogAnalyse PhylogééniqueniqueVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Screening de 64 patients hémodialysés à l’hôpital Hubert Kutuku Maga, Cotonou, B énin (Afrique)– Détection anticorps anti-VHC– Détection ARN VHC (limite détection <50UI/mL)
• Etude génétique et phylogénique de deux régions distinctes du génome viral– NS5B– Core-E1
Transmission Nosocomiale au BéninTransmission Nosocomiale au Transmission Nosocomiale au BBééninnin
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogAnalyse Phylogééniquenique
5aSA132aHCJ6
Patient 496aEUHK2 3aNLZ1
Patient 624aED43
1hFrSSD981h98CM1357
1h98CM15211cHCG91cSR0311cKhaja1
1aHCV11aHCVH
1aHCJ11jQC2
1jQC891kQC68
1kQC821eM4541N
1eCAM10781eQC172
1g13821g2152
1gEG0241lM5186N1l98CM14271l98CM1457
1fFR2Patient 59
Patient 46Patient 54Patient 2
Patient 28Patient 64Patient 16Patient 36
Patient 18Patient 17Patient 8
Patient 71bHCJ41bHCVBK
1bHCP01Patient 401iFR16
1iQC771iQC181Patient 48Patient 60Patient 52
Patient 261dFR17
1dHC1N161dBA1071mGUI171mGUI111mGUI24
0.05
59
99
96
34100
72
100
98
43
Région NS5B (286 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2
Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Transmissions NosocomialesTransmissions NosocomialesTransmissions Nosocomiales
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningNJPlot
2aQ2B
3aCB
2bJFH1
1aHCT18X5
6a33
4aED43
1aHCT27X5
Patient 7Patient 8Patient 16Patient 18
Patient 17Patient 2
Patient 28Patient 64
Patient 54Patient 46
5aSA13
Patient 59
Patient 52Patient 48
Patient 601bAWV2C33
1bHVR3812
0.2
Patient 26Patient 40
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCEMAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire dAssignation Provisoire d’’un Nouveau un Nouveau SousSous--type : type : Etude de la rEtude de la réégion NS5Bgion NS5B
Patient 16
Patient 18Patient 17Patient 8Patient 7
Patient 64Patient 46
1f_L38350
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1i_AY434119
1h_AY434131
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
0.05
PARCIMONIEPARCIMONIE
Patient 16Patient 18Patient 17Patient 7Patient 8
Patient 64Patient 46
1f_L38350
1h_AY434131
1i_AY434119
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCEMAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire dAssignation Provisoire d’’un Nouveau un Nouveau SousSous--type : type : Etude de la rEtude de la réégion Coregion Core--E1E1
PARCIMONIEPARCIMONIE
Patient 7Patient 64
Patient 46Patient 18Patient 16
Patient 17Patient 8
1h_AY434132
1h_AY257087
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_M58335
1b_L38372
1b_D90208
1f_L38371
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
0.02 Patient 64Patient 46Patient 18Patient 16Patient 17Patient 7Patient 8
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_D90208
1b_L38372
1b_M58335
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
1f_L38371
1h_AY434132
1h_AY257087
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en Grèce (" Papageorgiou General HospitalPapageorgiou General Hospital" , Thessaloniki), Thessaloniki)
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques mois
• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante– Système HCVpp
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Transmission Nosocomiale en GrèceTransmission Nosocomiale en GrTransmission Nosocomiale en GrèèceceVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
0,1 substitution per site
HCV-1HCV-H
SR052HC-G9
SR037HC-J4
HCV-BKBE90
Pt-11Pt-10Pt-9Pt-5Pt-12Pt-13Pt-15
Pt-16Pt-2Pt-4
Pt-3Pt-1Pt-17Pt-7Pt-6Pt-8
1b
HCV-1
1a
1c
Souche B
Souche A
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogAnalyse Phylogééniquenique
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Patient-10 (souche B)
ARN VHC(UI/mL)
Semaines
% neutralisationinfection
Huh7
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
• Absence de réponse neutralisante et absence de contrôle de l’infection
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Réponse Neutralisante - Groupe 1RRééponse Neutralisante ponse Neutralisante -- Groupe 1Groupe 1Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Réponse neutralisante forte et spécifique• Réponse neutralisante inversement proportionnelle
à la cinétique de la charge virale
Patient-1 (souche A)
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% neutralisationinfection
Huh7
Réponse Neutralisante - Groupe 2RRééponse Neutralisante ponse Neutralisante -- Groupe 2Groupe 2
ARN VHC(UI/mL)
Semaines
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique50 - 80%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation6 - 10%
HCC4-5% par an
Mortalité
20 -
30 a
ns
StéatoseFibrose
Histoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire NaturelleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique50 - 80%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation6 - 10%
HCC4-5% par an
Mortalité
20 -
30 a
ns
StéatoseFibrose
Histoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire NaturelleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Histoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation6 - 10%
HCC4 - 5% par an
Mortalité
10 -
30 a
ns
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Persistance ViralePersistance Virale
• Persistance virale– Echec de la réponse immune, pourtant
présente et adaptée, à éliminer le virus ou les cellules qui l’abritent
• Interface complexe
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Processus MultiProcessus Multi--éétapetape
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale ?
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Processus MultiProcessus Multi--éétapetapeVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Ferrari C, Gasroenterology 2007; 132(2): 801-805
Persistance du VHCPersistance du VHCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Roque-Afonso et al., J Virol 2005;79:6349-57)
Compartimentation Plasma-PBMCCompartimentation PlasmaCompartimentation Plasma--PBMCPBMCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
RRéégiongion 55’’NC NC (Pt(Pt--3)3)
RRéégion E1gion E1 --E2 E2 (Pt(Pt--3)3)
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique du VHCImpacts de la VariabilitImpacts de la Variabilitéé GGéénnéétique tique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Résistance naturelle du VHC àl’interféron
• Résistance du VHC à la th érapie par l’interféron
• Résistance du VHC aux inhibiteurs spécifiques (DAA)
Résistance du VHCRRéésistance du VHCsistance du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
HEPATITE C : Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
HEPATITE C : StratHEPATITE C : Stratéégie gie Diagnostique & Suivi Diagnostique & Suivi
VirologiqueVirologique
Virus de l’Hépatite CI. Cinétique des Marqueurs
Virologiques
Virus de lVirus de l’’HHéépatite Cpatite CI. CinI. Cinéétique des Marqueurs tique des Marqueurs
VirologiquesVirologiques
Marqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside
ARN VHC
Génotype VHC
Cinétique des MarqueursCinCinéétique des Marqueurstique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Titr
e
Anti-VHC
ALAT
Normal
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Aiguë
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Cinétique des MarqueursCinCinéétique des Marqueurstique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Titr
e
Anti-VHC
ALAT
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Chronique
Normal
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CII. Tests VirologiquesVirus de l’Hépatite CII. Tests Virologiques
Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MolTests Virologiques Molééculairesculaires
Tests quantitatifsSeuil de détection ≥≥≥≥ qualitatifs
Quelle quantité est présente ?
Tests qualitatifsTrès sensibles
(≤≤≤≤ 50 IU/mL)
Est-ce que le VHC est présent ?
Détermination du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MolTests Virologiques Molééculairesculaires
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Détermination du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Qualitatifs - Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détection -Quantification de l’ARN VHCIntIntéérrêts de la Dêts de la Déétection tection --Quantification de lQuantification de l’’ARN VHCARN VHC
• Evaluation de la réplication virale chez des patients anticorps anti-VHC positifs
• Evaluation de la réponse virologique au cours du traitement standard
– Interféron pégylé alpha-2a ou -2b– Ribavirine
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 4 8 12Semaines
Diminution ≥≥≥≥ 2 Log
Limite de détection(10-15 UI/mL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
AR
N V
HC
(Lo
g10
UI/m
L)
Peg-IFN-RBV
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Cinétiques & Réponses au Traitement
0 4 8 12Semaines
Limite de détection(10-15 UI/mL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
AR
N V
HC
(Lo
g10
UI/m
L)
RVRRV lente
RVP
Diminution ≥≥≥≥ 2 Log
Peg-IFN-RBV
2
Cinétiques & Réponses au Traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Techniques DisponiblesTechniques DisponiblesTechniques Disponibles
b-DNA PCRBranched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Principe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des Techniques
b-DNA PCRBranched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
bDNA : Forces & FaiblessesbDNA : Forces & FaiblessesbDNA : Forces & Faiblesses
• Forces– Quantification indépendante du génotype– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques– Faible volume de prise d’essai– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6,90 Log10 UI/mL
• Faiblesses– Faible sensibilité
. LLOD: 2,80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs – Méthode semi-automatisée (Siemens system 440 analyzer)– 12 contrôles par run
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Principe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des Techniques
b-DNA PCRBranched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR en Temps Réel
– Diminution du risque de contamination
– Amélioration de la sensibilité
– Augmentation de l’intervalle de quantification lin éaire
– Précision et reproductibilité
– Augmentation de d ébit à travers l’automatisation
– Diminution des co ûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
Intervalles de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
TaqMan 48 HCVTaqMan 48 HCV(Roche)(Roche)
HCV Quant ASRHCV Quant ASR(Abbott)(Abbott)
Versant HCV RNAVersant HCV RNA1.0 (kPCR, Siemens)*1.0 (kPCR, Siemens)*
*en développement
Intervalles de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
– Diminution du risque de contamination
– Amélioration de la sensibilité
– Augmentation de l’intervalle de quantification lin éaire
– Précision et reproductibilité
– Augmentation du d ébit à travers l’automatisation
– Diminution des co ûts
Avantages Techniques de la PCR en Temps Réel
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Remplace les techniques qualitatives de détection de l’ARN VHC
• Quantifie l’ensemble des charges virales observées en pratique clinique– Faibles charges virales au cours du traitement
• Surveille efficacement les cin étiques virales (évaluation précoce des réponses virologiques au traitement)
Avantages Cliniques de la PCR en Temps Réel
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Quantification de l’ARN VHC(CTM, Roche)Quantification de l’ARN VHC(CTM, Roche)
HC
V R
NA
leve
l in
CA
P/C
TM
48 (
Log
10IU
/mL)
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA(Log 10 UI/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
r = 0.889; p < 0.0001
8
7
6
5
4
3876543
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
15%15%30%30%
Diff
eren
ce b
etw
een
HC
V R
NA
leve
ls m
easu
red
in
CA
P/C
TM
and
in b
DN
A (
in L
og10
UI/m
L)CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Différences de QuantificationDifférences de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
Absence de Détection de l’ARN Viral de Patients Infectés par un VHC de Génotype 4Absence de Détection de l’ARN Viral de Patients Infectés par un VHC de Génotype 4
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|
F_7157 (4a): TAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCCGG
Patient 1 (4h): ...........................A.....................................A...................T...............
Patient 2 (4l): ...........................A.....................................A...................T...............
190 200 210 220 230 240 250 260 270
.........|.........|......-...|.........| .........|.........|.........|.........| .........|........
F_7157 (4a): GATGACCGGGTCCTTTCTTGGATTAA-CCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCC
Patient 1 (4h): ......................A.T.A..........................................................................
Patient 2 (4l): .......................C..-.......................................................C.......T..........
280 290 300 310 320 330 340
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.
F_7157 (4a): TTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC
Patient 1 (4h): .............................................................
Patient 2 (4l): .............................................................
Chevaliez et al., 2008; Hepatology, 49(4): 1397-1398.
(Log10IU/mL) CAP/CTM96 m2000SP/m2000RT Versant 3.0
Patient 1 (4h) <1.08 5.4 5.0
Patient 2 (4l) <1.08 6.0 5.7
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou Mutés en Position 145 et/ou 165 Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou Mutés en Position 145 et/ou 165
Chevaliez et al., Hepatology, 2009, 50(5): 1681.
HCV 5’NC sequence
Measured HCV RNA levels (Log10 IU/mL)
Real-time PCR assays bDNA assay
CTM m2000 Versant 3.0
Wild-type (G145 and A165)
5.73±0.13 6.05±0.10 6.43±0.01
Single mutant (G145 A and A165)
4.02±0.13 6.00±0.11 6.69±0.02
Single mutant (G145 and A165T)
4.28±0.35 5.88±0.20 6.30±0.02
Double mutant (G145 Aand A165 T)
<1.08* 5.95±0.25 6.60±0.18
*Target not detected
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
Quantification de l’ARN VHC(m2000, Abbott)Quantification de l’ARN VHC(m2000, Abbott)
r = 0.972; p < 0.0001
8
7
6
5
4
3876543
HC
V R
NA
leve
l in
m20
00S
P/m
2000
RT
(Log
10IU
/mL)
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA(Log 10 UI/mL)
Genotype 1 (n=55)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=3)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
David Sherman., Molecular Symposium, September 2007 (source: Siemens Medical Solutions Diagnostics).
132 clinical samples
Quantification de l’ARN VHC(kPCR, Siemens)Quantification de l’ARN VHC(kPCR, Siemens)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotypes du VHCGGéénotypes du VHCnotypes du VHC
Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
7
Central Africa
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détermination du GénotypeIntIntéérrêts de la Dêts de la Déétermination du termination du GGéénotypenotype
• Détermination systématique du génotype
– Facteur prédictif de la réponse au traitement
– Conditionne
. La dose de ribavirine
. La durée du traitement (24 vs 48 semaines)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du GénotypeDDéétermination du Gtermination du Géénotypenotype
• Détermination moléculaire du g énotype VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du g énotype VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du GénotypeDDéétermination du Gtermination du Géénotypenotype
• Détermination moléculaire du g énotype VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du g énotype VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
– Complete genome (new subtype identification)
– NS5B coding region (the reference region)
– Envelope E1 coding region (the second reference region)
– 5’-untranslated region, 5’UTR (the most frequently used in practice)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Régions Virales CibléesRRéégions Virales Ciblgions Virales Ciblééeses
Méthodes Moléculaires de GénotypageMMééthodes Molthodes Molééculaires de Gculaires de Géénotypagenotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification 1
• Hybridation inverse des produits d’amplification su r support solide : Line Probe Assay (INNO -LiPA HCV, Innogenetics)
• PCR en temps réel à l’aide de primers et/ou sondes génotype spécifiques
• Autres m éthodes :– Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP)– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Analyse Après Séquençage Direct
• The reference method
• Direct sequence analysis of NS5B or, eventually , E1 is used for accurate genotype and subtype determination
• Direct sequence analysis of the 5’UTR can be used in clinical practice.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
TRUGENE® HCV 5’NC Genotyping (Siemens)
• One-step RT-PCR generating a 244-bp fragment
• PCR products are sequenced in both senses
• Forward and reverse sequences are aligned with prototype reference strain sequences from the GeneLibrarian database
• The HCV genotype is determined by sequence homology
Young et al., J Clin Microbil, 1993; 31: 882-86; Roos et al., J Cli Microbiol, 2000; 38(10): 3581-84; Germer et al., J Clin Microbiol, 2003; 41(10): 4855-577
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Pros– Reference method for HCV genotype and subtype
determination– Can be used, with the appropriate target region, for
. Identification of new subtypes
. Molecular epidemiology studies
– Assays are available for use in clinical practice
• Cons– Mixed genotype infections are not detected– Labor intensive and time-consuming– Costly
Analyse Après S équen çage DirectStratégie diagnostique & suivi virologique
• Line probe assay
• Based on reverse hybridization of PCR products onto genotype-specific probes
• Two generations of assays– 1st-generation assay: probes in the 5’UTR – 2nd-generation assay: probes in the 5’UTR and
core region
Hybridation InverseStratégie diagnostique & suivi virologique
Versant® HCV Genotype 2.0 Assay (INNO-LiPA)VersantVersant®® HCV Genotype 2.0 Assay HCV Genotype 2.0 Assay (INNO(INNO--LiPA)LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Pros– Easy to use and potential semi-automation (Auto-
LiPA)– Cheaper – Mixed genotype infections can be detected
• Cons– Should not be used for identification of new
subtypes or molecular epidemiology studies because of possible mis-subtyping
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Hybridation Inverse
Intérêts de la Détermination du Sous-Type ?IntIntéérrêts de la Dêts de la Déétermination du termination du SousSous--Type ?Type ?
• DAA drugs may have different antiviral efficacies on different HCV genotype 1 subtypes in vitro and in vivo
• DAA drugs administration may be associated with different resistance profiles with different HCV genotype 1 subtypes in vitro and in vivo
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Activité Antivirale Sous-Type Dépendant
• BILB 1941, an NNI inhibitor of HCV RNA-dependent RNA polymerase, showed better antiviral efficacy in HCV subtype 1b than in subtype 1a
– In vitro, EC50s: 84 nM in subtype 1a vs 153 nM in subtype 1b
– In vivo, over 5 days of administration in HCV-infected patients
Erhardt et al., Antivir Ther 2009, 14: 23-32.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Profil de Résistance Sous-Type Dépendant
• HCV genotype 1 subtype-specific resistance to telaprevir – In vitro, R155K substitutions are selected only in genotype
1a replicons– In vivo, amino acid substitutions at positions 36 and 155 are
selected only in patients infected with subtype 1a
• HCV genotype 1 subtype-specific fitness of variants resistant to HCV-796– In patients infected with subtype 1b, the C316Y substitution
is found alone in fit resistant variants– In patients infected with subtype 1a, the C316Y substitution
requires additional substitutions to gain full fitness
Kieffer et al., hepatology 2007, 46: 631-639; Sarrazin et al., Gastroenterology 2007, 132: 1767-1777;; Delano et al., 1st International Workshop on HepC Resistance and New Compounds 2006; McCown et al., Antimicrob Agents Chemother 2009.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance de la Région Virale pour la Détermination du Sous-typeImportance de la RImportance de la Réégion Virale gion Virale pour la Dpour la Déétermination du Soustermination du Sous--typetype
Chevaliez et al., PLoS One 2009, 4(12): e820.
1st Generation of Line Probe Assay
(LiPA 1.0)
2nd Generation of Line Probe Assay
(LiPA 2.0)
RealTime HCV Genotype II
Sequence Analysis of the 5’NCR
GT 1a(n=237)
GT 1b(n=263)
77.6%(n=184)
90.5%(n=238)
70.5%(n=167)
91.3%(n=240)
97.5%(n=231)
96.2%(n=253)
93.2%(n=220)
88.6%(n=233)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts des "Nouveaux" Tests Sérologiques ?IntIntéérrêts des "Nouveaux" êts des "Nouveaux" Tests Tests SSéérologiques ?rologiques ?
• Détection - quantification de l’antigène de capside (AgC)
• Test de détection des antigènes et des anticorps (combo)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside : Marqueur Indirect de la Réplication Virale
Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218.
r = 0.92; p < 0.0001
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détection-Quantification de l’Ag de Capside• Diagnostic de l’infection virale C
– Marqueur sérologique précoce. Réduction de la fenêtre sérologique à environ 20 jours. Génotype-indépendant
– Facile à mettre en œuvre, rapide, bon marché (ELISA automatisée)
– Trousse commerciale
• Décision de traiter et Monitoring de l’efficacité du traitement – Marqueur indirect de la réplication virale
. 1 pg d’Ag C ≈ 8 000 UI/mL ARN
– Alternative aux méthodes moléculaires de quantification de l’ARN– Seuil de quantification équivalent à 20 000 UI/mL d’ARN
Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218; Mehdi et al., Clin Biochem. 2008, 41(18):1493.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection Simultanée Ag/Ac (Test Combo)• Diagnostic de l’infection virale C
– Réduction de la fenêtre sérologique (~20 jours). ~60 jours avec les dernières générations de trousses anticorps. ~40 jours ave les trousses Combo
– Alternative aux méthodes de DGV– Facile à mettre en œuvre, rapide (ELISA automatisé)– Trousses commerciales
– Pas aussi sensible que les méthodes qualitative de détection de l’ARN et de détection de l’Ag de capside
Laperche et al. J Clin Micribiol 2005, 43(8): 3877-3883; Alzahrani AJ., J Med Virol 2008, 80(4): 603-6.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Diagnostic Virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Diagnostic Virologique
Diagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection AiguInfection Aiguëë
Ac anti-VHC
-
-
+
+
ARN VHC*
-
+
-
+
* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL
Diagnostic
Absence d’infection aiguë
Infection aiguë C
Probablement pas d’infection aiguë
Difficile de conclure
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Facteurs supplémentaires à prendre en compte chez des populations à risque
– Niveaux de charges virales
– Variation de la charge virale 4 et 10 semaines après la suspicion de l’hépatite aiguë
– Activité sérique des transaminases
McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection AiguInfection Aiguëë
Algorithme pour le Diagnostic de l’Hépatite Aiguë*
*population à risque (IDVU)
Suspicion d’hépatite aiguë
SéroconversionARN VHC
< 5Log10 UI/mLFluctuations ARN>1 Log10 UI/mL
Fluctuations ARN<1 Log10 UI/mL
ouARN VHC
> 5 Log10 UI/mL
Hépatite aiguëProbabilité
élevée
ALAT> 7xLSN ALAT> 7xLSN
Probabilitémodérée
Probabilitéfaible
McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diagnostic de l’Infection ChroniqueDiagnostic de lDiagnostic de l’’Infection ChroniqueInfection Chronique
– Détection des anticorps anti-VHC totaux par ELISA
– Recherche d ’ARN du VHC par un test sensible*
– Détection d ’ARN du VHC* si le test ELISA est n égatif chez des patients h émodialysés ou immunod éprim és
* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge Thérapeutique
Virus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge Thérapeutique
Intérêts des Tests Virologiques en ThérapeutiqueIntIntéérrêts des Tests Virologiques en êts des Tests Virologiques en ThThéérapeutiquerapeutique
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20.
– Décision de traiter
– Optimisation du sch éma thérapeutique
– Etude de la réponse virologique au traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Classification des PatientsClassification des PatientsClassification des Patients
Type1
Types2, 3
Types4, 5, 6
Génotypes VHC
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Indications Actuelles du TraitementIndications Actuelles du TraitementIndications Actuelles du Traitement
• Patients infectés par un VHC de génotype 1– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)– Durée : 48 semaines
• Patients infectés par un VHC de génotype 2/3– Interferon pégylé plus ribavirine (800 mg/j)– Durée : 24 semaines
• Patients infectés par une VHC de génotype 4, 5 et 6– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)– Durée : 48 semaines
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
Génotype VHC
VHC-1 (4,5,6)Quantification ARN
VHC-2,3
Bithérapie24 semaines
Ribavirine 800 mg
Bithérapie48 semaines
Ribavirine 1000-1400 mg
Quantification ARN à S12
Diminution < 2 Log Diminution ≥ 2 Log ARN VHC +
Arrêt traitementpoursuite avec
IFN pégylé pour ralentir la
progression de la maladie
hépatique
Poursuite jusqu’àS24
Si ARN VHC -Poursuite jusqu’à
S48
diminution ≥ 2 Log ARN VHC -
Poursuite jusqu’àS48
Optimisation du Traitement en Fonction de la Réponse VirologiqueOptimisation du Traitement en Optimisation du Traitement en Fonction de la RFonction de la Rééponse Virologiqueponse Virologique
• Outils virologiques sensibles– Sensibilité : 10-15 UI/mL– Evaluation de la réponse au traitement
• Répondeurs virologiques rapides– Raccourcissement de la durée de traitement
• Répondeurs virologiques précoces partiels– Allongement de la durée de traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Raccourcissement de la Durée de Traitement
Réponses aux Semaines 4 et 12 : Facteur Pronostique de la RVS
RVR à S4 Absence de RVP à S24
Martinot-Peignoux et al., Ant Therapy 2009, 14: 501-511.
(n=62)
(n=221)(n=125)
(n=228) (n=62)
(n=221)(n=125)
(n=228)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
AlbIFN 1200µg/2s + RBV 1000-1200 mg/j (n=78)AlbIFN 900µg/2s + RBV 1000-1200 mg/j (n=96)PegIFN alpha-2a 180µg/s + RBV 1000-1200 mg/j (n=98)
AlbIFN 1200µg/4s + RBV 1000-1200 mg/j (n=96)
Neumannet al., J Hepatol 2009, 51: 21-28.
RRééponses aux Semaines 2 et 4 : ponses aux Semaines 2 et 4 : Facteur Pronostique de la RVSFacteur Pronostique de la RVS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Réduction de l’ARN du VHC à J2 : Facteur Pronostique de la RVS
ΔΔΔΔ(to-t2) Log ARN VHC
N°°°° de patients
RVS Pas de RVS VPP (%) VPN (%)
Cutoff à 2,5 88 54
>2,5 29 4
≤2,5 38 48
Cutoff à 0,8 67 95
>0,8 66 32
≤0,8 1 20
Durante-Mangoni et al., Clin Infect Dis 2009, 49: 498-506.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance de la RVRImportance de la RVRImportance de la RVR
• Analyse rétrospective de patients infectés par un VHC de génotype 1 traités pendant 48 semaines par pegIFN alfa-2a + RBV (N = 453)
ARN VHC PositifÀ S24
4 12 24Semaine ARN négatif
91
66
45
2
Ferenci P, et al. J Hepatol. 2005;43:425-433.
20
40
60
80
100
RV
S (
%)
0
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : GTraitement Court : Géénotype 1notype 1
• Patients par un VHC de g énotype 1
– ARN VHC < 600,000 IU/ml
– PegIFN-α2b + ribavirine
– 24 semaines de traitement
– Comparaison des données obtenus avec les résultats de l’étude pivot (Mann et al., Lancet 2001)
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : GTraitement Court : Géénotype 1notype 1
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Week 4 Week 12 Week 24
24 weeks24 weeks
48 weeks48 weeks(Mann et al., (Mann et al., 2001)2001)
Time to first negative HCV RNA (< 50 IU/ml)Time to first negative HCV RNA (< 50 IU/ml)
% S
VR
% S
VR
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Jensen et al., Hepatology 2006;43:954-960
Traitement court : Génotype 1Traitement court : GTraitement court : Géénotype 1notype 1
0
20
40
60
80
100
% d
e R
VS
% d
e R
VS
PegPeg--IFN alpha 2a 180 IFN alpha 2a 180 µµg/semaine + RBV 800 ou 1000g/semaine + RBV 800 ou 1000--1200 mg/j1200 mg/j
ARN VHC > 50 UI/mL à S4
2424--DFDF
2424--DSDS
4848--DFDF
4848--DSDS
73%
89% 88% 91%
ARN VHC < 50 UI/mL à S4
44%
23%35%
16%
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shiffman et al., EASL 2006.
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : GEtude ACCELERATE : Géénotypes 2/3notypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Génotype 2 Génotype 3
16 semaines24 semaines%
RV
S%
RV
S
p=<0.0001p=<0.0001 p=0.1565p=0.1565
65%
82%
65%71%
Rapid virological responseRapid virological responseHCV RNA < 50 IU/ml at week 4HCV RNA < 50 IU/ml at week 4
No rapid virological responseNo rapid virological responseHCV RNA HCV RNA ≥≥≥≥≥≥≥≥ 50 IU/ml at week 450 IU/ml at week 4
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : GEtude ACCELERATE : Géénotypes 2/3notypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shiffman et al., EASL 2006.
0102030405060708090
100
16 semaines24 semaines
0102030405060708090
100
82%90%
27%
49%
SVR rate SVR rate
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
14 weeks14 weeks
24 weeks24 weeks
% S
usta
ined
viro
logi
cal r
espo
nse
% S
usta
ined
viro
logi
cal r
espo
nse
Dalgard et al., Hepatology 2008;47:35-42
RVR (HCV RNA < 50 IU/ml at week 4)
93%84%
Genotype 2 Genotype 3
92%97%
Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : GTraitement court : Géénotypes 2/3notypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
PegIFN-αααα2b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
12 weeks12 weeks
24 weeks24 weeks
% S
usta
ined
viro
logi
cal r
espo
nse
% S
usta
ined
viro
logi
cal r
espo
nse
Lagging et al., Hepatology 2008;47:1837-45.
71%71%
91%91%
RVR
62%62%
41%41%
120120 111111 6868 7171
No RVR
PegIFN-αααα2a
Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : GTraitement court : Géénotypes 2/3notypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
NN
• Durée de traitement de 6 mois chez tous les patients avec une RVR ind épendamment du génotype
• Raccourcissement de la durée de traitement à 12 ou 16 semaines chez les patients infectés par une g énotype 2/3 avec un ARN ind étectable à S1 ou S2 (?)
RésuméRRéésumsumééStratégie diagnostique & suivi virologique
Allongement de la Durée de Traitement
Traitement Long : Génotypes 2/3Traitement Long : GTraitement Long : Géénotypes 2/3notypes 2/3
• Older age
• Male gender
• High BMI
• Fibrosis ≥≥≥≥ F3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotype 1 : Traitement LongGGéénotype 1 : Traitement Longnotype 1 : Traitement Long
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
48 weeks(n=230)
72 weeks(n=225)
53% 54%% S
VR
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0
20
40
60
80
100
% d
e R
VP
NSNS NSNS
NSNS
P<0.05P<0.05
S 4 S 12 S 4 S 12
ARN VHC < 50 UI/mlARN VHC < 50 UI/ml ARN VHC ARN VHC ≥≥≥≥≥≥≥≥ 50 UI/ml50 UI/ml
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
48 semaines
72 semaines
Génotype 1 : Traitement LongGGéénotype 1 : Traitement Longnotype 1 : Traitement LongStratégie diagnostique & suivi virologique
RésuméRRéésumsumééStratégie diagnostique & suivi virologique
• Allongement de la durée de traitement à72 semaines am éliore la RVS :
– Chez les patients avec une RVP partielle
– Chez les non-répondeurs à un premier traitement par une bi-thétrapie standard qui sont retraités
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