08/12/2014

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Place des nouvelles techniques dans l'optimisation diagnostiqueet thérapeutique des infections

nosocomiales en réanimation

Laurence ARMANDService de bactériologieCHU Bichat-Claude Bernard

Schéma classique pour le diagnostic microbiologique

Examen direct après coloration de GRAM• Morphologie : cocci, bacille…• Regroupement• GRAM + ou GRAM-

ATBiothérapie probabiliste

J0 J1 J2

ATBiothérapieprobabiliste

corrigée par culture

Culture pour obtenir des colonies isolées :De 18 h à 48h (ou plus)

ATBiothérapieadaptée

Identification phénotypique

AMX TIC PIP CF

CAZ AMC CTX MA

MOX ATM IPM FOX

FOS TET TZP CXM

Antibiogramme

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Qu’y a-t-il de mieux à ce jour ?

ATBiothérapieadaptée

AMX TIC PIP CF

CAZ AMC CTX MA

MOX ATM IPM FOX

FOS TET TZP CXM

Antibiogramme

J0 J1 J2

ATBiothérapieprobabiliste

corrigée par Identification

Culture pour obtenir des colonies isolées :De 18h à 48h (ou plus)

Identification Par spectrométrie de masse

Examen direct après coloration de GRAM• Morphologie : cocci, bacille…• Regroupement• GRAM + ou GRAM-

ATBiothérapie probabiliste

Innovation pour l’identification La spectrométrie de masse : Maldi-Tof

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Une innovation qui :

- Réduit le délai de rendu de l’identification à partir de la culturede 18 à 24h à moins de 10 minutes

- Démarche universelle quelque soit l’espèce bactérienne ou fongique

Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds“Bioanalytik”, Spektrum Akademischer Verlag, 1998

Laser Desorption/Ionization

Detector

m/z

Intensity

Time-of-Flight

DriftAcceleration

Electrodes

+ + ++++

MALDI-TOF Spectrométrie de Masse : Principe

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4

Aspergillus fumigatus

0

1000

2000

3000

Inte

ns.

[a.u

.]

Bacillussubtilis

0

2000

4000

6000

8000

Inte

ns.

[a.u

.]

Candida albicans

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Escherichia coli

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000m/z

Applicabilité à tous les microorganismes cultivables = identification universelle

Microorganisme inconnu

Dépôt d‘une colonie sur une des positions de la cible

Obtention d‘un profil

Comparaison avec base de données

Identification donnée

?

Workflow très simple, résultat automatiséRange Description Symbols Color

2.300 ... 3.000highly probable species

identification ( +++ ) green

2.000 ... 2.299

secure genus identification, probable species

identification ( ++ ) green

1.700 ... 1.999 probable genus identification ( + ) yellow

0.000 ... 1.699 no reliable identification ( - ) red

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Avantages / limites de l’identification par spectromètrie de masse

Cout élevé de l’automate mais faible de l’identification (vite rentabilisé)

Simplicité d’utilisation Rapidité de rendu impact sur la thérapeutique

Mauvaise identification des streptocoques alpha-hémolytiques : à ce jour, pas de différence entre Streptococcus pneumoniae et autres Streptocoques « oraux »

Ne sait pas différencier Shigella spp et E. coli

Avantages :

Limites :

Hémoculture positive

PlaqueMALDI-TOF

Identification

Prétraitement20 à 100 min

Application de l’identification par spectrométrie pour les hémocultures positives

Spectre

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Etudes des performances et impact de la spectrométrie sur hémocultures

Ferroni et al, J Clin Microbiol. 2010; Prod'hom et al, J Clin Microbiol. 2010 Stevenson et al, J Clin Microbiol. 2010; Christner et al, J Clin Microbiol. 2010 Ferreira et al, Clin Microbiol Infect. 2011; La Scola et al, PLoS One. 2009

Identification : 61% à 97%

Meilleure pour les bactéries à Gram négatifsque pour les Gram positifs

2012

+ 11% appropriate

- 10% inappropriate

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7

n = 256

n = 245

Huang et all, CID 2014

● 501 patients with bacteriemia or candidemia

Huang et al, CID 2014

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Test colorimétrique : LACTA™ test (Biorad) Prédiction de la résistance aux C3G

Principe : clivage d'une céphalosporine chromogénique (jaune rouge) en présence d’enzymes de type BLSE ou AmpC acquises

Test réalisable sur colonies bactériennes :- sensibilité de 96% pour E. coli et K. pneumoniae- Mais, sens de 67.4% chez Eb. du groupe 3 hyperproductrice d’AmpC

Test réalisable sur prélèvement :- Culots urinaires avec Eb productrices de BLSE (Sens 94% Spé 100%)- Hémocultures positives à BGN (Sens 97% Spé 100%)

Mauvaise prédiction de la résistance aux C3G chez Eb gr 3 déréprimé

Renvoisé et al, J. Clin Microb., 2013Gallah et al, J. Clin. Microb, 2014

Amzalag et al, RICAI 2014Waleski et al, RICAI 2014

Tests phénotypiques prédictifs de résistance

Nonhoff et al, J. Clin Microb., 2012Shim et al, Diag Microb Inf Dis., 2010

Test : Clearview PLP2a® (Alere) Prédiction de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus

● Principe : test immunochromatographique recherchant la présence dela PLP2a , témoin de la résistance à la méticilline

● Test réalisable sur colonies bactériennes :- sensibilité de 96.6% et spécificité de 100%

● Test réalisable sur hémocultures positives :- sensibilité de 94.4% et spécificité de 100%

Tests phénotypiques prédictifs de résistance

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● 88 LBA ou PDP- prélevés chez 66 patients suspects de PAVM- présentant un BGN à l’examen direct- 3 services de réanimation

● Réalisation d’un antibiogramme (méthode des disques) directement à partir du prélèvement avec standardisation de l’inoculum selon l’examen direct

Le Dorze et al, soumis Clin Micr Inf

Antibiogrammes réalisés directement sur prélèvements cliniques

● Performance par comparaison à la méthode conventionnelle :

Le Dorze et al, soumis Clin Micr Inf

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Changements potentiels d’antibiothérapie à J1 si l’antibiogramme direct avait été rendu aux cliniciens

41,2%

Principe:

●Rechercher la présence de gènes témoins de la présence de bactéries ou de certains gènes de résistance ou de virulence

Techniques :

●Plusieurs techniques d’amplifications (PCR classique ou en temps réel) ou de révélations (hybridation, micro-arrays, microfluidique …)

En constante évolution …

Tests génotypiques

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‐ S. aureus + gène mecA(dès hémocultures +)

Résultats rapides : total ~ 1h

La cartouche

Tube PCR11 chambres réactionnelles

Recherche de la résistance à la méticilline dans une hémoculture positive à cocci Gram positif

en amas par PCR temps réel automatisée : système GenExpert

Facilité de mise en oeuvre

Enlevez la cartouche et les réactifs de leur

emballage

Transférer une goutte de l’hémoculture positivedans le flacon d’élution

Reboucher le flacon et le vortexer pendant

10 secondes

Ajoutez la totalité du contenu du flacon dans

la chambre de la cartouche marquée S

Fermez le couvercle de la

cartouche

Insérer la cartouche dans

l’automate

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Très bonnes performances analytiques

Facilité de mise en oeuvre + + +

Rendu des résultats en 45 min à 2h

Inconvénients :

- Prix élevé de l’automate (mise à disposition …)

- Prix consommables ~ 40 Euros/test

- Études médico-économiques nécessaires

‐ S. aureus + gène mecA(souches/hémocultures+)

‐M. tuberculosis + résistance rifampicine

‐ C. difficile + toxine (selles)

‐ ERV (vanA/vanB)

‐ Carbapénémases

151 hémocultures positives à cocci Gram positif en amas

Après le résultat du Gram de l’hémoc : - 100% des patients avec SASM ont eu un traitement adéquat- 46% des patients avec un SARM ont eu un traitement adéquat

Dès le résultat du Genexpert, au total :- 26 % des patients ont eu un switch d’antibiothérapie - 16% des patients (tous Staph coag neg) ont eu un arrêt

d’antibiotique immédiat

-Economie de 16 637 $ (151 patients sur 7 mois)

Juin 2012

Impact du Dg rapide par PCR de SARM ou SASM dans les hémocultures

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- 156 Patients inclus avec hémoculture à S. aureus- 4 mois sans PCR (sept-dec 2008, n=74)- 4 mois avec Genexpert (mars-juin 2009, n=82)

• Switch pour 27 pts (33%) avec SASM et 4 (5%) avec SARM

• Switch 1,7 jours plus tôt en moyenne dans groupe PCR que non PCR

• Diminution durée d’hospitalisation de 6,2 jours dans le groupe PCR(21.5 vs 15.3 p=0.07)

• Pas d’impact sur la mortalité• Economies 21 387 $

CID 2010

Impact du Dg rapide par PCR de SARM ou SASM dans les hémocultures

Perspectives(Ce qui va arriver / n’arrivera pas…?)

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2 types de techniques :

Celles visant à rechercher les germes directement dans le sang du patient avant culture

Ex : Septifast (Lightcycler SeptiFast Test®, Roche Dg)PCR en temps réel + sondes hybridant 25 pathogènes

Chang et al, Plos One., 2013

Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les sepsis

Chang et al, Plos One., 2013Dark et al, Int Care Med., 2014

Très mauvaise VPN

Septifast

● Temps de rendu 6-8h

2 méta-analyses :● Sens : 0,75 (95% CI : 0,65–083)

0,68 (95 % CI 0.63–0.73)

● Spé : 0,92 (95%CI: 0,90–0,95)0,86 (95 % CI 0.84–0.89

● positive likelihood ratio (10,10) ● moderate negative LR (0,27)

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2 types de techniques :

Celles visant à identifier le germe (+/- résistances) après hémoculture positives

● Ex : Prove It Sepsis® (Mobidiag)Détection de 28 pathogènes + gène mecA

● 1807 of 2107 (86%) hémocultures contenant un pathogène présent dans le kit Se 94·7% (95% CI 93·6–95·7)Spé 98·8% (95% CI 98·1–99·2)

Délais de rendu : différence de 18h par rapport à la méthode de référence

Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les sepsis

Tissarit et al, Lancet, 2010

Lisenfeld et al, Eur. J. Micr. and Imm., 2014

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Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les PAVM

Pas grand-chose …

13 pathogènes identifiés dans les PAVM

24 déterminants de résistances

(Pénicillinase, BLSE, carbapénémase, gène mec)

Inconvénients :

- Rendu des résultats en 4 à 6h

- Manipulations encore lourdes

- Pas d’exhaustivité des résistances

- Prix élevé de l’automate et des tests ++++

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MALDI Biotyper

Target

preparation

Culture plate

1µl-loop filled

with bacteria

Resuspension

in antibiotic Solution

Incubation

1-2 h, 37°Ccentrifugation supernatant

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0

2000

4000

6000Inte

ns.

[a.u

.]

320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420m/z

Spectra analysisData output

Positiveblood

culture

1 ml culture

ModifiedSepsityperprotocol

Spectrométrie de masse et détection de la résistance

3h

34

Méropénème

Méropénème + K. pneumoniaesauvage

Méropénème +A. baumanniiNDM-1

Méropénème + K. pneumoniae KPC-2

Hrabak

Spectrométrie de masse et détection de la résistance

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Spectrométrie de masse : révolution pour l’identification bactérienne

Méthodes génotypiques : - longues et couteuses, - difficiles à intégrer dans le workflow d’un laboratoire de bactériologie- Impact à évaluer

Plutôt réfléchir sur des ré-organisations dans les laboratoires avec aide de spectromètre de masse

La détection des micro-organismes …

A l’heure actuelle, ou dans un avenir proche la détection des résistances bactériennes est meilleure par les techniques phénotypiques que génotypiques

Seuls les dépistages de gènes acquis (mecA, van) sont réalisés en pratique courante

BLSE : CTX-M facile mais TEM et SHV moins ……

Aucune technique n’envisage la détection de E. cloacae déréprimé ou P. aeruginosa muté sur la porine D2

Les techniques moléculaires pour la détection de la résistance s’ajoutent aux techniques classiques, mais ne les remplacent pas ….

La détection des résistances …

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19

37

Merci de votre attention

Perspective lointaine …?Diagnostic microbiologique par séquençage haut débit ?Lecture en parallèle de plusieurs millions de séquences d’ADN ou d’ARN

Analyse bio-informatique (reconstruction et analyse de génomesentiers à partir des fragments séquencés)

Human genome sequencing project1990-2003

3 milliards $

Nouvelle génération de séquenceur2012

1 génome2 heures – 1000 $

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20

Human genome sequencing project1990‐20033 milliards $

Nouvelle génération de séquenceur2012

1 génome2 heures – 1000 $

Diagnostic microbiologique par séquençage haut débit ?

Lecture en parallèle de plusieurs millions de séquences d’ADN ou d’ARN

Analyse bio-informatique (reconstruction et analyse de génomes entiers à partir des fragments séquencés)

Fev 2014

Perspective lointaine …?

- Etudes réalisées sur prélèvements respiratoires(LBA, PDP, A. Bronchiques) chez des patients suspects de PAVM

- Sensibilité données à quelques antibiotiquespar l’intermédiaire des bandelettes E-test (CMI)

- Gélose pour antibiogramme ensemencée directementavec le prélèvement clinique puis dépôt de E-test

-Très bonnes performancesTaux de concordances avec la méthode De référence : de 82.5 à 96.2%Erreurs majeures de 1,5 à 1,9%

Boyer et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 2012Kontopidou et al, Int J Antimicrob Agents, 2011Cercenado et al, Diagn Microbiol Infect Dis,2007

Antibiogrammes réalisés directement sur prélèvements cliniques

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250 Aspirations trachéales chez 250 patients avec une PAVM avérée

- 167 groupe E-test (oxacilline, pip/tazo, céfepime, imipénème, cipro, amikacine)- 83 groupe contrôle