7.4- Exploration des lipides plasmatiqueschristelle.larcher.free.fr/eal.pdf · Principe du dosage du cholestérol total 75 % des méthodes de dosage sont des méthodes enzymatiques

Cours biochimie BTS_ABM2 2017-2018 C. Larcher 7.5- EAL – Page 1 / 12 –

EXPLORATION DES ANOMALIES LIPIDIQUES

1. Physiologie des lipides Les lipides sont des biomolécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées d’atomes de carbone, d’hydrogène et d’oxygène de densité inférieure à celle de l’eau (< 1 g/cm3). Les huiles sont des liquides alors que les graisses sont des solides plus ou moins pâteux à température ambiante.

1.1. Nature des lipides alimentaires • 90 % de triacylglycérols (TG)

Þ Apport d’acides gras : saturés, insaturés cis ou trans, indispensables (acide linoléique w6 et acide a-linolénique w3) et essentiels.

• Phospholipides, stérols 1.2. Digestion des lipides alimentaires

1.2.1. Étapes • Émulsification des graisses grâce aux sels biliaires qui jouent un rôle d’agent de

surface (détergents) pour solubiliser les lipides en phase aqueuse. • Hydrolyse des lipides par la lipase pancréatique (lipides rendus accessibles par

l’émulsification). • Formation des micelles • Absorption par endocytose du contenu micellaire

1.2.2. Enzymes digestives des lipides a. Lipase pancréatique

Les lipases sont des enzymes hydrosolubles capables d’effectuer l’hydrolyse de fonctions esters et sont spécialisées dans la transformation de glycérides (triglycérides, diglycérides, monoglycérides) en glycérol et en acides gras (lipolyse).

Les lipases sont donc des hydrolases de la sous-classe des estérases. On distingue les lipases gastrique et pancréatique majoritaire. Les valeurs de référence de la lipasémie dépendent de la technique utilisée1 (variation

allant jusqu’à un facteur 10). A titre indicatif, par spectrophotométrie : 13 à 60 U·L-1

Augmentation due à des atteintes pancréatiques (notamment la pancréatite aiguë). b. Phospholipases

Les phospholipases A1 et A2 hydrolysent les phospholipides alimentaires pour en libérer les AG.

Figure 1 : site d’action des différentes phospholipases

a. Cholestérol estérase La cholestérol estérase pancréatique hydrolyse les esters de cholestérol (cholestérol

estérifié) entraînant la libération d’AG et de cholestérol libre.

1 https://www.biomnis.com/referentiel/liendoc/precis/LIPASE.pdf

PLA2

PLC PLD

PLA1

H2C

CH

O

H2C

O

O P

C

C

O

R1

O

R2 O

O

O-

X


Figure 2 : absorption des lipides

http://www.infirmiers.com/etudiants-en-ifsi/cours/cours-ifsi-biologie-fondamentale-les-lipides-partie-2.html

1.3. Transport plasmatique des lipides

1.3.1. Structure des lipoprotéines Les lipoprotéines sont de grands complexes de protéines et de lipides, hydrosolubles, qui transportent massivement les lipides dans tout l’organisme :

• la coque externe est une monocouche de phospholipides (PL) contenant du cholestérol et une ou plusieurs molécules protéiques appelées apolipoprotéines (par exemple apo-A, apo-B, etc...)

• la partie centrale contient des triglycérides (TG) et des esters de cholestérol (CE).

Figure 3 : structure d’une lipoprotéine

Schéma tiré d’un sujet de bac STL-BGB (2003)


1.3.2. Caractéristiques des lipoprotéines Il existe quatre catégories de lipoprotéines plasmatiques dont les caractéristiques sont regroupées

dans le tableau suivant :

1.3.3. Chylomicrons Les chylomicrons sont des lipoprotéines qui se forment en période de digestion. Elles sont

responsables du transport des lipides de l’intestin grêle vers les tissus. Lors de l’absorption, les divers lipides provenant de l’alimentation, et transportés par les

micelles, pénètrent à l’intérieur des cellules de la bordure en brosse par diffusion simple. Une fois à l’intérieur, acides gras et glycérol se regroupent pour former des triglycérides qui se retrouvent enveloppés par des protéines. Cet ensemble lipides-protéines forment les chylomicrons.

Les chylomicrons peuvent alors quitter les cellules de la paroi intestinale, mais de part leur taille, ils ne peuvent pas rejoindre les capillaires sanguins. Ils passent alors dans la circulation lymphatique par des chylifères (vaisseau lymphatique située au niveau de l’intestin).

1.3.4. VLDL Les VLDL (Very Low Density Lipoprotein, lipoprotéine de très basse densité) sont des

lipoprotéines responsables du transfert des lipides endogènes de leur lieu de synthèse, le foie, vers les tissus.

1.3.5. LDL-cholestérol Les lipoprotéines de basse densité (ou LDL pour Low density lipoprotein en anglais) sont un

groupe de lipoprotéines de types et de tailles variables (18 à 25 nm de diamètre), qui transportent le cholestérol, libre ou estérifié, dans le sang et à travers le corps pour les apporter aux cellules. Les LDL sont produites par le foie à partir des lipoprotéines de très basse densité (ou VLDL). Elles portent des apolipoprotéines B-100 et des vitamines anti-oxydantes (vitamine E et caroténoïdes).

Un défaut de captation des LDL par les cellules des tissus demandeurs augmente le taux de cholestérol dans les vaisseaux sanguins : elles s’y déposent ce qui entraîne l’athérosclérose. Pour cette raison, le LDL est souvent qualifié de mauvais cholestérol, par opposition au HDL qui lui est appelé bon cholestérol.

1.3.6. HDL-cholestérol Les HDL (High Density lipoprotein, lipoprotéine de haute densité) sont des lipoprotéines

responsables du transport du cholestérol vers le foie où il pourra être éliminé. Cette fonction permet d’éviter l’accumulation de cholestérol dans les vaisseaux sanguins et donc d’éviter les risques d’athérosclérose. C’est pour cela que le HDL est qualifié de bon cholestérol par rapport au LDL qui est appelé mauvais cholestérol.

Chylomicrons VLDL LDL HDL

Densité < 1 » 1 > 1 > 1

Taille Grosses Petites

Lipides 98 % 90 % 75 % 50 %

Protéines 2 % 10 % 25 % 50 %

Nature des lipides 90 % TG exogènes CE et 60 % TG CE 35 % ; PL CE 22 % ; PL

Nature des apoprotéines B48 - C- E B100 - C- E B100 A1


1.3.7. Circulation des lipoprotéines

Source : HDL-cholestérol : place de son dosagedans l’évaluation d’un risque cardiovasculaire Ann Biol Clin, vol. 61, n° 5, septembre-octobre 2003

2. Analyses au laboratoire L’EAL (Exploration des Anomalies Lipidiques) conserve l’ensemble indissociable suivant :

- aspect du sérum ; - cholestérol total (CT) ; - triglycérides (TG) ; - cholestérol HDL (C-HDL) ; - calcul du cholestérol LDL (C-LDL) par la formule de Friedewald.

2.1. Aspect du sérum

2.2. Test de crémage sur sérum trouble, opalescent, lactescent

Il faut laisser le tube de sérum présentant une opalescence 12 h à 4 °C. Si une couche crémeuse surnageante apparaît au-dessus du sérum plus clair, cela

est dû à un excès de chylomicrons de très faible densité. • Aspect lactescent et/ou couche crémeuse = excès de chylomicrons • Aspect trouble ou opalescent = excès de VLDL • Aspect trouble et surnageant crémeux = excès de VLDL et de chylomicrons


2.3. Principe du dosage des triglycérides 85 % des méthodes de dosage sont des méthodes enzymatiques spectrophotométriques (GPO-PAP glycérol 3-phosphate oxydase – amino-antipyrine avec correction du glycérol plasmatique à 0,11 mmol·L-1)

2.4. Principe du dosage du cholestérol total 75 % des méthodes de dosage sont des méthodes enzymatiques spectrophotométriques (couple peroxydase – complexe chromogène phénolique)

2.5. Principe du dosage du cholestérol-HDL

On peut doser spécifiquement le cholestérol des HDL par précipitation sélective des autres lipoprotéines à ApoB. Un mélange de phosphotungstate de sodium et de chlorure de magnésium permet de faire précipiter toutes les lipoprotéines qui contiennent des apoB (chylomicrons, VLDL et LDL). Après centrifugation, on récupère le surnageant qui contient les HDL (apoA1) dont on va doser le cholestérol noté C-HDL. C’est une méthode semi automatisable.

Le dosage spécifique des apolipoprotéines A1 (permet le dosage des HDL) mais celui des apoB n’est plus actuellement recommandé. 2.6. Détermination du cholestérol-LDL

La formule de Friedewald permet de calculer la fraction C-LDL si TG < 3,4 g·L-1 : En g·L-1 C-LDL = CT – C-HDL – !"

# En mmol·L-1 C-LDL = CT – C-HDL – !"

$,$

2.7. Valeurs physiologiques Triglycérides 0,6 à 1,7 mmol·L-1 0,4 à 1,6 g·L-1

Cholestérol total 4,1 à 6,2 mmol·L-1 1,6 à 2,4 g·L-1 HDL cholestérol 1,0 à 2,0 mmol·L-1 0,4 à 0,8 g·L-1 LDL cholestérol 2,6 à 4,1 mmol·L-1 1,0 à 1,6 g·L-1

Rapport CT/HDL < 4,4


Le rapport Cholestérol total / HDL-cholestérol est relié à un facteur de risque de maladie coronarienne (le risque augmente lorsque ce rapport augmente). Globalement, ce risque est faible lorsque Cholestérol total / HDL-cholestérol < 4,4.

2.8. Facteurs de risque et protecteur Les recommandations (HAS) donnent des valeurs seuils de C-LDL en fonction du nombre de

facteurs de risque : • en l’absence de facteur de risque C-LDL < 2,20 g/L (5,7 mmol/L) • en présence d’un facteur de risque C-LDL < 1,90 g/L (4,9 mmol/L) • en présence de 2 facteurs de risque C-LDL < 1,60 g/L (4,1 mmol/L) • en présence de plus de 2 facteurs de risque C-LDL < 1,30 g/L (3,4 mmol/L) • patient à haut risque cardiovasculaire C-LDL < 1 g/L (2,6 mmol/L)

Facteurs de risque : âge (homme de 50 ans ou plus, femme de 60 ans ou plus), antécédents familiaux de maladie coronarienne précoce, tabagisme actuel ou arrêté depuis moins de 3 ans, hypertension artérielle, diabète de type 2, HDL cholestérol < 0,40 g/L. Facteur protecteur : HDL cholestérol ≥ 0,60 g/L (soustraire alors « un risque » au score de niveau de risque) Les triglycérides ont progressivement émergé comme facteur de risque. Le syndrome « hypertriglycéridémie-hypo-HDL » constitue un facteur de risque très puissant, surtout chez la femme : triglycérides > 1,5 g/L (> 1,57 mmol/L) et HDL chol < 0,40 g/L (< 1,03 mmol/L). Un taux excessif de triglycérides dans le sérum (hypertriglycéridémie) peut être primitif (parfois favorisé par le stress), consécutif à une pathologie (alcoolisme, diabète, etc…), à la prise d’œstrogènes (pilule contraceptive), ou sans cause connue. Un taux anormalement bas de triglycérides dans le sérum (hypotriglycéridémie) est beaucoup plus rare. Il est habituellement lié à un apport alimentaire insuffisant de triglycérides.

3. Lipoprotéinogramme et classification des dyslipoprotéinémies 3.1. Définitions des anomalies lipidiques

• Hyperlipidémie ou hyperlipémie : augmentation anormale des triglycérides. • Hypercholestérolémie : augmentation anormale du cholestérol plasmatique. • Hyperlipoprotéinémie : augmentation anormale des lipoprotéines ; concentration élevée des

lipides totaux ; en triglycérides ou en cholestérol. • Dyslipoprotéinémie : profil des lipoprotéines anormal.

3.2. Électrophorèse des lipoprotéines (lipoprotéinogramme)

3.2.1. Nature de l’échantillon Après un repas, le sérum est lactescent, en raison de la présence des chylomicrons. L’échantillon à analyser est donc du sérum d’un patient à jeun depuis 12 heures.

3.2.2. Principe de l’électrophorèse des lipoprotéines L’électrophorèse est une méthode de séparation de constituants chargés, sous l’action

d’un champ électrique, sur un support imprégné d’un solvant tamponné. La vitesse de migration v est égale à la mobilité électrophorétique µ multipliée par le champ électrique E : v = µ x E. La mobilité électrophorétique est proportionnelle à la charge, inversement proportionnelle à la taille de la molécule et à la viscosité du milieu.

• leur densité (ultracentrifugation ; méthode de référence) • leur charge (électrophorèse de zone ou en gel d’agarose ; méthode courante) • leur taille (tamisage moléculaire sur polyacrylamide).

Les 4 principales classes de lipoprotéines peuvent être séparées, en fonction de :


Sur gel d’agarose à 8 g·L-1 (0,8 %), les lipoprotéines sont séparées en tampon pH 8,5, puis colorées par une solution de noir Soudan.

Le gel d’agarose présente à cette concentration des mailles lâches et n’exerce pas d’effet de tamis sur les lipoprotéines, la séparation est donc en fonction de la charge.

À pH 8,5 > pHi moyen, les lipoprotéines sont chargées négativement. Donc le sérum est déposé à la cathode (pôle négatif). En présence de chylomicrons, ces lipoprotéines restent au niveau de la zone de dépôt.

Figure 4 : lipoprotéinogramme sur gel d’agarose

3.3. Classification des dyslipoprotéinémies de Fredrickson

Type Nom Aspect du sérum à jeun Lipoprotéine augmentée Cholestérol TG Fréquence

I Hyperchylomicronémie Lactescent Chylomicrons +++ Très rare

IIa Hypercholestérolémie LDL ++ +++

IIb Hyperlipidémie combinée familiale (ou mixte) Opalescent LDL + VLDL ++ + +++

III Dysßlipoprotéinémie familiale Opalescent broadßL ++ ++ Rare

IV Hypertriglycéridémie familiale Opalescent VLDL HDL – ++ +++

V Hyperlipoprotéinémie familiale Lactescent VLDL +

chylomicrons ± +++ Très rare

Figure 5 : tableau de classification de Fredrickson des dyslipoprotéinémies

Les types I et V sont très rares, les types IIa – IIb et IV sont très fréquents et les III ont une fréquence intermédiaire (1/5000).

Hypercholestérolémie familiale - maladie autosomique dominante - déficit en récepteurs LDL - risque athérogène

Hyperlipidémie de type IIb - maladie oligogénique - augmentation de la production d’apo B100 par le foie - risque athérogène moindre

Les hyperlipidémies secondaires apparaissent à la suite d’autres maladies telles le diabète, l’hypothyroïdie, l’hypocorticisme.

Pôle + Pôle –

1A- HDL 2B- VLDL 3C- LDL

Sens

de

mig

ratio

n Sens de migration


4. Conséquences : maladies cardio-vasculaires 4.1. Athérosclérose

4.1.1. Définition L’athérosclérose est une maladie dégénérative des artères de gros et de moyen calibre qui

associe deux types de lésions : • Des plaques d’athérome (dépôts de lipoprotéines –LDL– riches en cholestérol) au

niveau de l’intima, obstruant petit à petit la lumière artérielle • Un durcissement de la média atteignant surtout les artères cérébrales, les artères

coronaires et les artères des membres inférieurs. L’athérome est le dépôt de lipides riches en cholestérol au niveau de l’intima des grosses et

moyennes artères.

Figure 6 : schéma d’une sténose artérielle due à une plaque d’athérome

4.1.2. Conséquences L’athérosclérose est responsable d’accidents et de troubles pathologiques de plus en

plus fréquents dans les pays à niveau de vie élevé : • Les accidents vasculaires cérébraux consécutifs à l’athérosclérose des artères

cérébrales • L’artérite des membres inférieurs consécutifs à l’athérosclérose des artères des

membres inférieurs • L’angor (angine de poitrine) et l’infarctus du myocarde consécutifs à

l’athérosclérose des artères coronaires. La plaque d’athérome obstrue progressivement les artères et entraîner :

• soit une fragmentation de la plaque d’athérome ; des emboles se détachent, migrent et obstruent des artères plus petites éloignées du foyer primitif : formation d’une embolie au niveau du cerveau (hémiplégie), du cœur (infarctus) ou des poumons (embolie pulmonaire). Une embolie est une obstruction de la lumière d’un vaisseau sanguin par un thrombus ou par un corps étranger, apporté par la circulation sanguine.

• soit une obstruction totale de l’artère ; le ralentissement du débit sanguin favorise la formation d’une thrombose c’est-à-dire la formation d’un caillot obstruant complètement l’artère. Cela peut conduire à une ischémie permanente responsable d’une anoxie et de la mort des tissus en aval ou nécrose (infarctus du myocarde ou cérébral, atteinte d’un membre)

4.1.3. Facteurs de risque a. Facteurs majeurs non accessibles à un traitement

Sexe masculin, hérédité, vieillissement (âge) b. Facteurs majeurs accessibles à un traitement

Hypertension artérielle, obésité (IMC >30), tabac, excès de boissons alcoolisées, hyperlipidémie (triglycérides et cholestérol), diabète

c. Facteurs mineurs

Stress, sédentarité, prise d’œstro-progestatifs associée au tabagisme, déficit en vitamine C du fumeur


4.2. Infarctus du myocarde

4.2.1. Définition L’infarctus du myocarde (IDM) correspond à une nécrose plus ou moins importante du

myocarde consécutive à une thrombose d’une artère coronaire ou de l’une de ses branches.

Figure 7 : Irrigation artérielle du cœur

Source : Physiopathologie et terminologie médicale de Gosselet et Tatossian Editions Foucher

4.2.2. Angor ou infarctus du myocarde

Angine de poitrine ou angor Infarctus du myocarde

Athérosclérose à l’origine d’une Sténose coronaire Thrombose coronaire Ischémie Transitoire Permanente Territoire en aval privé d’oxygène Partiellement Totalement Nécrose Non Oui

Figure 8 : différences entre angor et infarctus du myocarde 4.2.3. Diagnostic : dosage des marqueurs du tissu cardiaque

• Marqueurs presque plus utilisés car peu spécifiques : LDH, ASAT • Marqueurs utilisés : créatine kinase (CK-MB), la troponine et la myoglobine

Figure 9 : cinétique d’apparition des marqueurs de l’infarctus du myocarde

https://www.biomnis.com/referentiel/liendoc/precis/TROPONINES.pdf a. La myoglobine

La myoglobine est une protéine héminique de petite taille qui a un rôle dans le stockage cellulaire du dioxygène. C’est un marqueur précoce de la crise car elle a une demi-vie de 10 minutes. Elle augmente rapidement 2 heures après la crise, atteint un maximum en 8 heures et disparaît en 20 heures.

Mais c’est un marqueur non spécifique du cœur car c’est une protéine importante du muscle strié. Le dosage se fait par immuno-turbidimétrie, immuno-néphélémétrie ou immuno-enzymatiques type ELISA.

Artère coronaire droite

Artère coronaire gauche

Artère interventriculaire inférieure

Artère circonflexe


https://www.biomnis.com/referentiel/liendoc/precis/MYOGLOBINE.pdf

Figure 10 : principe du dosage ELISA « sandwich »

HRP : peroxydase de Raifort TMB : 3,3’,5,5’-Tétraméthylbenzidine : substrat chromogène de la peroxydase b. La créatine kinase (CK-MB) La CK est une isoenzyme dimérique. E.C.2 phospho-transférase

• CK1 ou CK-BB (brain = cerveau) ; • CK2 ou CK-MB (cœur) ; • CK3 ou CK-MM (muscle strié)

Dans les conditions normales, l’activité totale de la CK est due pour 95 % à la CK-MM et pour 5 % à la CK-MB. La forme CK-BB n’est jamais retrouvée dans le plasma car elle ne traverse pas la barrière méningée. L’augmentation de la CK totale et CK-MB sont le signe d’un IDM.

Le dosage des isoformes CK-MB et CK-MM se fait par séparation électrophorétique sur gel d’agarose à haut voltage avec révélation enzymatique et quantification en fluorescence (résultat obtenu en 30 min) ou par immunoinhibition.

https://www.biomnis.com/referentiel/liendoc/precis/ICK.pdf * Dosage de la CK totale

http://www.biolabo.fr/biolabo/pdfs/noticesFR/biochimieFR/FT-92207.pdf


* Dosage de la CK-MB https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CDD/manuals/CK-MB-Isoenzyme-Reagent-FR.pdf

c. La troponine La troponine est une protéine de

structure de la fibre musculaire localisée sur le filament de la myofibrille. Ce dernier, constitué d’une triple chaîne torsadée avec 2 brins d’actine et un brin de tropomyosine, porte à intervalle régulier un trimère associant la troponine T (TnT), la troponine C (TnC) et la troponine I (TnI).


Les sous unités Tn-I et Tn-T possèdent des isoformes spécifiques du cœur qui peuvent être dosées par immuno-néphélémétrie. Elles sont notés cTn-I et cTn-T. cTn-I est un marqueur spécifique, précoce et tardif qui augmente dès 3 heures après la crise et qui permet de mettre en évidence un infarctus sans signe clinique plusieurs jours après sa survenue car le retour à la normale se fait en 5 à 10 jours.

https://www.biomnis.com/referentiel/liendoc/precis/TROPONINES.pdf Le dosage sanguin de la troponine Ic peut être réalisé sur l’automate Advia

Centaur® (Bayer Diagnostics). Le principe analytique de chimiluminescence à l’ester d’acridinium associé à l’utilisation d’anticorps confère à ce dosage de type « sandwich » une grande spécificité et sensibilité. La molécule de troponine Ic est constituée de 206 acides aminés. La région la plus stable se trouve entre les acides aminés (aa) 30 et 110. Les acides aminés 1-31 sont les plus cardiospécifiques. La structure du test est la suivante :

– la phase solide est constituée de particules paramagnétiques auxquelles sont liés deux anticorps monoclonaux de souris qui permettent d’optimiser la stabilité du dosage tout en garantissant la cardiospécificité. L’un des anticorps est dirigé contre la région stable (entre les aa 70 et 110) de la troponine Ic. Le deuxième anticorps monoclonal est dirigé contre l’épitope P2 de la région cardiospécifique, entre les aa 11 et 26. Le test Bayer reconnaît de façon équimolaire les formes de TnIc libres et TnIc complexées. Il a été montré que la majeure partie de la TnIc est libérée sous la forme d’un complexe avec la troponine C cardiaque ;

– le traceur est constitué d’un anticorps polyclonal de chèvre marqué à l’ester d’acridinium. Il est dirigé contre l’épitope P3 de la région cardiospécifique entre les aa 27 et 40.

Figure 11 : principe de la chimiluminescence de type « sandwich » http://www.mdpi.com/2072-666X/8/5/149

http://www.jle.com/fr/revues/abc/e-docs/une_valeur_de_troponine_i_cardiaque_particulierement_elevee_265921/article.phtml?tab=texte

Source : https://www.has-sante.fr/portail/upload/docs/application/pdf/2010-02/document_cadrage_marqueurs_cardiaques.pdf

Documents

7.4- Exploration des lipides plasmatiqueschristelle.larcher.free.fr/eal.pdf · Principe du dosage du cholestérol total 75 % des méthodes de dosage sont des méthodes enzymatiques