Diagnostic de l’infection à VIH

DCEM1 année 2008-2009Diane Descamps, Bénédicte Roquebert, Thomas Mourez

Définition et classification

• Famille : Retroviridae

• Sous-famille : Orthoretrovirinae

• Genre : Lentivirus

• VIH-1 découvert en 1983, VIH-2 en 1986

• Virus enveloppé

• Virus à ARN sb (2 copies)

• VIH-1 groupes M (majeur), N et O

Structure génomique des provirus VIH-1 et VIH-2

Diversité génétique des VIH

2 types : VIH-1 et VIH-2 VIH-1 : 3 groupes M – N – O

-groupe M (major) = pandémique• 9 sous-types purs A-B-C-D-F-G-H-J-K• 37 CRFs (Circulating Recombinant Form)

VIH-2 : 8 sous-types A-H (Afrique de l’Ouest)

- groupes N (non-M/non-O) et O (outlier) minorité de souches (Afrique centrale)

Distribution mondiale des sous-types de VIH-1

Les outils du diagnostic des infections VIH

Diagnostic Direct : Mise en évidence de composants du virus lui-même

– Antigénémie p24– Acides nucléiques sous forme d’ARN plasmatique

ou d’ADN proviral– Isolement lymphocytaire et plasmatique

Diagnostic Indirect : Mise en évidence de la réponse de l’hôte contre l’infection

– Anticorps anti-VIH

Diagnostic de l’infection VIH

Adulte : SEROLOGIESauf dans le cas d’une primoinfection ou de variants (VIH-1 groupe O, groupe N)

Nouveau-né : PCR ou CULTURE

Dépistage des anticorps anti-VIH

Nécessite obligatoirement, pour chaque sérum, 2 techniques ou 2 réactifs différents:

– soit 2 réactifs ELISA Mixtes,

– soit 1 réactif ELISA Mixte et un réactif HIV-1 monospécifique,

– Soit 1 réactif ELISA Mixte et un test unitaire rapide.Direction Générale de la Santé

(08 septembre 1993)

Tests de dépistage des Anticorps anti-VIH : Sérologie

1985 Lysats de cellules infectées par le VIH-1 (première génération) Faux négatifs, et spécificité médiocre

1986 Antigènes recombinants produits par génie génétique et peptides de synthèse (deuxième génération)

1987 Tests mixtes de détection des anticorps anti-VIH1 et VIH2

1991 Tests sandwich IgG/IgM (troisième génération):- Sensibilité +++- Spécificité +++

1997 Tests combinés (quatrième génération) détectant Ac anti-VIH1, Ac anti-VIH2 et Ag p24.

Ag VIH1 groupe M sous type B et VIH1groupe O, Ag VIH2 sous-type A

ELISAEnzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Traité de virologie médicale, Huraux, Agut, Nicolas, Peigue-Lafeuille

Support

Serum du patient

Deuxième Ac marqué par une Enzyme

Substrat de l’enzyme

Révélation

Lecture

Antigène viral

Détection des Anticorps anti VIH

Technique Elisa :

– La plus utilisée– Simple– Rapide– Reproductibilité– Sensibilité++++– Spécificité+++– Adaptée à de grandes

séries– Mise en évidence des Ac

3 semaines après le contage

Dépistage combiné : Ac + Ag (Vidas : HIV Duo®)

Diagnostic de l’infection 15 à 17 jours après le contage

Tests unitaires rapides

Ne nécessitent pas d’appareillage sophistiqué 10-20 mn Dépistage des Ac contre le VIH-1 ET VIH-2 NOUVEAUTE 2008 : nouveaux tests rapides combinés

Ag/Ac (en évaluation) Lecture visuelle Sensibilité « légèrement » inférieure aux nouvelles

techniques Elisa (Pb des séroconversions) Aide au diagnostic d’urgence et en situation de détresse

matérielle. France : en association obligatoire avec les tests Elisa

Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2

Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2

négatif positif

Agrément par l’AFSSAPS : • Sensibilité :

- panels de séroconversions VIH-1 (50) - VIH-1 groupe M sous-types (150)- VIH-2 (50)- VIH-O (10)

• Spécificité : 2000 sérums

Réévaluation périodique des tests par AFSSAPS

Contrôle de qualité des laboratoires, obligatoire, tous les 6 mois

TESTS DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTI-VIH-1 ET VIH-2

Western-blot (WB)

Test de confirmation : OBLIGATOIRE (si + ou discordant)

Analyse de la spécificité Antigénique des AcSpécificité > ELISA mais Sensibilité < ELISA

Fractionnement préalable des protéines virales– électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide – transfert sur un support (nitrocellulose, Nylon) autorisant ELISA

WB spécifiques du VIH-1 et du VIH-2 : Si réaction sur les protéines issues des gènes « gag » et/ou « pol » de forte intensité par rapport aux protéines issues des gènes «env», faire un WB VIH-2 et envisager une infection par le VIH-1 de groupe O.

Deuxième prélèvement demandé immédiatement

• Confirme une séropositivité VIH-1• permet de soupçonner une primo-infection VIH-1• voire une séropositivité VIH-2.

Critères de positivité (France)2 env + gag ou pol

Western-blot (WB)

WB VIH-1 indéterminé?

• Séroconversion VIH-1?• Infection par VIH-2?• Erreur de tube?• Variant?

Diagnostic sérologique des infections par VIH-2

Stratégie identique à celle VIH-1

La réactivité croisée par WB est un problème pour confirmer ou infirmer une infection par VIH-2.

Une stratégie utilisant des protéines spécifiques VIH-1 ou VIH-2 avec des tests évitant la réactivité croisée est nécessaire.

Pas de critères sérologiques pour les doubles infections VIH-1/VIH-2

Détection génomique : PCR ADN VIH-1 et VIH-2

Différenciation Ac VIH1 / VIH2

La différenciation entre Ac anti VIH-1 et VIH-2 n’est pas une obligation légale

Recommandée par le groupe ANAES (2000)

Peptides synthétiques spécifiques de chacun des 2 virus

T- T+ VIH-2 VIH-1 VIH-1+2

VIH-2 sous type B

VIH-2 sous type A’

VIH-2 sous type A

WB HIV-1 WB HIV-2WB1 WB2

VIH-1 groupe O

• Environ 100 cas identifiés à ce jour en France et près de 600 au Cameroun

• Epicentre de l’épidémie : Cameroun

• Grande diversité au sein des VIH-O

• Parfois mal reconnu au dépistage: possible faible réactivité des EIA et WB le plus souvent indéterminé

• Non quantifié par les trousses commerciales de charges virales sauf Abbott

• Généralement résistant aux NNRTI

ARN VIH plasmatique

Antigénémie p24

ADN PROVIRAL

Anticorps anti-VIH positifs par ELISAFenêtre Sérologique

Anticorps anti-VIH positifs par WB

Cinétique des marqueurs viraux VIH

Fenêtre Virologique

VIH - Evolution des marqueursVIH - Evolution des marqueurs

Contage

ARN viral plasmatique: 10 à 10 copies / mL2 7

Ag HIV

Disparition Ag HIV et séroconversion

Diminution ARN et plateau

Fenêtre virologique 10 à 12 jours

22 à 26 jours après contageFenêtre sérologique

16 jours après contage

Algorithme sérologiquePrélèvement n°1

Dépistage

Absence d’infection en l’absence d’exposition

de moins de 3 mois

Prélèvement n°2

WB ou IB VIH1

Positif

Infection à VIH

Différenciation VIH-1 / VIH-2

Négatif ou indéterminé

• Infection récente ? Ag p24 ou ARN VIH

• VIH2 ? WB VIH2• Faux positif ? • Erreur tube ? • Variant ?

(2 tests)–/– +/+ ou +/–

Dépistage(2 tests)

Déclaration obligatoire

Tests spécialisés

Contrôle + M1, M3

Mesure de l’ARN-VIH plasmatique qui témoigne d’une réplication virale dans l’organisme

Marqueur le plus précoce, sensibilité 100%

Détectable 8 - 17 j après le contage (vers J11)

Au moment du pic : 102 à 107 copies/mL de plasma

En l’absence de traitement équilibre de la CV à M4-M6

Suivi virologique du patient infecté

Obstacle : diversité VIH

Diagnostic de la primo-infection

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant né de mère séropositive

Transmission : o 20-30% in utéroo 70-80% en péri-partum

Estimation de la proportion d’enfants infectés par semaine avant l’accouchement

Transmission :o 20% sans prise en chargeo < 1% si TTT +/- césarienne

Prélèvements de l’enfant –première semaine, 1 mois, 3 mois et 6 mois de vie–prélèvement de la mère en parallèle

Techniques–détection de l’ADN proviral lymphocytaire par PCR –2 PCR successives positives–détection de l’ARN plasmatique–ARN viral négatif avant l’âge de 6 semaines si l’enfant est traité–isolement de virus à partir des lymphocytes à M6–Suivi sérologique après 6 mois (négativation à 18 mois)

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant né de mère séropositive

Le maintien de la réalisation de deux techniques de dépistage sur le même prélèvement, dans le cadre de l’analyse de dépistage des anticorps anti-VIH, n’est plus justifié en 2008 basée sur

o performance des techniqueso comparaison de la performance des 2 stratégies

Un résultat négatif du test de dépistage ELISA mixte et combiné 6 semaines après l’exposition supposée pourra être considéré comme signant l’absence d’infection par le VIH basée sur performance des techniques

Recommandations HAS 2008

Recherche Ac anti VIH-1 et VIH-2Et Ag p24 par un test combiné

-

Absence d’infection*

+

WB ou IBDifférenciation VIH1/VIH2

+

Recherche Ac anti VIH-1 et VIH-2et Ag p24 par un test combiné

(2eme prélèvement)**

+

Infection VIH confirmée

-

Erreur identification

Contrôle sérologique

- ou indéterminé

Recherche ARN VIH plasmatique ou Ag p24

+ -

Primo infectionprobable

Contrôle Sérologique§

Absence d’infectionProbable réaction non spécifique

Contrôle SérologiqueExplorations complémentairesVariants?

* Sauf exposition supposée au VIHdans les 6 semaines précédentesSi PPE : délai reste 3 mois** le test combiné peut être identique ou différent du 1er§ 1 à 2 semaines plus tard

Algorithme sérologique de dépistage

• Mesure ARN VIH1 plasmatique: paramètre important danso la suivi du traitemento la décision de changer un traitement

•Nécessite d’avoir 2 mesures de charge virale dans le suivi récent du patient.

•Le résultat de la charge virale peut varier chez un même patient d’un facteur 3 (0,5 log) sur 2 points successifs sans signification particulière.

•Infections intercurrentes, vaccination peuvent augmenter transitoirement la charge virale.

ARN VIH plasmatique

Détection d’acides nucléiques viraux

• Amplification de la cible : PCR (Polymerase Chain Reaction)Multiplication, de manière exponentielle, d’un fragment

d’acide nucléique (ADN) afin d’augmenter la sensibilité de sa détection

• Amplification du signal: Augmenter le nombre de sondes marquées générant un

signal sans modifier la quantité de molécules cibles présentes initialement

PCR : amplification de la cible

5’ 3’

ADN cible

ARN cible

Amplicon

Dénaturation

Hybridation

Elongation

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’3’

3’

Transcription inverse

Cycle 3

Cycle 2

Cycle 1

95°C

55°C

72°C

PCR : amplification de la cible

n cycles

multiplication exponentielle

détection des produits amplifiés à l’aide de sondes marquées

Quantité théorique de copies générées par PCR en fonction du nombre de cycles : 1 cycle 2 copies2 cycles 4 copies3 cycles 8 copies….6 cycles 64 copies….22 cycles 4194304 copies….30 cycles 1073741824 copies

Cycle 3

PCR temps réel : Gamme de quantification

5 copies

10000 copies

- technologie « Taqman »-Amorces et sondes

Microplaque

ARN cible Label Extender*(LE)

CaptureExtender(CE)

Pré-amplificateur*

Sonde de Capture

Sondes* marquées et

Amplificateur*Technologie b-DNA « ADN branché »

PCR : amplification de la cible

ARN VIH-1 Plasmatique

Trousses disponibles

• Bayer Quantiplex bDNA 3.0 et • Roche Monitor 1.5: PCR classique puis hybridation• Roche Cobas taqman / PCR temps réel• Biomérieux Nuclisens temps réel• Abbott PCR temps réel : quantification des VIH-1

groupe O

Ne détectent pas l’ARN plasmatique VIH-2

Génotypage

Recherche de mutations de résistance aux antirétroviraux

Cas n°1

• Un jeune homme de 27 ans et sa fiancée envisagent des rapports sexuels stables sans préservatif. Auparavant le jeune homme juge bon de faire faire une recherche d'anticorps HIV dans son sérum.

• a) Des deux tests ELISA effectués, l'un est positif, l'autre négatif. Que dire ? Que faire ?

• b) Les deux tests ELISA effectués sont négatifs. Que dire ? Que faire ?

Cas n°2

Un homme de 32 ans homosexuel consulte pour un syndrome grippal associé à une angine et une éruption cutanée maculo papuleuse.

Quelles sont les étiologies virales les plus fréquentes à évoquer ?

La sérologie VIH (ELISA) est discordante : 1 test AC négatif, 1 test Ag/AC positif.

Quels examens complémentaires demandez vous pour affiner le diagnostic ?

Cas n°3

Après une grossesse sans suivi médical convenable, une séropositivité pour l’HIV-1 est découverte chez une femme le jour de son accouchement. Aucun traitement préventif pour la transmission materno-fœtale n’a pu être administré, ni à la mère, ni à l’enfant.

Quels examens faut-il prescrire et à quelles dates pour rechercher une infection par HIV chez ce nouveau-né, qui n’est pas allaité ?