2. Exemple de dissection génétique chez le poisson Zebrafish : biologie moléculaire de l'embryogenèse d'un vertébré

Embryogenèsed'un vertébré

Gène Protéineséquence

isolement demutants

clonage du gène& analyse bioinformatique

interprétation(biochimie, biologie cellulaire)

1994 : C. Nussleïn-Volhard (Tübingen) & W. Driever (Boston)

® programme commun : objectif : recherche exhaustive de mutants de Zebrafish présentant une anomalie au cours du développement

® 1996 : 371 gènes recensés et classés sur des bases phénotypiques

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2.1 Isolement des mutants

O

ENU

X

O O

F1

XF1

+ m

+ +

Two generations screen

F2

XF2

+ m

+ m

F3

50 % +/m50 % +/+

F2

25% [m]

- traitement de ~30 mâles (lignée consanguine AB) à l'éthylnitrosourée (ENU) (3 incubations, espacés de 2 jours chacune, pendant une heure dans 3 mM ENU -> une mutation par spermatozoïde en moyenne)

- après 3 semaines (spermatogonies mutagénisées devenues spermatozoïdes), croisement avec une femelle non mutagénisée. Chaque descendant F1 est donc hétérozygote pour en moyenne une mutation (m1/+, m2/+, .. ~ 3000 poissons F1)

Les poissons F1 qui présentent une anomalie sont porteurs d’une mutation dominante; on les écarte car le travail va se concentrer par la suite sur les mutations récessives (perte de fonction).

Pour chaque mutation, isolement de poissons homozygotes par un "crible en 2 générations" :

- croisement de chaque poisson F1 (~ 3000) avec le sauvage (® ~ 3000 descendances F2)

- isolement de couples F2 (5 à 6 / descendance F2) ® descendance F3 : 1 couple sur 4 en moyenne donnera 25% d'homozygotes pour la mutation m

Résultat du crible :

1163 mutants isolés parmi les descendances F3 –très grande variété de phénotypes (défauts à tous les stades du développement)

+m1

+m2

+m3 +

m4

+m5

+m6

+m1

+m1

25% m1m1

+m1

50% m1+

50% ++

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Exemples de phénotype :

- mutant oep (one eye pinhead) ou cyclops (B) : absence de développement de la partie antérieure de la corde ® système nerveux non induit/non formé (yeux réduits et fusionnés en un seul).

- mutant flh (floating head) (C ) ou ntl (no tail) : absence de développement de la corde postérieure

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Pour chaque phénotype : combien de gènes ?

® tests de complémentation (ex. si les mutations m1 et m2 provoquent le même phénotype) :

X

+ m1

+ m2

25% [m]

X

+ m1

+ m2

0% [m]

non complémentation complémentation

® 371 classes de complémentation ou gènes répertoriés

2.2 Classement des mutants

m1 et m2 affectent le même gène

m1 et m2 affectent des gènes différents

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2.3 Clonage des gènes : par positionnement

- la mutation est tout d’abord cartographiée par rapport à des marqueurs moléculaires de type SSLP (microsatellites) (cf. chap III p 57)

- les fragments d'ADN de la zone chromosomique correspondante sont disponibles grâce à la cartographie physique préalable du génome

- recherche (par des analyses bioinformatiques et expérimentales) du gène d'intérêt parmi ceux présents dans cette zone chromosomique (1)

chr.

zone cartographiée

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ZFIN databasehttp://zfin.org

(1) Chez le Zebrafish, 1 cM @ 625.000 pb et il y a en moyenne 1 gène (codant une protéine) tous les 100.000 pb

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Embryogenèsed'un vertébré

Gène Protéineséquence

isolement demutants

clonage du gène& analyse bioinformatique

interprétation(biochimie, biologie cellulaire)

Les protéines impliquées dans le développement embryonnaire du Zebrafish étant identifiées, la suite de l’étude visera à comprendre leur mode d’action moléculaire (par des analyses biochimiques, de biologie cellulaire, ..)

Exemple de sujet d’étude avec d’importantes retombées en médecine humaine : anomalies du cœur du Zebrafish

Le cœur et ses battements se voient aisément chez le Zebrafish, par transparence ® relativement aisé d’identifier des mutants avec des anomalies cardiaques. Beaucoup d’entre elles ressemblent à des pathologies connues chez l’être humain.

Mutant Gène Maladie humaine

passive agressive ? faible contractibilité de l'oreillettehal ? faible contractibilité du ventriculeslow mo et reggae ? bradycardiehiphop ? bloc auriculo-ventriculairebreakdance canal à ion K+ bloc auriculo-ventriculaireginger ? bloc auriculo-ventriculairetremblor ? fibrillationpickwick titine cardiomyopathie dilatéeisland beat canal à ion Ca++ fibrillation auriculaireheart and soul protéine kinase C malformation ventriculairehandsoff et pandora facteur de transcription bHLH micro-ventriculesanta ? cardiomégaliejekyll ? absence de la valve auriculo-ventriculairecasanova protéine Sox cardia bifidagridlock hey2 coarctation de l'aortebubble head ? hémorragie cérébraleleaky heart ? hémorragie péricardique

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