Compte rendu du stage de Tp de Microbiologie
Anne 2002-2003
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Prparation des milieux et du matriel
Ltude des bactries a connu son plein dveloppement partir du
moment o furent mises au point des mthodes permettant de les
cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces diffrentes
oprations ncessitent lemploi de milieux de culture. Principales
caractristiques dun milieu de culture Les microorganismes doivent
trouver dans le milieu de culture et son atmosphre tous les lments
chimiques les constituant, sous une forme approprie. Un bon milieu
doit : Etre strile Etre nutritif : doit contenir quantitativement
et qualitativement les aliments exigs pour la croissance et
lentretien des microorganismes. Contenir une quantit deau
suffisante pour permettre le mtabolisme bactrien. Avoir un pH
convenable. Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est
ncessaire aux microorganismes est dit milieu minimum.
Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont
classs en fonction de leur composition ou de leur utilisation. a)
Classification selon la composition. 1. Milieux naturels ou
empiriques Milieux complexes de composition mal dfinie. Leur
origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit vgtale
(pomme de terre, levure). 2. Milieux synthtiques Milieux composs de
substances chimiques exactement dfinies 3. Milieux semi synthtiques
Milieux synthtiques additionns dun produit naturel b)
Classification selon lutilisation 1. Milieu usuels = milieu de base
Milieu dun emploi aussi gnral que possible. Il nexiste cependant
pas de milieu de culture universel 2. Milieu disolement Les milieux
disolement peuvent tre : Des milieux de base Des milieux enrichis
de produits biologiques Des milieux lectifs : Ce sont des milieux
de culture permettant un dveloppement particulirement abondant de
certains germes. Des milieux slectifs (ou denrichissement) : Ce
sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique.
Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le dveloppement de la
plupart des bactries except celui de lespce recherche. Ces milieux
permettent donc disoler une espce bactrienne au milieu dun mlange
de germes. 3. Milieu didentification Ces milieux permettent la mise
en vidence des caractres biochimiques et donc de rsoudre les
problmes didentification diffrentielle qui se posent entre des
espces ou des genres voisins.
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c) Classification selon leur prsentation 1. Milieux liquides Ce
sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carns ou
protiques, soit des solutions riches en produits synthtiques. Dans
les deux cas la glose est totalement absente. La croissance
microbienne est ralise dans des tubes, des ballons ou des
erlenmeyers. Elle est suivie par turbidimtrie : un milieu limpide
au dpart devient de plus en plus trouble lorsquun microorganisme se
dveloppe. 2. Milieux solides Les milieux nutritifs solides peuvent
tre identiques aux prcdents mais ils contiennent de la glose. Si il
y a plus de 1% dagar on parle de milieu solide, si il y a moins de
1% dagar on parle de milieu semi solide. Ces milieux peuvent tre
rpartis en botes de ptri, dans des tubes glose molle prise en
culot, etc. La croissance microbienne se droule en surface ou en
profondeur et est suivie par observation de laugmentation de la
taille des colonies respectivement arobies et anarobies. Une
cellule initiale se multiplie et donne une descendance de plusieurs
millions dindividus tous identiques, formant une colonie.
Prparation des milieux de culture Sachant que de la prparation
des milieux de culture dpend les rsultats de lanalyse
microbiologique, un dfaut de fabrication, une strilisation mal
conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc apporter
un grand soin leur fabrication. Les milieux de culture existent
aujourdhui sous trois formes, soit, du plus coteux au plus
conomique : - Le prt lemploi - Le prt couler - En poudre Durant ce
Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du
fait de leur moindre cot, ce sont soit un mlange des constituants
de base, soit un des lments de base, dont le fabricant indique la
dose peser pour un volume final de milieu. Les diffrentes tapes de
la prparation de ces milieux consistaient en : - La pese - La
dissolution des ingrdients - La mesure du pH - La rpartition - La
strilisation des milieux (autoclave 121C pendant 20 min) Rq : Lagar
tant un compos insoluble froid, il sera incorpor aprs la
dissolution des ingrdients et la mesure du pH.
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Les milieux utiliss durant ce Tp, leur rle et leur prparation
Durant ce Tp nous avons utilis : Un milieu empirique sous forme
solide: Glose nutritive (GN) Un milieu empirique sous forme liquide
: Bouillon nutritif (BN) Deux milieux slectifs : Milieu losine et
bleu de mthylne (EMB), Milieu Malt agar (MA) De leau physiologique
Glose nutritive (GN): Relativement simplifie, sa formulation
apporte les lments nutritifs ncessaires la croissance dune grande
varit de germes non exigeants. Elle est utilise pour la culture et
la numration des microorganismes ne prsentant pas dexigences
particulires. Elle est constitue : - extrait de levure - bouillon
nutritif (nutrient broth) - glucose - agar Nous avons pes 20g de
BN, 3g dextrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placs
dans un erlen de 2L et auxquels nous avons ajout 1L deau dminralise
et plac sous agitation avec un barreau aimant afin de dissoudre les
diffrents constituants. Nous avons alors vrifi que le pH se situait
bien dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. Cest donc aprs la
dissolution des diffrents lments du milieu et ajustage du pH que
nous avons incorpor les 15g dagar. Nous avons alors bouch lencolure
de lerlen avec du coton card et plac une feuille daluminium autour
avant de striliser le milieu lautoclave 121c pendant 20 min.
Bouillon nutritif (BN) : Le bouillon nutritif contient exactement
les mmes constituants que la glose nutritive, except le fait quon
najoute pas dagar puisque cest un milieu liquide. Il est donc
constitu de : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient
broth) - glucose Sa prparation est identique celle de la glose
nutritive. Glose EMB (osine methylen bleu) : La glose EMB est
constitue dosine Y et de bleu de mthylne qui sont des agents
faiblement slectifs. Ils ninhibent que partiellement le
dveloppement des microorganismes gram positifs tels que les
Streptocoques fcaux. De plus ces colorants assurent la
diffrenciation entre les germes lactose positifs et les germes
lactose ngatifs, lorsque le milieu est lactos. Nous avons pes
18.75g afin de prparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons
ajout 500 mL deau dminralise. On a alors ajust le pH 6.8-7 laide de
KOH concentr et strilis 121c pendant 20 min suivant le mme
protocole que prcdemment.
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Glose Malt agar : Elle est constitue : - extrait de malt -
extrait de levure - glucose - agar Nous avions notre disposition
sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous
les constituants sauf lextrait de levure et le glucose. Le
fabricant indiquait quil fallait peser 45g pour prparer un litre.
Nous voulions prparer 500 mL, nous pesions par consquent 22.5g sur
une feuille daluminium. Nous avons galement pes 1.25g dextrait de
levure et 5g de glucose. Aprs avoir pes tous les constituants nous
les avons transfrs dans un erlen dun litre et ajout 500 mL deau
dminralise. Nous avons ensuite rajout 0.25g de Cloramphnicol avant
de striliser 121C pendant 20 min. La slection des levures se ralise
par lemploi du chloramphnicol Leau physiologique : Elle est obtenue
par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre deau
distille. Elle constitue un milieu isotonique qui permettra la
dissolution des microorganismes tout en maintenant la diffrence de
pression osmotique de part et dautre de la membrane plasmique
vitant ainsi la lyse.
Aprs strilisation nous avons procd ltape de rpartition des
milieux. Nous avons coul les gloses de faon strile proximit de la
flamme du bec Bunzen.
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Familiarisation avec le monde microbienLes Techniques de
prparations microscopiquesLobservation microscopique des
microorganismes peut se faire sans coloration ou aprs coloration.
Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprcie
ainsi la mobilit, la taille, la forme des germes ; dans un second
cas, on prcise la forme et on dtaille les structures invisibles,
par coloration, aprs fixation et desschage des prparations,
oprations tuant les germes. Observation sans coloration : Etat
frais Lobservation de ltat frais se ralise lobjectif x40, le conden
seur descendu, et le diaphragme lgrement ferm. On observe ainsi sur
un fond gristre des bactries brillantes. On met profit la proprit
de rfringence des microorganismes pour les observer vivants. 1)
Technique opratoire La technique opratoire consiste prparer une
lame propre dgraisse et sche. Homogniser la suspension observer :
prlever aseptiquement la Pipette Pasteur une goutte de culture :
dposer cette goutte au centre de la lame. Rq : Si on part dun
produit solide comme une colonie sur une boite de ptri par exemple,
on dposera dabord une goutte deau au centre de la lame et on y
suspendra une faible quantit de la colonie laide de lose. On
recouvrira ensuite la goutte dune lamelle tout en vitant les bulles
dair et les dbordements de liquide au-del de la zone dlimite par la
lamelle. On observera sur fond clair avec lobjectif 40.
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2) Interprtation Cette prparation permet dapprcier : Le nombre
de bactries contenues dans le prlvement ; notion semi quantitative
permettant de dire sil y a beaucoup ou peu de germes (renseignement
utile ultrieurement pour choisir la quantit dinoculum convenable
pour lobservation dun bon isolement et dune bonne culture). La
forme des bactries
Coques ou cocci : lments arrondis, sphriques.
Bacilles : btonnets : lments allongs de taille variable.
Bacilles de taille moyenne
Bacilles grles
Gros bacilles trapus
Bacilles courts et arrondis : coccobacilles
Le mode dassemblage de bactries Isols Groups par deux :
diplocoques En grappe ( Staphylocoques) En chanettes (
Streptocoques) En longue chanes Isols En courtes chanettes En
chanes En palissades
Coques
Bacilles
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La mobilit Les cellules peuvent tre mobiles : la prsence de cils
( non visibles ltat frais) favorise le dplacement qui ne doit pas
tre confondu avec le mouvement gnral du liquide ou avec le
mouvement brownien si la temprature du liquide est trop leve (du
fait de lclairage continu). Un corps microbien est mobile lorsquun
individu observ traverse le champ du microscope ou lorsque deux
individus se croisent.
Il ne faut pas oublier que dans un chantillon, il y a le plus
souvent plusieurs types de bactries, ltat frais permet de savoir
combien de types diffrents sont prsents. Dans dautres cas, cette
observation permet de vrifier la puret dune culture. Il ne faut
jamais oublier que les bactries sont vivantes. Lobservation de ltat
frais est une tape indispensable et trs importante, qui apporte de
nombreux renseignements et oriente dj le diagnostic et permet de
passer ltape suivante : lobservation de prparations colores.
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Observation aprs coloration Les observations aprs coloration se
font lobjectif 100 limmersion, le condenseur relev fond, et le
diaphragme ouvert entirement. Avant tout examen dun frottis color,
il faut dans un premier temps raliser le frottis. 1) Prparation dun
frottis On dpose une goutte de culture microbienne ou on suspend
une colonie dans une goutte deau au centre dune lame. On tale la
prparation avec loese de faon obtenir une couche mince On sche la
lame. On fixe la prparation en crasant la flamme du bec 2 3 fois
avec la lame. 2) Colorations Les colorants simples que lon emploie
sont des colorants acides qui colorent uniformment les cellules, et
des colorants basiques affinit pour le cytoplasme (fushine, violet
de gentiane) Durant ce Tp nous avons ralis : Un examen aprs
coloration diffrentielle dun frottis, cest la coloration de Gram.
2.1) Coloration de Gram Cest la coloration la plus utilise en
microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de
microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est base sur la
diffrence de structure des parois mise en vidence par la double
coloration. La lecture se fait avec lobjectif immersion. La
coloration de Gram permet de classer les bactries en deux grandes
catgories : - Les bactries Gram positif qui gardent la coloration
violette aprs action de lalcool - Les bactries Gram ngatif qui sont
dcolores par lalcool et teintes en rose plus ou moins vif par la
fushine. Cette distinction, base de toute la taxonomie bactrienne
repose sur une variation dans la structure de la paroi des
bactries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactries
Gram ngatif permet lalcool de traverser cette paroi et de dissoudre
le compos color, fix dans le cytoplasme, rsultat de laction co
njointe du violet de gentiane et du lugol. Par contre, la paroi des
Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est
impermable lalcool et par consquent garde le complexe color
violet.
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2.2) La coloration des spores La coloration de spore permet de
mettre en vidence les spores ou endospores, qui constituent les
formes de rsistances de deux classes de bactrie : - Les Bacillus
(arobie) - Les Clostridie (anarobie) La spore est rsistante la
chaleur, la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en
vidence il faut raliser une coloration chaud faisant intervenir du
vert de Malachite, rincer lalcool, et faire une contre coloration
la safranine.
Endospore
Les spores seront colores en vert et le cytoplasme des bactries
en rose.
2.3) Coloration la nigrosine : La nigrosine est un colorant qui
peut permettre la mise en vidence des cicatrices des
bourgeonnements des levures. Sinon on lutilise lors dtat frais pour
augmenter le contraste de la prparation. 2.4) Coloration lencre de
chine : Lencre de chine est obtenue partir dune suspension de
particules de charbon. Du fait de la taille leve des particules,
celles -ci ne pntrent pas dans la cellule. On observe donc des
cellules non colores sur un fond noir. Cette technique est une
coloration ngative, puisquon ne colore pas les cellules, ainsi on
peut mettre en vidence la prsence de capsules qui apparaissent
blanchtre autour de la cellule qui elle est rfringente. La
technique consiste placer sur une lamelle une goutte de la
prparation et une goutte de colorant cte cte.
Et de dposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mlangeront,
et on observera au grossissement x40.
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Observation dun mou de raisinsLe mou de raisin est un mlange en
solution aqueuse de raisins crass. Afin dobserver les diffrentes
catgories de germes prsents, nous avons raliser des techniques
microscopiques dobservation.
Technique s dobservation
Etat Frais (G x40)
Nigrosine (G x 40)
Coloration de spore (G x100) On observe des bactries roses en
forme de btonnet ne prsentant pas de spores, et des levures
roses.
Coloration lencre de chine (G x 40) On observe des bactries et
des levures. Les bactries ne possdent pas dhalo blanc caractrisant
la prsence de capsule.
Observations
On observe des bactries en forme de btonnet qui ne possdent pas
de mobilit. observe galement des levures On
On peut donc constater que le raisin possde plusieurs flores
microbiennes : une dorigine bactrienne et lautre de type levure.
Ces deux flores sont ncessaires la fabrication du vin.
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Observation dun jus de radisTechnique s dobservation Etat Frais
(G x40) Nigrosine (G x 40) Coloration de spore (G x100) Coloration
lencre de chine (G x 40) On observe quelques capsules.
Observations
On observe des protozoaires. On observe des arthrospores.
observe galement du On pseudomyclium.
Slection des bactries formants des endospores dans la suspension
de radis Les spores sont des formes de rsistances, afin de les
mettre en vidence nous allons mettre dans des conditions de stress
un aliquote de notre solution de jus de radis 90C pendant 20 min.
Cette tape pour but de tuer toutes les formes vgtatives, et de
slectionner uniquement les formes sporulantes. Par talement sur un
milieu GN de notre aliquote chauff et aprs incubation, on a obtenu
des colonies correspondantes aux bactries sporules. Nous avons
ainsi confirm la prsence de spores et isol les bactries
sporulantes.
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Etude de 6 souches de collectionNom de la souche Aspect
macroscopique Colonie blanche bord crnel de 0.5 cm de diamtre
Colonie blanche-jaune, ronde, lisse, brillante, diamtre 1mm
Coloration de spores Exospores verte et spores dformantes
subterminales Coloratio n lencre de chine
Coloration la nigrosine Btonnet bouts carrs 1.5*4 Mobilit + ou
par ciliature pritriche isol
Etat frais Btonnet bouts carrs 1.5*4 Mobilit + ou par ciliature
pritriche isol
Gram
oxydase
catalase
Mobilit
Bacillu s megaterium
Bacille violet gram + Coque gram + violet, isol, par 2, en amas,
ou en ttrade Bacille a gram variable Bacille rose Gram Isol ou par
2
-
-
+
+/-
Micrococcus flavus
Petit coque, immobile
Petit coque, immobile
-
-
+
-
Waksmania sp Petite colonie ronde, bombe pigmente en rose
Colonie lisse, 1.5 mm de diamtre, rondes, bombes, bord rguliers,
luisantes, jauntres Grande colonie plates de 2 3 mm de diamtre,
transparente, bords frangs, aspect iris, nacr
Bacille 1*5 Isol Courte chanette Btonnet ovode, group par 2 ou
isol Taille : 1-3
Bacille 1*5 Isol Courte chanette Btonnet ovode, group par 2 ou
isol Taille : 1-3
-
-
-
-
Serratia marcescens
-
-
+++
Escherichia coli
Petit btonnet ovode de forme coccobacille Isol, par 2 Taille :
1
Petit btonnet ovode de forme coccobacille Isol, par 2 Taille :
1
Coccobacille rose gramIsol, par 2
-
-
-
Pseudomonas aeruginosa
Petit btonnet Isol, par 2 Taille : 5
Petit btonnet Isol, par 2 Taille : 5
Bacille rose Gram Isol, par 2
-
+
++
+
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Ralisation dune courbe de croissanceLa croissance est dfinie
comme laccroissement ordonn de tous les composants dun organisme.
Chez les micro-organismes unicellulaires comme les bactries ou les
levures, elle aboutit une augmentation du nombre dindividus
rsultant dune division cellulaire. Cet accroissement est donc
synonyme de multiplication, puisque au bout dun temps correspondant
au temps de gnration, une bactrie peut donner naissance deux
nouvelles bactries. Paralllement, cette croissance se traduit par
un appauvrissement en divers mtabolites, et par laccumulation de
dchets entranant la mort des cellules. Afin dtudier la croissance,
nous avons valu le nombre de cellules en mesurant le trouble. Cest
le procd le plus simple et le plus rapide. Cest une mthode optique
gnrale, appele turbidimtrie, fonde sur la proprit que prsente
toutes les solutions dabsorber une partie de lintensit dun faisceau
de lumire qui la traverse. Cette proprit est base sur la loi de
Beer Lambert ou log (I0/I) = Il en dcoule que labsorbance est
proportionnelle la concentration. .l.c. Cependant cette loi nest
plus valable aux fortes concentrations, cest pour cela que nous
avons dilu nos chantillons lorsque la DO dpassait les 0.8.
Linconvnient de cette technique cest quelle est incapable de
diffrencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer
des 6 concentrations microbiennes infrieurs 10 bactries/mL. Cest
pour cela que nous avons ralis une prculture en milieu BN 24h
auparavant. Celle-ci avait pour but dobtenir une culture jeune avec
un fort inoculum, et aussi dhabituer la souche au milieu de
culture, permettant ainsi de diminuer la phase de latence qui
correspond au temps dadaptation de la bactrie. Nous avons ralis des
courbes de croissance sur deux souches diffrentes : Un coque gram +
: Micrococcus flavus Un bacille gram - : Escherichia coli Les
courbes ont t obtenues en traant lvolution de la densit optique en
fonction du temps, toutes les 30 minutes environ. La croissance est
constitue de diffrentes phases, dont la phase exponentielle de
croissance. Durant cette phase labsorbance, donc le nombre de
cellules, augmente de faon exponentielle et ln (nb cellules) est
proportionnel au temps. Cette phase permet de dterminer deux
paramtres : - Le temps de gnration - Le taux de croissance nprien
Cest ces paramtres que nous allons calculer ; ce sont des caractres
propres chaque espce. Nous allons utiliser du papier semi-log ce
qui permettra de reporter directement les valeurs de DO, tout en
linarisant la phase exponentielle de croissance.
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Explication des diffrentes phases de la croissance On a remarqu
que si on reprsente la fonction ln N = f (t), on obtient une zone
linaire pendant la phase o N augmente (phase exponentielle de
croissance).
Phase
Description Elle est facultative. Quand elle existe, elle
correspond une phase d'adaptation des bactries au milieu. Les
bactries ne se divisent pas (ou trop peu pour mesurer la
variation). Elle est absente quand l'inoculum est jeune et que le
milieu est le mme que le prcdent. Cette phase correspond au temps
ncessaire aux bactries pour synthtiser les enzymes ncessaires pour
dgrader le milieu et pour ajuster certains paramtres comme le
pH.
Valeur de x (vitesse spcifique de croissance) en h-1 x = 0 (ln N
= ln N o)
Phase de latence
Phase Les bactries se multiplient de plus en plus activement
d'acclration Les bactries se multiplient leur rythme le plus lev.
Le ln de N est Phase directement proportionnel eu temps. C'est la
phase physiologique (production exponentielle d'antibiotiques et de
toxines. La reprsentation est une droite d'quation : de croissance
Phase de Lorsque les nutriments se rarfient, la croissance
ralentit, le phnomne ralentissement s'accentue plus les nutrime nts
se rarfient. La biomasse est stable. Deux explications sont
envisageables : - Les bactries ne se divisent plus ; Phase - Il y a
autant de bactries qui se divisent que de bactries qui meurent.
stationnaire Elle peut tre due la disparition d'un ou plusieurs
nutriments, l'acidification du milieu et, ou surtout l'accumulation
de dchets toxiques. Phase de Les bactries ne se divisent plus,
certaines meurent et sont lyses. Leur nombre dclin N diminue.
x (G )
x = max
x et tend vers 0
x = 0
x < 0
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Temps de gnration : Le temps de gnration (en min) est le temps
de doublement de la population bactrienne, c'est l'intervalle de
temps compris entre 2 divisions bactriennes en phase
exponentielle..
Taux de croissance :
1) Escherichia coli : 1.1) Prculture :
Un jour avant de raliser notre courbe de croissance, nous avons
ensemenc 2 mL de bouillon BN laide dun clone de la bactrie. Nous
avons mis le tube incuber sous agitation au bain marie pendant la
nuit 30C. 1.2) Exprience :
Dans un premier temps nous avons talonn le spectrophotomtre.
Nous avons donc transfr dans une cuve 1mL du milieu BN restant
contenu dans notre flacon, et nous avons talonn le
spectrophotomtre. Ensemencement Pralablement nous avons mesurer la
Do 600 nm afin davoir une estimation de la concentration de
linoculum. On veut obtenir une absorbance infrieure 0.1 dans notre
Bouillon nutritif de 100 mL au temps t=0 initial. Pralablement jai
dilu la culture au 1/20me (50 dans un volume final de 1000L), ce
qui a donn L une DO de 0.395 pour 1mL soit une DO de 7.9 pour
lchantillon non dilu. 1 ml de la culture dans les 100 mL de
bouillon nutritif donnerait donc une Do de 0.08. On a donc inocul
les 100 ml de milieu BN laide de 1mL de la prculture. On a laiss la
pipette cotonne qui nous a servi linoculation dans lerlen en la
callant avec le coton card. On agite la solution pour lhomogniser
et on prlve 1 mL pour raliser la mesure de labsorbance au temps
t=0. On replace alors lerlen sous agitation au bain marie 30C, cest
le temps zro de lexprience. Mesure de la croissance : Toutes les 30
minutes, on prlve 1 mL de la culture en cours afin de suivre
lvolution de labsorbance et tracer la courbe de croissance. Rq : On
a toujours utilis la mme cuve pour faire les mesures quon a rinc
entre temps leau.
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Rsultats :
Temps 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Dilution Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune
Aucune
DO avec Dilution 0,122 0,125 0,163 0,213 0,28 0,364 0,516 0,798
0.5 0.595 0.715
DO 0,122 0,125 0,163 0,213 0,28 0,364 0,516 0,798 1 1,19
1,43
On a dilu partir du temps t=240 min, car le spectrophotomtre ne
donne plus de rponse linaire au-del dune absorbance de 0.8, ainsi
que la loi de Beer Lambert qui nest plus valable. 2) Calcul des
diffrents paramtres de la croissance Nom de la souche Temps de
gnration (min) 75 Taux de croissance (min-1) 0.009min-1 0.54
h-1
Escherichia coli
On a pu constater sur le graphique une augmentation de
labsorbance au temps t= 3h et ensuite une diminution au temps t=
3h30. Ce changement correspond une lvation de temprature et un
retour la temprature initiale, on est pass de 28C 30C puis on est
retourn 28C. De ce fait on a pu voir que le temps de gnration nest
une constante pour un germe donn que dans des conditions donnes. Le
temps de gnration est diffrent pour chaque microorganisme. On peut
sen servir pour obtenir un nombre de cellules un temps donn.
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Etude microbiologique de produitsLtude microbiologique dun
produit pour but de mettre en vidence et de dnombrer les
microorganismes prsents, comme les bactries, les levures, ou les
moisissures par lutilisation de milieux slectifs adquats. Par la
suite, ltude des caractres biochimiques permettra ventuellement de
caractriser ces microorganismes. Les microorganismes contenus
lintrieur du produit analyser doivent tre extraits puis ensemencs
en milieu solide ou liquide. Le choix des milieux et des conditions
de culture (temprature) est important et lutilisation de plusieurs
milieux slectifs permettra disoler lensemble de la flore
microbienne. On utilisera donc pour la recherche des bactries, le
milieu GN. La recherche des entrobactries se fera sur milieu
slectif au pH neutre : EMB La recherche des levures et moisissures
se fera sur milieu complexe slectif au pH acide :
Ma+chloramphnicol. Lextraction des microorganismes du produit
analyser devra tre adapte au type de produit analyser. Pour un
produit solide comme la terre, un broyat en prsence dun solvant
facilitant la dispersion des cellules (eau physiologique) a t
ralis. Pour le lait, milieu liquide, aucun traitement particulier
na t ncessaire.
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1 Analyse microbiologique et dnombrement dun chantillon de
sol
Extraction et analyse microbiologique dun chantillon de sol1)
Prlvement Afin de dterminer la flore prsente dans le sol, nous
allons prlever de faon le plus strilement possible, un chantillon
de terre afin de limiter lapport dautres contaminants. On veillera
prlever une masse suprieure 10g. Puisque par la suite nous aurons
besoin de deux fois 5g de terre, une pour dterminer le poids sec,
lautre pour dterminer la flore prsente. 2) Extraction A partir de
cet chantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre. Le contenu
de la premire pese sera plac dans un bcher et plac au four pasteur
pendant 6h 180C afin de dterminer le poids sec. Le contenu de la
deuxime pese est plac dans un mortier en prsence de 30 mL de
solution dextraction (eau physiologique). Leau physiologique
constitue un milieu isotonique qui empche la lyse des cellules, en
maintenant une pression constante de part et dautre de la cellule.
On broie alors laide dun pilon le produit, puis on transvase dans
un tube gradu de 50mL. Lensemble de ltape dextraction se ralise
dans des conditions striles autour du bec bunsen avec du matriel
strile. Le pilon et le mortier sont rincs avec la solution
dextraction afin de rcuprer toute la terre prsente. Puis le tube
est complt 50 mL avec la solution dextraction. Nous tant tromp
notre volume final tait de 53 mL .Lchantillon est homognis au
vortex puis on laisse reposer pendant 15 min. 3) Calcul du poids
sec Aprs avoir mis dans un bcher un poids connu et prcis de terre.
On place celui ci au four pasteur pendant un temps minimum de 6h.
Ainsi on saffranchira du taux dhydratation de la terre qui varie en
fonction des conditions atmosphriques et du lieu de prlvement. Ceci
est ncessaire pour comparer des chantillons prlevs des lieux
diffrents, puisquon ne prend plus en compte que la masse de la
terre sche. Masse du bcher 46.73g Masse terre humide = 4.97g Masse
du bcher + terre humide 51.70g Masse bcher + terre sche 47.99 Masse
terre sche = 51.7-47.99=3.71g On dispose donc de 3.71g de terre
sche. Il y avait donc ((4.97-3.71)/4.97)x100=25% dhumidit dans la
terre. Pour la suite des calculs on considrera que la masse de
terre humide tait de 5g. 4) Dilutions -1 -9 Les microorganismes en
suspension sont dilus en cascade de 10 10 . Le transfert de 1mL de
la er suspension prpare prcdemment dans le 1 tube contenant 9 mL de
solution de dilution -1 constitue la dilution 10 . On homognisera
laide dun vortex et on procdera de la mme -1 manire, en prlevant 1
mL dans le tube 10 pour le transfrer dans le tube 2, on homognise,
et ainsi de suite.
19
5) Ensemencement A partir des dilutions, les microorganismes
dilus sont tals sur botes de milieu nutritifs et inoculs en milieu
nutritif liquide. 6) Dnombrement Afin de dterminer le nombre de
microorganismes contenus dans notre chantillon de terre, nous
allons utiliser deux techniques de dnombrement : Une technique de
comptage sur boite Une technique statistique : le test de Mac Grady
faisant intervenir un paramtre : le MPN (most popular number) ou
NPP (nombre le plus probable) 6.1) Comptage sur boite Afin de
dnombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considrer
que chaque colonie ou clone visible correspond un microorganisme
dpos sur la bote lors de ltalement. Vue que certains
microorganismes peuvent tre pluricellulaire, on ne peut considrer
que chaque clone provient dune seule cellule originelle. On utilise
donc le terme dUFC (unit formant colonie) pour rapporter le rsultat
obtenu On ralisera donc des talements en surface de 0.1mL des
diffrentes dilutions prcdemment prpares, en inoculant 3 botes par
dilution. Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur
une bote ntant pas statistiquement fiable, seules les botes
contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes. Le
milieu MA va servir la multiplication des champignons Le milieu GN
va servir une multiplication non slective des bactries Le milieu
EMB va servir la prslection de notre souche isole dentrobactrie
Milieu MA Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-3 0 1 3 1.33
10-4 0 0 0 10-5 0 0 0
Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un
nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le
calcul la dilution 10 -3 qui donne un nombre de 1.33 colonies.
Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu,
il a donc par consquent : N = 1.33 x 10 3 x 10 = 1.33 x 104 UFC/mL
dans le sol. Ces germes correspondraient aux levures. Milieu GN
Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne-5
10-5 1 1 0 0.75
10-6 0 0 0
10-7 0 0 0
10-8 0 0 0
10-9 0 0 0
La dilution 10 donne un nombre de 0.75 UFC. Sachant que nous
avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par
consquent : N = 0.75 x 10 5 x 10 = 7.5 x 105 bactries/mL dans le
sol. Il y aurait donc 7.5 x 105 bactries, toutes flores confondues,
dans un mL de suspension de terre.
20
Milieu EMB Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-2 84 111 105
100 10-3 6 13 10 10 10-4 0 0 1
Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un
nombre comptable entre 30 et -2 300 colonies. La dilution 10 donne
un nombre de 100 UFC. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque
dilution sur le milieu, il a donc par consquent : 2 5 N = 100 x 10
x 10 = 1 x 10 bactries/mL dans le sol. Ces germes correspondraient
aux Entrobactries. 6.2) Test de Mac Grady (NPP: technique du nombre
le plus probable) Une utilisation de lanalyse statistique peut tre
faite pour obtenir des rsultats plus prcis en milieu liquide. Cette
technique utilise trois essais par dilution. Cest la mthode du
nombre le plus probable (NPP), drive des tudes de Mac Grady, qui
consiste interprter les rsultats en comparant les trois essais et
leurs rsultats. Il sagit dune interprtation probabiliste. Aprs
incubation des tubes, on notera pour chaque essai si le rsultat est
positif ou ngatif. Et, chaque dilution, on affectera un chiffre gal
au nombre de tubes positifs. On groupe ensuite en nombre de 3
chiffres la suite de chiffres obtenue, en commenant par le chiffre
obtenu pour la plus faible dilution. Dilution Tube 1 Tube 2 Tube 3
Nb de tube + 10-4 + + + 3 10-5 + + 2 10-6 + 1 10-7 0 10-8 0 10-9
0
Ici nous obtenons les nombres : 321 210 100 On choisi le nombre
le plus grand possible et si possible infrieur 330 (car cela
correspond une meilleure rpartition dans les dilutions). Pour
lchantillon de sol le nombre significatif est 321 pour la dilution
10 -4. On lit la valeur correspondante n dans la table, on obtient
un NPP de 15 La concentration de bactrie dans notre chantillon de
sol est: Nb bactrie = (n/10 )= 1.5 x 10 bactries/mL de la dilution
10On dpart on avait 53 mL dans lesquels on prlev 0.5 mL, ce qui
correspond : 5 7 (1.5 x 10 x 53)/0.5 = 1.59 10 bactries/ml Dans nos
53ml de dpart, il y avait 5g de terre humide soit 3.71g de terre
sche. Le nombre de bactrie par gramme de terre sche est : 7 6 1.59
10 / 3.71 = 4.28 10 bactries / gramme de terre sche. 6 Notre
chantillon de sol une concentration en bactrie de 4.28 10 bactries/
gramme de terre sche.-4 5 4
21
2 Analyse microbiologique et dnombrement dun chantillon de lait
cru1) Dilutions Nous avons prpar une gamme de dilution en NaCl 0.9%
de 10 -1 10-4. Pour cela nous avons plac au pralable 4.5 mL de NaCl
dans chaque tube. Nous avons homogniser lchantillon de lait cru,
prlever 0.5 mL et dilu dans le tube 1 (10 -1). Nous avons bien
homognis entre chaque prlvement, et transvaser 0.5 mL du tube 1
vers le tube 2. Nous avons rpt cette opration jusquau tube 4 (10-4)
en ralisant une dilution en cascade de 10 en 10. 2)
Enrichissement/slection A partir des dilutions 10 10 , nous allons
procder ltape denrichissement slection grce lutilisation de milieux
slectifs. Pour cela nous allons inoculer 0.1 mL sur les milieux GN
MA EMB, en utilisant trois botes par dilution. 3) Comptage sur
boite Afin de dnombrer des microorganismes sur milieu solide, il
faut considrer que chaque colonie ou clone visible correspond un
microorganisme dpos sur la bote lors de ltalement. Vue que certains
microorganismes peuvent tre pluricellulaire, on ne peut considrer
que chaque clone provient dune seule cellule originelle. On utilise
donc le terme dUFC (unit formant colonie) pour rapporter le rsultat
obtenu Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une
bote ntant pas statistiquement fiable, seules les botes contenant
entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes 4) Rsultats
Milieu MA (Slection des champignons) Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3
Moyenne 10-2 164 180 198 181 10-3 20 8 11 13 10-4 0 0 12 4-2 -4
Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un
nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le
calcul la dilution 10 -2 qui donne un nombre de 181 colonies.
Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu,
il a donc par consquent : 2 4 N = 181 x 10 x 10 = 1.81 x 10 UFC/mL
dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux levures.
22
Milieu GN (dveloppement non slectif de la totalit de la flore)
Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-2 inc inc inc inc 10-3 inc
inc inc inc 10-4 276 262 300 280
La dilution 10 donne un nombre de 280 UFC. Sachant que nous
avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par
consquent : 4 7 N = 280 x 10 x 10 = 2.8 x 10 bactries/mL dans le
lait cru. 7 Il y aurait donc 2.8 x 10 bactries, toutes flores
confondues, dans un mL de ce lait cru.
-4
Milieu EMB (dveloppement slectif du genre Entrobactrie) Dilution
Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne-3
10-2 inc inc inc inc
10-3 444 Pb Pb 444
10-4 Pb Pb Pb Pb
La dilution 10 donne un nombre de 444 UFC. Sachant que nous
avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par
consquent : 3 6 N = 444 x 10 x 10 = 4.44 x 10 bactries/mL dans le
lait cru. Ces germes correspondraient aux Entrobactries.
23
Identification dun bacille gram oxydase Rf : lait 2Origine :
lait Isolement partir de EMB Vrification du genre Enterobacteriacea
a) Ngrosine La coloration la nigrosine a pu mettre en vidence la
forme bacillaire de la bactrie. b) Coloration de Gram On a observ
des bacilles roses gram -. c) Encre de Chine La coloration lencre
de chine na pas rvl la prsence de capsule. d) Oxydase La bactrie ne
possde pas loxydase. Tous ces tests confirment bien la prsence dune
Entrobactrie Vrification du type fermentaire : Hugh et Leifson Les
entrobactries dgradent les oses, en particulier le glucose, par
voie fermentaire en produisant des acides organiques. Pour mettre
en vidence la fermentation dun sucre, il suffit donc de rechercher
la variation de pH du milieu grce un indicateur color. Grce au
milieu Hugh Leifson, nous allons tudier la voie dattaque du
glucose. Ce milieu, faiblement pepton, contient du glucose la
concentration de 1% et du bleu de bromothymol comme indicateur de
pH. Il est prsent en culot, du fait de sa consistance molle. Aprs
rgnration (limination de lO2 dissous par passage au bain marie) et
refroidissement, on a ensemenc par piqre centrale 2 tubes en
parallle : - un tube est recouvert dhuile minrale, il est dit ferm
:F - lautre est laiss au contact de lair : il est dit ouvert :O Les
rsultats obtenus permettent de distinguer plusieurs catgories de
bactries. Bactries acidifiant le milieu : - acidification dans les
deux tubes : bactries fermentatives. - acidification en surface
dans le tube ouvert : bactries oxydatives. Bactries ne modifiant
pas le pH du milieu : bactries inactives.
F
O
F
O
F
O
Culture et virage au jaune en O et F
Culture et virage au jaune en surface dans O seul
Peu ou pas de culture en F , culture en O mais pas de virage
24
Dtermination de la sensibilit de la bactrie aux
antibiotiques
1) Dfinition Antibiotique : Cest une substance chimique produite
par un microorganisme qui est capable dinhiber la croissance
(bactriostase) ou de tuer (bactricide) certaines bactries. De
nombreux antibiotiques sont susceptibles dtre obtenus par synthse,
de ce fait, la discrimination entre antiseptique et antibiotique
repose essentiellement sur leur mode daction : Un antibiotique est
lectif, dirig uniquement contre les bactries, agit rapidement et
faible dose. Alors quun antiseptique est global, dtruisant la fois
les germes et les cellules vivantes. 2) Antibiotiques utiliss et
leurs cibles Les agents antimicrobiens peuvent tre classs en
familles daprs leur origine, leur spectre daction, leur mode
daction.
25
Durant ce Tp nous avons test trois antibiotiques : - Ttracycline
- Ampicilline - Pnicilline Ces trois antibiotiques ont des cibles
diffrentes : Antibiotiques inhibiteurs de la synthse protique :
Diffrentes classes d'antibiotiques agissent en interfrant avec la
synthse protique bactrienne, et ce, au niveau de l'une des trois
tapes principales de la traduction : - l'initiation - l'longation -
la terminaison Les ribosomes procaryotes prsentent un coefficient
de sdimentation de 70S (50S pour la sous-unit lourde et 30S pour la
sous-unit lgre). La sous-unit 50S comporte les ARN ribosomaux
(ARNr) 5S et 23S alors que la sous-unit 30S intgre l'ARNr 16S
(impliqu dans la reconnaissance de la squence de Shine-Delgarno de
l'ARN messager, aboutissant l'initiation de la traduction). Les
ttracyclines sont des antibiotiques isols de souches de
Streptomyces , et aujourd'hui obtenus par hmisynthse. Les
ttracyclines inhibent la synthse protique en empchant la liaison de
l'aminoacyl-ARNt la sous unit 30 S du ribosome bactrien. Ce sont
des composs bactriostatiques trs large spectre. Nanmoins, leur
usage est aujourd'hui limit par l'mergence de rsistances. Les
ttracyclines doivent leur nom leur structure ttracyclique commune
(noyau naphtacne-carboxamide), sur laquelle viennent se greffer des
substituants au niveau des positions indiques par un astrisque dans
la figure cidessous.
Ttracycline hydrochlorure (masse molculaire : 480,9)
26
Les -Lactamines : Les -lactamines sont des inhibiteurs de la
synthse de la paroi bactrienne. Ces composs n'agissent donc que sur
des bactries se multipliant activement. Durant ce Tp, nous avons
utilis deux lactamines : - La pnicilline - Lampicilline
La pnicilline appartient la famille des lactamines. Lorsque les
bactries gram+ ou gramsont en croissance et traites par des
pnicillines, la synthse de leur paroi est stoppe. On peut observer
que les cellules saccroissent mais que la paroi diminue
progressivement. La pression osmotique augmente lintrieur de la
cellule, qui finit par clater. Au niveau du peptidoglycane les
pnicillines empchent lincorporation des peptides dans les chanes
polysaccharidiques de la paroi. Il se forme alors un complexe non
fonctionnel [peptidasepnicilline]. La pnicilline empche la
construction de la paroi en bloquant deux enzymes : Transpeptidases
qui a pour rle de faire rentrer les ttrapeptides Carboxypeptidase,
qui dcroche la 2me D-Ala.
Lampicilline est aussi appele aminopnicilline. Elle appartient
galement la famille des lactamines comme la pnicilline, et possde
le mme mode daction. Elle arrte le processus de transpeptidation
qui lie les peptidoglycannes de la paroi bactrienne. Les bta
lactamines se lient et inactivent des cibles enzymatiques situes
sur la paroi interne de la membrane bactrienne: les protines de
liaison des pnicillines : transpeptidases, carboxypeptidases,
endopeptidases. Les bta lactamines inactivent galement des
inhibiteurs endognes des autolysines bactriennes.
27
3) Antibiogramme par la mthode des disques Lantibiogramme est
lexamen de pratique courante qui permet dtudier commodment sur une
souche bactrienne lactivit bactriostatique dantibiotique choisi en
fonction de leur spectre dactivit et dapprcier les rsistances
acquises. Principe : La culture bactrienne est ralise la surface
dune glose GN. Des disques primprgns dune dose connue dantibiotique
sont dposs la surface de la glose. Lantibiotique diffuse
horizontalement et verticalement partir du disque en crant un
gradient de concentration minima inhibitrice. Les caractres de
sensibilit ou de rsistance de la souche bactrienne en seront
dduits. La mesure du diamtre de la zone dinhibition de la bactrie
peut tre relie la concentration de lantibiotique ce niveau : cette
concentration est la concentration minima inhibitrice ou CMI de la
souche pour cet antibiotique. Technique de lantibiogramme : Les
diffrentes tapes de la ralisation de lantibiogramme sont
standardises ; Il y a lensemencement : on verse 0.2 mL la surface
du milieu quon rparti a laide dun rteau ou de billes de verre. On
laisse scher les botes Ensuite nous appliquons les disques : Les
disques ne doivent pas tre trop prs les uns des autres, et ils ne
doivent pas tre dplacs une fois poss. On veillera ne pas les
chauffer avec la pince flambe. Il faut en dernier lieu quil y ait
prdiffusion avant dincuber la bote : on laisse les botes temprature
ambiante, puis on les incubent 18h ltuve 37C. Lectures et
interprtation : Aux diamtres mesurs autour du disque, permettant
lestimation de la CMI, on peut associer les diamtres critiques
eux-mmes correspondant deux concentrations critiques, concentration
critique suprieure et concentration critique infrieure. La
comparaison de la CMI aux deux concentrations critiques permet de
dterminer le caractre sensible (S), intermdiaire (I) ou rsistant R
de la souche. La comparaison des diamtres permettra la mme opration
: - diamtre dinhibition (correspondant la CMI) > diamtre de la
concentration critique infrieure souche sensible S - diamtre
dinhibition < diamtre de la concentration critique suprieure :
souche rsistante - diamtre dinhibition compris entre les deux
diamtres des concentrations critiques : souche intermdiaire. mm
CMI mg/L
Concentration critique infrieure
Concentration critique suprieure
S
I
R
28
Rsultats :
Sigle de lATB TE AM P
Nom de lantibiotique Ttracycline Ampicilline Pnicilline
Diamtre dinhibition (mm) 20 Pas de halo Pas de halo
Interprtation Par rapport au diamtre > 19
Interprtation CMI CMI < 4mg/L
Rsultat S R R
Schma explicatif pour la ttracycline :
19 S I
17 mm
RCMI mg/L
4
8
29
4) Dtermination de la CMI, mthode en tubes 4.1) Dfinition de la
CMI La CMI est la concentration minimale inhibitrice. Cest, pour un
temps donn dapplication de lantibiotique, la concentration la plus
faible en antibiotique pour laquelle on nobserve aucune croissance
( x= 0). 4.2) Principe de la dtermination de la CMI Il consiste
placer dans un mme inoculum de la souche tudier (prsente en tubes),
des concentrations croissantes dantibiotiques selon une progression
dordre 2 et en prsence dun tmoin sans antibiotique. Les tubes sont
incubs 37 C pendant 24 H la concentration du premier tube ne
prsentant pas de culture correspond la CMI. 4.3) Schma montrant la
prparation de la galerie de dilution et lensemencement de dilution
et lensemencement de la gamme Afin de dterminer la CMI
(concentration minima inhibitrice), nous allons raliser une gamme
de dilution de lantibiotique. On va donc prparer 10 tubes tube 2 9
contenant 5 mL de milieu BN Tube 1 contenant 10 mL de milieu BN
Rien dans le tube 10
Dans le tube 1, nous allons rajouter de la ttracycline afin
davoir une concentration finale de 150 g/mL. Pour cela, on dispose
dune solution initiale 10 mg/ml. CiVi = CfVf Vi = (CfVf)/Vi Ci :
concentration initiale en ATB : 10 mg/mL Cf : concentration finale
en ATB 150 g/mL Vf : volume du tube : 10 mL Vi : volume de solution
mre prlever Vi = (150.10 x 10) / (10.10 )= 0.15 mL soit 150 L Il
faudra donc introduire 150 L de la solution mre dantibiotique dans
le tube 1 afin dobtenir une concentration de150 g/mL. Ensuite, il
sera ralis une dilution gomtrique de raison 2 de lantibiotique.
Nous prlverons aprs homognisation 5 mL du tube 1 que nous
transvaserons dans le tube 2. Cette tape sera rpte jusquau tube
10.-6 -3
30
Ce nest quaprs dilution de lantibiotique que nous allons
incorporer la bactrie. Tube [ATB] g/mL Rsultat 1 150 2 75 3 37.5 4
18.75 5 9.375 + 6 4.6875 + 7 2.34375 + 8 1.171875 + 9 0.5859375 +
10 0.5859375 +
Absence de culture : Prsence dune culture : + La prsence ou
labsence de culture se traduit par la prsence ou non dun trouble
due un dveloppement bactrien.
4.4) Lecture de la galerie (reprsentation, dtermination de la
CMI en g.mL )
-1
Tmoin
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
Le tube contenant 18.75 g/mL est le premier ne prsentant pas de
culture, pour notre souche la concentration minimale inhibitrice
est de 18.75 g/mL.
31
5) DETERMINATION DE LA CMB 5.1) Dfinition de la CMB La CMB est
la concentration minimale bactricide. Cest pour un temps donn la
plus faible concentration pour laquelle le nombre de bactries
survivante est infrieur 1/10 000 (ou 0,01%). 5.2) Schma de la
technique de dtermination de la CMB Afin de dterminer la CMB :
concentration minima bactricide, nous allons taler une goutte de
nos tubes 1 6 qui ont servi raliser le test de la CMI. Afin de
vrifier que lorsque il ny a plus de trouble, cela signifie quil ny
a plus de culture et donc quon atteint la CMB.
Incubation : 37 C, 24 h. 5.3) Lecture : schma de lobservation de
la glose
6 5 4 3 2 1
On observe une dcroissance du nombre de bactrie dun demi de 6 1,
correspondant aux dilutions de lantibiotique, mais en aucun cas il
y a inhibition de la croissance traduisant un effet bactricide de
la part de lantibiotique.
32
5.4) Rsultat de la CMB La concentration minimale CMB est
suprieure 150 UI.mL -1. 6) Conclusion des deux rsultats CMI et CMB
trouvs La CMI est trs infrieure la CMB (CMI
