4.8 Les marqueurs génétiques moléculaires (ou anonymes)

- La cartographie génétique jusqu'en 1980 : les gènes sont cartographiés en utilisant comme repères (marqueurs) d'autres gènes préalablement cartographiés ® efficace pour des espèces comme la drosophile, la levure, certaines plantes, … mais non applicable aux mammifères, et à l’homme en particulier.

48

- D. Botstein et al. (1980) : " n’importe quelle séquencepolymorphe d’ADN peut potentiellement servir demarqueur génétique " (= marqueur moléculaire) ® ungène peut donc être cartographié en utilisant commerepères ces marqueurs moléculaires.

-> développement d’un nouveau type de carte génétique, applicable à n'importe quelle espèce, y compris les mammifères et l’être humain !!

David Botstein

RFLP : restriction fragment length polymorphism (2 allèles / RFLP)

allèle 1

allèle 2

1,1 2,2 1,2 génotypes

GATTTCCTAAAG amorces PCR

1) PCR2) Restriction EcoRI3) électrophorèse

4.8.1 Exemples de marqueurs génétiques moléculaires

= GAATTC = site de coupure par l’enzyme de restriction EcoRI

49

SNP :

?

GAATTCCTTAAG

Test expérimental pour génotyper un individu pour ce RFLP :

SSLP : simple sequence length polymorphism

® microsatéllite (répétitions en tandem d’une séquence 2 à 4 pb) ® minisatéllite (répétitions en tandem d’une séquence de 5 à 25 pb)

(n allèles / SSLP qui diffèrent au niveau du nombre de répétitions en tandem)

allèle 1

allèle 2

allèle 31,3 2,2 génotypes

- PCR- électrophorèse

paire d’amorces PCR spécifiques

50

Un type particulier de SSLP (ex. microsatellite de type CA) se rencontre typiquement en de très nombreux exemplaires au sein des génomes des espèces complexes (ex. vertébrés). Et on peut assez aisément les identifier.

Exemple : SSLP à 3 allèles

51

rem. : le principe des empreintes génétiques (test ADN) > analyse simultanée de n SSLPs

Ex. aux USA > combined DNA index system (CODIS) : analyse de 13 SSLPs, plus un gène AML (-> amélogénine) pour renseigner le sexe. En Europe, système similaire (SGM+, second generation mix +) basé sur l’analyse de 10 SSLPs et du gène AML. La probabilité pour deux individus choisis au hasard d’avoir le même profil génétique est de 10-13. Applications : test de paternité, ADN sur scène de crime, ...

Pour le test PCR, on utilise des couples d’amorces marqués par un molécule fluorescente, les fragmentsd’ADN amplifiés sont donc fluorescents. Trois molécules fluorescentes différentes sont utilisées, cesystème de marquage facilite l’interprétation des résultats (attribution aux fragments obtenus desdifférents SSLPs). Une quatrième molécule fluorescente (rouge) est utilisée pour le marqueur de poidsmoléculaire (non illustré ici).

SGM+ : 10 SSLPs + AML

Electrophérogramme : tailles des bandes PCR (3 couleurs) après séparation sur gel

4.8.2 Comment établir une carte génétique ?

52

souris

rat

poisson zèbrea) Définition de deux lignées consanguines

suffisamment polymorphes

Méthode du inbreeding : croisement d’un couplesuivi de croisements successifs d’un mâle et d’unefemelle de chaque descendance (intercross F1 x F1,F2 x F2, …Fn x Fn). Au bout de n croisements, lesindividus sont homozygotes pour quasi tous les locigénétiques = la lignée consanguine

X X X

A1 B2 C1A2 B3 C1

A1 B1 C2A2 B1 C3

A2 B2 C3A2 B2 C3

F1 F2 Fn

X X X

A1 B1 C3A3 B3 C2

A3 B4 C1A2 B1 C4

A3 B1 C2A3 B1 C2

F1 F2 Fn

Lignée A

Lignée B

(par ex.)

(par ex.)

ex. carte de SSLPs chez la souris

ADN ADN

A B

SSLPpolymorphe (allèles A et B

différents)

SSLPnon polymorphe

(allèles A et B identiques)

Dans chaque puit, il n’y a qu'une seule bande car les

souris A et B sont homozygotes

b) Recherche de marqueurs génétiques polymorphes entre les lignées A et B

Ex. marqueurs SSLP:

Certains marqueurs SSLP présentent un polymorphisme entre les lignées A et B , d’autres pas. On recherchera et retiendra un maximum de marqueurs qui sont polymorphes.

53

PCR et électrophorèse (p. 50) illus-trés ici pour deux SSLP. Un seul des deux SSLP est polymorphe, on le désigne "marqueur n°1", à deux allèles (M1A et M1B). Le génotype de A est M1A et celui de B est M1B

M1A M1B

A B

A B

A B

on espère que pour chaque SSLP testé, A et B seront polymorphes (allèles différents)

54

c) Croisement entre deux individus A et B ® F1 hétérozygotes pour tous les marqueurs

d) Test cross (backcross) et génotypage de la descendance F2 :

X X

A B AF1F2

M1A

M1A

M2A

M2A

M3A

M3A

MxA

MxA

...

M1B

M1B

M2B

M2B

M3B

M3B

MxB

MxB

...

M1A

M1B

M2A

M2B

M3A

M3B

MxA

MxB

...

M1A

M1A

M2A

M2A

M3A

M3A

MxA

MxA

...

M1A

M1A ou B?

M2A

M2A ou B?

M3A

M3A ou B?

MxA

MxA ou B?

...

génotypage M1

génotypage M2

génotypage M3

génotypage Mx

55

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... yM1 A B B A B A A A B A B B A B ... AM2 B B A A A B A A B B A B B A ... BM3 A A B B B A B A A B A A B B ... A...

M137 B B A A A B A A A B A B B B ... B...

M398 A A B B B B B A A A A A A B ... A...

allèle transmis par le parent F1 hétérozygote

Analyse :

- pour chaque M, env. 50% des F2 a hérité l’allèle A et 50% l’allèle B du parent F1 (1ère loi)- M1, M2 et M3 ne sont pas liés (ségrégation indépendante, 2de loi)- M2 et M137 sont fortement liés génétiquement (et faible fréq. de recombinants)- M3 et M398 sont également liés, mais la distance qui les sépare est plus grande (plus de recombinants)

2A

2B

AB

137A

137B

Après analyse de tous les marqueurs dans un max. d’individus F2 : - inventaire de tous les marqueurs liés et estimation des distances génétiques à partir des PR- répartition des marqueurs sur n groupes de liaison (n = nombre de chromosomes)- carte idéale : haute densité et répartition homogène des marqueurs

x marqueurs

y souris F2

3A

3B

AB

398A

398B

F1 :

56

Carte de SSLPs de la souris

- 20 chromosomes- somme des d = ∼ 1630 cM- Taille : ∼ 2.5.109 pb

donc taux de recombi-naison moyen = ∼ 0,65 cM

/ Mpb chez la souris

57

Carte génétique du poisson zèbre (zebrafish)

- 25 chromosomes- somme des d = ∼ 2700 cM- Taille : ∼ 1.7.109 pb

taux de recombinaison = ∼ 1,60 cM / Mbp

-> permet la cartographie rapide d'un gène d’intérêt

dm

DM

AB

?A

?B

?A

?B

On va rechercher les marqueurs génétiquement liés au locus dm.

Ces marqueurs auront tendance à êtrede type A dans les gamètes de F1 portant dm et de type B dans les

gamètes de F1 portant DM

58

Ex. : un mutant homozygote "dm" (dysfonctionnement moteur) a été isolé à partir de la souche consanguine A. Pour cartographier ce gène, on commence par croiser cette souris dm/dm avec la souris de la lignée polymorphe B :

X

A B F1

M1A

M1A

M2A

M2A

MxA

MxA

...

M1B

M1B

M2B

M2B

MxB

MxB

...

M1A

M1B

M2A

M2B

MxA

MxB

...

dmdm

DMDM

dmDM

4.8.3 Utilité d’une carte génétique

59

X X

A B AF1F2

M1A

M1A

M2A

M2A

MxA

MxA

...

M1B

M1B

M2B

M2B

MxB

MxB

...

M1A

M1B

M2A

M2B

MxA

MxB

...

M1A

M1A

M2A

M2A

MxA

MxA

...

M1A

M1A ou B?

M2A

M2A ou B?

MxA

MxA ou B?

...

dmdm

DMDM

dmDM

dmdm

50% [dm] 50% [DM]

dmdm

dmDMM1A

M1A ou B?

M2A

M2A ou B?

MxA

MxA ou B?

...

Pour examiner les gamètes produits par les souris F1hétérozygotes, on réalise un test-cross, cad qu’on lescroise avec la souris A dm/dm (back-cross) et on trieles souris F2 selon leur phénotype. Ces souris F2 sontensuite génotypées (M1, M2, ..) pour savoir quelle allèle(A ou B) a été transmis par la souris F1 hétérozygote :

test cross

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... pM1 B A B A A A A B B A B A B B ... AM2 A B A A A B A B B A A B B A ... BM3 A A B B A A B A B B B A B B ... A...

M84 A A A A A A A A A B A A A A ... A...

M227 A A B A A A A A B A A A A A ... A...

allèle transmis par le parent F1 hétérozygote

x marqueurs

p souris F2 [dm] (phénotype dm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... qM1 A B B A B A A A B A B B A B ... AM2 B B A A A B A A B B A B B A ... BM3 A A B B B A B A A B A A B B ... A...

M84 B B B A B B B B B B B B B B ... B...

M227 B B B B B A B B B B B B A B ... B...

x marqueurs

q souris F2 [DM] (phénotype DM)

Le gène DM n’est pas lié à M1, M2, M3, ... Il est parcontre proche de M84, et aussi de M227 (mais plus desrecombinants). Or, on sait où se trouvent M2 et M87 surla carte (p 56), ils sont dans la région ... du chr. Le gènedm est ainsi cartographié.

dm

DM

AB

227A

227B

84A

84B

Une fois cartographié, un gène peut être plus facilement identifié (cloné), en s'aidant de la "carte physique" du génome :

chr.

carte physique

carte génétique

Etablir la carte physique d’un génome, c’est cloner (par ex. dans une bactérie E. coli) unensemble de fragments d’ADN recouvrant la longueur complète de chaque chromosome. Laposition de ces fragments les uns par rapport aux autres et par rapport aux marqueurs dela carte génétique est connue. La cartographie physique est souvent une étape préalable auséquençage d’un génome (cf. chap. I).

61

Une fois le gène cartographié, il devient maintenant possible de l’identifier : nature du gène ? séquence du gène ? protéine codée par ce gène ? C’est le but ultime visé.

Comment procéder ?

a) Approche suivie avant le séquençage du génome :

chr.

zone cartographiée

Le gène "DM" se trouve donc sur ces fragments d’ADN.

Séquençage de ces fragments d’ADN pour identifier les différents gènes présents dans la zone cartographiée (1)

Application d’autres techniques pour déterminer lequel des gènes identifiés correspond à DM.

Une fois le gène DM identifié, on peut déduire la séquence d’aa de la protéine -> rôle ?

Autre question d’intérêt: cette protéine de souris est-elle conservée chez l’être humain ?

(1) Chez le Zebrafish, 1 cM @ 625.000 pb et il y a en moyenne 1 gène (codant une protéine) tous les 100.000 pb62

63

b) Approche suivie après le séquençage et l’annotation du génome :

chr.

zone cartographiée

analyse bioinformatique (par ex. NCBI)

Les gènes dans la zone cartographiée sont identifiés.

Réalisation d’autres expériences pour déterminer lequel de ces gènes correspond à DM.

1 M pb