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THÈSE
Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR des sciences fondamentales et appliquéesLaboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)
École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
Présentée par :Élodie Péraudeau
Évaluation et optimisation de l'efficacité de conjuguésanticancéreux ciblant les récepteurs de l'acide folique
Directeur(s) de Thèse :Laurent Cronier, Jonathan Clarhaut
Soutenue le 07 décembre 2016 devant le jury
Jury :
Président Sebastien Papot Professeur, Université de Poitiers
Rapporteur Frederic Blanchard Directeur de recherche, INSERM, Université de Nantes
Rapporteur Fabrice Soncin Directeur de recherche, INSERM, Université de Lille
Membre Laurent Cronier Maître de conférences, Université de Poitiers
Membre Jonathan Clarhaut Ingénieur de recherche, CHU, Université de Poitiers
Membre Francois Guilhot-Gaudeffroy Professeur et praticien hospitalier, Université de Poitiers
Membre Frédéric Schmidt Directeur de recherche CNRS, Institut Curie, Paris
Membre Nicolas Guilbaud Directeur de recherche, P. Fabre pharmaceutics, Toulouse
Pour citer cette thèse :Élodie Péraudeau. Évaluation et optimisation de l'efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs del'acide folique [En ligne]. Thèse Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique. Poitiers : Université de Poitiers, 2016.Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE DE DOCTORAT Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées
Diplôme national – Arrêté du 25 Avril 2012
Ecole doctorale Biosanté n°524 Discipline Biologie, Médecine, santé
Secteur Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
Présentée par
Elodie PERAUDEAU
Evaluation et optimisation de l’efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs de l’acide folique
Sous la direction des Dr Laurent Cronier et Jonathan Clarhaut et du Pr François Guilhot
Soutenue publiquement le 07 Décembre 2016 devant la commission d’examen
JURY
Dr Frédéric BLANCHARD Directeur de Recherche INSERM, Université de Nantes
Rapporteur
Dr Fabrice SONCIN Directeur de Recherche INSERM, Université de Lille
Rapporteur
Dr Nicolas GUILBAUD Directeur de l’innovation externe en oncologie, Pierre Fabre Pharmaceutics, Toulouse
Examinateur
Dr Frédéric SCHMIDT Directeur de Recherche CNRS Institut Curie, Paris
Examinateur
Pr Sébastien PAPOT Professeur Universitaire Université de Poitiers
Examinateur
Pr François GUILHOT Professeur Universitaire-Praticien Hospitalier CHU et Université de Poitiers
Examinateur
Dr Laurent CRONIER Maitre de Conférences Universitaire Université de Poitiers
Examinateur
Dr Jonathan CLARHAUT Ingénieur de Recherche CHU et Université de Poitiers
Examinateur
A ma mère
REMERCIEMENTS
C’est en toute logique que mes premiers remerciements s’adressent à mes
directeurs de thèse et tout particulièrement au Dr Jonathan Clarhaut, pour la confiance
qu’il m’a accordée en me recrutant d’abord en master puis en re-signant pour trois
années supplémentaires ! Et dire que tout est parti d’un coup du sort… Bien sûr, je te
remercie pour la formation scientifique et technique que tu m’as apportée. Mais aussi
pour des qualités plus subtiles à insuffler à un étudiant comme l’autonomie et la
confiance en ses capacités. Merci d’avoir imaginé tous les projets qui nous attendent,
qui nous poussent vers de nouvelles techniques et qui font que j’ai hâte de retourner à
la paillasse (et en réunion dès le lendemain de la soutenance…)!
Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Dr Laurent Cronier qui n’a pas hésité à
prendre la direction de cette thèse et qui a souvent représenté la voix de la raison dans
nos discussions et réunions. Merci pour votre présence et votre implication ainsi que
pour la patience dont vous avez fait preuve concernant l’apprentissage de la
manipulation sur animaux qui fut long et pas évident…
Ma reconnaissance s’adresse aussi au Pr François Guilhot qui, malgré son emploi
du temps chargé, a apporté son regard de clinicien expérimenté sur mes résultats au
cours de nos réunions.
Je souhaiterais remercier les membres extérieurs de mon jury de thèse, le Dr
Frédéric Blanchard, le Dr Fabrice Soncin, le Dr Nicolas Guilbaud et le Dr Frédéric
Schmidt, qui ont accepté d’accorder de leur temps pour faire le déplacement et
évaluer mon travail de thèse.
Toute ma gratitude s’adresse à l’ensemble du personnel du laboratoire de
Signalisation et Transports Ioniques Membranaires, en particulier aux membres de
l’équipe Implications Physiologiques et Physiopathologiques des Connexines qui m’ont
accueillie et avec qui j’ai pu collaborer. Je n’oublie pas non plus les donateurs et les
associations qui ont soutenu et permis la réalisation de cette thèse : Sport et Collection,
La Ligure Contre le Cancer, le Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers et France
ADOT86. Merci aux « jeunes » de l’étage, Camille « Camoïkis », Jonathan « N°Bis », et
Amandine pour les fous-rires, les nombreux débriefings de films et plus généralement
pour votre soutien et votre bonne humeur de (presque) tous les jours.
Merci également aux chimistes de L’institut de Chimie des Milieux et des
Matériaux de Poitiers avec qui j’ai eu la chance de collaborer toute ces années et en
particulier au Pr Sébastien Papot, même si je le l’entends déjà me chambrer en relisant
ce passage avec une voix beaucoup trop aiguë pour lui… Merci pour ta présence, ton
optimisme et ta créativité. J’ai tout de même le regret d’émettre quelques réserves sur
tes talents de graphiste…
Enfin, et de manière plus personnelle ma profonde gratitude s’adresse à mes
parents, qui m’ont toujours soutenue et cru en moi et qui ont sacrifié beaucoup pour
m’emmener jusque-là. Merci à toi, Quentin, pour ta patience, ton soutien et ta
compréhension indéfectibles. Merci à tous mes amis et notamment à Elodie avec qui
j’ai vécu cette aventure en parallèle, mais aussi à Jacques, Valentine et Clément avec
qui j’ai fait mes premiers pas à Poitiers il y a presque 10 ans maintenant !
AVANT-PROPOS
L’ère de la chimiothérapie pour le traitement du cancer a débuté dans les années 1940. En
dépit des nombreux progrès réalisé depuis, l’efficacité de cette stratégie de soin est toujours
limitée par les nombreux et sévères effets secondaires qu’elle entraine. Mon travail de thèse entre
dans le cadre du développement de nouveaux médicaments conçus pour cibler et détruire
sélectivement les tumeurs. L’introduction présentée dans ce document abordera succinctement
les différentes stratégies de ciblage thérapeutique des cancers avant de se focaliser sur les
récepteurs à l’acide folique dont le ciblage a constitué la majeure partie de mon travail. J’ai
abordé cette thématique selon deux approches :
une approche chimique au cours de laquelle de nouvelles molécules plus
performantes ciblant les récepteurs à l’acide folique ont été développées et testées
en collaboration avec les chimistes du groupe ;
une approche biologique qui a consisté à modifier les cellules tumorales pour
augmenter la quantité de récepteurs à l’acide folique afin de faciliter leur
reconnaissance et leur élimination par nos agents anticancéreux.
Ces travaux ont donné lieu à la publication de trois articles alors qu’un quatrième est en
cours de rédaction. De plus, au cours de ces trois années, j’ai eu l’opportunité de participer à des
études exploitant d’autres stratégies de ciblage thérapeutique donnant lieu à trois autres
publications et qui seront présentées de manière concise à la fin de ce document.
SOMMAIRE
SOMMAIRE
1ere Partie : Etat de l'art .................................................... 1
1er Chapitre – Généralités sur le cancer ...................................................... 1
I. Le cancer en quelques chiffres ............................................................................................... 1
II. Cancer : définition .................................................................................................................. 2
2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine ............................. 5
I. Des chimiothérapies classiques au ciblage des tumeurs ......................................................... 6
A. Les chimiothérapies classiques .......................................................................................... 6
B. Notion de ciblage tumoral .................................................................................................. 7
II. Les thérapies ciblées ............................................................................................................... 8
III.Les chimiothérapies vectorisées ........................................................................................... 10
A. Définition ......................................................................................................................... 10
B. Comment cibler les tumeurs? ........................................................................................... 10
1. Ciblage passif des tumeurs solides, exemple de l’« effet EPR » ....................... 11
2. Ciblage actif des tumeurs .................................................................................. 12
C. Différents types de vecteurs ............................................................................................. 13
1. Les nanotransporteurs ....................................................................................... 13
2. Les conjugués d’agents anticancéreux .............................................................. 14
3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs ....................................... 16
I. Les folates ............................................................................................................................. 16
II. Le transport des folates ......................................................................................................... 17
A. Le transporteur de folates réduits (RFC) .......................................................................... 17
1. Structure du gène et de la protéine RFC ........................................................... 17
2. Transport des folates par le RFC ....................................................................... 18
3. Expression et physiopathologies liées aux RFC ............................................... 18
B. Le transporteur de folates couplés aux protons (PCFT) ................................................... 19
1. Structure du gène et de la protéine PCFT ......................................................... 19
2. Transport des folates par le PCFT .................................................................... 20
3. Expression et physiopathologie liée au PCFT ................................................... 20
C. Les récepteurs à l’acide folique (FR) ............................................................................... 21
1. Généralités sur les FR ....................................................................................... 21
2. Différentes isoformes de FR ............................................................................. 22
3. Transport des folates et recyclage de FRα et FRβ ............................................. 25
4. Physiopathologies liées au récepteur FRα ......................................................... 25
5. Physiopathologies liées au récepteur FRβ ......................................................... 28
4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique ....................... 31
I. Les vecteurs de l’acide folique pour l’imagerie médicale .................................................... 31
A. Généralités ........................................................................................................................ 31
B. Exemple de l’Etarfolatide ................................................................................................. 32
II. Des vecteurs de l’acide folique à visée thérapeutique .......................................................... 33
A. Généralités ........................................................................................................................ 33
B. Exemple du Vintafolide ................................................................................................... 34
2e Partie : Objectifs de la thèse ....................................... 36
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs ...................... 36
I. Synthèse et validation d’un vecteur dérivé de la doxorubicine ............................................ 37
II. Synthèse du vecteur dérivé de la MMAE ............................................................................. 38
III.Transfert du concept sur cellules de patients ........................................................................ 40
→ Clarhaut J. et al., 2013, Leukemia Research........................................43
6e Chapitre – Objectifs de la thèse ............................................................. 42
3e Partie : Matériels & Méthodes ................................... 44
I. Culture cellulaire .................................................................................................................. 44
A. Modèles cellulaires ........................................................................................................... 44
B. Décongélation, entretien, congélation .............................................................................. 44
1. Décongélation des cellules ................................................................................ 44
2. Entretien des cellules ......................................................................................... 44
3. Congélation des cellules .................................................................................... 45
II. Etude de cytotoxicité ............................................................................................................ 46
A. Mesure de la viabilité cellulaire ....................................................................................... 46
1. Principe .............................................................................................................. 46
2. Protocole ............................................................................................................ 46
B. Mesure de la prolifération cellulaire ................................................................................ 47
1. Principe .............................................................................................................. 47
2. Protocole ............................................................................................................ 47
C. Mesure de l’apoptose ....................................................................................................... 48
1. Principe .............................................................................................................. 48
2. Protocole ............................................................................................................ 48
D. Test de morphogenèse sur Matrigel® .............................................................................. 49
III.Mesure de l’expression d’un gène par réaction en chaine par polymérase .......................... 50
A. Extraction des ARN totaux .............................................................................................. 50
1. A l’aide du kit Promega .................................................................................... 50
2. A l’aide du kit Macherey-Nagel ........................................................................ 51
3. Extraction d’ARN sur de petites quantités de cellules ...................................... 51
B. Qualité et dosage des ARN totaux ................................................................................... 52
C. Transcription inverse des ARN ........................................................................................ 52
1. A l’aide du kit Invitrogen .................................................................................. 52
2. A l’aide du kit Quanta ....................................................................................... 52
D. PCR quantitative en temps réel ........................................................................................ 53
1. Principe .............................................................................................................. 53
2. Protocole ............................................................................................................ 53
3. Analyse des résultats ......................................................................................... 54
IV.Etude de l’expression et de la localisation d’une protéine ................................................... 54
A. Etude de l’expression par Western blot ............................................................................ 54
B. Etude de la localisation par immunofluorescence ............................................................ 55
V. Etude de la résistance à l’anoïkis .......................................................................................... 56
A. Croissance sans ancrage et mesure de l’apoptose ............................................................ 56
B. Croissance en soft-agar .................................................................................................... 57
VI.Quantification de la MMAE par HPLC/HRMS ................................................................... 58
VII. Etudes in vivo ................................................................................................................... 58
A. Etude de l’efficacité antitumorale du vecteur MGAF ...................................................... 58
B. Analyse histopathologique des organes ........................................................................... 59
4e Partie : Résultats ......................................................... 60
7e Chapitre – Optimisation chimique ........................................................ 60
I. Synthèse et évaluation du vecteur diDGAF .......................................................................... 60
A. Introduction et principe de l’étude ................................................................................... 60
B. Résultats biologiques principaux ..................................................................................... 61
→ Grinda M. et al., 2013, Organic & Biomolecular Chemistry................64
II. Synthèse et évaluation du vecteur diMGAF ......................................................................... 63
A. Introduction et principe de l’étude ................................................................................... 63
B. Résultats biologiques principaux ..................................................................................... 64
→ Alsarraf J. et al., 2015, Chemical Communication...............................64
8e Chapitre – Optimisation biologique ...................................................... 65
I. Comment modifier l’expression du gène FOLR1 ? .............................................................. 65
II. Evaluation in vitro du mélange DV ...................................................................................... 67
A. Caractérisation des lignées KB et A549 ........................................................................... 67
B. Effet du mélange DV sur les cellules KB et A549 ........................................................... 68
1. Toxicité du mélange adjuvant ........................................................................... 68
2. Effet sur l’expression des récepteurs FR ........................................................... 68
C. Effet du mélange DV sur d’autres lignées tumorales ....................................................... 69
1. Caractérisation des lignées cellulaires ............................................................... 69
2. Toxicité et stimulation de FOLR1 induite par le mélange DV ......................... 70
D. Spécificité de la stimulation de FOLR1 ........................................................................... 71
E. Réversibilité de l’effet du traitement adjuvant ................................................................. 71
F. Effet du traitement adjuvant sur les cellules saines .......................................................... 72
III.Modulation in vivo de l’activité d’un vecteur anticancéreux ................................................ 73
A. Le mélange DV augmente-t-il in vivo l’expression tumorale des FR ? ........................... 73
1. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les tumeurs ........................................... 73
2. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les cellules saines ................................ 74
B. Modulation de l’activité antitumorale d’un vecteur ......................................................... 75
1. Effet sur la croissance tumorale ........................................................................ 75
2. Mesure de la quantité d’agent anticancéreux libéré .................................... 76
C. Toxicité du cotraitement – effets indésirables ............................................................. 77
1. Comportement et poids des souris ................................................................. 77
2. Etude histopathologique des organes sains ................................................... 77
IV. Mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du vecteur MGAF ................ 79
A. Internalisation du vecteur MGAF ................................................................................ 79
B. Effet du cotraitement sur la viabilité des cellules KB ................................................. 79
C. Toxicité du cotraitement sur les cellules cultivées en condition sans ancrage .......... 80
1. Effet sur la croissance des cellules dans une matrice semi-solide ............... 80
2. Effet sur l’apoptose dans les cellules KB cultivées en suspension............... 81
3. Effet sur les cellules HeLa, A2780 et A549 .................................................... 82
5e Partie : Discussion & Perspectives ............................. 84
I. Optimisation chimique des vecteurs dérivés de l’acide folique ...................................... 84
II. Optimisation biologique du ciblage des récepteurs à l’acide folique ............................. 86
A. Stimulation du gène FOLR1 .......................................................................................... 86
B. effets du mélange DV in vivo ......................................................................................... 89
C. Stimulation de l’activité d’un vecteur anticancéreux.................................................. 92
6e Partie : Conclusion ...................................................... 95
7e Partie : Travaux collaboratifs .................................... 98
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral .............................................................................. 98
→ Renoux B.. et al., 2016, Angewandte Chemie
(soumis)......................102
10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique ................... 103
→ Rubio S. et al., 2016, Peptide Science.................................................104
→ Barat R. et al., 2013, Chemical Science..............................................104
8e Partie : Bibliographie ............................................... 105
INDEX DES FIGURES &
TABLEAUX
INDEX DES FIGURES
Figure Sujet Page
1 Incidence et mortalité associées au cancer 2
2 Incidence et mortalité par cancer 2-3
3 Représentation de la carcinogenèse 2-3
4 Critères d’agressivité des cellules tumorales 3
5 Principe des chimiothérapies conventionnelles et des « Magic bullets » 7
6 Mécanismes des thérapies ciblées, des chimiothérapies classique et vectorisée 8
7 Structure de vaisseaux sanguins normaux et tumoraux 11
8 Principe des ciblages passif et acif 12
9 Représentation des différentes stratégies de vectorisation 13
10 Transport des folates 17
11 Conjugué d’acide folique et de fluorescéine isothiocyanate 31
12 Structure et activité de l’Etarfolatide (99mTc-EC20) 32
13 Structure et mécanisme d’action du Vintafolide (EC145) 34
14 Représentation et mode d’action des vecteurs dérivés de l’acide folique 37
15 Structure et hydrolyse du vecteur DGAF 37-38
16 Internalisation du vecteur DGAF dans les cellules HeLa et A549 37-38
17 Cytotoxicité du vecteur DGAF sur les cellules HeLa et A549 37-38
18 Structure du vecteur MGAF 38-39
19 Toxicité du vecteur MGAF en chambre de Boyden 38-39
20 Efficacité antitumorale du vecteur MGAF in vivo 39
21 Expression de FOLR2 et toxicité du DGAF sur des cellules leucémiques 40
22 Expression de FOLR2 et internalisation du DGAF dans des cellules de patient 41
23 Représentation des deux approches abordées au cours de ma thèse 42
24 Exemple de courbe obtenue en RT-qPCR 54
25 Structure et hydrolyse du vecteur diDGAF 61
26 Etude en microscopie confocale de l’internalisation du vecteur diDGAF 62
27 Toxicité du vecteur diDGAF sur les cellules A2780 et A549 62-63
28 Etude par cytométrie en flus de l’internalisation du diDGAF 62-63
29 Structure du vecteur diMGAF 63
30 Caractérisation de l’expression des FR dans les cellules KB et A549 67
31 Toxicité du mélange DV sur les cellules KB et A549 68
32 Effet du mélange DV sur l’expression des FR dans les cellules KB et A549 69
33 Expression de FOLR1 et FOLR2 des cellules KB, HeLa, A2780 et A549 70
34 Effet du mélange DV sur l’expression des FR dans les cellules HeLa et A2780 71
35 Effet du mélange DV sur l’expression des gènes RFC et PCFT 71-72
36 Réversibilité de l’effet du DV sur l’expression de FOLR1 71-72
37 Effet du mélange DV sur les cellules saines HUVEC 72
38 Effet in vivo du mélange DV sur l’expression des FR tumoraux 73
39 Effet in vivo du mélange DV sur FOLR1 dans les cellules saines 74
40 Effet du mélange DV sur l’activité du vecteur MGAF in vivo 75
41 Effet du mélange DV sur le poids des souris et étude histopathologique 77
42 Quantité de MMAE dans les cellules KB et A549 et cytotoxité 79
43 Croissance des cellules KB en matrice semi-solide d’agarose 80
44 Croissance des cellules KB sur poly-HEMA 81
45 Croissance des cellules HeLa, A2780 et A549 en matrice semi-solide 82
46 Modes d’action hypothétique du mélange DV sur la régulation des FR 86
47 Alternative au VPA et vecteur hétérodimérique dexaméthasone/MS-275 91
48 Mécanismes de déclenchement de l’anoïkis 92
49 Structure du vecteur MMAE-Alb 99
50 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur des xénogreffes tumorales KB 100
51 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur des tumeurs orthotopiques du
sein et du pancréas
101
52 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur la régression des tumeurs
orthotopiques du pancréas de volume important
102
INDEX DES TABLEAUX
Tableau Sujet Page
1 Distribution tissulaire des récepteurs à l’acide folique 22
2 Niveau d’expression des récepteurs à l’acide folique dans les cancers 27
3 Toxicité du MGAF en fonction du niveau de FOLR1 38-39
4 Caractéristiques des lignées cellulaires utilisées 45
5 Marquage des cellules par le Apoptotic/Necrotic/Healthy Cell Detection Kit 48
6 Séquences des couples d’amorces utilisés en RT-qPCR 53
7 Anticorps primaires et secondaires utilisés en Western blot 55
8 Anticorps primaires et secondaires utilisés en Immunofluorescence 56
9 Toxicité du vecteur diMGAF sur les cellules HeLa, SKOV-3 et A2780 64
10 Quantification de la MMAE présente dans les cellules A2780 64
11 Facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation de FOLR1 87
12 Toxicité du MMAE-Alb sur les cellules KB, MDA-MB-231 et MIA-PaCA2 99
ABREVIATIONS
ABREVIATIONS
5’UTR : 5’ Untranslated Region, région non transcrite en 5’ A ABC : ATP-Binding Cassette ADN : acide désoxyribonucléique ARN : acide riboNucléique ATP : adénosine triphosphate B Bim : Bcl-2 interacting mediator of cell death BrdU : 5-bromo-2’-déoxyuridine BSA : Bovin Serum Albumin C CIPA : Centre d’Imagerie du Petit Animal Ct : Cycle treshold, cycle seuil D Dexa : dexamethasone DGAF : Doxorubicine-Galactoside-Acide Folique diDGAF : diDoxorubicine-Galactoside-Acide Folique diMGAF : diMMAE-Galactoside-Acide Folique dNTP : désoxyribonucléotides DO : densité optique DV : mélange adjuvant composé de dexaméthasone et de VPA E EBM-2 : Endothelial cell Basal Medium-2 EGM-2 : Endothelial cell Growth Medium-2 EMEM : Eagle’s Minimum Essential Medium EPR : Enhanced Permeability and Retention ER : Estrogen Receptor EthD-III : Ethidium Homodinère III F FAK : Focal Adhesion Kinase FDA : Food and Drug Administration FITC : Isothiocyanate de fluorescéine
FR : Folate Receptor, récepteur à l’acide folique G GPI : Glycosyl PhosphatidylInositol GRE : Glucocorticoid receptor Response Element H HDAC : Histone Déacétylase HER2 : Human Epidermal Growth Factor-2 HPLC : chromatographie en phase liquide à haute performance HRMS : spectrométrie de masse à haute résolution HRP : Péroxydase de Raifort HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells I IRM : Imagerie à Résonance Magnétique K kDa : kilo Dalton L LAM : Leucémie Aigue Myéloblastique LMC : Leucémie Myéloïde Chronique -luc : luciférase M MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinases MDR : Multi-Drug Resistance Proteins MGAF : MMAE-Galactoside-Acide Folique MHAF : Malabsorption Héréditaire de l’acide folique MMAE : MonoMéthyl Auristatine E N NEAA : Non-Essential Amino Acids NRF-1 : Nuclear Respiratory Factor 1
P PBS : Phosphate Buffered Saline PCFT : Proton Coupled Folate Transporter, transporteur de folates couplé aux protons PCR : Polymerase Chain Reaction, réaction en chaine par polymérisation PEG : Poly-Ethylène Glycol PI3K : PhosphoInositol-3-Kinase
Poly-HEMA : poly(2-hydroxyethyl methacrylate) PS : Pénicilline/Streptomycine R RFC : Reduced Folate Carrier, transporteur de folates réduits rpm : rotations par minute RPMI : Roswell Park Memorial Institute RT-qPCR : PCR quantitative en temps réel S SAHA : acide subéroylanilide hydroxamique siRNA : short interfering RNA SVF : Sérum de Veau Fœtal
T TEMP : Tomographie par Emission MonoPhotonique TEP : Tomographie par Emission de Positons THF : Tetrahydrofolate TSA : Trichostatine A V VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR : Vascular Endothelium Growth Factor Receptor VPA : acide valproïque
1ERE PARTIE
ETAT DE L’ART
1ere Partie – Etat de l’art 1er Chapitre – Généralités sur le cancer
1
1ER CHAPITRE
Généralités sur le cancer
I. LE CANCER EN QUELQUES CHIFFRES
Selon le rapport « Les Cancers en France » publié en 2014 par l’Institut National du
Cancer, le nombre de nouveaux cas de cancers (toutes origines confondues) diagnostiqués en
France a augmenté d’environ 109 % chez l’homme comme chez la femme entre 1980 et 2012
(Figure 1). Ainsi, un homme sur deux et une femme sur trois de moins de 85 ans se voient
diagnostiquer un cancer. Ces chiffres sont liés à l’accroissement et au vieillissement de la
population française mais également à l’amélioration des techniques de dépistage de cette
maladie. Le cancer le plus fréquent chez l’homme est de loin le cancer de la prostate (56 800 cas
par an), suivi du cancer du poumon (28 200 cas par an) et du cancer colorectal (23 200 cas par
an ; Binder-Foucard et al., 2014). Avec 48 800 nouveaux cas diagnostiqués en 2012, le cancer du
sein est le plus fréquent chez la femme, suivis par les cancers colorectaux (18 900 cas) et
pulmonaires (11 300 cas ; Figure 2A). Selon cette étude, sur la période comprise entre 1980 et
2012, certains cancers moins fréquents ont vu leur incidence augmenter fortement. C’est le cas
des mélanomes de la peau (+ 590,7 %), des cancers de la thyroïde (+ 577,6 %), du foie (+ 350,9
%), du pancréas (+ 247,7 %) et du rein (+ 206,9 %).
Sur la même période, l’amélioration des traitements mais également les diagnostics à des
stades précoces de la maladie se sont traduits par une diminution du risque de décès à cause du
cancer. Malgré cela, l’accroissement et le vieillissement de la population aboutissent tout de
même à une augmentation de plus de 10 % chez l’homme et d’environ 17 % chez la femme du
nombre de décès liés à cette maladie (Figure 1). Chez l’homme, le cancer du poumon reste le
plus meurtrier avec plus de 21 000 décès estimés, loin devant les cancers colorectaux (9 300
décès) et prostatiques (8 900 décès). Chez la femme, les trois cancers entrainant le plus de
Figure 1. Incidence (A) et mortalité (B) des cancers de toutes origines confondues en France
métropolitaine sur la période 1980 - 2012. D’après Binder-Foucard F., 2014 et Les Cancers en
France, Les Données, INCa, 2014.
1ere Partie – Etat de l’art 1er Chapitre – Généralités sur le cancer
2
mortalité sont les cancers du sein (11 900 décès), du poumon (8 600 décès) et les cancers
colorectaux (8 400 décès ; Figure 2B).
Globalement, l’analyse de l’évolution de l’incidence et de la mortalité liée au cancer sur
la période 1980 – 2012 montre que pour de nombreux cancers (estomac, col de l’utérus, sein,
prostate…) l’incidence et/ou la mortalité ont diminué. En revanche, d’autres cancers présentent
des évolutions plus préoccupantes avec une augmentation à la fois de l’incidence et de la
mortalité. C’est notamment le cas du cancer du poumon chez la femme, du mélanome cutané et
du cancer du système nerveux central (Binder-Foucard et al., 2014).
II. CANCER : DEFINITION
Le terme « cancer » regroupe un ensemble de maladies caractérisées par la prolifération
et la propagation incontrôlées de cellules anormales. On distingue deux grandes catégories de
cancers : les cancers dits « solides » qui regroupent les carcinomes d’origine épithéliale et les
sarcomes qui apparaissent dans le tissu conjonctif, ainsi que les cancers hématopoïétiques qui
affectent des cellules sanguines situées dans la moelle osseuse dans le cadre des leucémies, ou
bien dans les organes lymphoïdes (ex : les ganglions lymphatiques) pour les lymphomes.
La carcinogenèse est un processus multifactoriel et complexe qui se développe autour de
trois étapes principales : l’initiation, la promotion et la progression. De manière simplifiée, au
cours de l’initiation, une cellule normale acquiert des anomalies génétiques irréversibles
conduisant à sa transformation (Figure 3A). Ces mutations peuvent se produire de manière
spontanée, par exemple suite à une erreur lors de la réplication de la cellule, mais dans la plupart
des cas, il s’agit d’une conséquence d’une exposition à des agents carcinogènes (polluants,
produits chimiques, rayons ultraviolets, virus, etc.) et/ou à l’influence de facteurs intrinsèques
(dérèglement hormonal ou immunitaire, mutation héréditaire, etc.). Lorsque ces altérations se
produisent au niveau de proto-oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs, cela peut
conduire à la dérégulation de processus essentiels à l’homéostasie cellulaire tels que la
croissance, la prolifération et la survie cellulaires. Ces mutations peuvent également altérer la
fonction de gènes impliqués dans la surveillance et la réparation du génome. On parle alors de
cellule initiée (pour revue : Oliveira et al., 2007).
Figure 2. Incidence (A) et mortalité (B) estimées par cancer chez les hommes et chez les
femmes en France métropolitaine en 2012. Les données concernant la mortalité pour le cancer du
foie et du pancréas ne sont pas disponibles compte tenu de leur faible qualité. D’après Binder-
Foucard F., 2014.
Figure 3. Représentation de la carcinogenèse. (A) Suite à une mutation spontanée ou à
l’exposition à des facteurs carcinogènes, une cellule normale acquière des altérations génétiques
irréversibles. C’est l’étape d’initiation. (B) Pendant l’étape de promotion, et en présence de
facteurs promoteurs, la cellule initiée prolifère pour former une lésion précancéreuse. (C) La
phase de progression correspond à la transformation de la lésion pré-maligne en cancer invasif.
Les cellules tumorales sont soumises à une forte instabilité génétique et acquièrent des
caractéristiques d’agressivité comme la capacité à envahir les tissus adjacents. (D) La mise en
place d’une angiogenèse soutient la croissance tumorale et favorise la dissémination des cellules
cancéreuses et la formation de métastases.
Figure 4. Au cours des différentes étapes de la carcinogenèse, une cellule cancéreuse acquiert
différents critères d’agressivité. Elle développe une auto-suffisance en facteurs de croissance,
une insensibilité aux facteurs anti-prolifératifs et apoptotiques et échappe à la sénescence
cellulaire ce qui lui confère un potentiel réplicatif illimité. Elle peut induire une angiogenèse
tumorale et développer des capacités d’invasion et un potentiel métastatique.
1ere Partie – Etat de l’art 1er Chapitre – Généralités sur le cancer
3
La promotion (Figure 3B) correspond à l’amplification clonale, autrement dit à la
prolifération, de la cellule initiée en réponse à des facteurs dits promoteurs tels que peuvent l’être
certaines hormones (Mehta, 1995). Contrairement à l’étape d’initiation, la promotion peut être
réversible. Après disparition de l’agent promoteur, il peut y avoir régression tumorale,
probablement par un processus d’apoptose (Oliveira et al., 2007).
Au cours de ces deux étapes, les cellules transformées subissent des mutations
additionnelles ainsi que des réarrangements génétiques qui leur permettent d’acquérir différentes
caractéristiques (Figure 4). Elles deviennent notamment indépendantes vis-à-vis des signaux
extérieurs de croissance : les cellules mutées sécrètent leurs propres facteurs de croissance et
stimulent leur prolifération de manière autocrine (Pedraza-Fariña, 2006). Elles développent
également une résistance aux facteurs inhibant la prolifération et déclenchant l’apoptose, ainsi
qu’un échappement à la senescence cellulaire (Hanahan and Weinberg, 2011).
L’étape de progression (Figure 3C) correspond à la transition entre une lésion pré-
maligne, telle qu’elle peut l’être au cours des étapes d’initiation et de promotion, et le
développement d’un cancer invasif. Au cours de cette phase, les cellules mutées acquièrent une
capacité invasive et un potentiel métastatique (Figure 4). Elles sont alors caractérisées par une
forte instabilité génétique, une croissance rapide et présentent des changements morphologiques,
biochimiques et métaboliques (Oliveira et al., 2007). L’angiogenèse, ou la formation de
vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est également un processus important dans
cette étape. En effet, en absence d’angiogenèse, la croissance tumorale est limitée à 1 ou 2 mm3
(Folkman, 1995). Au-delà, les cellules se trouvant au centre souffrent d’hypoxie et de carence en
nutriments. Pour y remédier, les cellules sécrètent des facteurs dits pro-angiogéniques dont le
Vascular Endothélium Growth Factor ou VEGF est un des plus emblématiques. En se liant à son
récepteur (le VEGFR ou Vascular Endothélium Growth Factor Receptor) situé à la membrane
des cellules endothéliales, le VEGF stimule la prolifération et la migration de ces dernières, qui
vont alors irriguer la tumeur (Figure 3D). Associée au potentiel invasif des cellules tumorales,
l’angiogenèse est ainsi un processus clé de la dissémination des cellules malignes et favorise la
formation de métastases dans les tissus situés à distance de la tumeur primaire (Hanahan and
Folkman, 1996 ; Hanahan and Weinberg, 2000). La lymphangiogenèse qui correspond à la
formation de capillaires lymphatiques au niveau de la tumeur participe également à ce
phénomène et est impliquée dans la colonisation des ganglions lymphatiques par les cellules
cancéreuses (Christiansen and Detmar, 2011).
1ere Partie – Etat de l’art 1er Chapitre – Généralités sur le cancer
4
En conclusion, avec plus de 384 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2015 et plus de
149 000 décès liés à cette pathologie, le cancer demeure aujourd’hui encore un problème majeur
de santé publique. Cette maladie est également un enjeu socio-économique puisque les dépenses
liées à la prise en charge des cancers en 2014 ont représenté plus de 5 milliards d’euros. En
France, depuis 2003, la lutte contre le cancer s’est structurée autour de plans nationaux appelés
« Plan Cancer » qui définissent des objectifs pour guider la prévention, le dépistage, les soins, la
recherche et l'accompagnement des patients. Ainsi, l’objectif 5 du troisième plan cancer s’étalant
de 2014 à 2019 souligne l’importance de l’innovation thérapeutique et du développement de la
médecine personnalisée notamment avec l’utilisation de nouveaux biomarqueurs pour le choix
des traitements. Il oriente ainsi la recherche vers l’optimisation des traitements et l’amélioration
de la qualité de vie des patients.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
5
2E CHAPITRE
De la chimiothérapie à la nanomédecine
Les protocoles de traitement mis en place pour lutter contre les cancers sont choisis en
fonction de différents facteurs prenant en compte l’âge et l’état général de la personne, le type et
le degré d’extension du cancer dont elle est atteinte ainsi que la présence d’éventuelles autres
maladies. La chirurgie, utilisée depuis de nombreux siècles pour l’ablation des tumeurs solides
fut longtemps la seule ligne d’attaque contre cette maladie. Aujourd’hui, elle est souvent utilisée
avec la radiothérapie pour lutter contre les tumeurs solides. Cependant, ces deux stratégies de
soin s’avèrent inefficaces lorsque le cancer est caractérisé par un fort potentiel métastatique,
qu’il est disséminé au sein de l’organisme ou que le patient présente un haut risque de rechute.
En agissant de manière systémique, les chimiothérapies cytotoxiques permettent de pallier à ce
manque car elles peuvent agir sur les cellules malignes disséminées dans l’ensemble du corps.
Bien qu’essentiels encore aujourd’hui dans les protocoles de traitement, le manque de
sélectivité des médicaments utilisés en chimiothérapie est souvent responsable de sévères effets
secondaires. Un des objectifs présents de la recherche en oncologie médicale est donc de
développer des molécules ou des stratégies innovantes capables de rendre l’action de l’agent
anticancéreux spécifique des cellules pathologiques à éliminer et, par conséquent, de limiter les
effets secondaires vis-à-vis du reste de l’organisme.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
6
I. DES CHIMIOTHERAPIES CLASSIQUES AU CIBLAGE DES
TUMEURS
A. LES CHIMIOTHERAPIES CLASSIQUES
L’aire de la chimiothérapie cytotoxique pour le traitement du cancer a débuté dans les
années 1940, lorsque Goodman et Gilman découvrent que les moutardes azotées, des dérivés du
gaz moutarde, sont capables d’entrainer une régression tumorale chez des patients atteints de
lymphome non-Hodgkinien (Gilman, 1963). Depuis, plusieurs dizaines de molécules
cytotoxiques ont été identifiées et sont utilisées pour le traitement des cancers. Il en existe
plusieurs catégories, classées par la société Vidal selon leur mode d’action. Les agents alkylants
forment des liaisons covalentes avec l’ADN pour en inhiber la réplication. On retrouve dans
cette catégorie les moutardes azotées citées ci-dessus, ainsi que la cisplatine qui est fréquemment
utilisée contre le cancer ovarien (Dasari and Tchounwou, 2014). Les anti-métabolites
comprennent des antifolates tels que le methotrexate et le pemetrexed ainsi que des antipuriques
et des antipyrimidiques (fluorouracil). Ces molécules qui inhibent la synthèse des acides
nucléiques et bloquent ainsi la réplication sont utilisées pour lutter notamment contre les cancers
mammaires, ovariens et colo-rectaux mais également pour le traitement des ostéosarcomes et des
choriocarcinomes (tumeurs du trophoblaste ; Gonen and Assaraf, 2012). Les taxanes et les vinca-
alcaloïdes tels que la vinblastine appartiennent au groupe des poisons du fuseau mitotique. Ils
perturbent la polymérisation des microtubules et empêchent ainsi la division cellulaire. A titre
d’exemple, la vinblastine est utilisée dans une variété de cancers incluant les cancers de l’ovaire,
de la vessie, du rein (Yue et al., 2010). Enfin, on trouve les inhibiteurs de topoisomérases, des
enzymes impliquées dans la réplication de l’ADN. Cette catégorie regroupe les anthracyclines
telles que la doxorubicine, une molécule fréquemment utilisée pour le traitement des leucémies
et des lymphomes (Rivankar, 2014).
Malgré leur diversité, l’efficacité des chimiothérapies conventionnelles est limitée par les
nombreuses contraintes qu’elles entrainent. En effet, les agents utilisés en chimiothérapie
traditionnelle exploitent les propriétés cytotoxiques d’agents non spécifiques, qui circulent dans
l’ensemble de l’organisme et qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles soient
cancéreuses ou non (Figures 3). Ce manque de sélectivité vis-à-vis des cellules malignes induit
une toxicité importante envers certaines cellules saines telles que les cellules du système
Figure 5. Les chimiothérapies classiques affectent sans discrimination les cellules cancéreuses et
les cellules saines (à gauche). Cela se traduit par la manifestation de nombreux effets secondaires
chez les patients. Paul Ehrlish proposa la création de « magic bullets », des médicaments qui
seraient conçus pour reconnaitre une structure moléculaire pathologique et ainsi épargner les
tissus sains (à droite, Strebhardt et Ullrich, 2008).
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
7
immunitaire, les cellules épithéliales gastro-intestinales, les follicules pileux, etc. De nombreux
effets secondaires dont la gravité peut varier sont alors observés suite à une chimiothérapie. Par
exemple, elles peuvent entrainer une aplasie médullaire (diminution de la proportion d’un ou
plusieurs types de cellules sanguines), une inflammation des muqueuses notamment de
l’œsophage et du colon pouvant aboutir à la formation d’ulcères, des diarrhées, constipations,
nausées et vomissements. Dans les cas les plus graves, les chimiothérapies peuvent être
responsables de lésions au niveau des organes, comme la doxorubicine pour laquelle une forte
toxicité au niveau du cœur a été rapportée (Rivankar, 2014).
A cause de ces lourds effets secondaires, la quantité d’agent anticancéreux administrée
au patient est souvent limitée voir insuffisante pour éradiquer le cancer et l’arrêt prématuré du
traitement est parfois recommandé. Par ailleurs, les cellules cancéreuses en présence de ces
agents de chimiothérapie traditionnelle développent régulièrement des mécanismes de
résistances dits multidrogues. Ces résistances peuvent résulter de plusieurs mécanismes tels que
des modifications lipidiques qui entrainent une internalisation moins efficace de l’agent
anticancéreux ou à la surexpression d’une famille de transporteurs ABC ou ATP-Binding
Cassette (Núñez et al., 2016). Ces protéines, appelées MDR pour Multidrug Resistance Proteins,
utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP (adénosine triphosphate) pour prendre en charge
l’agent chimiothérapeutique et l’expulser hors de la cellule cancéreuse (Zhang et al., 2015). Elles
sont notamment responsables d’une diminution de la sensibilité des cellules cancéreuses
pulmonaires à la vincristine, la cisplatine et à la doxorubicine (Young et al., 2001).
B. NOTION DE CIBLAGE TUMORAL
Considéré comme le père de la chimiothérapie, le célèbre immunologiste Paul Ehrlich
avait déjà conscience au début du XXe siècle de la « puissance aveugle » de ces molécules de
chimiothérapie et émit l’idée de la création de « magic bullets », des médicaments attaquant
efficacement une structure biologique pathogène tout en demeurant inoffensifs pour le reste de
l’organisme (Strebhardt et Ullrich, 2008 ; Figure 5). Dans le cadre du traitement du cancer, cela
signifie développer des agents thérapeutiques, utilisés seuls ou en combinaison avec des
chimiothérapies traditionnelles et dont l’activité est spécifique des cellules cancéreuses. Cet
objectif peut être atteint par deux approches différentes : les thérapies ciblées et les
chimiothérapies vectorisées dont les principes sont décrits ci-dessous.
Figure 6. (A) Les thérapies ciblées sont conçues pour altérer des acteurs majeurs de voies de
signalisation cruciales au développement du cancer. (B) Les agents anticancéreux utilisés en
chimiothérapie classique peuvent souvent pénétrer par diffusion passive dans les cellules
cancéreuses mais également dans les cellules saines, causant de nombreux effets secondaires. (C)
Enfin, la plupart des vecteurs anticancéreux ciblent des marqueurs moléculaires surexprimés ou
exprimés spécifiquement à la surface des cellules malignes. Le vecteur est ensuite internalisé
dans la cellule par endocytose et l’agent cytotoxique libéré pour tuer la cellule de l’intérieur.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
8
II. LES THERAPIES CIBLEES
La première approche pour le ciblage des cellules tumorales est une approche directe : les
molécules altèrent directement des voies de signalisation essentielles à la survie ou à la
progression tumorale (Figure 6A). La protéine ciblée par le médicament doit être drastiquement
surexprimée dans les cellules cancéreuses ou présenter une activité fortement augmentée
comparée aux cellules saines. Il peut également s’agir d’une forme mutée de la protéine ou d’une
protéine chimérique résultant de la fusion de deux gènes. Dans cette catégorie de médicaments,
on trouve généralement des anticorps monoclonaux dont un des plus emblématiques est le
Bevacizumab (Avastin®, Genentech). Le Bevacizumab, un anticorps humanisé dirigé contre le
VEGF-A (vascular endothelial growth factor A), est utilisé en complément de chimiothérapies
classiques pour bloquer l’angiogenèse tumorale (Kim et al., 1993). Il est utilisé pour le
traitement de plusieurs cancers tels que les cancers colorectaux, pulmonaires et mammaires mais
également pour la prise en charge de certaines formes de dégénérescence maculaire liée à l’âge
(Falk et al., 2015).
En plus des anticorps monoclonaux, on trouve également dans cette catégorie de thérapie
à ciblage direct de petites molécules inhibitrices comme l’Alpelisib (BYL917, Novartis) ou
l’Imatinib mesylate (Glivec®, Novartis). Le BYL917 est un inhibiteur spécifique de la
phosphoinositol-3-kinase (PI3K), une protéine à la base de nombreuses voies de signalisation
(apoptose, prolifération, différenciation, migration cellulaire, etc.) est fréquemment dérégulée
dans de nombreux cancers (Katso et al., 2001 ; Engelman, 2009). Le BYL917 est actuellement
testé dans différents essais cliniques de phase 1 pour le traitement de patients souffrant de
différents cancers solides (cancers mammaires, colorectaux, ovariens, etc. ; De Buck et al.,
2014). De plus, compte tenu des données précliniques et cliniques obtenues pour le BYL917,
Gobin et al., ont proposé en 2015 d’utiliser le BYL917 pour le traitement de l’ostéosarcome. Au
cours de cette étude préclinique, le BYL917 a montré qu’il était capable d’entrainer une
diminution de la croissance tumorale d’une part en inhibant la croissance des cellules tumorales,
mais également en influant sur le microenvironnement de la tumeur notamment pour inhiber
l’angiogenèse (Gobin et al., 2015).
Un autre exemple de thérapie ciblée est l’Imatinib mesylate. Ce médicament cible
différentes protéines ou récepteurs à activité tyrosine-kinase et notamment une protéine
particulière présente uniquement dans les cellules malignes de patients souffrant de leucémies
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
9
myéloïdes chroniques (LMC) : la protéine de fusion BCR-ABL (Rea et al., 2012). Cette protéine
est le produit du gène de Philadelphie, un gène de fusion issu d’une altération chromosomique au
niveau des gènes BCR et ABL. La protéine BCR-ABL est constitutivement activée et stimule la
prolifération des cellules leucémiques (Røsland et Engelsen, 2015). L’Imatinib mesylate est
apparu comme une révolution dans le traitement des LMC entrainant des résultats supérieurs au
traitement utilisé jusqu’alors (une combinaison d’interféron α et de cytarabine ; O’Brien et al.,
2003) et une survie globale à 5 ans de 89 % des patients (Druker et al., 2006). Par ailleurs,
l’Imatinib mesylate est également utilisé pour le traitement des tumeurs stromales gastro-
intestinales et des dermatofibrosarcomes protuberans dans lesquels il inhibe d’autres protéines
tyrosine-kinases telles que le récepteur Kit (Waller, 2014 ; Rutkowski and Debiec-Rychter,
2015).
La seconde approche permettant le ciblage des tumeurs est une approche indirecte qui
repose sur la reconnaissance et l’utilisation de caractéristiques spécifiques des cellules tumorales
ou de leur microenvironnement pour réaliser l’adressage d’agents chimiothérapeutiques
uniquement à ces cellules (Figure 6C). Pour cela, on utilise des vecteurs ou des conjugués, c’est-
à-dire des molécules permettant le transport et la protection du principe actif jusqu’au site
pathologique à traiter. On parle alors de chimiothérapie vectorisée, une stratégie qui fait l’objet
de mes travaux de thèse et qui est décrite plus particulièrement dans le chapitre suivant.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
10
III. LES CHIMIOTHERAPIES VECTORISEES
A. DEFINITION
La vectorisation consiste à associer un principe actif à une structure ou un édifice
moléculaire permettant son transport jusqu’au site d’action où il est libéré de manière contrôlée
(Pérez-Herrero and Fernández-Medarde, 2015). La vectorisation d’agents anticancéreux présente
de nombreux avantages puisqu’en plus de protéger les tissus sains des agents transportés, les
molécules vectorisées permettent d’éviter ou de ralentir la dégradation ou l’élimination du
principe actif par l’organisme. Certains composés permettent également de s’affranchir des
problèmes de solubilité et de stabilité du principe actif et d’en maitriser les propriétés de
pharmacodynamique et de pharmacocinétique (Duncan et Gaspar, 2011). De nombreuses
stratégies de vectorisation ont donc été imaginées pour transporter des médicaments ou des
agents permettant le diagnostic des tumeurs (agents de contraste pour l’imagerie médicale par
exemple). L’objectif de ce chapitre n’est pas d’en dresser une liste exhaustive mais, après une
présentation générale de l’adressage de ces molécules vectorisées aux cellules cancéreuses suite
à la reconnaissance de marqueurs tumoraux, de décrire les deux grandes familles de vecteurs :
les transporteurs et les conjugués.
B. COMMENT CIBLER LES TUMEURS?
A cause de l’instabilité génétique qui caractérise les cellules tumorales, chaque cancer
peut être considéré comme unique dans son répertoire de mutations et d’anomalies génétiques.
Cependant, les études dites « OMICS » (génomique, protéomique, métabolomique…) menées à
grande échelle font ressortir un certain nombre de particularités phénotypiques communes à
certaines cellules cancéreuses et permettant leur distinction des cellules saines (Alexandrov et
al., 2013). Ces signatures tumorales, ou marqueurs, sont exprimées par la cellule cancéreuse elle-
même, mais peuvent également être des spécificités du microenvironnement tumoral.
Pour reconnaitre les tumeurs, les molécules vectorisées exploitent deux types de ciblage.
Le ciblage passif tire profit des différences physiques entre les cellules saines et les cellules
cancéreuses ou leur microenvironnement. Il est principalement utilisé pour le ciblage des
Figure 7. Structure de vaisseaux sanguins normaux (à gauche) et tumoraux (à droite) en
microscopie électronique. (A) Les tissus sains murins ont une vascularisation simple et organisée
en artérioles, capillaires et veinules. Au contraire, la vascularisation tumorale ne suit pas cette
hiérarchie et présente une structure désorganisée et hautement ramifiée (d’après McDonald and
Baluk, 2005). (B) Les cellules endothéliales formant la paroi luminale des vaisseaux sanguins
sains sont lisses et présentent une structure resserrée, ce qui n’est pas le cas des cellules
endothéliales des vaisseaux tumoraux qui forment des pores dans lesquelles les macromolécules
peuvent s’accumuler et diffuser vers la tumeur (d’après Baluk et al., 2005).
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
11
tumeurs solides. Le ciblage actif des tumeurs repose sur la reconnaissance de marqueurs
moléculaires présents ou surexprimés de manière spécifique sur les cellules cancéreuses, tels que
peuvent l’être certains récepteurs membranaires.
1. Ciblage passif des tumeurs solides, exemple de l’« effet EPR »
Le ciblage passif des tumeurs solides exploite les différences physiques entre les tissus
tumoraux et les tissus sains pour déposer ou activer plus efficacement la molécule vectorisée là
où elle doit agir. Une des caractéristiques les plus exploitées pour ce type de ciblage est la
vascularisation anormale des tumeurs. En effet, comme les tissus normaux, les cellules tumorales
nécessitent un apport suffisant en nutriments et en oxygène pour survivre et se développer. Pour
cela, elles stimulent la formation de vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants par un
processus appelé angiogenèse. Chez l’adulte, les cellules endothéliales sont quiescentes en
conditions physiologiques et l’angiogenèse, est quasiment inexistante due à la balance entre la
production de facteurs pro- et anti-angiogéniques. Les cellules cancéreuses, en sécrétant des
facteurs pro-angiogéniques, activent les cellules endothéliales avoisinantes qui prolifèrent alors
pour former des vaisseaux et irriguer la tumeur (Folkman, 1995). La production non contrôlée de
ces facteurs pro-angiogéniques aboutit à la formation rapide d’un réseau vasculaire dont
l’architecture est fragile et aberrante. En effet, outre l’absence de hiérarchisation des vaisseaux
sanguins tumoraux, ceux-ci présentent une porosité plus importante que les vaisseaux normaux
et sont donc plus perméables aux macromolécules (Figure 7 ; Baluk et al., 2005 ; McDonald et
Baluk, 2005 ; Smith et al., 2012). De plus, l’absence ou le faible drainage lymphatique au sein
des tumeurs y entraine une rétention des macromolécules. Ce phénomène, appelé effet « EPR »
pour « Enhanced Permeabily and Retention », confère un avantage à certains vecteurs comme les
liposomes et les nanoparticules qui circulent à travers les pores des vaisseaux sanguins tumoraux
et s’accumulent dans les tissus malades (Figure 8 ; Zwicke et al., 2012). Ce ciblage passif est
donc conditionné préférentiellement par la taille du vecteur, sans véritable reconnaissance d’une
cible moléculaire.
Figure 8. (A) La structure des vaisseaux sanguins normaux empêche l’extravasation des
nanotransporteurs. (B) Le ciblage passif des tumeurs tire profit de la fenestration importante des
vaisseaux tumoraux. Les nanotransporteurs peuvent alors s’accumuler dans les pores des
vaisseaux et rejoindre le microenvironnement de la tumeur. (C) Le ciblage actif des tumeurs est
basé sur la reconnaissance de marqueurs moléculaires spécifiques aux cellules tumorales.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
12
2. Ciblage actif des tumeurs
L’effet « EPR » facilite la localisation efficace de certains vecteurs anticancéreux mais ne
promeut pas l’internalisation spécifique du principe actif qu’ils transportent dans la tumeur. Cette
seconde étape peut être assurée en intégrant à la structure du vecteur un ou plusieurs éléments de
ciblage des cellules tumorales tels que des petites molécules (par exemple de l’acide folique ou
des carbohydrates), des peptides, des protéines ou des anticorps. Souvent, ces éléments de
ciblage reconnaissent des récepteurs membranaires surexprimés ou exprimés spécifiquement à la
surface des cellules cancéreuses et déclenchent l’internalisation du composé au sein de la cellule
tumorale par un processus d’endocytose (Figure 6 ; Bazak et al., 2015). En plus de permettre la
libération du principe actif directement dans les cellules à éliminer, l’internalisation sélective par
endocytose du médicament (comparée à la diffusion passive d’une molécule de chimiothérapie à
travers la membrane plasmique) semblerait supprimer le phénomène de résistance multidrogue
observé dans certains cancers (Huwyler et al., 2002).
Compte tenu de ces avantages, de nombreux ligands de ciblage sont proposés pour cibler
activement les cellules cancéreuses, notamment des anticorps ou des fragments d’anticorps qui
sont une des approches les plus avancées, des aptamères, des peptides ou des protéines entières
comme la transferrine (une glycoprotéine sérique), différents ligands, etc. A titre d’exemple, la
sous-unité B non toxique de la toxine Shiga, produite par une bactérie intestinale pathogène, a
été conjuguée à différents agents anticancéreux. Le composé est internalisé via l’interaction de la
sous-unité B de la toxine et son récepteur Gb3 surexprimé notamment dans les cancers
colorectaux. In vitro, ces composés montrent des résultats prometteurs sur des cellules de cancer
du côlon (HT29) avec des concentrations inhibitrices médianes (IC50) de l’ordre du nanomolaire
et sont en attente d’évaluation in vivo (El Alaoui et al., 2007 ; Kostova et al., 2015).
Figure 9. Représentation schématique de différentes stratégies de vectorisation anticancéreuse. Il
existe deux grandes familles de vecteurs : les conjugués en rouge et les transporteurs en bleu,
dont la liste n’est pas exhaustive et qui sont classés selon la nature de leurs composants (d’après
Wicki et al., 2015).
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
13
C. DIFFERENTS TYPES DE VECTEURS
Il existe toute une variété de vecteurs même si beaucoup sont encore à des stades
précoces de développement. Ils diffèrent par leur taille, leur structure, la nature de leurs
composants, etc., ce qui rend leur classification assez difficile. Cependant, il est possible d’en
faire ressortir deux grandes catégories : les nanotransporteurs qui « encapsulent » le principe
actif, et les conjugués qui sont des structures liant de manière covalente un élément de ciblage
des cellules tumorales et le principe actif (Figure 9).
1. Les nanotransporteurs
Les nanotransporteurs représentent la plus grande catégorie de vecteurs. Ce sont des
assemblages moléculaires de taille nanométrique dans lesquels plusieurs molécules de principe
actif (petites molécules de faible poids moléculaire ou macromolécules telles que des gènes ou
des protéines) sont piégées pour permettre leur transport jusqu’au site d’action. Ils ont
généralement un diamètre compris entre 10 et 200 nm, leur conférant une taille suffisante pour
éviter leur élimination par le rein (Venturoli et Rippe, 2005) et une taille optimale à leur
extravasation entre les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins tumoraux (Dreher et al.,
2006). La libération des molécules de principe actif est réalisée dans le microenvironnement de
la tumeur (ciblage passif) ou directement dans la cellule à éliminer (ciblage actif) suite à la
décomposition du vecteur. Les propriétés de cette décomposition peuvent être modulées en
modifiant les composants du transporteur.
Il existe une très grande variété de ce type de vecteurs répartis selon Wicki et al. en
quatre classes en fonction de la nature des composants utilisés (Wicki et al., 2015 ; Pérez-
Herrero et Fernández-Medarde, 2015 ; Figure 9). Ainsi, il existe des nanoparticules virales
conçues pour se répliquer préférentiellement dans les cellules cancéreuses et qui entrainent leur
destruction en détournant les voies de signalisation de la cellule hôte et/ou en recrutant le
système immunitaire. On peut également citer les nanoparticules inorganiques qui peuvent être
utilisées comme sensibilisateurs à la radiothérapie ou pour l’ablation thermique des tumeurs
(NanoTherm® développé par MagForce AG pour l’ablation des glioblastomes, Rivera Gil et al.,
2010). On retrouve également les nanoparticules polymériques qui sont composées d’un
enchevêtrement de biopolymères piégeant les molécules de principe actif à transporter.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
14
Enfin, il est possible de trouver dans cette catégorie des liposomes, des structures
composées d’une bicouche phospholipidique formant un compartiment dans lequel se trouve le
principe actif (qui peut également être piégé dans la bicouche phospholipidique selon sa nature).
D’ailleurs, un des premiers nanotransporteurs lipidiques mis sur le marché est le Doxil®, ou
Caelyx® en Europe. Il s’agit d’un liposome contenant de la doxorubicine et recouvert de
polyéthylène glycol pour augmenter la durée de circulation systémique du composé. Il est
aujourd’hui utilisé pour le traitement du cancer du sein métastatique, des cancers ovariens
avancés, des sarcomes de Kaposi et des myélomes multiples (Barenholz, 2012).
2. Les conjugués d’agents anticancéreux
Une autre approche permet de délivrer des molécules cytotoxiques ou des agents
d’imagerie médicale en les liant de manière covalente à un anticorps ou à un ligand
reconnaissant une cible moléculaire présente à la surface des cellules cancéreuses. On parle alors
de conjugué ou de prodrogue. La liaison entre le principe actif et l’élément de ciblage doit être
stable au sein de la circulation sanguine pour permettre le maintien de l’inactivité du
médicament. En revanche, cette liaison covalente doit pouvoir être dégradée en intra- ou en
extracellulaire au niveau des cellules cancéreuses et libérer le médicament pour qu’il puisse
exercer son activité.
A titre d’exemple, le F14512 est un conjugué composé d’un ligand de ciblage, la
spermine et d’un agent anticancéreux dérivé de la podophyllotoxine (un inhibiteur de la
topoisomérase II). Le ligand de ciblage permet l’internalisation du composé au sein de certaines
cellules cancéreuses qui surexpriment le système de transport de polyamines. Le F14512 exerce
de fortes propriétés antitumorales in vitro sur différentes lignées cancéreuses (leucémie, cancers
du sein et du poumon, mélanomes et sarcomes) et in vivo, sur des modèles de leucémies, de
cancers du sein et du côlon (Barret et al., 2008 ; Kruczynski et al., 2009). Le F14512 a
également montré une forte efficacité au cours de différents essais cliniques de phase 1 menés
sur un modèle canin de lymphome ou chez l’homme pour le traitement de leucémies myéloïdes
aigues (LAM ; Tierny et al., 2015). Il est actuellement en cours d’évaluation chez l’homme, dans
une phase 2 pour le traitement des LAM.
1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine
15
Aujourd’hui, beaucoup de molécules de ce type sont testées en essais cliniques. Parmi
celles approuvées par la Food et Drug Administration, on trouve le brentuximab vendotin
(Adcetris®, Takeda Pharma) et le trastuzumab emtansine (Kadcyla®, Roche). Le brentuximab
vendotin consiste en un anticorps chimérique dirigé contre l’antigène CD30 et relié à un puissant
agent anticancéreux, la monométhyl Auristatine E (MMAE). Il est approuvé depuis 2011 pour le
traitement des lymphomes Hodgkiniens et des lymphomes anaplasiques à grandes cellules (Foyil
et Bartlett, 2011). Le trastuzumab emtansine, lui, cible le récepteur HER2 (Human Epidermal
growth factor Receptor-2) et est associé à un agent cytotoxique dérivé de la maitansine. Il est
autorisé depuis 2013 pour le traitement des cancers du sein métastatique exprimant le récepteur
HER2 (Verma et al., 2012).
Ainsi, il existe plusieurs stratégies de ciblage des cellules tumorales ou de leur
microenvironnement. A travers mes travaux de thèse, j’ai eu l’occasion de travailler sur plusieurs
types de ciblage mais c’est celui concernant les récepteurs à l’acide folique qui a représenté la
plus grande partie de mon travail. De ce fait, le prochain chapitre est consacré à la présentation
de ce récepteur particulier.
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
16
3E CHAPITRE
Les folates et leurs transporteurs
I. LES FOLATES
Le terme générique « folate » regroupe tous les composés, naturels et synthétiques
(comme l’acide folique), appartenant à la famille des vitamines B9. Ils interviennent comme
cofacteurs enzymatiques dans les réactions de transfert de carbone unique et sont de fait
impliqués dans de nombreuses fonctions essentielles du métabolisme cellulaire telles que la
biosynthèse des purines et des pyrimidines, la méthylation de l’ADN, la synthèse d’acides
aminés et de quelques vitamines (Iyer et Tomar, 2009).
Avec un apport quotidien recommandé de 400 µg pour un adulte, la vitamine B9 fait
obligatoirement l’objet d’apports exogènes, les cellules de mammifères ne possédant pas les
enzymes nécessaires à sa biosynthèse. Ainsi, les carences en folates sont courantes. Elles sont à
l’origine de nombreux symptômes et favorisent de nombreuses pathologies. A titre d’exemple,
une carence en vitamine B9 au cours du développement embryonnaire entraine des défauts de
formation du tube neural (Daly et al., 1995). Chez l’adulte, les déficiences en folate sont
associées à des anémies et différents problèmes neurologiques tels que des dépressions et des
accidents vasculaires cérébraux. Elles peuvent également favoriser l’apparition de maladies
cardio-vasculaires (Morrison et al., 1996) et de la maladie d’Alzheimer (Hinterberger et Fischer,
2013). Dans le cadre du cancer, les folates jouent un rôle ambivalent. En effet, alors qu’une
carence en folate peut augmenter le risque de cancers notamment mammaires et colorectaux
(Choi et Mason, 2002), ils sont également décrits comme un soutien majeur de la prolifération
des cellules malignes (Gonen and Assaraf, 2012). A ce titre, de nombreuses molécules ont été
utilisées en chimiothérapie comme antifolates. C’est par exemple le cas du méthotrexate et du
pemetrexed qui inhibent des enzymes clés du métabolisme des folates (la dihydrofolate reductase
et la thymidylate synthase, respectivement ; Gonen and Assaraf, 2012).
Figure 10. Transport des folates dans les cellules saines ou cancéreuses via le transporteur de
folates réduits (Reduced Folate Carrier), le transporteur de folates couplé aux protons (Proton
Coupled Receptor) ou le récepteur de l’acide folique (Folate Receptor).
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
17
II. LE TRANSPORT DES FOLATES
En raison des motifs glutamates qu’ils contiennent, les folates sont des molécules
hydrophiles anioniques qui ne peuvent diffuser passivement à travers la membrane plasmique
des cellules. L’internalisation des folates au sein des cellules dépend alors de trois systèmes de
transport : le transporteur de folates réduits (RFC pour Reduced Folate Carrier), le transporteur
de folates couplé aux protons (PCFT pour Proton Coupled Folate Transporter) et les récepteurs
de l’acide folique (FR pour Folate Receptor ; Figure 10). La régulation de la concentration
cellulaire des folates est un processus complexe dont les transporteurs RFC et PCFT sont les
acteurs principaux puisque, contrairement aux récepteurs FR, ils permettent des échanges
réversibles de folates à travers la membrane des cellules (Stover, 2004).
A. LE TRANSPORTEUR DE FOLATES REDUITS (RFC)
Le transporteur RFC est le premier transporteur de folates à avoir été identifié dans le
milieu des années 1960 (Matherly et al., 2007). C’est un membre de la « major facilitator
superfamily », une classe de transporteurs impliqués dans la diffusion facilitée à travers les
membranes cellulaires de molécules telles que des acides aminés, des neurotransmetteurs, des
sucres, des vitamines, des nucléosides et des phosphates organiques. Le RFC permet l’échange
des folates dans les tissus à partir de la circulation systémique. De ce fait, on le retrouve de
manière ubiquitaire dans les tissus sains et cancéreux, faisant de ce transporteur l’acteur
majoritaire du transport des folates chez les mammifères.
1. Structure du gène et de la protéine RFC
Le gène RFC, qui est hautement conservé d’une espèce à l’autre est situé chez l’homme
sur le chromosome 21q22.3 (Whetstine et al., 2002). Bien que la structure protéique de ce
transporteur ne soit pas encore clairement décrite, une structure tridimensionnelle prédictive a pu
être proposée à partir de l’analyse par cristallographie de protéines analogues au RFC. Il s’agit
d’un transporteur à 12 domaines transmembranaires, dont la courte extrémité aminée (N-
terminal) et la longue extrémité carboxyle (C-terminal) sont situées dans le compartiment
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
18
intracellulaire. Il est constitué de 591 acides aminés et possède un poids moléculaire d’environ
85 kDa. Il présente un site hautement conservé de N-glycosylation (asparagine 58) sur la
première boucle extracellulaire ainsi qu’une large boucle intracellulaire entre les domaines
transmembranaires 6 et 7 qui semble indispensable à la fonction optimale du transporteur (Liu et
al., 2003 ; Matherly et al., 2007).
2. Transport des folates par le RFC
Le RFC est un transporteur antiport qui couple l’influx de folates à un efflux de substrats
anioniques cellulaires (Figure 10). Il s’agit d’un transporteur actif secondaire qui utilise le
gradient de concentration transmembranaire de phosphates anioniques pour transporter les
folates contre leur gradient de concentration. Il n’est pas directement dépendant de l’hydrolyse
de l’adénosine triphosphate. Le transport des folates est maximal à pH neutre, et décroit
rapidement au fur et à mesure que le pH diminue. Il est saturable à de faibles concentrations et
fortement sensible à la compétition par des analogues. Comme son nom le laisse supposer, il
possède une haute affinité pour les folates réduits (Km = 1 à 3 µM) mais n’en présente que peu
pour les folates oxydés tels que l’acide folique (Km = 200 à 400 µM) (Sirotnak, 1985).
Le transporteur RFC est principalement présent sous forme monomérique mais peut aussi
être retrouvé comme beaucoup de transporteurs de la « major facilitator family » sous forme
d’homo-oligomères. Ceux-ci interviendraient notamment dans le transport des folates du
réticulum endoplasmique vers la membrane cellulaire, laissant supposer une régulation complexe
de la fonction de ce transporteur (Hou et al., 2010).
3. Expression et physiopathologies liées aux RFC
Le transporteur RFC est exprimé de manière ubiquitaire dans les tissus sains. Ainsi, de
forts niveaux d’expression du transcrit RFC ont été décrits par Whetstine et al. en 2002 dans le
foie et le placenta, et des niveaux intermédiaires dans des tissus tels que le rein, les leucocytes, le
poumon, la moelle osseuse, l’intestin et dans certaines parties du système nerveux central et du
cerveau. Des niveaux d’expression plus modestes ont également été décrits dans le cœur et les
muscles squelettiques.
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
19
Témoignant de l’importance physiologique de ce transporteur, l’inactivation des deux
allèles du gène RFC chez la souris est létale. Par ailleurs, de faibles niveaux d’expression du
RFC se traduisent par de nombreux symptômes associés à des carences en folates, tels que des
maladies cardiovasculaires, des défauts de formation du tube neural au cours du développement
et des troubles neurologiques (Matherly et al., 2007). Dans le cadre du cancer, les folates jouent
un rôle complexe et ambivalent. En effet, alors qu’une déficience en folate peut favoriser
l’apparition de certains cancers (Iyer and Tomar, 2009), au sein des tumeurs, ils soutiennent la
croissance et la prolifération des cellules malignes (Vergote et al., 2015). Bien que les variations
d’expression du RFC dans les cancers soient peu étudiées, de nombreuses molécules inhibant le
métabolisme des folates telles que le méthotrexate ont été conçues pour être internalisées dans
les cellules pathologiques via ce transporteur. Cependant, des mécanismes de résistance sont
souvent observés suite à la mise en place de ce type de traitements, notamment à cause d’une
perte de la fonction du RFC (perte allélique, mutation, etc. ; Gonen and Assaraf, 2012).
B. LE TRANSPORTEUR DE FOLATES COUPLES AUX PROTONS (PCFT)
D’abord connu comme un transporteur d’hèmes, le PCFT a été décrit en 2006 par Qiu et
al. comme le transporteur majoritaire concernant l’absorption intestinale des folates provenant de
l’alimentation. C’est un transporteur de type symport qui permet l’entrée de folates et de protons
au sein des cellules intestinales par diffusion facilitée (Figure 10). Il est principalement exprimé
dans la partie proximale de l’intestin grêle où le pH acide permet l’activité optimale de ce
transporteur.
1. Structure du gène et de la protéine PCFT
Le gène humain codant le transporteur PCFT est constitué de cinq exons et de quatre
introns et se situe sur le chromosome 17q11.2. Il code une protéine constituée de 439 acides
aminés possédant un poids moléculaire de 49,8 kDa. Sa composition prédit une structure à 12
domaines transmembranaires dont les terminaisons carboxyle et aminée sont
intracytoplasmiques. La première boucle extracellulaire de ce transporteur contient deux
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
20
domaines de glycosylation (asparagines 58 et 68) qui semblent importants pour l’efficacité du
transport des folates (Unal et al., 2008).
2. Transport des folates par le PCFT
La principale caractéristique de ce transporteur réside dans le pH acide permettant son
activité optimale. Ainsi, le transport de folate est maximal lorsque le pH est compris entre 5 et
5,5 et diminue rapidement à mesure que le pH augmente pour être quasiment inexistant à un pH
de 7. En tant que symport, le PCFT permet un transport électrogénique des folates : deux protons
sont cotransportés pour chaque molécule de folale internalisée (anion bivalent ; Figure 10).
L’internalisation des folates par le PCFT s’accompagne alors d’une acidification du milieu
intracellulaire (Qiu et al., 2006). Enfin, et contrairement au RFC, le PCFT possède des affinités
équivalentes (Km 0,5 – 1 µM) pour les folates réduits et les folates oxydés tels que l’acide
folique (Zhao et Goldman, 2007).
3. Expression et physiopathologie liée au PCFT
a) Expression du PCFT
Le PCFT possède un profil d’expression plus limité que le transporteur RFC. Acteur
majeur de l’absorption intestinale des folates provenant de l’alimentation, le PCFT est fortement
exprimé à la face apicale des cellules à bordure en brosse du duodenum et du jejunum (intestin
grêle). Son expression diminue drastiquement dans les autres segments de l’intestin et du colon
(Urquhart et al., 2010). Par ailleurs, le PCFT serait également exprimé dans les cellules
épithéliales du plexus choroïde où il agirait en tandem avec les récepteurs à l’acide folique pour
maintenir un taux physiologique de folates dans le liquide céphalorachidien, et ce, malgré la
présence de la barrière hémato-encéphalique (Wollack et al., 2008).
Enfin, alors que l’ARN messager (ARNm) du transporteur PCFT est faiblement exprimé,
voir indétectable dans la plupart des tissus, il est détecté dans les reins et le foie mais le rôle qu’il
pourrait y jouer reste encore à élucider.
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
21
b) Malabsorption héréditaire des folates
C’est l’identification d’une mutation homozygote dans le gène PCFT chez des patients
atteints de malabsorption héréditaire de l’acide folique qui a permis d’établir le rôle
physiologique du PCFT. Cette maladie rare est causée par la perte de fonction du transporteur et,
de fait, par une forte carence en folates (Qiu et al., 2006). Les personnes atteintes par cette
pathologie présentent des défauts de développement au cours des premiers mois de leur vie et
des retards cognitifs. Elles souffrent également d’anémie et d’hypo-immunoglobulinémie
associée à des complications infectieuses (pneumonie ; Desmoulin et al., 2012). Ces symptômes
lourds traduisent l’importance du PCFT dans le transport des folates à travers l’épithélium
gastro-intestinal et indiquent que le RFC n’y contribue pas de manière significative.
C. LES RECEPTEURS A L’ACIDE FOLIQUE (FR)
Bien que les transporteurs PCFT et RFC représentent les principaux acteurs de
l’internalisation et du transport des folates au sein des cellules, une troisième voie d’entrée existe
(Figure 10). Les récepteurs à l’acide folique (FR), aussi appelés FBP ou Folbp pour « Folate
Binding Protein » lient l’acide folique et les folates réduits avec une affinité plus importante que
le RFC et le PCFT (Km < 1 nM). De plus, contrairement aux RFC et au PCFT, les récepteurs FR
sont également capables de lier des dérivés chimiques de l’acide folique comme les vecteurs
anticancéreux et de permettre leur internalisation au sein de la cellule (voir page 12).
1. Généralités sur les FR
Chez l’homme, quatre gènes notés FOLR1 à 4 ont été identifiés et localisés sur le
chromosome 11q13.3 à q13.5. Ces gènes codent respectivement quatre isoformes des récepteurs
de l’acide folique appelés FRα, FRβ et FRγ. La protéine FRδ codée par le gène FOLR4 est une
protéine particulière qui n’a été identifiée que récemment et pour laquelle très peu de données
sont aujourd’hui disponibles.
Les récepteurs FR forment une famille de glycoprotéines de 220 à 243 acides aminés
dont les poids moléculaires sont compris entre 38 et 45 kDa. Ils partagent entre 68 et 79 %
Isoforme de la protéine Distribution tissulaire physiologique Surexpression dans les tissus tumoraux
FRα Quelques cellules épithéliales : Trompes de Fallope Tubules proximaux du rein Pneumocytes de type I et II Plexus choroïde Glandes salivaires sous-maxillaires Glandes bronchiques Epithélium pigmentaire rétinien Cellules trophoblastiques placentaires
Carcinomes : Gynécologiques Rein Poumon Cerveau Sein Colon
FRβ Monocytes (faibles niveaux) Macrophages activés (forts niveaux) Placenta
Hémopathies malignes : Leucémie myéloïde aigue (70 % des cas) Leucémie myéloïde chronique
Macrophages pathologiques : Maladies inflammatoires Tumor-Associated Macrophages (TAM)
FRγ Cellules hématopoïétiques (rate, moelle osseuse, thymus)
FRδ Ovocytes Lymphocytes T régulateurs (souris)
Tableau 1. Distribution tissulaire des différentes isoformes de la protéine FR
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
22
d’homologie au sein de leur séquence peptidique primaire et présentent deux (pour FRβ et γ) ou
trois (pour FRα) sites de N-glycosylation (Elnakat et Ratnam, 2004). Ces sites sont impliqués
dans le repliement correct de la protéine, son adressage fonctionnel à la membrane de la cellule,
et confèrent une demi-vie de plus de 24 h à la protéine. En revanche, ils n’interviennent pas dans
la liaison avec le ligand (Shen et al., 1997).
Bien qu’important dans le développement embryonnaire du tube neural (Henderson et al.,
1995), la fonction des FR dans les tissus adultes sains est très limitée et il existe peu de données
sur ce sujet. Ils pourraient être importants lorsque les taux de folates extracellulaires sont faibles
(Elnakat and Ratnam, 2004).
2. Différentes isoformes de FR
Parmi les quatre isoformes de FR qui existent, les formes FRα, FRβ et FRδ sont
caractérisées par des extrémités carboxyles hydrophobes qui contiennent un signal permettant la
fixation d’un motif glycosylphosphatidylinositol (GPI) et donc leur ancrage à la membrane
plasmique (Elnakat and Ratnam, 2004). Contrairement au RFC et au PCFT, les FR sont exprimés
sur une population restreinte de cellules et permettent l’internalisation des folates par un
processus d’endocytose non canonique. Le récepteur FRγ, quant à lui, est dépourvu du signal
entrainant l’ajout de l’ancre GPI. Il s’agit donc d’une protéine constitutivement secrétée. Des
formes solubles de FRα et FRβ, obtenues suite au clivage des formes membranaires ont
également été rapportées dans les fluides extracellulaires (lait maternel, liquide céphalorachidien,
urine...) mais leur rôle reste encore largement méconnu. Dans le lait maternel, ces récepteurs
solubles pourraient faciliter l’internalisation des folates en liant la vitamine pour la protéger de
l’oxydation, pour en faciliter l’absorption intestinale par le nouveau-né ou pour éviter leur
utilisation par des bactéries, (Colman et al., 1981 ; Mason et Selhub, 1988 ; Birn et al., 2005).
Les FR solubles sont également étudiés comme marqueurs sérologiques pour le diagnostic de
tumeurs exprimant cette protéine, leur taux dans le sérum normal étant généralement très bas
(Cheung et al., 2016).
Les isoformes du récepteur de l’acide folique sont exprimées de manière différentielle en
fonction des tissus (Tableau 1). Ces profils d’expression résulteraient principalement de
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
23
modifications transcriptionnelles et post-transcriptionnelles (épissage alternatif, stabilité des
transcrits, etc., Elnakat and Ratnam, 2004).
a) Le récepteur membranaire FRα
Dans les tissus sains, le récepteur FRα présente une expression restreinte à une variété de
cellules épithéliales polarisées dans lesquelles il est le plus souvent localisé à la face apicale où il
n’est alors pas en contact avec les folates circulants. Il a ainsi été décrit au niveau des tubules
proximaux du rein, du plexus choroïde, des trompes de Fallope, de l’utérus, de l’ovaire, de
l’épididyme, des cellules acineuses du sein, des glandes salivaires sous-maxilaires, des glandes
bronchiques, des pneumocytes de types I et II et au niveau du trophoblaste dans le placenta
(Weitman et al., 1992 ; Ledermann et al., 2015 ; Cheung et al., 2016). En 2000, Chancy et al.
montrent que la forme FRα est également retrouvée dans les cellules pigmentaires de la rétine,
mais elle est cette fois adressée à la face basolatérale de la membrane.
Compte tenu du faible niveau d’expression des FR et de leur localisation à la face apicale
des cellules épithéliales où ils ne sont pas en contact avec les folates circulants, le rôle
physiologique de ces protéines n’est pas toujours évident. Cependant, il a été décrit qu’au niveau
du rein, FRα permet la récupération des folates filtrés par le glomérule et excrétés dans l’urine
primaire (Selhub et al., 1987). Au niveau du plexus choroïde, il est indispensable au maintien
d’une concentration suffisante de folates au sein du liquide céphalorachidien (Serrano et al.,
2012) et au niveau du placenta, il participe au transfert des folates maternels au fœtus (Solanky et
al., 2010).
b) Le récepteur membranaire FRβ
Alors que FRα est principalement exprimé sur les cellules épithéliales, FRβ n’est retrouvé
de manière significative dans les tissus normaux qu’au niveau du placenta et sur certaines
cellules hématopoïétiques, où il peut être considéré comme un marqueur de différenciation de
l’hématopoïèse normale. Son expression est alors restreinte à certaines cellules de la lignée
myélomonocytaire : FRβ est retrouvé à de faibles niveaux sur les monocytes de la moelle
osseuse et du sang périphérique et à des niveaux plus importants sur les neutrophiles matures et
les monocytes/macrophages activés (Ross et al., 1999). Dans ces cellules myélomonocytaires,
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
24
FRβ est incapable de lier les folates et sa fonction demeure inconnue (Reddy et al., 1999 ; Puig-
Kröger et al., 2009).
c) Le récepteur soluble FRγ
Le récepteur FRγ est une protéine dépourvue de signal permettant son association à la
membrane via une ancre GPI. Elle est donc constitutivement secrétée. L’ARNm de cette protéine
a été détecté par analyse PCR (Polymerase Chain Reaction) dans des cellules hématopoïétiques
saines et malignes présentes dans la rate et le thymus, ainsi que dans les carcinomes ovariens,
cervicaux et utérins (Salazar and Ratnam, 2007). Cette protéine difficilement détectable pourrait,
tout comme les formes solubles de FRα et FRβ, servir à stabiliser les folates extracellulaires
(Elnakat and Ratnam, 2004).
Le gène FOLR3 codant la protéine FRγ est polymorphique. Il présente une version mutée
par délétion de deux nucléotides qui aboutit à l’apparition prématurée d’un codon stop. Il en
résulte une protéine tronquée dont la taille n’est plus que de 104 acides aminés (contre 243
acides aminés pour la protéine non mutée) et qui est alors notée FRγ’ (Shen et al., 1994).
Contrairement à la forme native de la protéine, la forme mutée est incapable de lier les folates,
mais aucun trouble n’est à ce jour associé à ce phénotype (Elnakat and Ratnam, 2004 ; Salazar
and Ratnam, 2007).
d) Le récepteur membranaire FRδ (JUNO)
La recherche d’homologie de séquence au sein du génome humain montre la présence de
quatre gènes distincts de récepteurs de l’acide folique sur le chromosome 11. Le quatrième gène
FOLR4 code une protéine FRδ de 27,7 kDa qui, jusqu’à récemment, n’avait été identifiée que
chez la souris sur une certaine catégorie de lymphocytes T régulateurs (Yamaguchi et al., 2007).
Au cours des deux dernières années, plusieurs équipes ont montré la présence de la protéine FRδ
à la membrane d’ovocyte de plusieurs espèces de mammifères, dont l’homme (Bianchi et al.,
2014 ; Aydin et al., 2016). Associée à la membrane par une ancre GPI mais incapable de lier les
folates, la protéine FRδ permet en réalité la reconnaissance de IZUMO1, une protéine exprimée
par les spermatozoïdes. L’interaction de ces deux protéines est une étape indispensable à la
fécondation puisque les souris n’exprimant pas ces gènes sont stériles (Aydin et al., 2016).
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
25
Compte tenu de son expression préférentielle et du rôle essentiel qu’elle joue dans la
fécondation, la protéine FRδ a été renommée en 2014 « JUNO », du nom romain de la déesse de
la fécondité.
3. Transport des folates et recyclage de FRα et FRβ
Le transport des folates par les récepteurs FR fait intervenir un mécanisme d’endocytose
non classique appelé potocytose et impliquant les cavéoles (Sabharanjak and Mayor, 2004 ;
Cheung et al., 2016). Suite à la liaison du ligand sur son récepteur, la membrane plasmique
s’invagine et forme une vésicule qui va ensuite fusionner avec des ensodomes et des lysosomes.
Ces fusions permettent l’acidification du milieu vésiculaire et, à un pH de 5, les folates sont
libérés de leur récepteur et transférés vers le cytoplasme par un mécanisme encore inconnu
(Zwicke et al., 2012). Les récepteurs FR sont alors recyclés vers la membrane en quelques
minutes (Sabharanjak et Mayor, 2004 ; Figure 10).
4. Physiopathologies liées au récepteur FRα
a) Déficit de Transport Cérébral des Folates
Comme présenté précédemment, les folates sont impliqués dans de nombreux processus
biologiques majeurs. Au niveau de la barrière hémato-encéphalique, les folates sont transportés
du sang vers le liquide céphalo-rachidien via un mécanisme qui n’est pas encore complètement
élucidé mais qui implique le récepteur FRα (Grapp et al., 2012). Le déficit de transport cérébral
des folates est responsable d’un syndrome neurodégénératif progressif infantile qui se déclenche
dans les quatre à six premiers mois de l’enfant. Il est associé à des mutations au sein du gène
FOLR1 ou à la présence d’anticorps dirigés contre ce récepteur. Ce défaut de FR est caractérisé
par des concentrations fortement réduites de folates dans le liquide céphalo-rachidien et se
traduit, chez l’enfant, par un ensemble de symptômes neurologiques (régression psychomotrice,
épilepsie, autisme, etc. Grapp et al., 2012). Dans la plupart des cas, un traitement par de l’acide
folinique permet d’augmenter la concentration de folates dans le liquide céphalo-rachidien et
d’améliorer significativement la condition du patient (Gordon, 2009).
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
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b) Expression de FRα dans le cancer
Régulation du gène FOLR1
La présence ou la surexpression de FRα dans les tissus cancéreux est un phénomène
largement décrit dans la littérature scientifique (pour revues : Elnakat and Ratnam, 2004 ; Xia
and Low, 2010 ; Vergote et al., 2015). Cependant, les mécanismes permettant l’augmentation de
l’expression de FR dans les cellules malignes restent encore obscurs. Souvent, la surexpression
de FOLR1 résulterait de l’amplification du gène, situé sur le chromosome 11q13.3, une zone
décrite comme instable génétiquement (Gibcus et al., 2006). A titre d’exemple, dans les cancers
ovariens, l’amplification du gène FOLR1 est retrouvée dans environ 33 % des prélèvements
analysés (Siu et al., 2012). Des mutations activatrices et des mécanismes épigénétiques
pourraient également être impliqués dans la régulation de l’expression de FOLR1 mais les
données disponibles à ce jour ne permettent pas l’établissement de conclusion (Kelemen, 2006 ;
Vergote et al., 2015).
D’autres facteurs ont également été décrits comme pouvant influencer l’expression du
gène FOLR1. In vitro, il a été montré dans des cellules tumorales que le niveau d’expression de
FRα pourrait être régulé par la concentration extracellulaire en folates du milieu de culture
(Kelemen, 2006). Dans les cellules cultivées dans un milieu déplété en acide folique,
l’expression de FRα serait augmentée. La concentration en folate pourrait entrainer des
variations de régulations transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, notamment en modulant la
demi-vie de l’ARNm de FOLR1 (Sadasivan et al., 2002). Ces données sont en accord avec une
autre étude montrant in vitro que l’accumulation d’homocystéine, marquant une déficience
intracellulaire en folate, serait accompagnée d’une augmentation de l’expression de FRα (Antony
et al., 2004).
Par ailleurs, la régulation du gène FOLR1 pourrait également être influencée par
différentes hormones stéroïdiennes. Dans les cellules souches embryonnaires murines, il a été
décrit que l’acide rétinoïque pouvait induire une augmentation du taux d’ARNm du gène FOLR1
(Bolton et al., 1999). Dans les cellules tumorales, les glucocorticoïdes entrainent une
augmentation de l’expression des récepteurs à l’acide folique in vitro et in vivo (Tran et al.,
2005). A l’inverse, les œstrogènes comme l’œstradiol réprimeraient l’expression de FRα dans
différentes lignées de cancers ovariens et cervicaux (Kelley et al., 2003).
Tissus Quantité moyenne de FR (pmoles)/mg de protéine
Expression importante (%)
Expression intermédiaire (%)
Expression négligeable (%)
n
Ovarien Carcinome séreux Carcinome Endométrioïde Carcinome mucineux Métastase Normal
34,31 ± 22,87 15,66 ± 9,26 1,83 ± 1,19 46,36 ± 49,68 1,54 ± 1
100 100 / 100 /
/ / 36 / 25
/ / 64 / 75
7 4 14 4 12
Endomètre Carcinome primaire Métastase Normal
9,32 ± 18,10 8,17 0,95 ± 0,5
20 100 /
20 / /
60 / 100
10 1 7
Sein Carcinome primaire Normal
7,44 ± 5,83 3,99 ± 1,68
43 50
40 60
14 20
7 5
Pancréas Carcinome primaire Métastase Normal
3,56 ± 2,28 8,78 2,43 ± 1,80
10 100 /
60 / 40
30 / 60
10 1 5
Lymphome Carcinome primaire Métastase
1,94 ± 1,77 4,16 ± 2,64
/ 50
12 /
88 50
8 2
Cerveau Carcinome primaire Normal
4,51 ± 6,15 0,32 ± 0,30
25 /
25 /
50 100
4 3
Tableau 2. Niveaux d’expression du récepteur FR (α et β) dans différents tissus humains,
normaux et cancéreux. Les taux de FR ont été obtenus par un test de « binding » d’acide folique
radiomarqué (d’après Parker et al., 2005).
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
27
Rôles des FR dans le cancer
Bien que souvent associée à un critère d’agressivité, le rôle de la surexpression de cette
protéine n’est pas clairement établi. En plus de son rôle de transporteur de folates, de récentes
études montrent qu’in vitro, FRα pourrait exercer des fonctions de signalisation cellulaire dans
certains cancers. Après liaison à son ligand et internalisation, il serait transloqué vers le noyau où
il agirait comme facteur de transcription et stimulerait l’expression de gènes impliqués dans la
division cellulaire, l’angiogenèse et le processus de métastase (Boshnjaku et al., 2012 ; Hansen
et al., 2015). Cependant, des données supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les
conséquences physiologiques de cette découverte.
Expression de FRα en fonction du type de cancer
Compte tenu de son profil d’expression physiologique, FRα est retrouvé dans de
nombreuses tumeurs d’origine épithéliale (Elnakat et Ratnam, 2004 ; Parker et al., 2005 ;
Cheung et al., 2016). Bien que Xia et Low décrivent un nombre moyen de 1 à 3 millions de
récepteurs FRα par cellule (Xia and Low, 2010), le niveau d’expression des FR semble variable
d’un type de cancer à un autre (Tableau 2 ; Parker et al., 2005). Ainsi, FRα est régulièrement
surexprimé dans les cancers gynécologiques (ovaire et endomètre), dans certains cancers
mammaires et cérébraux. D’autres études montrent que FRα est également surexprimé dans de
nombreux cancers pulmonaires (Iwakiri et al., 2008, O’Shannessy et al., 2012). La plupart des
études concernant le développement de médicament ciblant le récepteur FRα sont aujourd’hui
principalement menées pour lutter contre les cancers gynécologiques, mammaires et
pulmonaires.
FRα dans les cancers ovariens. Alors que 80 à 90 % des cancers ovariens présentent une
surexpression de FRα, le niveau d’expression de cette protéine a été corrélé avec le stade et le
grade de la tumeur (O’Shannessy et al., 2013). L’expression de FRα dans les cancers ovariens
est considérée comme un critère d’agressivité de la maladie, et au moins pour les cancers
d’origine séreuse, est associée à un mauvais pronostic (Chen et al., 2012).
FRα dans les cancers mammaires. Le récepteur FRα est surexprimé dans 75 % des cancers
mammaires double-négatifs (pas d’expression des récepteurs aux œstrogènes et à la
progestérone) et dans les cancers triple-négatifs (pas d’expression des récepteurs aux œstrogènes,
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
28
des récepteurs à la progestérone et des récepteurs HER2 pour Human Epidermal Growth Factor
Receptor-2). Ces derniers représentent un faible pourcentage des cancers mammaires mais se
caractérisent par leur agressivité, leur propension à former des métastases et la forte mortalité
qu’ils entrainent. De la même manière que les cancers ovariens, le taux d’expression de FRα
dans les cancers mammaires est corrélé au stade et au grade de la maladie ainsi qu’aux chances
de survie des patients (Hartmann et al., 2007 ; Zhang et al., 2014).
FRα dans les cancers pulmonaires. FRα est surexprimé dans 70 % des mésothéliomes pleuraux,
mais aucune corrélation n’est pour l’instant établie entre le niveau d’expression du récepteur et le
pronostic de survie du patient (Cheung et al., 2016). Associés à un mauvais pronostic, les
cancers du poumon non à petites cellules représentent entre 75 et 80 % des cancers pulmonaires
et expriment souvent de forts niveaux de FRα. De manière surprenante, l’expression de FRα
dans les cancers pulmonaires est associée à des tumeurs précoces dont les cellules sont bien
différenciées. Contrairement aux cancers ovariens et mammaires, et sans que cette différence soit
à ce jour expliquée, l’expression de FRα dans les cancers pulmonaires est corrélée à un meilleur
pronostic de survie des patients (Iwakiri et al., 2008).
5. Physiopathologies liées au récepteur FRβ
A cause de l’absence d’outils moléculaires efficaces, l’expression de FRβ dans les tissus
pathologiques est nettement moins étudiée que celle de FRα. Cependant, ce récepteur a été
identifié dans différents macrophages pathologiques et dans certaines cellules leucémiques où il
est alors surexprimé. De plus, et contrairement aux FRβ exprimés dans les cellules saines, les
FRβ retrouvés sur les macrophages pathologiques et sur les cellules leucémiques sont
fonctionnels et capables de lier l’acide folique (Nakashima-Matsushita et al., 1999 ; Pan et al.,
2002). Ces différences fonctionnelles seraient liées à des différences de modifications post-
traductionnelles qui restent encore aujourd’hui à identifier (Elnakat and Ratnam, 2004).
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
29
a) FRβ dans les macrophages pathologiques.
Dans les maladies inflammatoires auto-immunes.
Les macrophages activés surexprimant le récepteur FRβ jouent un rôle important dans la
physiopathologie de maladies auto-immunes inflammatoires (Danks et al., 2002 ; Jager et al.,
2012). C’est notamment le cas dans l’arthrite rhumatoïde où le récepteur FRβ est surexprimé par
des macrophages synoviaux. Ces macrophages produisent des médiateurs pro-inflammatoires qui
peuvent altérer les tissus sains environnant mais également recruter davantage de cellules
inflammatoires (Varghese et al., 2014). Puisque ces cellules participent à la pathogénèse de la
maladie, le récepteur FRβ peut être exploité pour délivrer spécifiquement un agent thérapeutique
à ces macrophages (Nakashima-Matsushita et al., 1999).
Dans le microenvironnement tumoral
Le microenvironnement tumoral contient de nombreuses cellules non transformées
comme des fibroblastes et des adipocytes ainsi que de nombreuses cellules immunitaires telles
que les macrophages (Pollard, 2004). Une des caractéristiques principales des macrophages
réside dans leur plasticité phénotypique. En réponse à différents signaux environnementaux, ils
peuvent acquérir des phénotypes et des fonctions opposés. Alors que les macrophages de type
M1 présentent une activité pro-inflammatoire et des fonctions antitumorales (Cook and
Hagemann, 2013), les macrophages de type M2 sont caractérisés par une faible capacité de
présentation d’antigènes, par une production importante de cytokines immunosuppressives
(IL10) et participent à la résolution de l’inflammation et la réparation tissulaire (Galdiero et al.,
2013). En produisant des facteurs tels que le TGFβ (transforming growth factor) et des
chimiokines comme la CCL2, les tumeurs reprogramment les macrophages présents dans leur
microenvironnement (Josephs et al., 2015). Ces macrophages, appelés TAM pour Tumor-
Associated Macrophages présentent alors un phénotype pathologique « M2-like » et soutiennent
la croissance et la dispersion des cellules tumorales notamment en sécrétant des facteurs de
croissance, des métalloprotéases et des facteurs pro-angiogéniques (Nagai et al., 2009). Une
récente étude montre que les TAM présents dans la plupart des cancers surexpriment le récepteur
FRβ (Shen et al., 2015). De plus, cette étude établit une forte corrélation entre le pourcentage de
cellules exprimant FRβ et le stade de développement du cancer.
1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs
30
b) FRβ des cellules leucémiques
En conditions physiologiques, le récepteurs FRβ est un marqueur de différenciation de la
lignée myélomonocytaire. Comme pour FRα, son profil d’expression dans les tissus cancéreux
est lié à celui des tissus sains. Ainsi, il est surexprimé dans certaines hémopathies malignes,
comme par exemple dans les leucémies myéloïdes chroniques et dans 70% des leucémies
myéloïdes aiguës (Ross et al., 1999 ; Pan et al., 2002 ; Clarhaut et al., 2013).
Pour résumer, les récepteurs FRα et FRβ présentent des profils d’expression restreints à
quelques cellules saines. Dans certaines cellules cancéreuses, ces récepteurs sont surexprimés et
sont capables de lier avec une forte affinité (Km < 1 nM) et d’entrainer l’internalisation de
l’acide folique et de ses dérivés chimiques. Ces propriétés font des récepteurs à l’acide folique
des marqueurs tumoraux de choix pour le développement de molécules vectorisées dérivées de
l’acide folique. Le chapitre suivant n’a pas pour vocation de dresser une liste exhaustive des
molécules dérivées de l’acide folique en cours de développement, mais de présenter les plus
innovantes ou les plus avancées.
Figure 11. (A)Structure de la molécule développée par van Dam et al. et composée d’acide folique et de
fluorescéine isothiocyanate. (B) Image en couleurs (gauche) et de la fluorescence (droite) émise par une
tumeur ovarienne exprimant FRα au cours d’une chirurgie (van Dam et al., 2011).
1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique
31
4E CHAPITRE
Vectorisation et ciblage par l’acide folique
I. LES VECTEURS DE L’ACIDE FOLIQUE POUR L’IMAGERIE
MEDICALE
A. GENERALITES
L’interaction entre les récepteurs de l’acide folique et leur ligand peut être exploitée pour
le développement d’outils d’imagerie médicale. Les sondes moléculaires couplées à l’acide
folique permettent la localisation et l’identification non invasive de tumeurs solides exprimant
les récepteurs FR par exemple à l’aide des imageries optique, à résonance magnétique (IRM), ou
par ultrasons, ou encore par de la tomodensitométrie, de la tomographie par émission
monophotonique (TEMP) et de la tomographie par émission de positons (TEP ; Zwicke et al.,
2012). Plusieurs molécules vectorisées ont alors été imaginées telles que des boites quantiques
(« quantum dots »), des dendrimères ou des nanoparticules d’oxyde de fer supermagnétiques
couplés à l’acide folique pour un usage en IRM (Konda et al., 2000 ; Yang et al., 2009 ; Meier et
al., 2010). L’acide folique peut également être conjugué à des agents fluorescents dans le cadre
d’une aide à la chirurgie, les qualités optiques des molécules fluorescentes nécessitant une
chirurgie pour l’obtention d’une image (Sega et Low, 2008). Ainsi, en 2011, van Dam et al.
testent pour la première fois chez l’homme l’utilisation d’un conjugué d’acide folique et de
fluorescéine isothiocyanate pour l’aide à la résection par chirurgie de tissus tumoraux (Figure
11).
Les molécules conçues pour l’imagerie peuvent parfois également remplir une fonction
thérapeutique, on parle alors d’outils théranostiques. C’est par exemple le cas des nanoparticules
d’or couplées à l’acide folique qui, utilisées comme agents de contraste, peuvent également être
Figure 12. (A) Etarfolatide (99mTc-EC20, Folcepri®, développé par Endocyte). Dans
l’Etarfolatide, le ligand de ciblage (acide folique) est lié directement par liaison covalente à un
motif chélateur de l’agent d’imagerie, le technétium 99m (99mTc). (B) Image en tomographie par
émission monophotonique montrant l’Etarfolatide s’accumulant dans les tumeurs ovariennes
exprimant les récepteurs FR (FR-positive lesion) mais pas dans celles n’exprimant pas cette
protéine (FR-negative lesion). D’après Vergote et al., 2015.
1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique
32
chauffées à l’aide d’une lumière pulsée intense pour la réduction thermique de la tumeur
(Zwicke et al., 2012).
B. EXEMPLE DE L’ETARFOLATIDE
Une des molécules vectorisées dont le développement est le plus avancé est l’Etarfolatide
(Folcepri®, développé par Endocyte), aussi appelé 99mTc-EC20 (Vergote et al., 2015). C’est un
agent d’imagerie radioactif composé d’une molécule d’acide folique liée de manière covalente à
un chélateur de radionucléide, le technétium (99mTc) et conçu pour le diagnostic par TEMP de
tumeurs primaires et métastatiques exprimant les FR (Figure 12A ; Leamon et al., 2002).
L’Etarfolatide a été évalué comme « compagnon » de son homologue thérapeutique (Vintafolide,
Vynfinit®, EC145, développé par Endocyte) dans plusieurs essais cliniques de phase 2 chez des
patients atteints de cancers avancés de l’ovaire, du péritoine, de l’endomètre et du poumon (essai
clinique n°NCT00507741 ; source « clinicaltrials.gov »). Ces études ont établi une corrélation
entre l’expression des FR et l’internalisation du 99mTc-EC20 (Figure 12B). Ainsi, l’utilisation de
ce type d’agent d’imagerie permet de prédire de manière non invasive l’efficacité des thérapies
ciblant les FR sur la base de l’analyse en imagerie de l’incorporation du 99mTc-EC20 (Morris et
al., 2014).
1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique
33
II. DES VECTEURS DE L’ACIDE FOLIQUE A VISEE
THERAPEUTIQUE
A. GENERALITES
Compte tenu de leurs propriétés particulières, les FR apparaissent comme des cibles de
choix pour l’adressage aux cellules tumorales de molécules anticancéreuses et éviter ainsi des
effets secondaires sur le reste des cellules saines de l’organisme. Bien que beaucoup soient
encore à des stades précoces de développement, une grande variété de molécules vectorisées et
dérivées de l’acide folique ont été imaginées. Ainsi, l’acide folique peut, entre autre, être ajouté à
la surface de nanoparticules virales, de liposomes et de micelles pour l’adressage d’agents
anticancéreux aux cellules malignes (Xia et Low, 2010) ou de petits ARN interférants et
oligodesoxyribonucléotides antisens pour abolir ou moduler l’expression d’un gène (Rettig et
Behlke, 2012).
L’acide folique peut également être lié directement et de manière covalente à des
principes actifs tels que des haptènes, des motifs hautement immunogéniques reconnus par un
organisme comme étrangers. Après une série de vaccination par injection de l’haptène seul (par
exemple l’haptène de la fluorescéine) et de différentes cytokines stimulatrices du système
immunitaire, le conjugué haptène-acide folique est administré aux patients pour « décorer » la
tumeur et l’éliminer suite au recrutement du système immunitaire via les anticorps anti-haptènes
(Lu et al., 2004). Cette stratégie fut testée jusqu’en phase 2, notamment pour le traitement des
carcinomes à cellules rénales mais les résultats de cette étude n’ont, pour l’instant pas encore été
publiés.
Dans d’autres molécules, l’acide folique est conjugué à des agents anticancéreux utilisés
en chimiothérapie traditionnelle et connus pour leurs propriétés cytotoxiques. Les deux
molécules sont alors reliées par un espaceur qui doit être stable dans la circulation sanguine,
mais être clivable suite à un stimulus extérieur pour permettre la libération de l’agent
anticancéreux actif.
Figure 13. (A) Structure et représentation schématique du Vintafolide (Vergote and Leamon,
2015). (B) Après liaison au récepteur FR, le Vintafolide est internalisé dans la cellule cancéreuse
par endocytose. Au sein de l’endosome, le système disulfide est réduit, aboutissant à la libération
de la vinblastine. L’agent anticancéreux peut alors exercer son activité et entrainer la mort de la
cellule.
1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique
34
B. EXEMPLE DU VINTAFOLIDE
Une des molécules emblématiques du ciblage des FR est le Vintafolide (Vynfinit®,
EC145, développé par Endocyte). Ce vecteur est composé d’une molécule d’acide folique et
d’un dérivé de vinblastine, un agent anticancéreux de la famille des vinca-alcaloïdes. Ces deux
éléments sont reliés par un espaceur peptidique et un système disulfide réductible et
autoimmolable (Figure 13A). Le Vintafolide agit comme un cheval de Troie moléculaire : suite à
l’interaction entre le ligand de ciblage et son récepteur, le complexe récepteur-vecteur est
internalisé par endocytose dans la cellule tumorale. Au sein de l’endosome, le système disulfide
est réduit, permettant la libération de l’agent anticancéreux (indépendamment de la libération du
vecteur de son récepteur) et peut exercer son activité cytotoxique. Une fois le récepteur libéré de
son ligand, il est recyclé à la membrane et permet un nouveau cycle (Figure 13B).
Le Vintafolide fut développé et testé conjointement avec l’Etarfolatide décrit plus haut
(voir page 32), l’internalisation de ce dernier permettant d’estimer l’expression tumorale des
récepteurs FR. Plusieurs études cliniques de phases 2 et 3 ont alors été menées chez des patients
atteints de cancers pulmonaires ou ovariens respectivement. Les études de phase 2 menées pour
le traitement des cancers ovariens (essai clinique n°NCT00507741, source « clinicaltrials.gov »)
et pulmonaires (essai clinique n°NCT00511482, source « clinicaltrials.gov ») dans lesquelles le
Vintafolide est utilisé en monothérapie montrent une amélioration du contrôle de la maladie et
une survie globale plus importante chez les patients dont la tumeur présente une forte expression
comparée aux patients dont le niveau de FR tumoral est moindre ou nul (Morris et al., 2014 ;
Vergote et Leamon, 2015). Cependant, malgré les résultats encourageants obtenus au cours
d’une autre étude de phase 2 (essai clinique n°NCT00722592, source « clinicaltrials.gov »)
menées sur 162 femmes atteintes de cancer ovarien et traitées avec du Doxil® seul (un liposome
contenant de la doxorubicine) ou en combinaison avec le Vintafolide, l’étude de phase 3 (essai
clinique n°NCT01170650, source « clinicaltrials.gov ») qui suivit fut annulée au cours du
recrutement de patients. En effet, les données préliminaires obtenues au début de l’étude ont été
jugées statistiquement insuffisantes pour justifier la poursuite de cette phase 3 (Cheung et al.,
2016).
Quoiqu’il en soit, malgré le fait que les molécules présentées ci-dessus n’aient pas atteint
tous les objectifs souhaités, l’étude conjointe chez l’homme de l’Etarfolatide et du Vintafolide a
amené de précieuses informations concernant le ciblage des récepteurs de l’acide folique dans le
1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique
35
cadre des chimiothérapies vectorisées. Par exemple, l’étude exploratoire des résultats obtenus
montre que les meilleures réponses cliniques sont obtenues chez les patients dont les lésions
tumorales expriment un fort taux de récepteurs FR. De plus, au cours de ces essais cliniques,
aucun effet supplémentaire dû au Vintafolide n’a pu être observé, les effets indésirables
constatés étant classiquement imputés à la vinblastine elle-même ou au Doxil. En effet, les reins
exprimant des niveaux non négligeables de récepteurs FRα, l’absence de néphro-toxicité
observée au cours de ces études est une étape encourageant la viabilité et l’amélioration des
molécules anticancéreuses ciblant les récepteurs FR.
2E PARTIE
OBJECTIFS DE LA THESE
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
36
5E CHAPITRE
Contexte scientifique & travaux antérieurs
Mes travaux de thèse ont été menés en étroite collaboration avec le groupe « Système
Moléculaires Programmés » dirigée par le Pr Papot (UMR-CNRS 7285). Cette équipe travaille
depuis plusieurs années sur le développement de conjugués d’agents anticancéreux, notamment
dérivés de l’acide folique. J’ai rejoint les thématiques du laboratoire en 2012 au cours de mes
stages de master. Deux vecteurs anticancéreux avaient alors été développés par le groupe du Pr
Papot (Thomas et al., 2011 ; Legigan et al., 2012). Ce sont des assemblages moléculaires
complexes dans lesquels une molécule de principe actif (doxorubicine ou Monométhyl
Auristatine E) est reliée via un espaceur central autoimmolable développé par le groupe
(Demande française n° 1053921 - Demande internationale n° PCT/IB2011/052184) à une
molécule d’acide folique et à une gâchette enzymatique galactosylée (Figure 14A). Une fois
internalisée dans la cellule cible, la gâchette enzymatique est hydrolysée par les β-galactosidases,
des enzymes présentes dans les lysosomes des cellules saines et malignes et qui sont notamment
impliquées dans la transformation du galactose en glucose pour la glycolyse. L’activation de la
gâchette galactosylée permet la décomposition spontanée de l’espaceur central et la libération du
principe actif (Figure 14B). Etant à l’origine de mes travaux de thèse, ces deux vecteurs font
l’objet d’une brève description dans les parties suivantes.
Figure 14. (A) Représentation schématique des vecteurs dérivés de la doxorubicine ou de la
MMAE. (B) Suite à sa liaison au récepteur FR, le vecteur est internalisé dans la cellule tumorale
par endocytose. Au sein du lysosome, les β-galactosidases clivent la gâchette enzymatique (en
vert). L’espaceur autoimmolable se décompose libérant l’agent anticancéreux qui peut alors
exercer ses fonctions cytotoxiques. Le récepteur FR, quant à lui, est recyclé à la membrane de la
cellule.
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
37
I. SYNTHESE ET VALIDATION D’UN VECTEUR DERIVE DE
LA DOXORUBICINE
Le vecteur DGAF (Doxorubicine-Galactoside-Acide Folique) est un conjugué de
doxorubicine, un agent anticancéreux de la famille des anthracyclines qui s’intercale entre les
brins d’ADN et inhibe la topoisomérase II (Figure 15A, Thomas et al., 2011). La doxorubicine
est régulièrement utilisée dans le traitement de différents cancers solides et circulants (Yang et
al., 2014).
Après validation de la stabilité de ce composé à 37 °C dans du PBS ou du sérum bovin, la
libération de la doxorubicine suite au clivage de la gâchette enzymatique a été suivie par
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) après ajout de β-galactosidase
bovine ou bactérienne (Figure 15B). Le composé a ensuite été testé sur deux lignées tumorales,
les cellules HeLa (cancer du col de l’utérus) qui expriment les récepteurs FR et les cellules A549
(cancer du poumon) qui ne les expriment pas.
En plus de la cytotoxicité qu’elle entraine, la doxorubicine présente une fluorescence
intrinsèque (longueurs d’onde d’excitation/d’émission : 488/590 nm) permettant de suivre par
microscopie confocale l’internalisation du composé DGAF dans les cellules (Figure 16). Alors
que la doxorubicine libre pénètre passivement dans les cellules HeLa et A549, le vecteur DGAF
n’est présent que dans les cellules HeLa. Pour démontrer le rôle des FR dans l’internalisation du
DGAF, une compétition avec de l’acide folique libre a été mise en place. Dans les cellules HeLa,
cette compétition empêche l’internalisation du vecteur. En contrôle, les cellules ont été traitées
avec le composé Dox-gal qui ne contient pas l’élément de ciblage des cellules. Ce composé Dox-
gal ne pénètre dans aucune des deux lignées, témoignant ainsi de l’internalisation spécifique du
vecteur DGAF via les FR. Ces résultats ont ensuite été confirmés par vidéo-microscopie
confocale.
L’activité antiproliférative du vecteur DGAF vis-à-vis des cellules HeLa et A549 a
également été évaluée (Figure 17). Après trois jours de traitement, alors que la doxorubicine
entraine une toxicité à la fois dans les cellules HeLa et A549 (IC50 = 52 nM et 190 nM,
respectivement), le vecteur DGAF ne présente une activité antitumorale que dans les cellules
exprimant les FR, avec une efficacité du même ordre de grandeur que la molécule libre (IC50 =
220 nM).
Figure 15. (A) Structure du vecteur DGAF, composé d’un ligand de ciblage (acide folique, en
orange), d’un agent anticancéreux (doxorubicine, en rouge) et d’une gâchette enzymatique
(galactoside, en vert). Ces trois éléments sont articulés autour d’un espaceur central auto-
immolable (en bleu). (B) Hydrolyse du vecteur DGAF en présence de β-galactosidase suivie par
HPLC. Après ajout de la β-galactosidase, le vecteur DGAF disparait au profit de l’apparition
d’un intermédiaire réactionnel et de la doxorubicine.
Figure 16. Etude par microscopie confocale de l’internalisation de la doxorubicine (longueurs
d’onde d’excitation/d’émission : 488/590 nm). Les cellules HeLa et A549 ont été traitées
pendant 2 heures avec 10 µM de doxorubicine, de vecteur DGAF, de vecteur DGAF en présence
d’acide folique (AF, 1 mM) ou avec le vecteur ne contenant pas l’élément de ciblage appelé
Dox-gal. Images représentatives de 2 expériences, barres d’échelle : 50 µm.
Figure 17. Mesure par test XTT de la viabilité des cellules HeLa et A549 traitées pendant 4
jours avec de la doxorubicine libre ou le vecteur monomérique DGAF. Pour les cellules A549, la
toxicité du vecteur en présence de β-galactosidase exogène a également été déterminée.
Moyennes ± s.e.m. (erreur standard sur la moyenne) de 3 expériences.
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
38
L’ensemble de ces résultats témoigne de l’activité hautement spécifique du vecteur
DGAF vis-à-vis des cellules cancéreuses exprimant les récepteurs FR. La présence de la gâchette
galactosylée, activable uniquement en intracellulaire, est un grand avantage puisqu’elle devrait
empêcher la libération prématurée du principe actif dans la circulation sanguine ou les tissus non
ciblés.
II. SYNTHESE DU VECTEUR DERIVE DE LA MMAE
Suite à la validation du composé DGAF, les chimistes du groupe ont entrepris la synthèse
d’un composé dérivé d’un des agents anticancéreux les plus puissants existant à ce jour : la
MMAE, une molécule appartenant à la famille des vinca-alcaloïdes qui se fixe au niveau des
microtubules et bloque ainsi la division cellulaire. Le vecteur développé est alors appelé MGAF
pour MMAE-Galactoside-Acide Folique (Figure 18 ; Legigan et al., 2012).
Après synthèse et purification du composé, l’efficacité du vecteur MGAF a été évaluée in
vitro sur différentes lignées cellulaires : les cellules KB, qui expriment fortement les récepteurs
FR, les cellules HeLa, dont l’expression est moindre et les cellules A549 qui ne les expriment
pas. Alors que les trois lignées cellulaires sont sensibles à l’activité antiproliférative de la
MMAE, seules les cellules KB et HeLa sont affectées par le vecteur MGAF (Tableau 3). Ainsi,
après trois jours de traitement, le vecteur MGAF présente une efficacité égale à celle de la
MMAE libre sur les cellules KB (IC50 de 0,240 nM) alors que la toxicité entrainée sur les
cellules HeLa est plus faible (IC50 = 8,408 nM). Ces différences d’efficacité peuvent être la
conséquence de niveaux d’expression de FR différents dans les deux lignées.
A cause de l’hétérogénéité génétique régnant au sein d’une tumeur, certaines cellules
malignes peuvent échapper à l’action du vecteur, notamment parce qu’elles expriment peu ou
pas le marqueur ciblé. Une activation enzymatique efficace au sein des cellules tumorales
exprimant les récepteurs FR pourrait permettre la libération de suffisamment de MMAE pour
éradiquer les cellules cancéreuses voisines dont l’expression du marqueur ciblé est moindre.
Pour tester cette hypothèse, une expérience de coculture en chambre de Boyden a été réalisée
(Figure 19). Les cellules A549 ont été cultivées seules ou co-cultivées avec des cellules KB ou
Figure 18. Structure du vecteur MGAF composé d’un ligand de ciblage : l’acide folique (en
orange), d’un agent anticancéreux : la MMAE (en rouge) et d’une gâchette enzymatique de type
galactoside (en vert). Ces trois éléments sont articulés autour d’un espaceur central auto-
immolable (en bleu).
IC50 (nM)
Cellules Expression FOLR1 MMAE MGAF
KB +++ 0,240 0,240
HeLa ++ 0,630 8,408
A549 - 0,872 195,230
Tableau 3. Niveaux relatifs de l’expression du gène FOLR1 mesurés par PCR quantitative en
temps réel (RT-qPCR) dans les cellules KB, HeLa et A549 et toxicité induite par la MMAE libre
ou le vecteur MGAF dans chacune des lignées après 3 jours de traitement.
Figure 19. Viabilité des cellules A549 cultivées seules (en blan) en chambre de Boyden
(Polytéréphtalate d'éthylène, 0,4 μM pore size, BD Biosciences), ou cocultivées avec des cellules
KB (en orange) ou des cellules A549 (en gris). Les cellules ont été traitées pendant 3 jours avec
5 ou 10 nM de MMAE ou de MGAF. La viabilité des cellules A549 a ensuite été mesurée par
XTT après retrait du compartiment supérieur.
Figure 20. (A) et (B) Suivi par bioluminescence de la croissance tumorale. Des xénogreffes de
tumeurs KB ont été implantées par voie sous-cutanées à des souris nude Balb/c mâles. Les
animaux ont alors reçu par voie intraveineuse une injection 0,1 mg/kg de MMAE libre les jours
4, 7, 10 14 et 17 ou bien une injection de 5 mg/kg de MGAF les jours 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21,
23 et 26. La croissance des tumeurs a été déterminée par la bioluminescence émise par les
cellules tumorales suite à l’administration de 100 mg/kg de d-luciferin. (C) La survie des
animaux au cours de l’étude a également été rapportée.
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
39
A549. Cette expérience a mis en évidence que l’activation du vecteur MGAF au sein des cellules
KB libérait suffisamment de MMAE pour tuer les cellules A549 co-cultivées.
Enfin, l’efficacité du vecteur MGAF a été évaluée in vivo sur des souris nude auxquelles
des xénogreffes de cellules KB ont été implantées par voie sous-cutanée. Les animaux ont
ensuite été traités par voie intraveineuse trois fois par semaine avec 0,1 mg/kg de MMAE libre
ou avec 5 mg/kg de MGAF. La croissance tumorale a alors été suivie par bioluminescence
(Figure 20A et B). Comparé au groupe de souris non traitées, la MMAE utilisée à 0,1 mg/kg ne
permet que de limiter modérément la croissance tumorale. Une dose supérieure de MMAE a
également été testée (0,5 mg/kg), mais celle-ci était responsable d’une perte de poids chez
l’animal empêchant la poursuite de l’étude. Le vecteur MGAF, quant à lui, entraine une
diminution durable et presque totale de la tumeur au 21e jour, ce qui se traduit par une meilleure
survie des animaux (Figure 20C). Par ailleurs, aucune toxicité du composé n’a pu être détectée
sur les organes des souris au cours de cette étude.
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
Figure 21. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les lignées
leucémiques KG-1 et HL60. Moyennes ± s.e.m. de 3 expériences. (B) Mesure par test XTT de la
viabilité des cellules KG-1 et HL60 traitées pendant 4 jours avec de la doxorubicine libre, le
vecteur DGAF, ou le vecteur ne contenant pas l’élément de ciblage et noté Dox-gal. Moyennes ±
s.e.m. de 5 expériences.
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
40
III. TRANSFERT DU CONCEPT SUR CELLULES DE
PATIENTS
Les travaux antérieurs à mon arrivée au laboratoire ont abouti à la synthèse des deux
vecteurs anticancéreux présentés ci-desus et dérivés de la doxorubicine ou de la MMAE. J’ai
rejoint le laboratoire lors d’une étude complémentaire sur l’activité antitumorale ex vivo du
vecteur DGAF. Les résultats obtenus au cours de cette étude ont permis de déterminer les
objectifs de mon sujet de thèse et ont donné lieu à la publication de mon premier article dont
voici la référence :
A galactosidase-responsive doxorubicin-folate conjugate for selective
targeting of acute myelogenous leukemia blasts.
Clarhaut J., Fraineau S., Guilhot J., Péraudeau E., Tranoy-Opalinski I., Thomas M., Renoux B.,
Randriamalala E., Bois P., Chatelier A., Monvoisin A., Cronier L., Papot S., Guilhot F.
Leukemia Research, 2013, 37, 948-955.
Puisque les récepteurs FRβ, codés par le gène FOLR2 sont exprimés dans plus de 70 %
des Leucémies Aigües Myéloblastiques (LAM, Ross et al., 1999), et que les anthracyclines telles
que la doxorubicine sont encore régulièrement utilisées pour le traitement de patients atteints de
cette pathologie, nous avons évalué l’efficacité thérapeutique du vecteur DGAF sur deux lignées
de cellules leucémiques exprimant les récepteurs FRβ : les cellules KG-1 et HL60 (Figure 21A).
Pour ces lignées, le vecteur DGAF présente des IC50 de 200 nM et 300 nM après quatre jours de
traitement, respectivement (Figure 21B). Comme démontrées précédemment, l’internalisation et
l’activation du conjugué sont dépendantes de l’interaction des récepteurs membranaires FR avec
leur ligand, puisque le composé Dox-gal ne contenant pas l’acide folique ne présente pas de
toxicité.
Dans un second temps, le vecteur DGAF a été évalué sur des cellules leucémiques isolées
à partir de la moelle osseuse de 31 patients atteints de LAM. Pour cela, deux groupes de patients
ont d’abord été élaborés selon leur niveau d’expression du gène FOLR2. En effet, ce gène est
Figure 22. (A) Expression du gène FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les blastes issus de
patients atteints de différents types de LAM. (B) Les cellules leucémiques des patients atteints de
LAM de type 0, 1 ou 2 expriment plus faiblement le gène FOLR2 que les cellules malignes des
patients atteints de LAM de type 3, 4, 5 et 7. (C) Pour chaque patient, l’internalisation du vecteur
DGAF a été mesurée par cytométrie en flux dans des lymphocytes (n’exprimant par les FR) et
dans les cellules leucémiques. Pour cela, les cellules ont été traitées 3 heures avec 10 µM de
DGAF. (D) L’internalisation du vecteur DGAF dans les cellules leucémiques traitées pendant 3
heures avec 10 µM de DGAF est corrélée à leur niveau d’expression du gène FOLR2 (Spearman
p = 0,0025).
2e Partie – Objectifs de la thèse
5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs
41
exprimé à des niveaux inégaux selon le sous-type de LAM dont est atteint le patient (Figure
22A). Ainsi, le premier groupe comprend les patients atteints de LAM de type M0, M1 et M2
dont les cellules malignes expriment faiblement le gène FOLR2, avec une valeur médiane de
0,0012 % de GAPDH (Figure 22B). Le second groupe est composé des patients atteints de LAM
de type M3, M4, M5 et M7 dont les blastes ont un niveau d’expression du récepteur FRβ plus
important (médiane : 0,0129 % de GAPDH).
Par la suite, le taux d’internalisation du vecteur DGAF dans les blastes et les lymphocytes
des patients de chaque groupe a été mesuré par cytométrie en flux (Figure 22C). Dans les deux
groupes de patients, et après trois heures de traitement avec 10 µM du composé, le vecteur
DGAF n’est internalisé que dans les cellules leucémiques. Les lymphocytes n’exprimant pas les
récepteurs de l’acide folique, ces résultats démontrent la spécificité de l’internalisation du
composé dans les cellules ciblées.
Par ailleurs, les données individuelles obtenues pour les patients atteints de LAM de type
M0, M1 et M2 montrent que les seuls blastes ayant internalisé le vecteur DGAF sont ceux dont
l’expression de FOLR2 est la plus importante. Avec le raisonnement inverse, les blastes des
patients du second groupe qui internalisent le moins le vecteur sont ceux dont l’expression du
gène FOLR2 est la plus faible.
L’ensemble de ces résultats démontre la spécificité et l’efficacité antitumorale du vecteur
DGAF sur des cellules leucémiques de patients. De plus, au cours de cette étude, nous avons pu
démontrer une forte corrélation entre le niveau d’expression du récepteur FRβ et le taux
d’internalisation du vecteur DGAF (Spearman p = 0,0025 ; Figure 22D). Le niveau d’expression
des récepteurs FR apparait alors comme une information importante dans l’élaboration du
protocole de soins du patient puisqu’il pourrait permettre de prédire l’efficacité des thérapies
ciblant ce marqueur.
Figure 23. (A). Pour optimiser le ciblage des récepteurs à l’acide folique, une première approche
consiste à développer des vecteurs permettant la libération de deux molécules d’agents
anticancéreux avec un nombre de récepteurs FR constant. (B) La seconde approche consiste à
identifier un moyen d’augmenter l’expression du marqueur ciblé, soit les récepteurs FR à la
surface des cellules tumorales.
2e Partie – Objectifs de la thèse
6e Chapitre – Objectifs des travaux de thèse
42
6E CHAPITRE
Objectifs des travaux de thèse
Les résultats obtenus au cours des évaluations in vitro et ex vivo des vecteurs MGAF et
DGAF indiquent que leur efficacité est dépendante du niveau de récepteurs FR exprimés par les
cellules cancéreuses. Les travaux d’autres groupes parus ultérieurement viennent confirmer cette
hypothèse. Par exemple, lors du développement clinique de l’Etarfolatide, Morris et al. ont
montré une relation entre l’internalisation de cet agent et le taux de récepteurs FR exprimés par
les tumeurs des patients (voir page 32 ; Morris et al., 2014). Ainsi, le niveau d’expression des
récepteurs FR d’une tumeur est un facteur prédictif de l’efficacité des thérapies vectorisées
dérivées de l’acide folique et permet la sélection des patients susceptibles de bénéficier au mieux
de ce type de thérapies.
L’objectif principal de ma thèse a alors été d’optimiser le ciblage des récepteurs FR en
permettant l’internalisation de plus d’agent anticancéreux dans les cellules malignes. Pour cela,
deux approches ont été envisagées. La première approche repose sur la modification chimique
des vecteurs DGAF et MGAF afin de permettre la libération de deux molécules anticancéreuses
(Figure 23A). Deux vecteurs homodimères permettant le transport et la libération de deux
molécules de doxorubicine ou de MMAE ont alors été synthétisés par les chimistes de l’équipe
du Pr Papot. J’ai ensuite réalisé leur évaluation biologique : les vecteurs diDoxorubicine-
Galactoside-Acide folique (diDGAF) et diMMAE-Galactoside-Acide folique (diMGAF) ont été
testés sur différentes lignées cellulaires et/ou sur des cellules malignes de patients et leur
efficacité comparée à celle des vecteurs monomériques correspondants.
En parallèle de l’étude de ces deux vecteurs, une seconde approche a été abordée. Elle
consiste à augmenter le taux de récepteurs FR présents à la surface des cellules cancéreuses afin
d’améliorer l’internalisation d’un conjugué dérivé de l’acide folique dans ces cellules (Figure
23B). Les gènes codant les récepteurs FRα et FRβ présentent des organisations et des
mécanismes de régulation différents. Compte tenu du nombre important de données cliniques
disponibles pour le ciblage du récepteur FRα, c’est sur la stimulation de l’expression de cette
2e Partie – Objectifs de la thèse
6e Chapitre – Objectifs des travaux de thèse
43
isoforme que s’est focalisé mon travail. Cet axe, qui a représenté la plus grande partie de ma
thèse, s’est articulé autour de trois étapes principales : 1/ détermination des paramètres
(concentrations, durées des traitements, etc.) permettant la stimulation de l’expression du gène
FOLR1 par un mélange d’activateurs transcriptionnels; 2/ démonstration in vivo que ce mélange
est capable d’agir comme un adjuvant d’un vecteur anticancéreux dérivé de l’acide folique en
augmentant son internalisation dans les cellules malignes et 3/ identification des mécanismes
permettant l’augmentation d’efficacité du vecteur en présence du mélange adjuvant.
D’autre part, au cours de ma thèse, j’ai eu l’occasion de travailler sur d’autres types de
ciblage des tumeurs. Ces études, menées en collaboration avec différentes équipes, ont donné
lieu à la publication de plusieurs articles et seront décrites succinctement dans une partie intitulée
« Travaux collaboratifs » située page 98.
3E PARTIE
MATERIELS &
METHODES
3e Partie – Matériels & Méthodes
44
I. CULTURE CELLULAIRE
A. MODELES CELLULAIRES
Les lignées cellulaires utilisées au cours de mes différents travaux de thèse ainsi que leurs
caractéristiques principales sont répertoriées dans le tableau 4. Les lignées tumorales A2780,
A549, HeLa et SKOV-3 proviennent de chez Sigma-Aldrich (European Collection of
Authenticated Cell Cultures). Les cellules cancéreuses KB ont été achetées chez LGC Standards
(American Type culture Collection) et les cellules saines HUVEC chez Lonza. Les cellules
épithéliales bronchiques immortalisées 16HBE14o- ont été généreusement fournies par Sandra
Mirval (CNRS ERL 7368). Enfin les cellules cancéreuses MDA-MB-231-luciférase et MIA-
PaCa-2-luciférase ont été fournies par le Centre d’Imagerie du Petit Animal (CIPA) d’Orléans
(CNRS – TAAM UPS44).
B. DECONGELATION, ENTRETIEN, CONGELATION
1. Décongélation des cellules
Les cellules sont stockées dans l’azote liquide à -196°C. Les cellules sont rapidement
décongelées dans 15 mL de milieu de culture approprié (Tableau 4) puis centrifugées 7 minutes à
1000 rpm (rotations par minute). Après resuspension du culot dans du milieu de culture, les
cellules sont distribuées en boite de Pétri et placées en atmosphère humide dans un incubateur à
37°C et 5% de CO2 pendant au moins 24 heures. Le milieu de culture est remplacé le lendemain.
2. Entretien des cellules
Les cellules saines 16HBE et toutes les cellules cancéreuses sont cultivées dans du RPMI
1640 + GlutaMAXTM (Gibco) dans lequel ont été rajoutés 10% de sérum de veau fœtal (SVF ;
PAN Biotech) et 1% de pénicilline/streptomycine (PS ; Gibco). Les cellules HUVEC sont
cultivées dans du milieu EGM™-2 BulletKit™ composé d’Endothelial cell Basal Medium-2
Cellules tumorales
Nom de la lignée Fournisseur Origine Tissu d’origine Morphologie Milieu de culture
A2780 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Ovaire Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
A549 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Poumon Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
HeLa Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Col de l’utérus Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
KB/KB* LGC Standards (ATCC) Humaine Tête et cou Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
MDA-MB-231-luc* CIPA Orléans Humaine Sein Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
MIA-PaCa-2-luc* CIPA Orléans Humaine Pancréas Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
SKOV-3 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Ovaire Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
Cellules saines
Nom de la lignée Fournisseur Origine Tissu d’origine Morphologie Milieu de culture
16HBE14o- CNRS ERL 7368 Humaine Poumon Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)
HUVEC Lonza Humaine Cordon ombilical Endothéliale EGMTM-2 BulleKitTM
Tableau 4. Récapitulatif des lignées cellulaires utilisées et de leurs principales caractéristiques. *Les cellules ont été transfectées avec un
plasmide contenant le gène de la luciférase. ECACC : European Collection of Authenticated Cell Cultures ; ATCC : American Type Culture
Collection ; RPMI : Roswell Park Memorial Institute ; CIPA : Centre d’Imagerie du Petit Animal (CNRS – TAAM UPS44, Orléans) ; EGM :
Endothelial Growth Medium.
3e Partie – Matériels & Méthodes
45
(EBM-2 ; Lonza) et d’EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (SVF, hydrocortisone,
hFGF, VEGF, R3-IGF, acide ascorbique, hEGF et gentamicine/amphotericine-B; Lonza).
Lorsqu’elles arrivent à 80% de confluence, les cellules sont décrochées avec de la
trypsine à 0,25% contenant 0,9 mM d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA (Gibco) puis
centrifugées 7 minutes à 1000 rpm. Après comptage sur cellule de Malassez, les cellules sont
ensemencées à la concentration souhaitée dans le milieu adéquat et placées en atmosphère
humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Les cellules sont utilisées sur environ 10
passages afin d’éviter leur dérive.
3. Congélation des cellules
Afin de stocker les cellules à long terme, celles-ci sont décrochées à l’aide de trypsine
(0,25 %) - EDTA puis centrifugées 7 minutes à 1000 rpm. Le culot cellulaire est resuspendu
dans un mélange contenant le milieu adapté à la lignée cellulaire, 20% de SVF, 1% de PS et 5%
de DMSO (VWR), un agent cryoprotecteur. Les cellules sont placées provisoirement à -80°C
dans une boite de congélation (CoolCell® LX, de Biocision) permettant une diminution de la
température d’1 °C par minute. Les cellules sont transférées à l’azote liquide le lendemain.
3e Partie – Matériels & Méthodes
46
II. ETUDE DE CYTOTOXICITE
A. MESURE DE LA VIABILITE CELLULAIRE
1. Principe
Afin de déterminer la toxicité entrainée par une molécule, la viabilité des cellules est
mesurée à l’aide du kit Cell Proliferation Kit II, XTT (Roche). Il s’agit d’un test basé sur la
réduction de sels de tétrazolium (XTT) en un composé de couleur orange, le formazan dont la
densité optique peut être déterminée par spectrophotométrie à 490 nm. La réduction des sels de
tétrazolium en formazan étant assurée par les déhydrogénases mitochondriales, cette conversion
ne se produit que dans les cellules métaboliquement actives. Ainsi, la quantité de formazan
formé est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.
2. Protocole
Pour réaliser ce test, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits et incubées 24
heures en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Après traitement des
cellules avec les composés à tester, 25 µL du mélange réactionnel constituant le XTT sont
ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont alors incubées 4 heures supplémentaires à 37°C et
5% de CO2 pour permettre la formation de la réaction colorimétrique puis la densité optique du
formazan est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm sur un lecteur de plaque (Mithras
LB940TM, Berthold ou Multiskan Go, Thermo Scientific). Chaque expérience est réalisée en
triplicat et reproduite au minimum trois fois.
Pour chaque expérience, la valeur moyenne des absorbances de chaque triplicat est
calculée. La valeur moyenne obtenue pour le puits ne contenant que du milieu (« blanc », soit
sans cellule) est retranchée à l’ensemble des autres valeurs moyennes. Les résultats sont
exprimés en pourcentage de viabilité et normalisés par rapport aux cellules non traitées,
considérées comme étant à 100% de viabilité.
3e Partie – Matériels & Méthodes
47
B. MESURE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE
1. Principe
La prolifération des cellules est déterminée en suivant l’incorporation de
bromodéoxyuridine (BrdU) à l’aide du kit Cell Proliferation ELISA, BrdU Colorimetric (Roche).
C’est un test colorimétrique reposant sur le dosage de BrdU, un analogue de la thymidine qui est
incorporé au sein de l’ADN nouvellement synthétisé dans les cellules en prolifération. La
quantité de BrdU incorporé est alors proportionnelle au nombre de cellules ayant subi une
division.
2. Protocole
Pour réaliser ce test, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits et incubées 24
heures en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2 avant l’ajout des
composés à tester. Vingt-quatre heures avant la fin du traitement des cellules, 10 µM de BrdU
(concentration finale) sont ajoutés dans chaque puits. Après la fin du traitement, le milieu de
culture est retiré puis les cellules sont fixées et l’ADN dénaturé par ajout de 200 µL de la
solution de fixation fournie dans le kit. Après 30 minutes à température ambiante, cette solution
est retirée et 100 µL d’anticorps anti-BrdU couplés à la péroxydase (dilués au 1:100 dans la
solution de dilution fournie dans le kit) sont ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 90
minutes à température ambiante. Après 3 lavages avec 200 µL de solution de lavage, 100 µL de
tétraméthyl-benzidine (substrat de la péroxydase) sont ajoutés dans chaque puits et incubés à
température ambiante et à l’obscurité pendant 15 minutes, puis l’action de la peroxydase est
stoppée par ajout de 25 µL d’acide sulfurique 2N dans chaque puits. Après 1 minute
d’incubation, l’absorbance du produit formé suite à l’action de la péroxydase est déterminée par
spectrophotométrie à 450 nm sur un lecteur de plaque (Mithras LB940TM, Berthold ou
Multiskan Go, Thermo Scientific). Cette absorbance est proportionnelle au nombre de cellules
ayant incorporé le BrdU, soit au nombre de cellules ayant subi une division.
Cette expérience est réalisée au minimum trois fois en duplicat. Pour chaque expérience,
la valeur moyenne des absorbances de chaque duplicat est déterminée. La valeur moyenne
obtenue pour le puits ne contenant que du milieu (« blanc », soit sans cellule) est retranchée à
Cellules marquées Hoechst 33342
λex/λem = 350/461 nm
Annexine V – FITC
λex/λem = 492/514 nm
Ethidium homodimère III
λex/λem = 528/617 nm
Saines + - -
En apoptose + + -
En apoptose tardive + - +/-
Nécrotiques + + +
Tableau 5. Marquage des cellules par le kit Apoptotic / Necrotic / Healthy Cells Detection Kit
(PromoKine). λ : longueur d’onde, FITC : Isothiocyanate de fluorescéine. Les cellules saines ne
sont marquées que par le Hoechst 33342, une sonde nucléique perméable aux membranes
cellulaires. A cause du « switch » des phoshatidylsérines du feuillet membranaire interne au
feuillet membranaire externe qui se produit dans les étapes précoces de l’apoptose, les cellules
apoptotiques sont marquées par l’Annexine V-FITC et par le Hoechst 33342. L’éthidium
homodimère III est une sonde nucléique imperméable aux membranes cellulaires qui marque
alors les cellules en apoptose tardive et les cellules nécrotiques. Enfin, les cellules en nécrose
sont reconnues par chacun des trois marqueurs.
3e Partie – Matériels & Méthodes
48
l’ensemble des autres valeurs moyennes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
prolifération et normalisés par rapport aux cellules non traitées, considérées comme étant à 100%
de viabilité.
C. MESURE DE L’APOPTOSE
1. Principe
L’apoptose des cellules est déterminée par cytométrie en flux à l’aide du kit
Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit (PromoKine) qui contient trois marqueurs :
l’Annexin V, L’éthidium homodimère III et le Hoechst 33342. Le Hoechst 33342 (longueur
d’onde d’excitation/d’émission = 350/461 nm) est une sonde nucléique perméable aux
membranes cellulaires qui émet une fluorescence lorsqu’elle est fixée à de l’ADN. Le Hoechst
33342 marque alors l’ensemble des cellules. L’Annexine V, qui est ici couplée à l’isothiocyanate
de fluorescéine (FITC ; longueur d’onde d’excitation/d’émission = 492/514 nm), lie avec une
forte affinité les phosphatidylsérines qui sont transloquées du feuillet membranaire interne au
feuillet membranaire externe au cours des premières étapes de l’apoptose. L’Annexine V-FITC
identifie donc les cellules en apoptose. Enfin, l’éthidium homodimère III (EthD-III ; longueur
d’onde d’excitation/d’émission = 528/617 nm) est une sonde nucléique qui est, contrairement au
Hoechst 33342, imperméable aux membranes des cellules vivantes et apoptotiques. Il marque
alors les cellules nécrotiques ou en apoptose tardive (Tableau 5).
2. Protocole
Pour réaliser ce test, les cellules adhérentes sont décrochées à l’aide de Versene (Gibco)
et mises en commun avec le milieu de culture des cellules qui aura été conservé. Après
centrifugation 10 minutes à 1100 rpm les cellules sont resuspendues dans 1 mL de PBS
(Phosphate Buffered Saline) puis 150 µL de cette suspension cellulaire sont prélevés afin d’être à
nouveau centrifugés 5 minutes à 1000 rpm. Le culot cellulaire est alors repris dans 100 µL de
tampon fourni dans le kit (contient du calcium permettant la liaison de l’Annexine V aux
phosphatidylsérines) auxquels sont rajoutés 5 µL de Hoechst 33342, 5 µL d’Annexine V-FITC et
5 µL d’EthD-III. Après 15 minutes d’incubation à température ambiante et à l’obscurité, les
3e Partie – Matériels & Méthodes
49
cellules sont diluées dans 400 µL supplémentaires du même tampon et analysées en fonction de
leur marquage par cytométrie en flux (cytomètre Analyseur BD FACS Verse). Pour chaque
échantillon, 3×104 événements sont comptés sur une population de cellules sélectionnées pour
exclure les débris et les agrégats cellulaires.
Chaque expérience est réalisée au minimum trois fois en uniplicat. Cette expérience
permet de comptabiliser le nombre de cellules vivantes, apoptotiques ou nécrotiques présentes
dans un échantillon. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules totales.
D. TEST DE MORPHOGENESE SUR MATRIGEL®
Le test de morphogenèse est un test basé sur la capacité des cellules endothéliales à
former spontanément un réseau de tubules lorsqu’elles sont ensemencées sur une matrice telle
que le Matrigel®. Ce test est particulièrement indiqué pour étudier les capacités pro- ou anti-
angiogéniques d’une molécule.
Pour ce test, les puits d’une plaque 48 puits sont recouverts avec 250 µL de Matrigel®
complet (Corning). Après 4 heures d’incubation en atmosphère humide dans un incubateur à
37°C et 5% de CO2, 5×104 cellules HUVEC sont déposées dans chaque puits, dans 500 µl de
milieu EGM-2 (Lonza) supplémenté ou non de la molécule à tester. Après 16 heures en
atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2, le milieu de culture est
délicatement retiré et les cellules sont incubées 30 minutes avec 25 µM de Calcein AM
(longueur d’onde d’excitation/d’émission = 514/520 nm ; Sigma-Aldrich). Les structures
capillaires sont ensuite fixées pendant 45 minutes avec une solution de formaldéhyde à 2%.
Après deux lavages au PBS, les structures capillaires sont photographiées à l’aide d’un
macroscope (MacroView MVX10 Olympus).
Chaque expérience est réalisée en uniplicat et reproduite au minimum trois fois. La
capacité des cellules endothéliales à former un réseau vasculaire est déterminée à l’aide du
logiciel AngioQuant en mesurant la longueur des tubules formés par les cellules et en comptant
le nombre d’intersections formées entre ces tubules.
3e Partie – Matériels & Méthodes
50
III. MESURE DE L’EXPRESSION D’UN GENE PAR
REACTION EN CHAINE PAR POLYMERASE
L’expression d’un gène peut être déterminée en mesurant le niveau d’expression de
l’ARN messager (ARNm) correspondant. Pour cela, les cellules sont lysées et le contenu
cellulaire est récupéré. Les ARN totaux sont isolés puis transcrits en ADN complémentaire
(ADNc) par une réaction de transcription inverse employant des amorces dont les séquences sont
aléatoires afin de s’hybrider sur tous les ARN. La quantification de l’ARNm d’intérêt est ensuite
réalisée par une réaction en chaine par polymérisation (PCR, Polymerase Chain Reaction) qui
elle, n’emploie que les amorces spécifiques des gènes étudiés. L’expression d’un gène d’intérêt
est alors mesurée par comparaison d’un gène dit de ménage, c’est-à-dire un gène dont
l’expression n’est pas influencée par le traitement appliqué aux cellules, et notée en pourcentage
d’expression de ce gène.
A. EXTRACTION DES ARN TOTAUX
1. A l’aide du kit Promega
Les ARN totaux sont extraits à l’aide du kit SV Total RNA Isolation System (Promega),
selon les instructions fournies par le fabricant. Pour cela, 1,5×103 à 5×106 cellules ou jusqu’à 30
mg de tissu sont lysés dans 175 µL de tampon de lyse contenu dans le kit et auquel du β-
mercaptoéthanol a préalablement été ajouté. Ce lysat cellulaire est dilué dans 350 µL de tampon
de dilution et placé 3 minutes à 70°C pour permettre la compaction des acides nucléiques. Après
centrifugation 10 minutes à 12 000 rpm, le surnagent débarrassé des débris cellulaires est
mélangé à 200 µL d’éthanol 95% puis déposé sur une colonne contenant une membrane de silice
avant d’être à nouveau centrifugé pendant 1 minute à 12 000 rpm. Cette membrane de silice
présente une charge positive et retient les éléments de charges opposés contenus dans le lysat
cellulaire comme par exemple les acides nucléiques. Après deux lavages avec un tampon
éthanolique fourni dans le kit, la membrane est incubée 30 minutes à température ambiante en
présence d’un mélange contenant de la DNase I, une enzyme permettant la dégradation de
l’ADN pour ne conserver que l’ARN sur la membrane. L’activité de cette enzyme est ensuite
3e Partie – Matériels & Méthodes
51
stoppée par 200 µL de « DNase Stop Solution ». Après centrifugation d’une minute à 12 000
rpm suivie de deux lavages, les ARN sont élués dans 100 µL d’eau pure sans nucléase, puis
stockés à – 80°C.
2. A l’aide du kit Macherey-Nagel
Les ARN totaux sont extraits à l’aide du kit NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel), selon
les recommandations du fabricant. Pour cela, jusqu’à 30 mg de tissu ou 5×106 cellules sont lysés
dans 350 µL de tampon de lyse contenant du β-mercaptoéthanol puis les débris cellulaires sont
éliminés à l’aide d’un filtre fourni dans le kit. Après centrifugation d’une minute à 12 000 rpm,
350 µL d’éthanol 70 % sont ajoutés au lysat cellulaire. Ce mélange est ensuite déposé sur une
membrane de silice puis centrifugé 30 secondes à 12 000 rpm. La membrane est ensuite
débarrassée des sels qu’elle contient et qui diminuent l’efficacité de la DNase, par ajout de 350
µL de la solution adaptée contenue dans le kit. Après centrifugation d’une minute à 12 000 rpm,
95 µL d’un mélange contenant de la DNase sont ajoutés sur la menbrane et incubés entre 30
minutes à température ambiante. Après inactivation de l’enzyme avec 200 µL du tampon appelé
« RAW2 », la membrane est lavée deux fois avec le tampon de lavage. Les ARN sont alors élués
dans 60 µL d’eau pure sans nucléase puis stockés à -80°C.
3. Extraction d’ARN sur de petites quantités de cellules
Lorsque la quantité de cellules disponibles (maximum 1×105 cellules) pour l’extraction
d’ARN est faible (par exemple pour les cellules HUVEC), un troisième kit d’extraction est
utilisé, le kit NucleoSpin® RNA XS (Macherey-Nagel). Pour cela, les cellules sont lysées dans
100 µL de tampon de lyse du kit auquel 2 µL de TCEP, un agent réducteur, ont été
préalablement ajoutés. Les ARN sont ensuite stabilisés par 5 µL de «Carrier RNA ». Le lysat est
alors filtré comme précédemment puis 100 µL d’éthanol à 70% sont ajoutés au filtrat obtenu. Le
mélange est déposé sur une membrane de silice et centrifugé 30 secondes à 12 000 rpm. Les sels
contenus sur la membrane sont élués avec 100 µL de la solution fournie par le kit à cet effet puis
25 µL d’une solution contenant la DNase sont ajoutés. La membrane est incubée 15 minutes à
température ambiante avant d’inactiver l’enzyme avec 100 µL de tampon d’inactivation. Après
deux lavages, les ARN sont élués dans 10 µL d’eau pure sans nucléase et stockés à -80°C.
3e Partie – Matériels & Méthodes
52
B. QUALITE ET DOSAGE DES ARN TOTAUX
La qualité des ARN extraits est vérifiée par migration sur un gel contenant 1% d’agarose
d’une fraction de l’éluat obtenu mélangée à du bromure d’éthidium ou du Midori Green
Advanced DNA stain (Nippon Genetics Europe). La concentration en ARN de l’échantillon est
déterminée par spectrophotométrie à 260 nm (Multiskan Go, Thermo Scientific). La pureté de
l’échantillon est estimée par mesure des densités optiques (DO) à 230 et 260 nm. Conformément
aux fiches techniques des kits d’extraction d’ARN, il a été vérifié que les rapports
DO260nm/DO280nm (contamination protéique) et DO260nm/DO230nm (autres contaminations) étaient
compris entre 1,7 et 2,1 dans le premier cas et 1,8 et 2,2 dans le second.
C. TRANSCRIPTION INVERSE DES ARN
1. A l’aide du kit Invitrogen
Pour la transcription inverse des ARN en ADNc, le kit SuperScript® II Reverse
Transcriptase (Invitrogen) est utilisé. Pour cela, 1,5 à 2 µg d’ARN totaux sont incubés pendant 5
minutes à 70°C avec 1,4 µg d’amorces de séquence aléatoire (volume total 12,3 µL, complété
avec de l’eau pure). Après hybridation des amorces sur les matrices d’ARN, leur élongation est
permise en ajoutant au mélange 1 µL de dithiothréitol (0,1 M), 1 µL de
désoxyribonucléotides (dNTP, 10 mM), 4 µL de tampon (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15
mM MgCl2, pH = 8,3) et 0,7 µL de transcriptase inverse (200 unités/µL). Le mélange est alors
incubé à 25°C pendant 10 minutes, à 42°C pendant 50 minutes et enfin à 95°C pendant 15
minutes. Les ADNc obtenus sont stockés à -20°C.
2. A l’aide du kit Quanta
Pour la transcription inverse des ARN, un second kit peut également être utilisé : le
qScriptTM cDNA synthesis Kit (Quanta). Contrairement au kit précédent, il ne contient qu’une
seule étape dans laquelle 1 à 1,5 µg d’ARN sont mélangés à 4 µL du mélange réactionnel
(amorces de séquence aléatoire, dNTP et constituants nécessaires au fonctionnement de
Nom Espèce reconnue Amorces sens Amorces antisens
hFOLR1 Humaine 5’-AGCACCACAAGGAAAAGCCAGG-3’ 5’-GTGCCATCTCTCCACAGTGGTT-3’
hFOLR2 Humaine 5’-CCACTTCATCCAGGACACCTGT-3’ 5’-CATCCAGGAAGCGTTCTTTGCG-3’
hFOLR3 Humaine 5’-CTACACCTGCAAAAGCAACTGGC-3’ 5’-GGAAGTAGGACTCAAAGGTGCTG-3’
hFOLR4 Humaine 5’-TGTCGGAAGCACTTCATCCAGG-3’ 5’-CGGCACATTCACAACTCGCTCT-3’
mFOLR1 Murine 5’-GGACTGAACTTCTCAATGTCTGC-3’ 5’-CTTCCTGGCTTGTGTTCGTGGA-3’
mFOLR2 Murine 5’-CTGACCTAGGGAGAGGCCAA-3’ 5’-TGTCTGTTTCCAGGCCATGT -3’
GAPDH Humaine/murine 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’ 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’
hPCFT Humaine 5’-CCTTTGCCACTATCACGCCTCT-3’ 5’-ACCAGCTTGGAGAGTTTAGCCC-3’
hRFC Humaine 5’-CTTTGCCACCATCGTCAAGACC-3’ 5’-GGACAGGATCAGGAAGTACACG-3’
Tableau 6. Liste des amorces utilisées pour l’étape de RT-qPCR. Pour chaque couple d’amorces, l’amplification unique et spécifique du gène
d’intérêt a été vérifiée.
3e Partie – Matériels & Méthodes
53
l’enzyme) et à 1 µL d’enzyme. Le volume total, qui doit être de 20 µL est complété avec de l’eau
pure. Le mélange obtenu est alors placé à 22°C pendant 5 minutes, à 42°C pendant 30 minutes et
à 85°C pendant 5 minutes. Les ADNc obtenus sont stockés à -20°C.
D. PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL
1. Principe
L’expression d’un gène peut être évaluée en réalisant une PCR quantitative en temps réel
(RT-qPCR). Pour réaliser cette technique, on peut utiliser des agents comme le SYBR Green qui
émettent une fluorescence lorsqu’ils sont liés à des acides nucléiques double brins. La RT-qPCR
consiste alors à mesurer, à chaque cycle de PCR effectué, la fluorescence émise par l’échantillon,
représentative de la quantité d’ADN amplifiée.
2. Protocole
La sensibilité de la RT-qPCR autorise l’utilisation de petites quantités de réactifs. Ainsi,
dans les puits d’une plaque optique à 96 puits (Applied Biosystems) 2,5 µL d’ADNc (dilués au
1/10e dans de l’eau pure) sont mélangés à 5 µL de réactif SYBRGreen (Applied Biosystems), 2,4
µL d’eau, 0,05 µL d’amorces sens (25 µM) et 0,05 µL d’amorces antisens (25 µM). Pour vérifier
la pureté du mélange réactionnel, un puits dans lequel l’ADNc est remplacé par de l’eau est
également réalisé (« blanc »). Les échantillons sont alors placés dans l’appareil GeneAmp 7500
Sequence Detection System (Applied Biosystems) où, après 10 minutes de dénaturation à 95°C,
ils subissent 40 cycles d’amplification (15 secondes à 95°C puis 1 minute à 60°C).
Chaque expérience est réalisée en duplicat et est répétée au minimum trois fois. Les
séquences des amorces utilisées pour cette technique sont répertoriées dans le tableau 6. La
qualité et la spécificité d’amplification ont été vérifiées pour chaque couple d’amorces.
Figure 24. Exemple de courbe obtenue par RT-qPCR. Le Ct, ou cycle seuil correspond au
nombre de cycles de PCR nécessaire pour que la fluorescence émise par un échantillon atteigne
une valeur seuil, fixée dans la partie inférieure de la phase linéaire de la courbe. L’expression
d’un gène peut alors être déterminée par l’expression suivante : % gène de ménage = 100×2-(Ct du
gène d’intérêt – Ct du gène de ménage).
3e Partie – Matériels & Méthodes
54
3. Analyse des résultats
Le cycle threshold (Ct), ou cycle seuil, correspond au nombre de cycles nécessaires à
l’échantillon pour atteindre une valeur seuil, définie au-dessus de la ligne de base correspondant
au bruit de fond, lorsque l’amplification de l’échantillon entre en phase exponentielle. Ainsi,
moins il y a de matériel génétique dans l’échantillon au début de la réaction, plus il faut de cycle
à cet échantillon pour atteindre la valeur seuil fixée et donc, plus le Ct est élevé (Figure 24). En
calculant la différence de Ct (∆Ct) entre un gène d’intérêt et un gène de ménage, il est alors
possible de réaliser une normalisation des résultats. Il s’agit donc d’une expression relative,
exprimée en pourcentage d’expression du gène de ménage et qui peut être déterminée par le
calcul suivant : % 𝑒𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛 𝑔è𝑛𝑒 𝑑𝑒 𝑚é𝑛𝑎𝑔𝑒 = 100 × 2−∆𝐶𝑡.
IV. ETUDE DE L’EXPRESSION ET DE LA LOCALISATION
D’UNE PROTEINE
A. ETUDE DE L’EXPRESSION PAR WESTERN BLOT
Le niveau d’expression d’une protéine peut être étudié par Western blot. Pour cela, les
cellules sont lysées sur glace dans 100 µL d’un tampon non réducteur (Tris-HCl 10 mM, NaCl
150 mM, Triton X-100 1%, NP-40 0,5%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, sodium orthovanadate
100 mM, pH = 7,4). La concentration protéique de l’échantillon est déterminée à l’aide du kit
DC protein assay (Bio-Rad) consistant en un dosage colorimétrique qui suit un protocole
amélioré à partir de celui de Lowry. Les lysats sont conservés à -20°C.
Les protéines sont séparées par électrophorèse, à l’aide du système XCell SureLock Mini-
Cell (Invitrogen). Pour cela, une fraction du lysat protéique est mélangée à un tampon de charge
dénaturant (NuPAGE LDS Sample Buffer 4X, Life Technologies) et à un tampon réducteur
(NuPAGE Sample Reducing Agent 10X, life technologies). Le mélange est alors placé 10
minutes à 70°C puis 10 à 100 µg de protéines sont déposés sur un gel de polyacrylamide pré-
coulé Novex 10% Tris-Glycine (Life Technologies). Les protéines sont alors séparées selon leur
poids moléculaire en appliquant un courant électrique à 100 V pendant 1 à 3 heures dans un
Anticorps primaires
Nom anticorps Référence Type Fournisseur Espèce Dilution Tampon de dilution Tampon de lavage
IgG Anti-FRα (FL-257) sc-28997 Polyclonal Santa-Cruz Lapin 1:250 PBS-lait 5% PBS-Tween 0,1%
IgG Anti-α-Tubuline (B-5-1-2) T6074 Polyclonal Sigma-Aldrich Souris 1:2000 PBS-lait 5% -Tween 0,1% PBS-Tween 0,1%
Anticorps secondaires
Nom anticorps Référence Type Fournisseur Espèce Dilution Tampon de dilution Tampon de lavage
Anti-Rabbit IgG-HRP A0545 Polyclonal Sigma-Aldrich Chèvre 1:5000 PBS-lait 5% PBS-Tween 0,1%
Anti-mouse IgG-HRP A0168 Polyclonal Sigma-Aldrich Chèvre 1:5000 PBS-lait 5% -Tween 0,1% PBS-Tween 0,1%
Tableau 7. Anticorps primaires et secondaires utilisés en Western blot.
3e Partie – Matériels & Méthodes
55
tampon d’électrophorèse à 1X (Novex Tris-Glycine SDS Running Buffer 10X, Life
Technologies).
Une fois la migration terminée, les protéines sont transférées sur une membrane de
nitrocellulose (Amersham Hybond-ECL, GE Healthcare) en appliquant un courant de 50 V
pendant 45 minutes dans un tampon de transfert (NuPAGE Transfer Buffer 20X, Life
Technologies). Les sites non spécifiques des protéines sont saturés au cours d’une incubation de
3 heures sous agitation dans une solution de PBS contenant 5% de lait. La membrane est alors
incubée à 4°C sur la nuit avec l’anticorps primaire (Tableau 7). Après trois lavages de 5 minutes,
la membrane est incubée sous agitation 1 heure à température ambiante avec un anticorps
secondaire couplé à la péroxydase de Raifort (HRP ; Tableau 7). Après trois autres lavages de 5
minutes, la protéine d’intérêt est révélée par chimiluminescence, en déposant sur la membrane un
substrat de la HRP (Luminata Forte Western HRP Substrate, Millipore). Le signal produit par la
réaction de chimiluminescence est recueilli sur un film radiographique (Amersham Hyperfilm
ECL, GE Healthcare).
Les films radiographiques obtenus sont numérisés et les images sont analysées à l’aide du
logiciel ImageJ qui va déterminer une intensité moyenne pour les bandes correspondant à la
protéine étudiée. Les résultats sont alors normalisés en calculant le rapport entre la moyenne
d’intensité de signal obtenue pour la protéine étudiée et celle obtenue pour une protéine de
référence. Pour chaque expérience, au moins trois échantillons protéiques sont produits et chaque
échantillon protéique subit au minimum deux Western blot.
B. ETUDE DE LA LOCALISATION PAR IMMUNOFLUORESCENCE
L’immunofluorescence est une technique permettant l’étude de la localisation d’une
protéine. En complément de techniques quantitatives, elle peut également permettre une
représentation du niveau d’expression de la protéine étudiée.
Pour réaliser cette expérience, les cellules sont ensemencées en plaque 12 puits, sur des
lamelles de verre de 12 mm de diamètre. Après traitement, le milieu de culture est retiré et deux
lavages au PBS (NaCl 0,137 M, NaH2PO4 0,05 M, pH = 7,4) sont réalisés. Les cellules sont
fixées par du formaldéhyde (Sigma-Aldrich) dilué à 3,7% dans du PBS pendant 20 minutes sous
agitation à température ambiante. Après deux lavages supplémentaires, les sites non spécifiques
Anticorps primaires
Nom anticorps Référence Type Fournisseur Espèce Dilution Tampon de dilution Tampon de lavage
IgG anti-hFOLR1 (548908) MAB5646 Monoclonal R&D systems Souris 1:50 PBS - BSA 1% - Triton X-100
0,3% - sérum de chèvre 1% PBS - BSA 1%
Anticorps secondaires
Nom anticorps Référence Type Fournisseur Espèce Dilution Tampon de dilution Tampon de lavage
Alexa Fluor® 488 goat anti-
mouse A11001 Polyclonal
Life
Technologies Chèvre 1:250
PBS - BSA 1% - Triton X-100
0,3% - sérum de chèvre 1% PBS - BSA 1%
Tableau 8. Anticorps primaire et secondaire utilisés en immunofluorescence.
3e Partie – Matériels & Méthodes
56
sont saturés pendant 45 minutes avec une solution de PBS contenant 10% de sérum de chèvre et
0,3% de Triton X-100. Les cellules sont alors incubées avec l’anticorps primaire dilué dans le
tampon adéquat (Tableau 8) pendant 2h30 à température ambiante. Après deux lavages avec une
solution de PBS contenant 1% de BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich), les cellules
sont incubées 45 minutes à température ambiante avec l’anticorps secondaire (Tableau 8). Enfin,
après deux lavages au PBS - BSA 1%, un lavage au PBS et un lavage à l’eau, la lamelle est
montée sur lame à l’aide de Mowiol. Lorsque le montage est sec, les cellules sont observées par
microscopie confocale (FV 1000, Olympus IX-81). Les lames sont stockées à -20°C. Chaque
expérience est réalisée au minimum à deux reprises, et pour chaque expérience, une condition
dans laquelle l’anticorps primaire n’est pas ajouté est réalisée pour mesurer le bruit de fond
entrainé par l’anticorps secondaire.
V. ETUDE DE LA RESISTANCE A L’ANOÏKIS
L’anoïkis est une forme particulière d’apoptose qui se déclenche lorsque des cellules
adhérentes se détachent ou établissent des interactions inappropriées avec leur matrice ou les
cellules voisines. C’est un processus dont l’inhibition est indispensable à la métastase des
cellules cancéreuses, et qui est donc un critère d’agressivité des tumeurs. In vitro, la résistance à
l’anoïkis peut être étudiée en cultivant des cellules normalement adhérentes en condition sans
ancrage ou en les plaçant dans une matrice semi-solide.
A. CROISSANCE SANS ANCRAGE ET MESURE DE L’APOPTOSE
Pour étudier la capacité des cellules à proliférer dans des conditions sans ancrage, celles-
ci sont cultivées sur du poly(2-hydroxyethyl methacrylate) ou poly-HEMA (Sigma-Aldrich), un
polymère qui inhibe l’adhérence des cellules au plastique de la boite de culture. Après
ensemencement, les cellules demeurent donc en suspension.
Les puits d’une plaque 6 puits sont recouverts de 5 mg/cm² de poly-HEMA et, après
séchage sur la nuit et sous atmosphère stérile, 1,5×105 cellules sont ensemencées dans chaque
puits. Suite à un traitement de 3 jours avec 5 nM de vecteur MGAF en présence ou en absence de
3e Partie – Matériels & Méthodes
57
0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de VPA, les cellules sont récupérées et l’apoptose est
mesurée par cytométrie en flux, selon le protocole décrit page 48.
B. CROISSANCE EN SOFT-AGAR
Les cellules cultivées en agar ou agarose mou, ou plus communément en « soft-agar »
sont ensemencées dans une matrice semi-solide. Leur capacité à résister à l’anoïkis est alors
traduite par leur propension à former des colonies au sein de cette matrice.
Pour réaliser cette technique, un premier gel à 0,6% d’agarose dans du milieu de culture
RPMI 1640 déplété en acide folique (Gibco) et contenant 10% de SVF est déposé dans des
boites de Pétri de 3,5 cm de diamètre. Une fois ce premier gel solidifié, 5×103 cellules sont
ensemencées dans un second gel à 0,35% d’agarose dans du milieu de culture RPMI 1640
déplété en acide folique et contenant 10% de SVF. Pour permettre le développement des
colonies, les cellules sont placées entre 4 (cellules KB) et 11 jours (cellules HeLa, A2780 et
A549) en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Au cours de cette
incubation, 750 µL de milieu RPMI 1640 déplété en acide folique (Gibco) et contenant 10% de
SVF sont ajoutés tous les 3 ou 4 jours aux cellules.
A la fin de cette période, les cellules sont traitées 3 ou 6 jours avec 5 nM de vecteur
MGAF en présence ou en absence de 0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de VPA, les
colonies sont photographiées au microscope (Olympus CKX41) pour l’étude de la taille des
colonies, ou au macroscope (MacroView MVX10 Olympus) pour l’étude du nombre de colonies.
La taille des colonies est mesurée à l’aide du logiciel ImageJ. Pour cela, l’aire des colonies est
déterminée en pixels² et rapportée en µm² à l’aide d’un étalon de taille connue. Le nombre de
colonies est également déterminé à l’aide de ce logiciel. Les colonies prises en compte présentent
alors une taille supérieure ou égale à une taille seuil, elle-même déterminée à partir de la taille
moyenne la plus faible obtenue après 3 ou 6 jours de traitement. Pour chaque condition, trois
champs sont photographiés aléatoirement et les valeurs obtenues pour la taille et le nombre de
colonies sont moyennées. Chaque expérience est réalisée au moins trois fois.
3e Partie – Matériels & Méthodes
58
VI. QUANTIFICATION DE LA MMAE PAR
HPLC/HRMS
La présence de MMAE au sein des cellules cancéreuses après traitement avec les
composés à tester a été vérifiée par chromatographie en phase liquide à haute performance
couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS). Pour cela, les cellules
issues de culture in vitro ou de 40 à 80 mg de xénogreffes tumorales sont broyées dans 500 µL
d’acétate de sodium à 0,3 M. Après centrifugation 7 minutes à 1500 ×g, le surnageant est
récupéré, ajouté à 1 mL d’éthanol 100% glacé et placé à -20°C pendant 1 heure. L’échantillon
est à nouveau centrifugé, cette fois à 17 000 ×g et 4°C pendant 20 minutes puis le surnageant est
récupéré et mélangé à 500 µL d’acétonitrile-méthanol (quantité volume/volume : 2/1). Après 1
heure supplémentaire à -20°C et une centrifugation de 20 minutes à 4°C et 17 000 ×g, le
surnageant est transféré dans un nouveau tube et à nouveau centrifugé 10 minutes à 17 000 ×g.
Le surnageant obtenu est ensuite analysé par HPLC/HRMS sur un système HPLC Accela couplé
à un spectomètre de masse haute résolution Q-Exactive.
VII. ETUDES IN VIVO
A. ETUDE DE L’EFFICACITE ANTITUMORALE DU VECTEUR MGAF
Toutes les expérimentations ont été réalisées avec l’accord du comité local d’éthique
COMETHEA (« Évaluation de médicaments anticancéreux intelligents », saisine
n°2015061708011100).
Des souris femelles BALB/c nude âgées de 6 à 8 semaines reçoivent par voie sous-
cutanée et en position dorso-latérale 1×106 de cellules KB exprimant le gène de la luciférase et
diluées dans 50% de PBS et 50% de Matrigel® complet (10 mg/mL ; Corning). Tout au long de
l’étude, le poids des souris et les signes de douleur ou de stress sont surveillés quotidiennement.
La croissance tumorale est mesurée deux fois par semaine par bioluminescence in vivo suite à
l’injection par voie intrapéritonéale de D-Luciférine (XenoLight D-Luciferin - K+ Salt
Bioluminescent Substrate ; PerkinElmer) et/ou par mesure au pied à coulisse.
3e Partie – Matériels & Méthodes
59
Les traitements débutent quatre jours après l’implantation des tumeurs. Les souris
reçoivent alors quotidiennement par voie intrapéritonéale une injection de 2 mg/kg de
dexaméthasone et de 300 mg/kg de VPA ou de solvants (PBS – éthanol 6,8%) et/ou par voie
intraveineuse une injection de 0,5 mg/kg de MGAF ou de solvant (PBS – 5% DMSO) les jours 6,
8, 11, 13 et 15 suivant l’implantation des tumeurs.
A la fin de l’expérimentation, ou s’ils atteignent les points limites définis dans la saisine,
les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse (Isoflurane). Les
tumeurs ainsi que différents organes sont récupérés par dissection puis sont soumis à une
congélation instantanée dans un bain d’azote liquide ou stockés dans du formol à 4% selon les
analyses à effectuer.
B. ANALYSE HISTOPATHOLOGIQUE DES ORGANES
A la fin de l’étude in vivo, le cœur, le foie et le rein des animaux sont prélevés et fixés
dans un bain de formol à 4%. Ces échantillons sont ensuite transférés à un organisme
indépendant (Novaxia) pour leur inclusion en paraffine. Des sections d’environ 4 µm d’épaisseur
sont réalisées au microtome et montées sur lame. Après coloration à l’hématoxyline et l’éosine,
l’analyse histopathologique des lames est réalisée par un pathologiste indépendant de la société
Le Net Pathology Consulting.
4E PARTIE
RESULTATS
4e Partie – Résultats
7e Chapitre – Optimisation chimique
60
7E CHAPITRE
Optimisation chimique
La première approche abordée au cours de ma thèse repose sur la synthèse d’une nouvelle
génération de vecteurs. L’objectif de ces vecteurs est d’augmenter le nombre de molécules
actives internalisées pour un nombre donné de récepteurs FR à la surface des cellules ciblées.
Pour cela, à partir des connaissances acquises sur les vecteurs monomériques, les chimistes de
l’équipe « Systèmes Moléculaires Programmés » ont synthétisé deux vecteurs différents. Le
premier permet l’internalisation et la libération de deux molécules de doxorubicine, le second de
deux molécules de MMAE. Au cours de ces études, mon rôle a consisté à établir des preuves de
concept à travers des techniques simples de biologie cellulaire. Cette collaboration a alors donné
lieu aux deux publications présentées ci-dessous.
I. SYNTHESE ET EVALUATION DU VECTEUR DIDGAF
A. INTRODUCTION ET PRINCIPE DE L’ETUDE
Le vecteur synthétisé dans cette première étude est composé de cinq unités comprenant
une molécule d’acide folique, une gâchette enzymatique activée par la β-galactosidase, un
espaceur central et deux molécules de principe actif articulées autour d’un amplificateur
chimique (Figure 25A). Comme pour les vecteurs DGAF et MGAF, l’internalisation de ce
composé devrait être réalisée par endocytose via les récepteurs FR. Au sein du lysosome, la
gâchette enzymatique du vecteur devrait alors être clivée par les β-galactosidases, déclenchant
ainsi des réarrangements chimiques intramoléculaires aboutissant à la libération successive des
deux molécules actives.
Figure 25. (A) Structure du vecteur diDGAF composé de deux molécules de doxorubicine (en
rouge), d’un élément de ciblage (acide folique, en orange) et d’une gâchette enzymatique
(galactoside, en vert). Ces quatre éléments sont reliés via un espaceur (en bleu) et un
amplificateur chimique (en gris). (B) Suivi par chromatographie en phase liquide à haute
performance couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS) de la
décomposition du vecteur diDGAF et de l’apparition de la doxorubicine en présence de β-
galactosidase (ajoutée à t = 0 minute) dans le milieu réactionnel (tampon phosphate, pH = 7).
4e Partie – Résultats
7e Chapitre – Optimisation chimique
61
Compte tenu de ses propriétés cytotoxiques et fluorescentes, la doxorubicine est apparue
comme une molécule de choix pour établir la preuve de concept de cette stratégie. Ainsi, le
vecteur utilisé dans cette étude contient deux molécules de doxorubicine et est appelé vecteur
diDGAF (diDoxorubicine-galactoside-acide folique). La synthèse et l’évaluation de ce composé
ont donné lieu à une publication dont la référence est la suivante :
An enzyme-responsive system programmed for the double release of bioactive
molecules through an intracellular chemical amplification process.
Grinda M., Legigan T., Clarhaut J., Péraudeau E., Tranoy-Opalinski I., Renoux B., Thomas M.,
Guilhot F. and Papot S.
Organic & Biomolecular Chemistry, 2013, 11, 7123-7133.
B. RESULTATS BIOLOGIQUES PRINCIPAUX
Après synthèse du composé par les chimistes, la stabilité du vecteur diDGAF a été testée
par chromatographie en phase liquide après incubation dans du milieu de culture en atmosphère
humide à 37°C et 5% de CO2. Après 24 heures, aucune décomposition n’a été observée.
L’hydrolyse enzymatique du vecteur par la β-galactosidase a ensuite été suivie par
chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/HRMS). Comme
illustré sur la figure 25B, lorsque l’enzyme est ajoutée, on observe une disparition du vecteur
diDGAF au cours du temps, simultanément à l’apparition du signal de la doxorubicine. La
stabilité du vecteur et la libération de la doxorubicine suite à l’activation de la gâchette
enzymatique étant validées, j’ai alors participé à l’évaluation biologique du vecteur diDGAF.
L’un des enjeux majeurs du développement de molécules vectorisées est d’établir une
interaction spécifique du vecteur avec les cellules ciblées. L’internalisation de la doxorubicine
libre et du vecteur diDGAF a donc été étudiée par microscopie confocale sur deux lignées
cellulaires cancéreuses : les cellules A2780 qui expriment les récepteurs à l’acide folique, et les
cellules A549 qui ne les expriment pas. Comme attendu, alors que l’agent anticancéreux libre
pénètre dans les deux types de cellules, le conjugué diDGAF n’est détecté que dans les cellules
Figure 26. Détection par microscopie confocale de la doxorubicine (longueur d’onde
d’excitation/d’émission : 488/590 nm) dans les cellules A2780 et A549 traitées pendant 1 ou 3
heures avec avec 10 µM de doxurbicine libre ou de vecteur diDGAF, respectivement. Images
représentatives de 2 expériences, barre d’échelle : 50 µm.
4e Partie – Résultats
7e Chapitre – Optimisation chimique
62
A2780 exprimant le marqueur ciblé (Figure 26). Ces résultats, mis en parallèle de ceux décrits
dans l’article Thomas et al., 2011, confirment l’importance des récepteurs FR pour
l’internalisation de ces vecteurs dérivés de l’acide folique dans les cellules tumorales.
L’efficacité antiproliférative du vecteur diDGAF a ensuite été testée sur les cellules
A2780 et A549 et comparée à celle de son homologue monomérique, le vecteur DGAF (Figure
27, voir également Thomas et al., 2011 ; page 37). Sur les cellules A2780, le vecteur diDGAF
est responsable d’une toxicité 3,7 fois supérieure à celle entrainée par son homologue
monomérique (0,30 µM contre 1,10 µM, respectivement). A l’inverse, aucun des deux vecteurs
testés ne permet d’atteindre l’IC50 sur les cellules A549.
Après vérification in vitro de la spécificité et de l’efficacité du vecteur diDGAF celui-ci a
été testé ex vivo sur des cellules de six patients atteints de LAM et dont les cellules leucémiques
expriment l’isoforme β des récepteurs FR. Ainsi, les lymphocytes et les blastes isolés de la
moelle osseuse de ces patients ont été traités par la doxorubicine libre, le vecteur DGAF ou le
vecteur diDGAF. Le nombre de cellules présentant une fluorescence détectable en cytométrie en
flux a alors été déterminé. Comme pour les cellules A2780 et A549, la doxorubicine pénètre de
manière non sélective dans les lymphocytes et les cellules malignes, ce qui se traduit par une
détection de fluorescence dans la quasi-totalité des cellules (Figure 28). En revanche, les
vecteurs DGAF et diDGAF sont internalisés presque exclusivement dans les cellules malignes,
puisque seuls 2 à 3 % des lymphocytes présentent une fluorescence, respectivment. Cette
observation confirme l’implication des FR dans l’internalisation de ces composés vectorisés.
De plus, suite à leur traitement par le vecteur diDGAF, un plus grand nombre de cellules
leucémiques présente une fluorescence détectable, comparé aux cellules traités avec le vecteur
monomérique (67 et 31 % des cellules, respectivement). Ce résultat montre que, pour un nombre
équivalent de cellules ciblées, le vecteur diDGAF permet la pénétration dans les cellules
tumorales d’une quantité plus importante de doxorubicine que le vecteur DGAF. De ce fait, les
cellules dont l’expression en FR est faible contiennent suffisamment de doxorubicine pour être
détectées par cette technique lorsqu’elles sont traitées avec le vecteur diDGAF alors que la
quantité de doxorubicine est en dessous du seuil de détection lorsque les cellules sont traitées
avec le vecteur DGAF.
L’ensemble des résultats présentés ci-dessus ont permis la validation in vitro et ex vivo
d’un composé homodimérique programmé pour libérer successivement deux molécules actives.
Figure 27. Mesure par test XTT de la viabilité des cellules A2780 et A549 traitées pendant 4
jours avec de la doxorubicine libre, le vecteur monomérique DGAF ou le vecteur dimérique
diDGAF. Moyennes ± s.e.m. de 7 à 11 expériences.
Figure 28. Evaluation par cytométrie en flux de l’internalisation de la doxorubicine. Les
lymphocytes (n’exprimant pas les FR) et les blastes (possédant une forte expression des FR)
isolés de la moelle osseuse de patients atteints de LAM ont été traités pendant 3 heures avec 10
µM de doxorubicine libre, de DGAF ou de diDGAF. Moyennes ± s.e.m. calculées sur les
cellules de 6 patients, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns (non
significatif) : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001
Figure 29. Structure du vecteur diMGAF composé de deux molécules de MMAE (en rouge),
d’un élément de ciblage, l’acide folique ajouté en position α ou γ (en orange) et d’une gâchette
enzymatique de type galactoside (en vert). Ces quatre éléments sont articulés autour d’un
espaceur central (en bleu) et d’un amplificateur (en noir) chimiques.
4e Partie – Résultats
7e Chapitre – Optimisation chimique
63
Cette démonstration de l’amplification d’un processus catalysé par une enzyme intracellulaire a
ouvert de nouvelles perspectives quant à la synthèse de molécules vectorisées innovantes.
Cependant, la doxorubicine présente plusieurs inconvénients freinant le développement
préclinique des molécules dérivées de cet agent, notamment sa faible solubilité qui limite
l’évaluation biologique in vivo des vecteurs DGAF et diDGAF. Les chimistes de l’équipe du Pr
Papot ont alors développé un second vecteur homodimère, dérivé d’un agent anticancéreux plus
efficace et plus soluble : la MMAE.
II. SYNTHESE ET EVALUATION DU VECTEUR DIMGAF
A. INTRODUCTION ET PRINCIPE DE L’ETUDE
Du fait de leur structure et de la stratégie de leur synthèse, les vecteurs anticancéreux
permettent le transport de différents composés. Ainsi, les molécules de doxorubicine dans le
vecteur diDGAF présenté ci-dessus sont interchangeables avec des sondes ou d’autres agents
thérapeutiques. Sur la même base stratégique, notre groupe a alors synthétisé un vecteur
permettant la libération de deux molécules de MMAE suite à un unique évènement
d’internalisation et d’activation enzymatique (Figure 29). Après vérification des mécanismes de
libération des molécules de MMAE contenues dans le vecteur, j’ai réalisé la validation
biologique in vitro de ce composé appelé vecteur diMGAF (diMMAE-Galactoside-Acide
Folique) et comparé son efficacité à celle du vecteur monomérique MGAF. Les résultats obtenus
ont été publiés dans l’article dont voici la référence :
A dendritic β-galactosidase-responsive folate–monomethylauristatin E
conjugate.
Alsarraf J., Péraudeau E., Poinot P., Tranoy-Opalinski I., Clarhaut J., Renoux B., and Papot S.
Chemical Communications, 2015, 51, 15792-15795.
IC50 (nM)
Cellules Expression FR
(% GAPDH) MMAE diMGAF MGAF
Ratio
MGAF/diMGAF
HeLa 23,69 1,12 ± 0,41 16,30 ± 3,76 29,36 ± 5,77 1,80
SKOV-3 3,37 0,64 ± 0,08 9,62 ± 1,12 20,16 ± 1,45 2,10
A2780 0,29 6,67 ± 3,54 64,51 ± 14,13 248,23 ± 87,09 3,85
Tableau 9. Valeurs d’IC50 déterminées par mesure de la viabilité (XTT) sur les cellules HeLa,
SKOV-3 et A2780 traitées pendant 4 jours avec la MMAE libre, le vecteur MGAF ou le vecteur
diMGAF. IC50 moyennes ± s.e.m. calculées à partir de 6 expériences.
Aire relative
diMGAF MGAF
Ratio
diMGAF/MGAF
Test 1 56 813 491 13 353 647 4,25
Test 2 58 596 545 14 515 931 4,04
Tableau 10. Quantification par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à
la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS) de la MMAE libérée dans les
cellules A2780 après 24 heures de traitement avec 100 nM de diMGAF ou de MGAF. Moyennes
de 3 expériences.
4e Partie – Résultats
7e Chapitre – Optimisation chimique
64
B. RESULTATS BIOLOGIQUES PRINCIPAUX
Les cytotoxicités induites par les vecteurs MGAF et diMGAF ont été évaluées sur trois
lignées tumorales exprimant des niveaux différents de récepteurs à l’acide folique : les cellules
HeLa qui les expriment fortement, les cellules A2780 qui les expriment plus faiblement et les
cellules SKOV-3 qui expriment ce récepteur à un niveau intermédiaire (Tableau 9). Après quatre
jours de traitement, le vecteur diMGAF entraine une toxicité environ deux fois plus importante
que le vecteur MGAF sur les cellules HeLa et SKOV-3. Ce résultat est compatible avec
l’hypothèse de la libération de deux fois plus de MMAE (IC50 respectives de 16,30 ± 3,76 et
29,36 ± 5,77 nM pour les cellules HeLa et de 9,62 ±1,12 et 20,16 ± 1,45 nM pour les cellules
SKOV-3 ; Tableau 9). En revanche, la toxicité entrainée par le vecteur diMGAF sur les cellules
A2780 est quatre fois supérieure à celle obtenue avec le monomère MGAF (IC50 respectives de
64,4 et 248,9 nM). Pour vérifier ce résultat, nous avons comparé par chromatographie en phase
liquide couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/HRMS) les concentrations de MMAE libérée
au sein des cellules A2780 traitées par les vecteurs MGAF ou diMGAF. A concentrations égales,
les cellules traitées avec le vecteur diMGAF contiennent approximativement quatre fois plus de
MMAE que celles traitées par le monomère (Tableau 10). Le résultat obtenu sur les cellules
A2780 peut être expliqué par l’étude publiée récemment par Antunes et al. qui a démontré que la
des enzymes lysosomales pouvaient être libérées dans le milieu extracellulaire par les cellules
cancéreuses en nécrose (Antunes et al., 2012). Les résultats que nous avons obtenus à la fois en
test de viabilité et en HPLC/HRMS pourraient alors être la conséquence d’une activation en
extracellulaire du vecteur suite à la libération de la β-galactosidase par les cellules mortes. Ce
phénomène serait moins important lorsque les cellules sont traitées avec le monomère.
En conclusion, à travers ces deux articles résultant de la collaboration de chimistes et de
biologistes, nous avons développé deux conjugués dérivés de l’acide folique permettant le
transport et la libération de deux molécules anticancéreuses suite à un seul évènement
d’internalisation. Ces travaux pourraient être une étape importante dans le développement d’une
nouvelle génération de vecteurs.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
65
8E CHAPITRE
Optimisation biologique
En parallèle de l’approche chimique reposant sur la synthèse de vecteur permettant la
libération de deux fois plus d’agents anticancéreux, une seconde approche plus biologique a été
entreprise et a constitué le sujet principal de ma thèse. Elle consiste à augmenter la quantité de
récepteurs FR à la surface des cellules tumorales afin de permettre l’internalisation d’une plus
grande quantité de vecteurs monomériques (Figure 23B, page 42). Pour ce faire, j’ai mis au point
un traitement qui agit comme complément du traitement anticancéreux vectorisé et qui, de ce
fait, entre dans la définition des traitements adjuvants proposée par l’INCa.
I. COMMENT MODIFIER L’EXPRESSION DU GENE FOLR1 ?
Le gène FOLR1, localisé sur le chromosome 11, est un gène de 5 à 7 kb constitué de 7
exons et de 6 introns. Malgré le potentiel thérapeutique des thérapies vectorisées dérivées de
l’acide folique, très peu d’études s’intéressent à la stimulation de l’expression des récepteurs FR
dans le but de potentialiser l’efficacité de ces vecteurs. En 2005, Tran et al. montrent in vitro
dans des cellules tumorales HeLa que le promoteur du gène FOLR1 peut être indirectement
activé par un agoniste des récepteurs aux glucocorticoïdes, la dexaméthasone. Cette activation de
FOLR1 se traduit in vitro et in vivo par une augmentation du taux de FRα dans ces mêmes
cellules. Dans cette même étude, ils montrent qu’in vitro, la stimulation de l’expression du gène
FOLR1 par la dexaméthasone est potentialisée par la trichostatine A ou l’acide valproïque, deux
inhibiteurs de déacétylases d’histones (HDAC), des enzymes impliquées dans la modification de
la chromatine. Récemment, un autre groupe a pu montrer in vitro que la stimulation du gène
FOLR1 par de la dexaméthasone permettait l’augmentation de l’internalisation d’une micelle
conjuguée à de l’acide folique et encapsulant un agent fluorescent (la coumarine) ou un agent
anticancéreux (le mitoxantrone, Chen et al., 2013).
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
66
La dexaméthasone est un corticoïde synthétique principalement utilisé comme anti-
inflammatoire et immunosuppresseur. Elle possède également des propriétés pro-apoptotiques, et
est utilisée en chimiothérapie pour lutter contre différents types de lymphomes (Schmidt et al.,
2004). L’acide valproïque (VPA) est utilisé depuis de nombreuses années comme agent anti-
convulsant et anti-épileptique. Plus récemment, cette molécule a également montré des
propriétés anticancéreuses, notamment en inhibant des HDAC de type I et II (Kuendgen and
Gattermann, 2007).
A partir des données bibliographiques concernant la régulation de l’activité du promoteur
du gène FOLR1, j’ai déterminé les paramètres d’un traitement composé de dexaméthasone et de
VPA. Pour plus de simplicité, ce traitement sera par la suite appelé traitement DV. Le premier
objectif de ce traitement est d’agir comme un activateur transcriptionnel du gène FOLR1 afin
d’augmenter la concentration de récepteurs FR exprimés à la surface des cellules tumorales. En
augmentant le nombre de FR disponibles, il serait alors possible d’entrainer l’internalisation et la
décomposition d’une plus grande quantité de molécules vectorisées. De plus, compte tenu des
propriétés anticancéreuses décrites pour la dexaméthasone et le VPA, le mélange DV pourrait
alors soutenir et compléter l’activité cytotoxique de l’agent anticancéreux libéré par le vecteur.
Dans ces deux cas, le mélange DV agirait comme un adjuvant du vecteur anticancéreux.
Pour tester ces hypothèses, le travail que j’ai mené s’est décomposé en trois parties
principales. La première étape a consisté à tester in vitro les capacités du mélange DV à stimuler
l’expression des FR dans différentes lignées cellulaires. Par la suite, l’efficacité d’un vecteur
anticancéreux dérivé de l’acide folique a été évaluée in vivo chez la souris en présence ou en
absence du mélange DV. Enfin, dans une dernière partie encore en cours d’investigation à
l’heure de la rédaction de cette thèse, j’ai tenté d’identifier l’implication des processus
d’apoptose et de prolifération dans la coopération du vecteur anticancéreux et de l’activité
adjuvante du mélange DV.
Figure 30. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les cellules
KB et A549. Moyennes ± s.e.m. de 8 à 9 expériences. (B) Expression des protéines FRα (100 µg
de protéines totales) et tubuline-α (15 µg de protéines totales) analysées par Western blot dans
les cellules KB et A549. Images représentatives de 3 expériences. (C) Immunocytochimie du
récepteur FRα dans les cellules KB et A549. Photos représentatives de 3 expériences, barre
d’échelle : 50 µm.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
67
II. EVALUATION IN VITRO DU MELANGE DV
A. CARACTERISATION DES LIGNEES KB ET A549
Afin de tester l’effet du mélange DV sur l’expression des FR, différentes lignées
tumorales humaines ont été utilisées : les cellules KB, issues d’un carcinome oral et les cellules
A549, provenant d’un carcinome pulmonaire. Les niveaux d’expression basale des gènes FOLR1
et FOLR2 de ces lignées ont été mesurés par RT-qPCR (Figure 30A). Ainsi, les cellules KB
présentent une forte expression du gène FOLR1 (79,91 ± 12,73 % de GAPDH) alors que les
cellules A549, avec une expression de FOLR1 de seulement 0,0021 ± 0,0004 % de GAPDH sont
classiquement utilisées comme témoins négatifs pour l’étude des récepteurs à l’acide folique
(Parker et al., 2005 ; Reddy et al., 2007 ; (Legigan et al., 2012a). Par ailleurs, le gène FOLR2,
qui n’est pas détecté dans les cellules A549, est très faiblement exprimé dans les cellules KB
(0,0017 ± 0,0002 % de GAPDH), si bien que comparée au gène FOLR1, son expression peut être
considérée comme négligeable.
Les profils d’expression obtenus au niveau ARNm pour les cellules KB et A549 se
confirment au niveau protéique (Figure 30B). En effet, l’analyse par Western blot révèle une
bande d’environ 40 kDa correspondant à la protéine FRα dans les cellules KB alors qu’aucun
signal n’est obtenu pour l’extrait protéique A549. Par immunocytochimie, les protéines FRα sont
identifiées à la membrane des cellules KB, une localisation compatible avec leur fonction de
récepteurs membranaires (Figure 30C). En revanche, avec les mêmes paramètres d’analyse,
aucune protéine n’est révélée par cette technique dans les cellules A549, confirmant ainsi les
résultats obtenus en Western blot et le statut de contrôle négatif de cette lignée. Par ailleurs, à
cause du manque d’anticorps commercial efficace dirigé contre le récepteur FRβ, l’expression de
cette protéine n’a pas pu être étudiée par les techniques citées ci-dessus. Néanmoins, compte
tenu de l’expression du gène au niveau ARNm et des données bibliographiques disponibles, il est
raisonnable d’estimer que l’expression de la protéine FRβ dans ces lignées est négligeable
comparée à celle de FRα, d’autant plus que les affinités des deux récepteurs pour l’acide folique
sont équivalentes. Ces profils d’expression établis, j’ai par la suite testé l’effet du mélange DV
sur ces deux lignées cellulaires.
Figure 31. Viabilité mesurée par test XXT des cellules KB et A549 traitées pendant 3 jours avec
0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA (test XTT). Moyennes ± s.e.m. de 5 à 6
expériences. Test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value >
0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
68
B. EFFET DU MELANGE DV SUR LES CELLULES KB ET A549
1. Toxicité du mélange adjuvant
Afin de s’affranchir des effets anticancéreux décrits pour les molécules composant le
mélange DV, j’ai traité les cellules avec des gammes de concentrations allant de 25 à 500 nM
pour la dexaméthasone et de 0,1 à 2 mM pour le VPA. L’induction du promoteur de FOLR1 par
la dexaméthasone étant visible à partir de 48 heures (Tran et al., 2005), nous avons opté pour un
traitement de 72 heures afin de nous assurer les meilleurs résultats possibles. Cette étape m’a
permis de choisir des doses non toxiques vis-à-vis des cellules pour chacune de ces deux
molécules. J’ai ensuite utilisé ces doses non toxiques de dexaméthasone et de VPA en
combinaison pour finalement choisir de travailler avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de
VPA. A ces concentrations, après trois jours de traitement, la dexaméthasone et le VPA qu’ils
soient utilisés seuls ou en combinaison n’entrainent pas de variation significative de la viabilité
des cellules KB et A549 (Figure 31). Ces concentrations permettent de se concentrer, in vitro,
sur les fonctions de régulation de la transcription du gène FOLR1.
2. Effet sur l’expression des récepteurs FR
a) Au niveau transcriptomique.
L’effet du mélange DV sur la régulation du gène FOLR1 a été étudié par RT-qPCR
(Figure 32A). Pour cela, les cellules KB et A549 ont été traitées pendant trois jours avec les
concentrations déterminées dans le paragraphe précédent, soit 0,1 µM de dexaméthasone et 200
µM de VPA. Alors que le traitement des cellules KB par l’une ou l’autre des molécules ne
permet pas d’augmentation significative de l’expression de FOLR1, le mélange DV stimule
l’expression du gène d’un facteur 2,2 (179,31 ± 29,05 % de GAPDH, contre 79,91 ± 12,73 % de
GAPDH en condition basale). Dans les cellules A549, ni la dexaméthasone, ni le VPA ou la
combinaison des deux molécules ne modifie l’expression du gène FOLR1.
Puisque FRβ est surexprimé dans certains cancers et est capable de lier et d’entrainer
l’internalisation de vecteurs dérivés de l’acide folique, l’expression du gène FOLR2 a également
été mesurée dans ces deux lignées cellulaires (Figure 32B). Ainsi, le traitement des cellules KB
Figure 32. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans des cellules
KB et A549 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA.
Moyennes ± s.e.m. de 5 à 9 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test
Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01. (B) Images représentatives de l’analyse par
Western blot des protéines FRα (100 µg protéines totales) et tubuline-α (15 µg protéines totales)
extraites de cellules KB traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de
VPA. Moyennes ± s.e.m de l’intensité des bandes de 10 expériences (4 échantillons protéiques
analysés entre 2 et 3 fois), quantifiées par le logiciel ImageJ. Test statistique : One-way ANOVA
suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 (C) Immunocytochimie
de la protéine FRα réalisée sur des cellules KB traitées pendant 3 jours avec le mélange DV.
Images représentatives de 3 expériences, barre d’échelle : 50 µm.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
69
par la dexaméthasone et/ou le VPA n’entraine pas de variation de l’expression de FOLR2. Dans
les cellules A549, le traitement par le mélange DV ne permet toujours pas la détection de
l’ARNm de ce gène.
b) Au niveau protéique.
L’analyse par Western blot des extraits de cellules KB montre que les traitements
individuels par la dexaméthasone ou le VPA n’entrainent pas de différence du taux de protéine
FRα (Figure 32C). En revanche, lorsque les cellules sont traitées simultanément avec les deux
molécules, il est possible de détecter environ 7 fois plus de protéine FRα, comparé aux cellules
non traitées. De plus, les protéines surexprimées en réponse au mélange DV présentent une
localisation fonctionnelle et ne sont pas retenues dans un compartiment intracellulaire (Figure
32D). Enfin, en accord avec les résultats obtenus par RT-qPCR, le traitement des cellules A549
avec le mélange DV ne permet pas la détection par immunocytochimie de la protéine FRα dans
ces cellules.
C. EFFET DU MELANGE DV SUR D’AUTRES LIGNEES TUMORALES
1. Caractérisation des lignées cellulaires
Les expériences précédentes montrent que le mélange DV stimule la transcription du
gène FOLR1 dans les cellules KB qui expriment déjà ce gène de manière basale, mais pas dans
les cellules A549 qui ne l’expriment pas. Afin de voir si la stimulation de ce gène par le mélange
DV pouvait être appliquée à d’autres cellules tumorales exprimant les FR, deux autres lignées
cellulaires ont été utilisées : les cellules HeLa, issues d’un cancer du col de l’utérus et qui
expriment FOLR1 à 5,06 ± 0,32 % de GAPDH et les cellules A2780, dérivées d’un carcinome
ovarien et exprimant ce même gène à 0,16 ± 0,02 % de GAPDH (Figure 33A). De plus, comme
pour les cellules KB, FRα est le récepteur à l’acide folique principal dans ces cellules puisque les
HeLa expriment le gène FOLR2 à 0,0005 ± 0,0001 % de GAPDH et les cellules A2780 à 0,0035
± 0,0006 % de GAPDH.
Figure 33. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans des cellules
KB, HeLa, A2780 et A549. Moyennes ± s.e.m. de 4 à 9 expériences. (B) Viabilité mesurée par
XTT dans les cellules HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone
et/ou 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences. Test statistique : One-way
ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
70
2. Toxicité et stimulation de FOLR1 induite par le mélange DV
Avant de tester l’effet du mélange DV sur l’expression du gène FOLR1 dans les cellules
HeLa et A2780, la toxicité induite par ce traitement sur ces cellules a été mesurée par XTT
(Figure 33B). A l’instar des cellules KB et A549, la dexaméthasone et le VPA, utilisés seuls ou
en combinaison, n’entrainent pas de variation significative de la viabilité des cellules HeLa et
A2780 après trois jours de traitement.
Dans les cellules HeLa, la dexaméthasone seule stimule l’expression de FOLR1 d’un
facteur 1,65, l’expression du récepteur étant alors de 8,33 ± 0,67 % de GAPDH contre 5,06 ±
0,32 % de GAPDH en condition basale (Figure 34A). Cependant, le traitement avec le mélange
DV permet une augmentation de l’expression plus importante puisque celle-ci est alors
multipliée par un facteur de 2,90 (14,67 ± 0,51 % de GAPDH). Le VPA seul, quant à lui, n’a pas
d’effet sur l’expression de FOLR1. Dans les cellules A2780, seule l’utilisation simultanée de la
dexaméthasone et du VPA permet d’augmenter le niveau de FOLR1 qui se trouve alors environ
cinq fois plus important qu’au niveau basal (0,79 ± 0,10 % et 0,16 ± 0,02 % de GAPDH,
respectivement).
Par ailleurs, tandis que l’expression du gène FOLR2 n’est pas modifiée dans les cellules
HeLa, celle-ci est stimulée d’un facteur 5,81 dans les cellules A2780 traitées avec le mélange
DV (Figure 34B). Dans ce cas, les cellules expriment ce gène à 0,02 ± 0,003 % de GAPDH, soit
40 fois moins que le gène FOLR1. De ce fait, la suite des tests in vitro se poursuivra seulement
sur le récepteur FOLR1.
Ainsi, les résultats présentés ci-dessus indiquent que le traitement composé de
dexaméthasone et de VPA agit comme un activateur transcriptionnel du gène FOLR1 dans les
cellules tumorales exprimant déjà ce gène de manière basale (cellules KB, HeLa et A2780). En
revanche, dans les cellules tumorales n’exprimant pas les FR, ou l’exprimant à des niveaux
négligeables telles que les cellules A549, le mélange DV n’est pas capable d’amplifier
l’expression de ce gène.
Figure 34. Expressions des gènes FOLR1 (A) et FOLR2 (B) mesurées par RT-qPCR dans des
cellules HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de
VPA. Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences. Test statistique : One-way ANOVA suivi d’un
post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
71
D. SPECIFICITE DE LA STIMULATION DE FOLR1
Par la suite, j’ai cherché à savoir si l’augmentation de l’expression de FRα entrainée par
le mélange DV dans les cellules KB, HeLa et A2780 reflétait un phénomène global dans ces
cellules. Pour répondre à cette question, l’expression des gènes des deux autres transporteurs de
folates connus, le RFC et le PCFT, a également été étudiée par RT-qPCR (Figures 35A et 35B,
respectivement). Ainsi, le traitement DV n’a pas d’effet sur l’expression de ces transporteurs,
quelle que soit la lignée tumorale étudiée. La stimulation de la transcription du gène FOLR1 en
réponse au mélange DV ne reflète donc pas un phénomène global, mais résulte d’une activité
préférentielle sur le promoteur de ce gène. La question suivante a alors été de savoir si cette
activité était un processus transitoire ou irréversible.
E. REVERSIBILITE DE L’EFFET DU TRAITEMENT ADJUVANT
Afin de tester la réversibilité de la stimulation de la transcription du gène FOLR1 par le
mélange DV, les cellules KB, HeLa, A2780 et A549 ont été traitées avec le mélange DV selon
différents protocoles (Figure 36A). Dans les deux premières conditions, les cellules ont été
traitées en continu avec le mélange DV pendant trois ou cinq jours avant que l’expression de
FOLR1 ne soit mesurée par RT-qPCR. Dans la dernière condition, les cellules ont été traitées
pendant trois jours avec le mélange DV puis le milieu de culture a été remplacé par du milieu ne
contenant pas les activateurs transcriptionnels. L’expression du gène FOLR1 a alors été mesurée
deux jours plus tard.
Dans les cellules KB, HeLa et A2780, la stimulation de FOLR1 observée après trois jours
de traitement est conservée lorsque ce traitement est maintenu cinq jours (Figure 36B). A
l’inverse, deux jours après l’arrêt du traitement des cellules, l’expression de FOLR1 diminue de
moitié pour les cellules HeLa ou retourne à son niveau basal pour les cellules KB et A2780.
Dans les cellules A549, malgré une tendance à l’augmentation de l’expression de FOLR1, les
différences observées ne sont pas statistiquement significatives.
Figure 35. Expression des gènes RFC (A) et PCFT (B) mesurée par RT-qPCR dans des cellules
KB, HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA.
Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test
Bonferroni ; ns : p-value > 0,05.
Figure 36. (A) Schéma représentatif des protocoles de traitement des cellules. (B) Mesure par
RT-qPCR de l’expression du gène FOLR1 dans les cellules KB, HeLa, A2780 et A549 traitées
avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA selon les protocoles décrits ci-dessus.
Moyennes ± s.e.m de 3 à 5 expériences, test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test
Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.
Figure 37. (A) Mesure par test XTT de la viabilité des cellules HUVEC traitées pendant 3 jours
avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 7 expériences, test
statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; * : p-value
≤ 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01. (B) Mesure par incorporation de BrdU de la prolifération des
cellules HUVEC traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA.
Moyennes ± s.e.m. de 5 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test
Bonferroni ; ns : p-value > 0,05. (C) Morphogenèse sur Matrigel® des cellules HUVEC traitées
pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA. Images représentatives
de 2 expériences, barre d’échelle : 1 mm. (D) Quantification par le logiciel AngioQuant de la
longueur totale des tubules formés par les cellules HUVEC. Moyennes ± s.e.m. de 2 expériences.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
72
F. EFFET DU TRAITEMENT ADJUVANT SUR LES CELLULES SAINES
Après avoir montré que le mélange DV stimule de manière réversible l’expression du
gène FOLR1 dans les cellules tumorales, je me suis intéressée à l’effet de ce traitement sur des
cellules saines. Plus particulièrement, et compte tenu de l’importance de l’angiogenèse dans la
progression tumorale, j’ai vérifié que le mélange DV n’avait pas d’effet sur le comportement des
cellules.
La viabilité de cellules endothéliales HUVEC a donc été étudiée après traitement avec les
composants du mélange DV (Figure 37A). Alors qu’après trois jours de traitement, la
dexaméthasone utilisée seule n’entraine pas de variation de la viabilité des cellules, le VPA, qu’il
soit administré seul ou en combinaison avec la dexaméthasone, est responsable d’une faible
diminution de la viabilité (diminutions de 11,4 et 13,7% respectivement). Cet effet ne se retrouve
pas lorsque l’on étudie la prolifération de ces cellules (Figure 37B). Par ailleurs, dans les cellules
HUVEC, aucune expression des gènes FOLR1 et FOLR2 n’est détectable en RT-qPCR. Ce profil
d’expression reste inchangé en présence du traitement DV. Les cellules endothéliales étant
impliquées dans l’angiogenèse tumorale, j’ai également vérifié que le traitement adjuvant ne
stimulait pas la formation de tubules par la technique de morphogenèse sur Matrigel® (Figures
37C et 37D).
En conclusion, le traitement composé de 0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de
VPA stimule l’expression du gène FOLR1 dans les cellules tumorales exprimant de manière
basale les récepteurs à l’acide folique. En revanche, ce traitement n’en déclenche pas
l’expression dans les cellules saines endothéliales et n’a pas d’incidence majeure sur leur
fonctionnalité. Ces données in vitro établies, le mélange DV a par la suite été testé in vivo chez la
souris.
Figure 38. (A) Mesure par RT-qPCR de l’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 dans les
extraits totaux issus de tumeurs KB. Les souris ont été traitées quotidiennement pendant 15 jours
par voie intrapéritonéale avec 2 mg/kg de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Moyennes ±
s.e.m. de 6 tumeurs, test statistique : t-test de Student, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01.
(B) Analyse par Western blot des protéines FRα et tubuline-α dans les cellules tumorale KB
issues de culture in vitro (puits 1) ou provenant d’extraits totaux de xénogreffes KB (puits 2).
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
73
III. MODULATION IN VIVO DE L’ACTIVITE D’UN
VECTEUR ANTICANCEREUX
A. LE MELANGE DV AUGMENTE-T-IL IN VIVO L’EXPRESSION TUMORALE
DES FR ?
Au cours des expériences précédentes, nous avons pu observer que le mélange DV
stimulait la transcription de FOLR1 dans les cellules tumorales exprimant ce gène de manière
basale. La question qui se pose à présent est de savoir si cette stimulation est transposable à un
modèle in vivo. Pour cela, des xénogreffes de cellules KB ont été implantées par voie sous-
cutanée à des souris femelles BALB/c nude. Quatre jours après implantation des tumeurs, les
animaux ont été traités quotidiennement par voie intrapéritonéale avec 2 mg/kg de
dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA ou avec un mélange de solvants contrôles. Ces doses ont
été choisies sur la base de données bibliographiques indiquant la toxicité de ces molécules et leur
potentiel anticancéreux (Leiva et al., 2012 ; Krishnan et al., 2013 ; Tsai et al., 2013 ; Kervoëlen
et al., 2015). Après quinze jours de traitement, les animaux ont été euthanasiés. Les niveaux
d’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 ont alors été mesurés dans les extraits issus des
tumeurs KB ainsi que de différents organes sains.
1. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les tumeurs
Les niveaux d’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 ont été mesurés par RT-qPCR
dans les extraits tumoraux. Comme illustrée sur la figure 38A, l’administration du traitement DV
aux souris aboutit à une augmentation de 44% de l’expression de FOLR1 comparée aux souris
traitées avec le mélange de solvants (10,25 ± 0,83 et 7,11 ± 0,35 % de GAPDH, respectivement).
Concernant le gène FOLR2, les résultats sont semblables à ceux obtenus in vitro puisqu’aucune
variation de l’expression de ce gène n’est observée lorsque le mélange DV est administré aux
animaux. Les niveaux d’expression atteints restent par ailleurs négligeables (0,00045 ±
0,00009% de GAPDH) comparés à ceux de l’homologue FOLR1.
Par ailleurs, j’ai également tenté d’étudier l’expression du récepteur FRα au niveau
protéique dans les tumeurs (Figure 38B). Malheureusement, lorsque les cellules proviennent des
Figure 39. Mesure par RT-qPCR de l’expression des gènes mFOLR1 et mFOLR2 dans les
extraits totaux issus de l’ovaire, de l’utérus, du rein et du cœur. Les organes ont été prélevés à
des souris traitées quotidiennement pendant 15 jours avec 2 mg/kg de dexaméthasone et 300
mg/kg de VPA ou avec le mélange de solvants contrôles. Moyennes ± s.e.m. des organes de 6
animaux, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
74
xénogreffes prélevées aux souris, nous observons l’apparition d’une double bande surnuméraire
(puits 2) qui n’est pas observée lorsque les cellules sont issues d’une culture in vitro (puits 1). A
ma connaissance, seule une modification post-traductionnelle de type glycosylation a été
raportée pour le récepteur FRα, compatible avec la présence de plusieurs sites de N-
glycosylation au sein de la molécule (Salazar and Ratnam, 2007). Sans identification, cette
double bande rend difficile l’interprétation des résultats fournis en Western blot. C’est pourquoi,
en attente de tests complémentaires, l’étude de l’expression des récepteurs FR sera limitée à
l’analyse transcriptomique pour la suite de ce travail.
2. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les cellules saines
Les résultats précédents indiquent que le mélange DV stimule la transcription du gène
FOLR1 dans les tumeurs in vivo chez la souris. Il s’agit à présent de vérifier que cet effet n’est
pas retrouvé dans les cellules saines. Dans le cas contraire, le traitement DV pourrait sensibiliser
les cellules saines à l’action d’un vecteur dérivé de l’acide folique et provoquer une toxicité vis-
à-vis de certains organes.
Pour tester cela, l’expression des gènes murins mFOLR1 et mFOLR2 a été mesurée par
RT-qPCR dans des extraits de cellules saines provenant de l’ovaire, de l’utérus, des reins et du
cœur. Comme illustré sur la figure 39, le mélange DV n’entraine pas de variations significatives
de l’expression de ces gènes, comparée aux cellules provenant des animaux traités uniquement
avec le mélange de solvants. Ces résultats établis, l’étude in vivo de l’efficacité d’un vecteur
dérivé de l’acide folique administré seul ou avec le mélange DV a été entreprise.
Figure 40. (A) Suivi de la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Des xénogreffes de
cellules KB ont été implantées par voie sous-cutanée à des souris femelles BALB/c nude (jour
0). A partir du 4e jour, les animaux ont reçu quotidiennement par voie intrapéritonéale 2 mg/kg
de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Les jours 6, 8, 11, 13 et 15, les souris ont également
reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de vecteur MGAF. Moyennes ± s.e.m. de 5 à 8 animaux,
test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-
value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (B) Après euthanasie, les tumeurs des animaux de chaque
groupe ont été pesées. Moyennes ± s.e.m. de 5 à 8 tumeurs, test statistique : One-way ANOVA
suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; *** : p-value ≤ 0,001. (C) Mesure par
HPLC/HRMS de la MMAE présente dans les tumeurs des animaux traités avec le vecteur seul
ou en combinaison avec le mélange DV. Moyennes ± s.e.m. pour 6 à 8 tumeurs, test statistique :
t-test de Student, * : p-value ≤ 0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
75
B. MODULATION DE L’ACTIVITE ANTITUMORALE D’UN VECTEUR
1. Effet sur la croissance tumorale
Précédemment, notre groupe a mis au point un vecteur appelé MGAF dérivé de la
monométhyl Auristatine E et ciblant les récepteurs FR (Legigan et al., 2012a). Ce vecteur qui est
décrit page 38, a été validé in vitro et in vivo sur des cellules KB. Pour rappel, suite à la liaison
du vecteur au récepteur FR, celui-ci est internalisé par endocytose. Au sein du lysosome, les β-
galactosidases clivent la gâchette enzymatique du vecteur, la MMAE est alors libérée et peut
exercer son activité cytotoxique. Ainsi, en augmentant le nombre de récepteurs à la surface des
cellules tumorales grâce au mélange DV, une plus grande quantité de vecteur devrait pénétrer à
l’intérieur des cellules, et de fait, son efficacité devrait augmenter.
Afin de tester cette hypothèse, des cellules KB ont été implantées comme précédemment
à des souris femelles BALB/c nude. Quatre jours après implantation des tumeurs, 2 mg/kg de
dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA ont été administrés quotidiennement aux animaux. Les
souris ont également reçu une injection de vecteur MGAF ou de solvant aux jours 6, 8, 11, 13 et
15. Au cours de l’étude permettant sa validation biologique, il a été montré que le vecteur
MGAF, utilisé à la concentration de 5 mg/kg, entrainait une réduction durable et presque totale
de la masse tumorale (Legigan et al., 2012a). Dans la présente étude, une concentration non
efficace de ce vecteur a volontairement été choisie, soit 0,5 mg/kg de MGAF. Avec cette dose, il
sera alors possible de visualiser, le cas échéant, le gain d’activité du vecteur dû au mélange DV.
Ainsi, comme attendu, le vecteur MGAF administré seul à 0,5 mg/kg n’a pas d’effet sur
le développement des tumeurs, comparé aux souris du groupe contrôle (solvant, Figure 40A). En
revanche, la dexaméthasone et le VPA utilisés sans le vecteur sont à eux seuls responsables
d’une inhibition significative de la croissance tumorale à partir du 11e jour de l’étude. A la fin de
l’expérience, le traitement des souris par le mélange DV aboutit à une inhibition de la croissance
tumorale de 53,9 % (813,4 ± 96,1 mm3 contre 1765,4 ± 204,3 mm3 pour les animaux du groupe
contrôle). Ces résultats sont en accord avec les données bibliographiques décrivant les propriétés
anticancéreuses de la dexaméthasone et du VPA (Tsai et al., 2013 ; Sau and Banerjee, 2014 ;
Geng et al., 2014).
Enfin, dans le dernier groupe, les souris ont été traitées avec le vecteur MGAF (0,5
mg/kg) en plus du mélange DV (Figure 40A). Dans ce cas, la croissance des tumeurs est
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
76
significativement inhibée dès le 11e jour de l’expérience comparée aux souris du groupe
contrôle. A la fin de l’étude, le cotraitement des animaux par le mélange DV et le vecteur MGAF
aboutit à une inhibition de 81,3 % de la croissance tumorale (329,5 ± 85,5 mm3 contre 1765,4 ±
204,3 mm3 pour les souris traitées avec les solvants) soit environ 30 % de plus que lorsque les
animaux sont traités uniquement avec le mélange DV.
A la fin de l’expérimentation, les tumeurs ont été prélevées et pesées (Figure 40B). Les
tumeurs prélevées aux animaux traitées avec les solvants ou le vecteur MGAF seul pèsent en
moyenne 1,21 ± 0,08 et 1,19 ± 0,11 g, respectivement. Les tumeurs des souris traitées par le
mélange DV présentent quant à elles un poids moyen de 0,48 ± 0,06 g, tandis que celles du
groupe de souris traitées avec le mélange adjuvant et le vecteur anticancéreux pèsent en
moyenne 0,29 ± 0,05 g. Il y a donc une différence d’environ 40 % de la masse des tumeurs de
ces deux groupes expérimentaux, en accord avec les résultats obtenus par la mesure du volume
tumoral.
Ces données suggèrent que le mélange DV, en plus d’exercer une activité antitumorale
qui lui est propre, semble agir comme un adjuvant du vecteur MGAF en permettant
l’internalisation d’une plus grande quantité de vecteur suite à la stimulation de l’expression des
récepteurs FR. Pour vérifier cela, la quantité de vecteur internalisé et métabolisé par les cellules
malignes lorsque celui-ci est administré aux souris seul ou en co-traitement avec le mélange DV
a été mesurée.
2. Mesure de la quantité d’agent anticancéreux libéré
L’effet du traitement DV sur la quantité de MMAE libérée suite à la décomposition du
vecteur MGAF dans les cellules tumorales a été étudié en mesurant la quantité de MMAE
présente dans les tumeurs (Figure 40C). En chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse (HPLC/HRMS), l’aire correspondant à la MMAE présente dans les
tumeurs des animaux traités uniquement avec le vecteur représente 480 300 ± 77 670 unités
arbitraires. Dans les tumeurs des souris traitées à la fois avec le mélange DV et le vecteur
MGAF, l’aire de la MMAE représente 744 100 ± 78 640 unités arbitraires. Ainsi, le traitement
DV augmente de 55 % la quantité de MMAE présente dans les cellules malignes. L’ensemble de
ces résultats suggère que l’inhibition de la croissance tumorale observée lorsque les animaux
Figure 41. (A) Suivi du poids des souris traitées quotidiennement à partir 4e jour avec 2 mg/kg
de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Les jours 6, 8, 11, 13 et 15, les souris ont également
reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de vecteur MGAF ou de solvant. Moyennes ± s.e.m. de 5 à
8 animaux. Test statistique réalisé sur chaque groupe expérimental, comparaison au poids
mesuré au jour 4 : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni. (B) Coloration à l’éosine-
hémalun réalisée sur des coupes de reins prélevés à des souris traitées avec le vecteur MGAF
et/ou le mélange DV. Pour chaque condition, images représentatives du rein de 2 animaux.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
77
sont traités avec le mélange DV et le vecteur MGAF est en lien avec une internalisation plus
importante du vecteur suite à l’augmentation du nombre de récepteurs FR à la surface des
cellules tumorales. Dans la suite de cette étude, la toxicité et les effets secondaires que pouvaient
entrainer le mélange DV et le vecteur MGAF chez les animaux ont également été étudiés.
C. TOXICITE DU COTRAITEMENT – EFFETS INDESIRABLES
1. Comportement et poids des souris
Au cours de l’expérimentation décrite ci-dessus, la mesure du poids des souris ainsi que
la recherche de signes de douleur ou de stress ont été effectuées quotidiennement. Aucun
changement dans le comportement ou l’activité des animaux n’a alors pu être noté malgré la
différence de poids observée entre les souris recevant le traitement adjuvant (seul ou en
cotraitement avec le vecteur) et les autres (Figure 41A). En effet, alors que le poids des souris
traitées avec les solvants ou avec le vecteur seul augmente régulièrement au cours de l’étude, le
poids des souris recevant le mélange DV n’évolue pas et est stabilisé entre 17 et 18 g dès la
première injection. L’augmentation du poids des souris traitées avec les solvants et le MGAF
seul peut en partie être expliquée par la croissance des tumeurs elles-mêmes qui, à la fin de
l’étude, pèsent en moyenne 1,20 g (Figure 40B). Cependant, les animaux étant âgés de six
semaines au début de l’expérimentation, cette différence peut également être expliquée par
l’administration de la dexaméthasone qui, comme beaucoup de glucocorticoïdes, peut provoquer
un retard ou un ralentissement de la croissance (Schäcke et al., 2002 ; Krishnan et al., 2013).
2. Etude histopathologique des organes sains
Afin de s’assurer de l’innocuité du cotraitement des souris par le mélange DV et le
vecteur, et compte tenu de la perte de poids entrainée par le mélange DV, une analyse
histopathologique a été réalisée sur différents organes tels que le cœur, le foie et les reins. Cette
étude, réalisée par un pathologiste indépendant, n’a alors révélé aucune toxicité due au traitement
des souris par le mélange DV ou par le vecteur MGAF, qu’ils aient été administrés seuls ou en
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
78
combinaison. A titre d’exemple, les colorations obtenues pour les reins de souris appartenant à
chaque groupe de traitement sont illustrées figure 40B.
En résumé, in vitro comme in vivo, le mélange DV agit comme un activateur
transcriptionnel du gène FOLR1 dans les cellules tumorales mais pas dans les cellules saines. In
vivo, le mélange DV présente deux activités : une activité antitumorale propre et une activité
adjuvante du vecteur MGAF. En effet, suite à l’augmentation de l’expression du gène FOLR1
entrainée par le mélange DV, une plus grande quantité de vecteur MGAF est internalisée par les
cellules tumorales. Cela aboutit à la libération de plus de MMAE dans les tumeurs ce qui se
traduit par un ralentissement plus important de la croissance tumorale, d’où des tumeurs 40 %
plus petites en comparaison des animaux traités uniquement avec le mélange DV. Si de prime
abord ces résultats semblent modestes, ils permettent cependant de valider le concept de l’étude.
En effet, l’utilisation d’une concentration non efficace du vecteur permet de conclure que
l’inhibition supplémentaire de la croissance des tumeurs observée lorsque les souris sont
cotraitées avec le mélange DV et le vecteur MGAF résulte de l’internalisation d’une plus grande
quantité de vecteur dans les tumeurs. Par ailleurs, ces résultats pourraient être améliorés en
augmentant la quantité de vecteur utilisée. Comme précisé au début de la description de cette
étude, la dose de MGAF administrée ici est 10 fois inférieure à la concentration efficace du
vecteur (5 mg/kg, Legigan et al., 2012a). Ainsi, en utilisant une concentration supérieure de
vecteur, par exemple 1 mg/kg, il pourrait être possible d’obtenir une inhibition plus importante,
voir une régression de la masse tumorale.
Dans la dernière partie de ce travail, qui est encore en cours à l’heure actuelle, j’ai
cherché, in vitro, quels mécanismes gouvernaient la coopération entre le mélange DV et le
vecteur MGAF.
Figure 42. (A) Mesure par HPLC/HRMS de la MMAE présente dans cellules KB et A549
traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA puis 24 heures avec
100 nM de MGAF. Les résultats ont été normalisés par rapport à la MMAE présente dans les
cellules traitées uniquement avec le vecteur. Moyennes ± s.e.m. de 6 expériences, test
statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; *** : p-value
≤ 0,001. (B) Mesure par test XTT de la viabilité des cellules KB traitées pendant 3 jours avec 0,1
µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA puis pendant 24 heures avec différentes
concentrations de MMAE ou de MGAF. Moyennes ± s.e.m. de 6 expériences, test statistique :
Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
79
IV. MECANISMES IMPLIQUES DANS LA MODULATION
DE L’ACTIVITE DU VECTEUR MGAF
A. INTERNALISATION DU VECTEUR MGAF
Avant de tenter d’identifier les mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du
vecteur MGAF en présence du mélange DV, j’ai cherché à vérifier qu’à l’instar des tumeurs de
l’étude précédente, l’augmentation de l’expression des FR par le mélange DV aboutissait, in
vitro, à l’internalisation et à la métabolisation d’une quantité plus importante de vecteur MGAF.
Pour cela, comme précédemment, la quantité de MMAE libérée à partir du vecteur a été
mesurée par HPLC/HRMS dans les cellules KB et A549 prétraitées ou non avec le mélange DV
(Figure 42A). Dans les cellules A549, le mélange DV n’a pas d’effet sur la quantité de MMAE
libérée. A l’inverse, dans les cellules KB, le mélange DV entraine une augmentation de 74 % de
la quantité de MMAE détectée dans les cellules KB comparée aux cellules traitées uniquement
avec le vecteur. La suite de mon travail a alors consisté à déterminer l’impact de cette
augmentation sur les cellules tumorales. A cette fin, la viabilité des cellules KB traitées avec le
vecteur seul ou en combinaison avec le mélange DV a été étudiée.
B. EFFET DU COTRAITEMENT SUR LA VIABILITE DES CELLULES KB
La toxicité induite sur les cellules KB par le vecteur MGAF en présence ou en absence du
mélange DV a été évaluée par mesure de la viabilité (Figure 42B). De manière surprenante,
quelle que soit la concentration à laquelle le vecteur MGAF est utilisé, aucune variation de son
activité n’est observée en présence du mélange DV. J’ai alors vérifié que l’activité de la MMAE
elle-même n’était pas modifiée en présence du mélange DV (Figure 42B). Ainsi, bien que son
activité ne soit pas altérée, l’augmentation de la quantité de MMAE libérée dans les cellules KB
n’a pas d’impact sur la viabilité de ces cellules in vitro. Pour expliquer les résultats in vivo, une
autre piste a alors été explorée.
Figure 43. (A) Colonies de cellules KB cultivées en matrice semi-solide d’agarose et traitées
pendant 3 ou 6 jours avec 5 nM de vecteur MGAF et/ou 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de
VPA. Images représentatives de 5 expériences et obtenues au macroscope (MacroView MVX10
Olympus) ou au microscope (Olympus CKX41). La taille (B) et le nombre (C) de colonies ont
été déterminés à l’aide du logiciel ImageJ. Moyennes ± s.e.m. de 4 à 5 expériences, test
statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value
≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
80
C. TOXICITE DU COTRAITEMENT SUR LES CELLULES CULTIVEES EN
CONDITION SANS ANCRAGE
Plusieurs études ont montré que les agents déstabilisant les microtubules ou perturbant la
formation du fuseau mitotique tels que la paxilline et la staurosporine, entrainaient la mort de
certaines cellules cancéreuses en activant les mécanismes d’une apoptose particulière appelée
anoïkis (Deschesnes et al., 2007 ; Yadav et al., 2015). L’anoïkis est déclenchée notamment
lorsque les cellules saines se détachent ou établissent des contacts inappropriés avec la matrice
extracellulaire ou les cellules avoisinantes (Frisch and Screaton, 2001). C’est un élément clé de
l’homéostasie tissulaire. La dérégulation ou l’échappement des cellules cancéreuses à l’anoïkis
favorise alors leur survie et la formation de métastases. Ainsi, la résistance des cellules
cancéreuses à cette forme particulière d’apoptose est aujourd’hui clairement considérée comme
un facteur d’agressivité (pour revue Paoli et al., 2013).
La MMAE est un puissant agent cytostatique dérivé de la dolastatine 10 qui inhibe la
polymérisation des microtubules en se liant à la sous-unité β de la tubuline (Bai et al., 1990).
Compte tenu de ces données, j’ai testé la capacité du cotraitement par le mélange DV et le
vecteur MGAF à stimuler l’anoïkis dans les cellules KB. Pour cela, et afin de mimer les
conditions nécessaires au déclenchement de l’anoïkis, les cellules n’ont plus été cultivées sous
forme de tapis cellulaire, mais en condition sans ancrage, permettant leur développement en trois
dimensions.
1. Effet sur la croissance des cellules dans une matrice semi-solide
Afin de tester la capacité du mélange DV et du vecteur MGAF à déclencher l’anoïkis, les
cellules KB ont été cultivées dans une matrice semi-solide d’agarose de sorte à empêcher leur
adhérence à la boite de culture. La capacité des cellules à échapper à l’anoïkis a alors été évaluée
en déterminant la taille et le nombre des colonies formées (Figures 43A). Les colonies formées
par les cellules KB non traitées présentent une aire moyenne de 10970,8 ± 831,6 µm² et de
17812,0 ± 2032,2 µm² au troisième et sixième jour de l’expérience, respectivement (Figure 43B).
Alors que seuls, ni le mélange DV ni le vecteur n’ont d’effet sur la taille des colonies, leur
utilisation simultanée entraine une réduction d’environ 50 % après trois jours de traitement, et
d’environ 60 % après six jours, l’aire respective des colonies étant alors de 5648,4 ± 496,6 et
Figure 44. (A) Cellules KB adhérentes ou ensemencées sur poly-HEMA et traitées 3 jours avec 0,1
µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA et/ou 5 nM de MGAF. Images représentatives de 4
expériences, barre d’échelle : 150 µm. (B) Mesure par cytométrie en flux de l’apoptose induite dans
les cellules KB après 3 jours de traitement avec 5 nM de MGAF en présence ou en absence de 0,1
µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 4 expériences, test statistique :
One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 ; ** : p-
value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (C) Mesure par RT-qPCR de l’expression du gène FOLR1 dans
les cellules KB adhérentes ou cultivées sur poly-HEMA et traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de
dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 4 expériences, test statistique : Two-way
ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, * : p-value ≤ 0,1 ; ** : p-value ≤ 0,05.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
81
7095,3 ± 1056,1 µm². De plus, le nombre de colonies formées par les cellules KB diminue
également au bout de six jours de traitement avec le mélange DV et le vecteur MGAF (Figure
43C). En effet, alors qu’il est possible de compter en moyenne 216,1 ± 27,7 colonies de plus de
7000 µm² lorsque les cellules ne sont pas traitées, il n’y en a plus que 44,2 ± 12,2 après six jours
de traitement.
Ainsi, lorsqu’ils sont utilisés séparément, le mélange DV et le vecteur MGAF n’ont pas
d’effet sur le développement des colonies KB. En revanche, utilisés ensemble, ils entrainent une
diminution d’environ 80 % du nombre de colonies, les colonies restantes étant 60 % plus petites.
Pour tester l’hypothèse de l’anoïkis, j’ai alors cherché à savoir si l’inhibition de la croissance des
colonies de cellules KB était due à une stimulation de l’apoptose.
2. Effet sur l’apoptose dans les cellules KB cultivées en suspension
Malgré les observations intéressantes que fournit la croissance en matrice semi-solide
d’agarose, celle-ci ne permet que difficilement la récupération des cellules pour analyse. C’est
pourquoi, pour la suite de cette démonstration, les cellules KB ont été cultivées en suspension à
l’aide d’un polymère appelé poly-HEMA. Ce dernier est utilisé comme revêtement des boites de
culture et empêche l’adhérence des cellules (Friedrich et al., 2009 ; Kuroda et al., 2013). Les
cellules KB ont alors été traitées avec le mélange DV et/ou 5 nM de MGAF. De prime abord, il
est possible de constater que les cellules KB cotraitées avec le mélange DV et le vecteur MGAF
ne forment pas d’agrégat comme dans les autres conditions (Figure 44A). Le nombre de cellules
apoptotiques a alors été déterminé par cytométrie en flux.
Comme illustrée sur la figure 44B, la culture des cellules sur poly-HEMA n’entraine pas
de variation de la proportion de cellules en apoptose (11,9 ± 0,9 % des cellules) comparée aux
cellules adhérentes (10,7 ± 1,2 % des cellules). De plus, le traitement des cellules KB par le
mélange DV n’a pas d’effet sur l’induction de l’apoptose, quelles que soient les conditions de
culture. A l’inverse, que les cellules KB soient adhérentes ou en suspension, le vecteur MGAF
multiplie par deux la proportion de cellules apoptotiques (23,8 ± 1,8 % de cellules apoptotiques
adhérentes et 22,5 ± 1,8 % de cellules apoptotiques en suspension). Par ailleurs, lorsqu’elles sont
adhérentes, le cotraitement des cellules KB par le mélange DV et le vecteur MGAF n’augmente
pas la proportion de cellules apoptotiques. Au contraire, le nombre de cellules en apoptose est
Figure 45. (A) Taille et (B) nombre de colonies formées par les cellules HeLa, A2780 et A549
en matrice semi-solide d’agarose et traitées pendant 6 jours avec 5 nM de vecteur MGAF en
présence ou en absence de 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de
2 expériences.
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
82
alors équivalent à celui observé pour les cellules non traitées. En revanche, lorsqu’elles sont
cultivées en condition sans ancrage, le traitement simultané des cellules KB par le mélange DV
et le vecteur MGAF se traduit par l’induction de l’apoptose dans 59,3 ± 5,2 % des cellules
(contre 22,5 ± 1,8 % des cellules lorsque le vecteur est utilisé seul). Dans ces conditions,
l’activité du vecteur MGAF en présence du mélange DV est alors multipliée par 2,6 fois. Compte
tenu de ces conditions particulières de culture, il a également été vérifié que la capacité du
mélange DV à stimuler la transcription du gène FOLR1 dans les cellules KB était conservée
(Figure 41C).
Ainsi, lorsque les cellules KB sont cultivées en condition sans ancrage, l’activité du
vecteur MGAF est potentialisée en présence du mélange DV. L’inhibition de la croissance
tumorale observée in vivo lorsque les souris sont traitées avec le mélange DV et le vecteur
MGAF impliquerait alors l’induction d’une apoptose de type anoïkis. Par ailleurs, à l’heure de la
rédaction de cette thèse, une étude similaire a été initiée afin de voir si ce phénomène est
retrouvé pour les cellules HeLa, A2780 et A549.
3. Effet sur les cellules HeLa, A2780 et A549
Comme pour les cellules KB, les cellules HeLa, A2780 et A549 ont été ensemencées en
matrice semi-solide d’agarose et le développement des colonies a été observé (Figure 45). Par
manque de temps, seuls des résultats préliminaires sont disponibles à ce jour et l’analyse des
données a été réalisée d’après les paramètres déterminés pour les cellules KB. Cependant, bien
que ces résultats soient à prendre avec prudence (deux expériences seulement), après six jours de
traitement, seul le traitement simultané des cellules HeLa et A2780 semble capable d’inhiber le
développement des colonies, que ce soit en termes de taille (Figure 45A) ou de nombre (Figure
45B). A l’inverse, le développement des colonies de cellules A549 (qui n’expriment pas les
récepteurs FR même suite au traitement par le mélange DV) ne semble pas affecté par le vecteur
MGAF, qu’il soit utilisé seul ou en combinaison avec le mélange DV.
Ainsi, ces premiers résultats sur les cellules HeLa et A2780 semblent amener vers les
mêmes conclusions que celles déduites pour les cellules KB. De plus, l’absence d’effet observé
pour les cellules A549 suggère le rôle primordial des FR et de la stimulation de leur expression
par le mélange DV pour l’augmentation de l’activité du vecteur MGAF. Néanmoins, ces
4e Partie – Résultats
8e Chapitre – Optimisation biologique
83
expériences préliminaires nécessitent d’être reproduites et approfondies pour permettre une
analyse plus rigoureuse de ces données.
5E PARTIE
DISCUSSION &
PERSPECTIVES
5e Partie – Discussion & Perspectives
84
I. OPTIMISATION CHIMIQUE DES VECTEURS DERIVES DE
L’ACIDE FOLIQUE
Dans la première partie de ce travail, nous avons vu qu’il était possible d’optimiser le
ciblage des récepteurs à l’acide folique en synthétisant des conjugués capables de doubler la
quantité d’agent anticancéreux internalisée par les cellules tumorales exprimant les récepteurs à
l’acide folique.
Le premier vecteur reposant sur ce concept est le veteur diDGAF, constitué d’une
molécule d’acide folique, de deux molécules de doxorubucine et d’une gâchette enzymatique
galactosylée (Grinda et al., 2013, voir page 64). Les propriétés à la fois cytotoxiques et
fluorescentes de la doxorubicine nous ont permis d’établir des preuves de concept de synthèse
chimique. Cependant, la vectorisation de la doxorubicine aboutit à des composés dont la
solubilité limite l’évaluation in vivo. Ainsi, après cette étude, nous avons fait le choix de nous
concentrer sur la synthèse d’un vecteur homodimérique dérivé de la Monométhyl Auristatine E
(vecteur diMGAF) et qui est aujourd’hui en attente d’évaluation in vivo (Alsarraf et al., 2015,
voir page 64).
In vitro, le vecteur diMGAF a été testé sur trois lignées tumorales exprimant les
récepteurs à l’acide folique. Le traitement de deux de ces lignées, les cellules SKOV-3 et HeLa,
révèle une toxicité environ deux fois plus importante que celle de l’homologue monomère
MGAF, ces résultats étant alors compatibles avec la libération de deux fois plus de MMAE par le
vecteur diMGAF. En revanche, dans la troisième lignée cellulaire utilisée, les cellules A2780, la
toxicité induite par le vecteur diMGAF est environ quatre fois plus importante que celle du
vecteur monomérique. Par spectrométrie de masse, le vecteur diMGAF entraine également la
détection de quatre fois plus de MMAE dans les cellules A2780, comparée aux cellules traitées
avec le MGAF.
En 2012, Antunes et al. décrivent que la nécrose entrainée par des agents toxiques dans
les cellules tumorales peut aboutir au relargage d’une enzyme lysosomale (la β-glucuronidase)
dans le milieu extracellulaire. La MMAE étant un agent cytotoxique et la β-galactosidase une
enzyme lysosomale, ce phénomène pourrait alors expliquer les résultats obtenus sur les cellules
A2780. Dans ces cellules, la libération de deux fois plus de MMAE pourrait déclencher une
nécrose, aboutissant au relargage des β-galactosidases lysosomales dans le milieu de culture des
5e Partie – Discussion & Perspectives
85
cellules. S’en suivrait alors un cercle vicieux dans lequel une partie du vecteur serait activée en
extracellulaire par la β-galactosidase relâchée dans le milieu alors que l’autre partie continuerait
à être internalisée et activée en intracellulaire. Ce modèle aboutirait ainsi à une toxicité plus
importante sur les cellules A2780 que sur les cellules HeLa et SKOV-3. Cette théorie pourrait
être facilement testée en mesurant à l’aide d’un substrat colorimétrique l’activité des β-
galactosidases présentes dans le milieu de culture des cellules HeLa, SKOV-3 et A2780 traitées
par le vecteur diMGAF.
En plus d’augmenter la quantité d’agent anticancéreux internalisé et libéré dans les
cellules tumorales, les vecteurs dimériques présentent d’autres avantages. Le premier avantage
de ces composés réside dans leur structure et leur stratégie de synthèse qui permettent
d’interchanger l’agent anticancéreux vectorisé. Ces molécules pourraient alors être importantes
dans le développement d’une nouvelle génération de vecteurs entrant dans le concept de
médecine personnalisée, dont l’amélioration constitue le sixième objectif du Plan Cancer 2014-
2019, et qui repose sur l’adaptation du traitement en fonction des caractéristiques biologiques
(génétiques, métaboliques, etc.) d’une tumeur.
Par ailleurs, dans les deux études présentées ici, les vecteurs sont des homodimères. Pour
augmenter l’efficacité antitumorale de ces composés, il est possible de concevoir des composés
hétérodimériques qui transporteraient des agents anticancéreux dont les modes d’action seraient
différents et/ou dont les activités seraient synergiques. Ainsi, on peut imaginer des vecteurs
hétérodimériques conjuguant un agent cytostatique ou cytotoxique (doxorubicine ou MMAE)
dont l’activité serait complétée par un agent anti-angiogénique (Imatinib, Sunitinib, etc.) ou par
un composé permettant le recrutement du système immunitaire (cytokines, chimiokines, motifs
bactériens, etc.).
Dans ce contexte, en utilisant un autre type de ciblage que celui des récepteurs à l’acide
folique, le laboratoire a développé un conjugué contenant une molécule de doxorubicine et un
inhibiteur d’HDAC, le MS-275 (Grinda et al., 2011). En plus de promouvoir la différenciation,
l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose dans les cellules tumorales (Rosato et al., 2003), le MS-
275 pourrait soutenir l’activité de la doxorubicine. Comme il l’a été montré pour d’autres
inhibiteurs d’HDAC, le MS-275 pourrait faciliter l’accès de la doxorubicine à l’ADN en
favorisant un état relâché de la chromatine et ainsi potentialiser l’induction de l’apoptose
(Catalano et al., 2006 ; Pan et al., 2007). De plus, il est maintenant établi que l’usage de
combinaison d’agents anticancéreux présentant différents sites d’action est une stratégie efficace
Figure 46. Modes d’action hypothétiques de la dexaméthasone et du VPA sur la stimulation de
l’expression des récepteurs à l’acide folique (FRα) dans les cellules cancéreuses. (A) Au sein des
cellules, la dexaméthasone lie et active l’isoforme α des récepteurs aux glucocorticoïdes (GRα).
Par la suite, les récepteurs GRα se dimérisent et sont transloqués dans le noyau où ils agissent
comme facteurs de transcription et entrainent la synthèse de novo de facteurs intermédiaires
inconnus. Ces facteurs induisent alors le promoteur P4 du gène FOLR1 aboutissant à la synthèse
de protéines FRα fonctionnelles. Le mode d’action du VPA est plus hypothétique. Il pourrait
favoriser l’accès des facteurs transactivateurs au promoteur P4 du gène FOLR1 en maintenant la
chromatine dans un état relâché (B). Il pourrait également diminuer la proportion de GRβ, qui
s’hétérodimérise avec GRα pour en inhiber l’activité (C) ou inhiber le rétrocontrôle négatif
exercé par la dexaméthasone sur l’expression de GRα (D).
5e Partie – Discussion & Perspectives
86
pour prévenir l’apparition de résistances dans les cellules tumorales (Chabner and Roberts,
2005 ; Núñez et al., 2016). Cette caractéristique pourrait constituer un argument supplémentaire
pour le développement de vecteurs hétérodimères.
II. OPTIMISATION BIOLOGIQUE DU CIBLAGE DES
RECEPTEURS A L’ACIDE FOLIQUE
A. STIMULATION DU GENE FOLR1
Dans la seconde partie de mes travaux de thèse, nous avons mis en évidence que le
mélange DV, composé de dexaméthasone et de VPA stimulait l’expression du gène FOLR1 dans
les cellules tumorales. Pour le moment, seule une étude fonctionnelle a été menée. Pour
compléter ce travail, il est nécessaire d’identifier les mécanismes par lesquels le mélange DV
aboutit à l’augmentation de l’expression des récepteurs à l’acide folique. Pour cela, plusieurs
pistes peuvent être envisagées.
Le gène FOLR1, situé sur le chromosome 11, est constitué de 7 exons et de 6 introns. Il
possède deux promoteurs alternatifs appelés P1 et P4 et situés respectivement en amont des
exons 1 et 4 du gène (Saikawa et al., 1995 ; Elwood et al., 1997). En 2005, Tran et al. ont
montré que la dexaméthasone stimule indirectement la transcription du gène FOLR1 et isolent la
séquence du promoteur responsable de la réponse à ce glucocorticoïde. Compte tenu du délai
d’activation du promoteur suite au traitement des cellules par la dexaméthasone, ce groupe
suggère qu’en se liant et en activant les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR), la dexaméthasone
entrainerait la synthèse de novo de médiateurs permettant l’activation du promoteur P4 du gène
FOLR1 (Figure 46A). Cette hypothèse est renforcée par l’absence d’induction du gène FOLR1
par la dexaméthasone lorsque les cellules sont traitées avec de la cycloheximide, un inhibiteur de
synthèse protéique. Ils observent également que l’induction de l’expression de FOLR1 par la
dexaméthasone dans les cellules HeLa est potentialisée par la trichostatine A (TSA) ou le VPA,
deux inhibiteurs de déacétylases d’histones (HDAC).
Nom du facteur Séquence de fixation Nombre de sites
Maz CCCTCCC 1
E47 ACAGCTG 1
AP4 CAGCTG 2
IK3 GCATTCCC 1
Myc-Max ACCATGTG 2
c-MYB GATTGTTGG 1
MZF1 GGGGA 1
PPARG GGGGGCAAAGGCCA 2
HNF4 GGGCAAAGGCCA 2
DR1 GGGCAAAGGCCA 1
GLI TGGGTGGTC 1
ZIC2 GGTGGT 2
ZIC3 GGTGGT 1
USF CACCTG 2
HNF4 GGGCA 1
SF1 CAAGGCAA 1
LYF1 TCCCAAA 1
PPARA GGTCAAAGGATT 1
SMAD4 GCTGGCTGTCCCCT 1
COUP TGTCCTGTGAC 1
IK2 GGGA 1
GC CCCCACCC 1
SP1 CCACCC 2
MAZR CCCCACC 1
HIF1 CACCT 1
PEBP ACCACA 1
OSF2 ACCACA 1
AML1 ACCACA 1
Tableau 11. Liste des facteurs de transcription possédant des sites de fixation potentiels sur
l’intron 3 (comprenant le promoteur P4) du gène FOLR1. Cette liste a été établie par
comparaison in silico des introns 3 des gènes FOLR1 humain, canin et simien (macaque) à l’aide
du site http://www.dcode.org.
5e Partie – Discussion & Perspectives
87
L’induction du promoteur de FOLR1 par la dexaméthasone résulte d’un processus autre
que la fixation du complexe GR/dexaméthasone sur un site Glucocorticoid receptor Response
Element (GRE, Tran et al., 2005) un site de liaison des récepteurs GR. L’analyse in silico que
j’ai menée sur l’intron 3 du gène FOLR1 et contenant la séquence du promoteur P4 conforte
cette hypothèse puisqu’elle n’identifie aucun site de liaison GRE. Cette analyse révèle en
revanche la présence de sites de fixation potentiels pour une trentaine de facteurs de
transcription, listés dans le tableau 11. En parallèle, une analyse par puce à ARN, permettrait
d’identifier si l’expression de certains de ces facteurs est modifiée par la dexaméthasone et/ou
par le mélange DV. Pour tester l’interaction des facteurs les plus intéressants, ainsi que l’impact
du traitement de la dexaméthasone sur cette interaction, une expérience d’immunoprécipitation
de la chromatine pourrait être mise en place.
D’autre part, dans nos modèles cellulaires, il faudrait déterminer quel est le rôle du VPA
dans la stimulation du gène FOLR1. Les HDAC sont des enzymes impliquées notamment dans la
structure de la chromatine. En catalysant la perte d’un groupement acétyle sur les histones, les
HDAC favorisent l’interaction entre ces protéines et l’ADN, maintenant de ce fait la chromatine
dans un état compacté souvent associé à une répression de l’expression des gènes (Lane and
Chabner, 2009). Du fait de son activité inhibitrice d’HDAC, le VPA favoriserait au contraire un
état relâché de la chromatine et pourrait faciliter l’accès de facteurs de transcription à leur site de
liaison sur le promoteur P4 du gène FOLR1 (Figure 46B). Pour tester cela, une expérience
d’immunoprécipitation de la chromatine pourrait être mise en place pour étudier le niveau
d’acétylation des histones au niveau du promoteur P4 en présence et en absence de VPA.
Par ailleurs, par épissage alternatif, plusieurs variants de récepteurs aux glucocorticoïdes
sont générés, les deux plus abondants étant les isoformes GRα et GRβ (Oakley et al., 1997).
L’isoforme GRα, qui est exprimé de manière ubiquitaire dans les conditions physiologiques, est
activée par les glucocorticoïdes tels que la dexaméthasone. Après homodimérisation, les
complexes dexaméthasone/GRα sont alors transportés dans le noyau où ils régulent la
transcription de nombreux gènes. A l’inverse, l’isoforme GRβ est incapable de lier les ligands et
son profil d’expression est plus restreint (Lu and Cidlowski, 2006). Il se lie à l’isoforme GRα
pour réprimer son activité transactivatrice (Oakley et al., 1999 ; Figure 46C). En diminuant la
proportion du variant GRβ au profit de la forme GRα, le VPA pourrait soutenir l’activité
transactivatrice de la dexaméthasone sur le gène FOLR1. Enfin, en plus de lier et d’activer les
GR, la dexaméthasone exerce un rétrocontrôle négatif sur leur expression (Dong et al., 1988 ; Xu
5e Partie – Discussion & Perspectives
88
et al., 2003, Figure 46D). Une diminution de ce rétrocontrôle par le VPA pourrait expliquer le
maintien de la stimulation de l’expression du gène FOLR1 au court du temps, malgré le
traitement continu des cellules par la dexaméthasone.
Au cours de l’étude menée in vivo, nous avons observé que le mélange DV stimulait
l’expression des récepteurs dans les cellules tumorales, au moins au niveau transcriptomique. Au
niveau protéique, l’analyse par Western blot des tumeurs KB révèle une double bande qui n’est
pas détectée lorsque les cellules tumorales proviennent d’une culture cellulaire. Le récepteur
FRα contient trois sites potentiels de N-glycosylation (Wang et al., 1992 ; Salazar and Ratnam,
2007). Les bandes que nous avons observées par Western blot pourraient alors correspondre à
des formes différentes de FRα due à des modifications post-traductionnelles. Après s’être assuré
de la spécificité de l’anticorps en mettant en place une compétition avec une protéine FRα
recombinante ou un peptide mimant l’épitope reconnu par l’anticorps, l’hypothèse d’une
modification post-traductionnelle pourrait être étudiée en incubant les échantillons issus des
tumeurs avec des glycosylases. En 1997, Shen et al. ont montré que la glycosylation des
protéines FR était importante pour leur maturation et leur adressage à la membrane des cellules
(Shen et al., 1997). Dans notre cas, l’étude de la glycosylation des FR est intéressante car elle
pourrait influencer l’efficacité de l’internalisation du vecteur MGAF.
Ainsi, nous avons observé que l’expression du gène FOLR1 pouvait être stimulée par les
récepteurs aux glucocorticoïdes activés par la dexaméthasone et que cette induction pouvait être
potentialisée par un inhibiteur d’HDAC. Hors, une autre hormone stéroïdienne semble
importante dans la régulation du gène FOLR1. Les récepteurs à l’acide folique étant souvent
surexprimés dans les cancers mammaires et d’origine gynécologique (Parker et al., 2005), Kelley
et al. se sont intéressés à la régulation de ce gène par les récepteurs aux œstrogènes (ER). Ils ont
alors montré que l’expression de FOLR1 était réprimée par les récepteurs ER activés par le 17β-
œstradiol (Kelley et al., 2003). Ceci est en accord avec l’observation selon laquelle 70 à 80 %
des cancers mammaires n’exprimant pas les récepteurs aux œstrogènes présentent une forte
expression des récepteurs à l’acide folique (Cheung et al., 2016). Il existe d’ailleurs une
corrélation négative entre les tumeurs qui expriment les récepteurs aux œstrogènes et celles
exprimant les FR (O’Shannessy et al., 2012b ; Zhang et al., 2014). Dans une large étude menée
sur plus de 2900 femmes atteintes de carcinome ovarien, 81 % des tissus examinés présentaient
une expression des récepteurs aux œstrogènes (Voutsadakis, 2016). Compte tenu de leur effet
répresseur quant à l’expression de FOLR1, les récepteurs aux œstrogènes pourraient alors
5e Partie – Discussion & Perspectives
89
entrainer des variations dans les niveaux d’expression de FRα dans les cancers ovariens et
diminuer l’efficacité thérapeutique de molécules vectorisées telles que le Vintafolide (Cheung et
al., 2016, voir page 34). Dans ce contexte, le mélange d’activateurs transcriptionnels développé
au cours de ma thèse apparait comme une alternative pour potentialiser l’activité anticancéreuse
de ce type de médicaments.
B. EFFETS DU MELANGE DV IN VIVO
Au cours de l’étude in vivo, nous avons observé que le mélange DV était capable à lui
seul d’inhiber la croissance tumorale d’environ 50 % comparée aux animaux traités avec le
solvant. Ce résultat est en accord avec les propriétés anticancéreuses rapportées pour chacune de
des molécules composant le mélange DV. La dexaméthasone est fréquemment utilisée dans les
protocoles de chimiothérapie pour prévenir les effets secondaires dus aux agents anticancéreux
(nausées, vomissements, douleur, etc.) mais aussi pour traiter certains types de leucémies et de
myélomes (Sau and Banerjee, 2014). Elle est également à l’étude pour le traitement de certains
types de cancers solides, notamment de la prostate (Holder et al., 2015 ; Venkitaraman et al.,
2015). L’activité anticancéreuse de la dexaméthasone serait due à ses propriétés anti-
inflammatoires et anti-angiogéniques ainsi qu’à sa capacité de régulation de certains facteurs de
transcription impliqués dans la prolifération, l’invasion et la métastase des tumeurs (Yano et al.,
2006 ; Wang et al., 2015). Par exemple, la dexaméthasone réprime l’expression de NF-κB, un
facteur de transcription impliqué dans la survie et la croissance cellulaires et qui est souvent
activé de manière constitutive dans les cellules cancéreuses (Bosscher et al., 2000).
Le VPA est utilisé depuis les années 1960 comme agent anti-convulsant et stabilisateur
d’humeur pour le traitement de pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie,
dépression, schizophrénie, etc. Chateauvieux et al., 2010). Du fait de son activité inhibitrice
d’HDAC, le VPA présente également un intérêt dans le traitement du cancer. En effet, comme
beaucoup d’inhibiteurs d’HDAC, le VPA est impliqué dans plusieurs processus biologiques
(pour revue : Bracker et al., 2009). En altérant l’expression de protéines régulatrices du cycle
cellulaire, les inhibiteurs d’HDAC peuvent entrainer l’arrêt du cycle cellulaire. Ils peuvent
également induire l’apoptose dans plusieurs types de cancers (mammaire, prostatique,
thyroïdien, leucémie et myélome) en favorisant l’expression de facteurs pro-apoptotiques et en
inhibant l’expression de facteurs anti-apoptotiques (Bracker et al., 2009 ; Chateauvieux et al.,
5e Partie – Discussion & Perspectives
90
2010). Les quelques essais cliniques utilisant le VPA seul n’ont fourni que de modestes résultats.
En revanche, au cours de différents essais cliniques de phases I et II, l’utilisation du VPA en
combinaison avec des agents cytotoxiques chimiothérapeutiques ont montré des résultats
encourageants pour le traitement de différentes tumeurs solides (cancers mammaires
métastatiques, mésothéliomes, mélanomes métastatiques), voir une amélioration de la survie
globale pour le cancer du col de l’utérus (Brodie and Brandes, 2014).
Lors de cette expérience, nous avons observé que le poids des souris traitées uniquement
avec le vecteur MGAF ou le mélange de solvants augmentait tout au long de l’étude. Au
contraire, lorsque les animaux reçoivent le mélange DV, seul ou en combinaison avec le vecteur,
leur poids n’évolue pas et reste équivalent à celui mesuré le jour de la première injection. Ceci
peut être expliqué par l’utilisation de glucocorticoïdes comme la dexaméthasone qui peut
entrainer un retard ou un ralentissement de croissance (Schäcke et al., 2002 ; Krishnan et al.,
2013), ainsi qu’une perte de poids et une atrophie musculaire chez la souris (Qin et al., 2013 ;
KIM et al., 2015). Le VPA, quant à lui est associé chez l’homme à une prise de poids voir à
l’apparition d’une obésité (Pickrell et al., 2013 ; Verrotti et al., 2009). Chez les rongeurs, il
semble cependant avoir l’effet inverse puisqu’il entraine une perte de poids chez le rat (Wolden-
Hanson et al., 1998 ; Korkmazer et al., 2006).
Par le biais de différentes études, il a été mis en évidence que la dexaméthasone et le
VPA pouvait entrainer une toxicité vis-à-vis du cœur et du foie, respectivement (Oakley and
Cidlowski, 2015 ; Ren et al., 2012 ; Abdel-Dayem et al., 2014). Compte tenu de ces données et
de la différence de poids entre les animaux traités avec le mélange DV et les autres, le cœur et le
foie des animaux de chaque groupe expérimental ont été soumis à une analyse histopathologique,
réalisée par un spécialiste indépendant. Cette étude n’a alors révélé aucune toxicité suite au
traitement des souris par le mélange DV seul ou en combinaison avec le vecteur. D’autre part,
parce que les tubules proximaux des reins expriment les récepteurs à l’acide folique (Low and
Kularatne, 2009), une analyse histopathologique a également été réalisée dans ces organes.
Aucune nephro-toxicité n’a alors été observée pour les reins des animaux traités avec le vecteur
MGAF seul ou en présence du mélange DV. Ces résultats sont en accord avec ceux observés au
cours des essais cliniques menés sur l’Etarfolatide et le Vintafolide (Cheung et al., 2016). En
effet, les études menées chez l’homme pour l’Etarfolatide mais également pour d’autres agents
d’imagerie vectorisés ciblant les récepteurs à l’acide folique, montrent que ces derniers sont
retenus au niveau des reins (Low and Kularatne, 2009). En dépit de cela, lors de l’essai clinique
Figure 47. (A) Mesure par RT-qPCR de l’expression du récepteur FOLR1 dans les cellules KB
traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone. En plus de la dexaméthasone, les
cellules sont traitées avec 200 µM de VPA, 100 nM de SAHA ou 100 nM de MS-275. Moyennes
± s.e.m. de 4 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, **
: p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (B) Structure hypothétique d’un vecteur
hétérodimérique conjuguant deux molécules actives, la dexaméthasone et le MS-275, reliées par
un amplificateur et un espaceur auto-immolable à une gâchette glucuronylée et un système de
ciblage des vaisseaux tumoraux (ancre maléïmide).
5e Partie – Discussion & Perspectives
91
du Vintafolide, aucune toxicité liée à ce vecteur n’a pu être notée, les effets secondaires
principaux étant attribués à l’agent anticancéreux lui- même (vinblastine).
La dexaméthasone et le VPA sont deux molécules utilisées depuis plusieurs années en
clinique pour le traitement de diverses pathologies. Les effets secondaires entrainés par ces deux
molécules sont très bien décrits chez l’homme (Berthelot et al., 2013 ; Chateauvieux et al.,
2010). Pour limiter le risque de la survenue de ces effets délétères ou en diminuer l’intensité, il
faudrait déposer ces molécules au niveau des tumeurs à l’aide d’un vecteur hétérodimérique.
Pour ne pas saturer les récepteurs à l’acide folique, qui seront ciblés par le vecteur MGAF, cet
hétérodimère pourrait exploiter l’« effet EPR » (voir page 11) observé dans la vascularisation
pathologique des tumeurs.
La vectorisation de la dexaméthasone est quelque chose d’envisageable puisque
récemment, un groupe de biochimistes a synthétisé un conjugué permettant le transport de ce
glucocorticoïde dans le cadre du traitement de l’arthrite (Bajpayee et al., 2016). Cependant, dans
le cas de ce vecteur hétérodimérique, il serait nécessaire d’utiliser un inhibiteur d’HDAC autre
que le VPA. En effet, les résultats encourageants que nous avons obtenus au cours de l’étude in
vivo ont nécessité l’administration d’une quantité plus importante de VPA (300 mg/kg
quotidiennement) que de dexaméthasone (2 mg/kg quotidiennement). Pour permettre l’efficacité
optimale d’un vecteur hétérodimérique, il faudrait que les deux molécules transportées
présentent des concentrations efficaces du même ordre de grandeur. Dans cette optique, j’ai initié
une étude dans laquelle d’autres inhibiteurs d’HDAC ont été testés en combinaison avec la
dexaméthasone (100 nM). Comme illustré sur la figure 47A, le MS-275 et le SAHA (acide
subéroylanilide hydroxamique) fournissent des résultats préliminaires prometteurs puisqu’à
stimulation de l’expression de FOLR1 équivalente, les concentrations de MS-275 et de SAHA
utilisées sont bien inférieures à celle du VPA (200 µM pour le VPA contre 100 nM pour le MS-
275 et le SAHA). De ce fait, ces inhibiteurs d’HDAC, dont les propriétés anticancéreuses ont
également été décrites (Bracker et al., 2009) pourraient être des candidats de choix pour la
substitution du VPA dans le vecteur hétérodimérique. D’ailleurs, notre groupe possède déjà une
expérience dans la vectorisation de ce type de molécules (Grinda et al., 2011), la structure
hypothétique d’un vecteur conjuguant une molécule de dexaméthasone et de MS-275 peut alors
être proposée (Figure 47B).
Figure 48. (A) Lorsqu’elles sont adhérentes, les cellules établissent des communications avec les
composants de la matrice extracellulaire via les intégrines. En réponse à ces signaux, les intégrines
activent différentes voies de signalisation, dont celles impliquant l’Integrin-Linked Kinase (ILK) et
la Focal Adhesion Kinase (FAK). Une fois phosphorylées, ces protéines activent à leur tour des voies
de signalisation soutenant la survie des cellules. Suite à leur détachement et à la perte de
communication avec les composants de la matrice cellulaire, les cellules entament un programme de
mort cellulaire particulier appelé anoïkis. Cette anoïkis est déclenchée par l’induction des caspases
par la voie extrinsèque, qui implique l’activation de récepteurs de mort membranaires et par la voie
intrinsèque, qui aboutit à la perméabilisation des mitochondries. La voie intrinsèque est régulée par
les protéines pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Dans ce cas-là, les protéines anti-
apoptotiques sont inhibées au profit des protéines pro-apoptotiques. La protéine pro-apoptotique Bim
(Bcl-2 interfering mediator of cell death) est d’un intérêt particulier dans notre étude puisque dans les
cellules adhérentes, elle est inhibée par séquestration au niveau des microtubules. Lorsqu’elle est
libérée, elle active les protéines Bak et Bax qui sont responsables de la perméabilisation des
mitochondries.
5e Partie – Discussion & Perspectives
92
C. STIMULATION DE L’ACTIVITE D’UN VECTEUR ANTICANCEREUX
In vivo, nous avons observé que le mélange DV stimule l’expression des récepteurs à
l’acide folique au niveau des tumeurs. Cela entraine une augmentation de l’internalisation et de
la décomposition d’un vecteur appelé MGAF composé d’une molécule d’acide folique, d’une
molécule de MMAE et d’une gâchette enzymatique galactosylée. Ainsi, le mélange DV permet
d’augmenter l’activité du vecteur MGAF, ce qui se traduit in vivo par une inhibition d’environ
80 % de la croissance tumorale comparée aux souris traitées avec les solvants. In vitro, lorsque
les cellules KB sont cultivées dans des conditions permettant leur adhérence, aucune stimulation
de l’activité du conjugué MGAF par le mélange DV n’est observée in vitro alors qu’une plus
grande quantité de vecteur est métabolisée. En revanche, lorsque les cellules KB sont cultivées
en condition sans ancrage ou en suspension, leur cotraitement par le mélange DV et le vecteur
MGAF se traduit par une inhibition du développement des colonies et par une induction de
l’apoptose. La MMAE contenue dans le vecteur MGAF est un agent perturbateur des
microtubules dont elle inhibe la polymérisation (Bai et al., 1990). Pour montrer que le mélange
DV permet d’augmenter l’activité du vecteur MGAF dans ces conditions de culture, il faudrait
mesurer par Western blot la quantité de tubuline non polymérisée ou étudier par microscopie
confocale l’état de polymérisation des microtubules dans les cellules traitées avec le vecteurs
MGAF et/ou le mélange DV.
Par ailleurs, compte tenu des résultats obtenus en croissance sans ancrage, nous avons
émis l’hypothèse que le mélange DV permettait l’internalisation dans les cellules KB d’une
quantité de MGAF suffisante pour déclencher une apoptose de type anoïkis. Dans les cellules
saines (en particulier dans les cellules épithéliales), l’anoïkis est déclenchée lorsque des cellules
adhérentes perdent ou établissent des communications inappropriées avec la matrice
extracellulaire (Paoli et al., 2013). L’implication des intégrines dans le déclenchement ou
l’inhibition de cette forme particulière d’apoptose est alors un phénomène largement décrit
(Boudreau and Jones, 1999 ; Frisch and Screaton, 2001 ; Alanko et al., 2015). Les intégrines sont
des protéines transmembranaires qui servent de médiateurs entre les signaux provenant de la
matrice extracellulaire et la cellule (Harburger and Calderwood, 2009). Colocalisées au niveau
des adhérences focales avec différentes protéines du cytosquelette et des protéines de
signalisation, les intégrines sont ainsi à la base de la régulation de différentes voies de
signalisation cellulaires qui incluent par exemple la voie de l’Integrin-Linked Kinase (ILK) et la
Focal Adhesion Kinase (FAK, Figure 48). Lorsque les cellules sont adhérentes, ces deux kinases
5e Partie – Discussion & Perspectives
93
sont phosphorylées et entrainent notamment l’activation de la voie Phosphoinositide-3-OH
kinase (PI3K)/Akt, une voie de signalisation soutenant la survie et la croissance des cellules.
Ainsi, dans les cellules cancéreuses, ces deux protéines sont souvent surexprimées ou exprimées
constitutivement (Paoli et al., 2013).
Dans le cas présent, la Focal Adhesion Kinase ou FAK présente un intérêt particulier. Il a
précédemment été montré que la rupture de la dynamique des microtubules par des agents
perturbateurs entrainait l’hydrolyse de la protéine FAK (Deschesnes et al., 2007). Dans les
cellules KB cultivées sans ancrage, le mélange DV entrainerait la libération d’une quantité
suffisante de MMAE perturbant alors la polymérisation des microtubules, ce qui pourrait
entrainer l’hydrolyse de la protéine FAK. Cela interférerait alors avec les voies de signalisation
activées par FAK et participerait à la restauration de l’anoïkis. Cette hypothèse pourrait
facilement être mise à l’épreuve en étudiant par Western blot le clivage de FAK dans les cellules
KB cultivées sans ancrage et traitées avec le vecteur seul ou avec le mélange DV.
En plus des signaux relayés par les intégrines, l’induction de l’anoïkis peut également se
faire par l’activation des caspases, que ce soit par la voie extrinsèque, qui implique l’activation
de récepteurs de mort situés à la surface des cellules, ou par la voie intrinsèque qui résulte de la
perméabilisation des mitochondries (Gilmore, 2005, Figure 48). La voie intrinsèque est régulée
par les protéines pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 qui régulent la formation de pore
dans la membrane externe des mitochondries et donc la libération de facteurs pro-apoptotiques.
Dans le cadre de notre étude, une protéine particulière de cette famille pourrait jouer un rôle
important dans l’induction de l’anoïkis : la protéine pro-apoptotique Bim (Bcl-2 interacting
mediator of cell death). Dans les cellules adhérentes, Bim est inactivée par séquestration au
niveau des microtubules via la sous-unité LC8 de la dynéine (Puthalakath et al., 1999 ; Paoli et
al., 2013). Suite au détachement des cellules, Bim est libérée et transloquée dans les
mitochondries ou elle active alors deux autres effecteurs, Bak et Bax qui sont responsables de la
formation des pores dans la membrane externe de cet organite (Valentijn et al., 2004). En tant
qu’agent perturbateur des microtubules, la MMAE libérée dans les cellules KB traitées par le
mélange DV pourrait entrainer la libération de la protéine Bim séquestrée au niveau du
cytosquelette et ainsi activer la voie intrinsèque de l’anoïkis. Ceci pourrait être testé par une
expérience de co-immunoprécipitation de la sous-unité LC8 de la dynéine et une analyse par
Western blot de la protéine Bim. Il serait alors possible de comparer la quantité de protéine Bim
5e Partie – Discussion & Perspectives
94
séquestrée au niveau du cytosquelette lorsque les cellules KB sont traitées uniquement avec le
vecteur ou bien avec le mélange DV en plus.
6E PARTIE
CONCLUSION
6e Partie – Conclusion
95
Les chimiothérapies conventionnelles encore utilisées en clinique exploitent les
propriétés cytotoxiques d’agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles
soient cancéreuses ou non. Pour délivrer spécifiquement les agents anticancéreux aux tumeurs,
une des stratégies consiste à développer des vecteurs, des structures moléculaires dans lesquelles
les agents anticancéreux sont liés de manière covalente à des ligands de ciblage. A cette fin,
notre laboratoire a synthétisé plusieurs conjugués utilisant l’acide folique comme ligand de
ciblage. Celui-ci permet la reconnaissance de récepteurs particuliers, les récepteurs à l’acide
folique, et l’internalisation du vecteur via un processus d’endocytose. Ces molécules vectorisées
contiennent également une gâchette enzymatique qui est clivée au sein de la cellule cible par des
enzymes appelées β-galactosidase.
Malgré les résultats encourageants que fournissent de telles molécules, les études menées
au sein du laboratoire ainsi que les essais cliniques menés sur l’Etarfolatide et le Vintafolide
montrent que leur efficacité dépend du nombre de récepteurs à l’acide folique exprimés par les
cellules malignes. L’objectif de mes travaux de thèse a alors été d’augmenter l’efficacité
thérapeutique de ces molécules en optimisant le ciblage des récepteurs FR. Dans une première
approche, nous avons démontré qu’il était possible de synthétiser des vecteurs homodimèriques
qui permettent de doubler la quantité d’agent anticancéreux libérée dans les cellules ciblées. Ces
conjugués sont responsables d’une toxicité entre deux et quatre fois plus importante que celles de
leur homologue monomérique vis-à-vis des cellules tumorales. Du fait de leur structure et de leur
processus de synthèse, ces vecteurs présentent un potentiel important dans le développement
d’une nouvelle génération de vecteurs anticancéreux.
La seconde approche aborde un aspect plus biologique et a constitué la majeure partie de
mon travail. A ce jour, très peu d’études s’intéressent à la stimulation de l’expression des
récepteurs à l’acide folique dans le but d’augmenter l’efficacité thérapeutique des vecteurs
anticancéreux. La principale étude, publiée par Tran et al. en 2005, se focalise sur la régulation
du gène FOLR1 (codant l’isoforme α des récepteurs à l’acide folique) par les récepteurs aux
glucocorticoïdes dans les cellules HeLa traitées avec de la dexaméthasone. Ils montrent in vitro
que cette stimulation peut être potentialisée par un cotraitement par de l’acide valproïque (VPA).
Un autre groupe a montré, toujours in vitro sur les cellules HeLa, qu’en présence de
dexaméthasone, une quantité plus importante de micelles couplées à l’acide folique et
transportant de la coumarine (une sonde fluorescente) était internalisée (Chen et al., 2013).
6e Partie – Conclusion
96
Dans ce projet, j’ai développé un traitement composé de dexaméthasone et de VPA. In
vivo, ce traitement appelé mélange DV présente une activité antitumorale propre, compatible
avec les propriétés anticancéreuses décrites dans la littérature pour chacune des deux molécules.
De plus, le mélange DV entraine une augmentation de 44 % de l’expression du gène FOLR1
(codant l’isoforme α des récepteurs à l’acide folique) dans les cellules tumorales KB. J’ai
également testé in vivo l’efficacité d’un conjugué anticancéreux dérivé de l’acide folique en
présence du mélange DV ce qui, à ma connaissance n’a jamais été réalisé. De plus, par
spectrométrie de masse, j’ai mis en évidence que suite à l’augmentation du nombre de récepteurs
à l’acide folique, une plus grande quantité de vecteur était internalisée et métabolisée dans les
tumeurs. Concernant la croissance tumorale, le cotraitement des souris par le mélange DV et le
vecteur entraine une inhibition plus importante d’environ 40 % en comparaison des animaux
traités uniquement avec le mélange DV, le vecteur utilisé seul n’ayant pas d’effet sur le
développement des tumeurs. Sur les organes sains, le mélange DV n’entraine pas de variation de
l’expression des récepteurs de l’acide folique et une étude histophatologique menée par un
spécialiste indépendant n’a révélé aucune toxicité chez les animaux ayant reçu le vecteur et/ou le
mélange DV.
En parallèle, j’ai vérifié dans une étude in vitro que la stimulation du gène FOLR1 était
retrouvée dans trois lignées cellulaires tumorales exprimant les récepteurs à l’acide folique de
manière basale. J’ai également montré que cette stimulation ne reflétait pas un phénomène
général au sein de la cellule, puisque l’expression des deux autres transporteurs de folates, le
transporteur de folates réduits (RFC) et le transporteur de folates couplé aux protons (PCFT)
n’est pas modifiée suite au traitement par le mélange DV. L’action du mélange DV présente
également l’avantage d’être réversible, l’expression du gène FOLR1 retournant à son niveau
basal seulement deux jours après l’arrêt du traitement. Enfin, dans les cellules n’exprimant pas
de manière spontanée les récepteurs à l’acide folique, qu’elles soient cancéreuses comme les
cellules A549 ou saines comme les cellules HUVEC, le mélange DV ne permet pas de
déclencher l’expression du gène FOLR1.
Comme cela a été démontré in vivo, nous avons également montré in vitro par
spectrométrie de masse que le mélange DV permettait la libération d’une plus grande quantité
d’agent anticancéreux dans les cellules KB. J’ai alors émis l’hypothèse que le traitement
combiné des cellules cancéreuses par le mélange DV et le conjugué anticancéreux déclenchait
une apoptose particulière appelée anoïkis. Dans les cellules normales, l’anoïkis est déclenchée
6e Partie – Conclusion
97
suite à la perte ou à l’établissement de liaisons aberrantes avec la matrice extracellulaire ou des
cellules avoisinantes. Ce processus prévient l’attachement et la survie d’une cellule dans un
environnement inapproprié. Dans les cellules tumorales, l’inhibition de cette apoptose favorise la
survenue de métastases et est donc un critère d’agressivité de la maladie. Les lignées cancéreuses
étudiées dans ces travaux sont résistantes à cette anoïkis et se développent sous forme de
colonies lorsqu’elles sont cultivées sans ancrage dans une matrice semi-solide. Cependant, leur
cotraitement par le mélange DV et le vecteur MGAF entraine une diminution de la taille et du
nombre de colonies de cellules tumorales formées, le nombre de cellules en apoptose étant alors
multiplié d’environ 2,6 fois. Ces résultats établissent ainsi pour la première fois un lien entre
l’augmentation du nombre de récepteurs à l’acide folique dans les cellules tumorales et
l’amélioration de l’activité anticancéreuse d’un vecteur dérivé de l’acide folique.
7E PARTIE
TRAVAUX
COLLABORATIFS
7e Partie – Travaux collaboratifs
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
98
9E CHAPITRE
Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
En parallèle du ciblage de marqueurs membranaires tumoraux tels que les récepteurs à
l’acide folique, le groupe du Pr Papot travaille depuis plusieurs années sur le développement de
molécules vectorisées dont l’activation ne nécessite pas l’internalisation du vecteur au sein de la
cellule cible. Ces molécules sont activées dans le microenvironnement immédiat des tumeurs par
une enzyme particulière appelée β-glucuronidase.
La β-glucuronidase est une glycosyl hydrolase qui, en conditions physiologiques, est
présente dans les lysosomes et est impliquée dans la dégradation et l’élimination des
protéoglycans (Naz et al., 2013). Cependant, plusieurs études établissent la présence d’une
concentration importante de β-glucuronidase active dans les microenvironnements tumoraux,
notamment dans les mélanomes, les cancers mammaires, pulmonaires, ovariens et gastro-
intestinaux (Bosslet et al., 1998 ;Naz et al., 2013 ; Tranoy-Opalinski et al., 2014). En effet, sous
certaines conditions inflammatoires, que l’on peut retrouver au niveau des tumeurs, des enzymes
lysosomales telles que la β-glucuronidase peuvent être libérées par les neutrophiles, les
macrophages (Kawai, 2014) et par les cellules tumorales en nécrose (Antunes et al., 2012). Cette
observation représente un intérêt particulier dans le développement de stratégies visant à délivrer
un agent anticancéreux spécifiquement et de manière contrôlée au niveau de la tumeur. Le profil
d’expression particulier de la β-glucuronidase a alors donné naissance à plusieurs conjugués au
sein desquels un agent anticancéreux est relié de manière covalente à un composé glycosidique
de type glucuronide. Ainsi modifié, l’agent anticancéreux voit son hydrophilie augmenter ce qui
empêche sa diffusion passive à travers les membranes cellulaires. La liaison covalente entre le
glucuronide et l’agent anticancéreux assure la stabilité de la prodrogue jusqu’à son transport dans
le microenvironnement de la zone à traiter. A ce niveau, l’interaction des β-glucuronidases avec
le groupement glucuronide engendre des réarrangements internes au sein du vecteur qui
aboutissent à la libération du principe actif.
Figure 49. Structure du MMAE-Alb. Ce vecteur est composé d’un agent anticancéreux, la
MMAE (en rouge), d’une gâchette glucuronylée (en vert) et d’une ancre maléïmide (en orange)
reliés par un espaceur auto-immolable (en bleu). L’ancre maléïmide permet la formation d’un
complexe avec l’albumine, une macromolécule plasmatique.
IC50 (nM)
MMAE MMAE-Alb MMAE-Alb + β-glucuronidase
KB 0,39 ± 0,06 35,97 ± 8,91 0,46 ± 0,07
MDA-MB-231 1,38 ± 0,72 126,46 ± 57,34 0,084 ± 0,14
MIA-PaCa2 0,73 ± 0,09 76,20 ± 11,79 0,99 ± 0,32
Tableau 12. IC50 mesurées par test de viabilité cellulaire (XTT) sur les cellules cancéreuses KB
(naso-pharynx), MDA-MB-231 (sein) et MIA-PaCa2 (pancréas) traitées pendant 3 jours avec de
la MMAE libre, le vecteur MMAE-Alb en présence et en absence d’enzyme β-glucuronidase.
Moyennes ± s.e.m. de 3 expériences.
7e Partie – Travaux collaboratifs
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
99
Dans ce contexte, le groupe du Pr Papot a acquis depuis plusieurs années une certaine
expertise dans la synthèse de molécules dites glucuronylées. Les premières molécules
synthétisées par le groupe étaient constituées d’un ou deux agents anticancéreux (agents tubulo-
affins, inhibiteurs de topoisomérases, d’HDAC ou d’acteurs de la voie Hedghog, etc.) relié par
un espaceur auto-immolable à un motif glucuronide (Thomas et al., 2008 ; Hamon et al., 2010 ;
Renoux et al., 2011 ; Grinda et al., 2011 ; Grinda et al., 2012 ; Legigan et al., 2013 ; Bensalma et
al., 2015). In vivo, ces systèmes de ciblage présentent une activité antitumorale supérieure à celle
des chimiothérapies conventionnelles ainsi qu’une diminution de la toxicité induite chez
l’animal. Cependant, en l’état, le potentiel thérapeutique de ces molécules glucuronylées
demeure limité in vivo du fait de leur rapide élimination rénale qui nécessite l’administration
d’une quantité importante de vecteur à l’animal. Ceci est dû à la glucuronylation naturelle qui se
produit dans l’organisme et qui assure sa détoxification en marquant les molécules à éliminer
(Mazerska et al., 2016).
Pour pallier à ce problème, notre groupe a cherché à augmenter la demi-vie plasmatique
de nos agents, notamment en utilisant l’albumine comme transporteur. L’albumine est une
macromolécule qui présente de nombreux avantages : 1/ elle s’accumule passivement au niveau
de la tumeur par effet « EPR » (« enhanced permeability and retention », voir page 11) ; 2/ sa
rétention y est facilitée par la présence de deux protéines à forte affinité pour l’albumine au
niveau de l’endothélium tumoral (le récepteur gp60) ou des interstices tumoraux (la protéine
SPARC, Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) et enfin 3/ elle est attirée au niveau des
tumeurs par un phénomène d’hypoalbuminémie dû à une forte dégradation de l’albumine au
niveau de la masse tumorale pour fournir des acides aminés aux cellules hautement prolifératives
(Elsadek and Kratz, 2012 ; Kouchakzadeh et al., 2015).
Par ailleurs, il a été décrit qu’un agent anticancéreux muni d’un groupement chimique de
type « maléïmide » était capable de se lier à la cystéine 34 de l’albumine plasmatique pour être
transporté dans la circulation sanguine (Kratz et al., 2000 ; Legigan et al., 2012b). Le groupe du
Pr Papot a alors synthétisé une nouvelle molécule appelée MMAE-Alb constituée d’un agent
anticancéreux, la MMAE, d’une gâchette glucuronylée ainsi que d’un groupement maléïmide
permettant la formation d’un complexe avec l’albumine (Figure 49).
Après avoir caractérisé les paramètres physico-chimiques du MMAE-Alb (solubilité,
stabilité, sensibilité à l’action de la β-glucuronidase), nous avons évalué ses capacités
thérapeutiques in vitro et in vivo sur différents types de cancer. In vitro, la toxicité de ce composé
Figure 50. Suivi par bioluminescence in vivo de la croissance des tumeurs KB. Des xénogreffes
ont été implantées par voie sous cutanée à des souris nude Balb/c. Les jours indiqués par les
flèches noires, les animaux ont reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de MMAE, 2mg/kg de
MMAE-Alb, 1,9 mg/kg de MMAE-glu ou 1,18 mg/kg de MGAF. Moyennes ± s.e.m. des
tumeurs de 8 animaux, test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ** :
p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.
7e Partie – Travaux collaboratifs
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
100
est inférieure à celle de la MMAE libre puisque les IC50 déterminées pour les cellules KB
(cancer naso-pharynx), MDA-MB-231 (cancer mammaire) et MIA-PaCa2 (cancer du pancréas)
sont environ 100 fois supérieures à celles de la MMAE (Tableau 12). L’ajout d’enzyme β-
glucuronidase dans le milieu de culture des cellules aboutit à une activation de la molécule, ce
qui se traduit par une toxicité équivalente à celle de la MMAE sur ces trois lignées cellulaires.
Cette prodrogue a par la suite été testée in vivo chez des souris nude Balb/c auxquelles
des xénogreffes de tumeur KB ont été implantées par voie sous cutanée. Les cellules KB
expriment fortement les récepteurs à l’acide folique et sont ainsi très sensibles à l’activité des
vecteurs dérivés des folates tels que le MGAF (Legigan et al., 2012a). Cette première étude nous
a alors permis de comparer l’efficacité d’une libération d’agent anticancéreux catalysée par une
enzyme du microenvironnement avec celle d’une libération nécessitant une internalisation
cellulaire. L’efficacité de la prodrogue ne contenant pas l’ancre maléïmide (appelée MMAE-glu)
a également été évaluée.
Tous les agents anticancéreux vectorisés ont été utilisés avec la même équivalence
molaire de MMAE (0,77 mg/kg). La MMAE libre, elle, n’a pu être administrée qu’à 0,5 mg/kg,
dose correspondant à la dose maximale tolérée. Comme indiqué en figure 50, seul le traitement
avec le vecteur MMAE-Alb (à une dose de 2 mg/kg correspondant à 0,77mg/kg de MMAE)
permet d’obtenir une limitation de la croissance tumorale. Une étude anatomopathologique de
tous ces animaux a été réalisée par un spécialiste indépendant qui n’a observé aucune toxicité sur
les organes sains.
Pour faire suite à ces résultats, le vecteur MMAE-Alb a été testé contre des xénogreffes
de tumeurs MDA-MB-231 ou MIA-PaCa2 implantées de manière orthotopique à des souris
nude. Les animaux ont alors été traités avec 0,5 mg/kg de MMAE libre ou 4 mg/kg de MMAE-
Alb (correspondant à 1,54 mg/kg de MMAE). Par bioluminescence, nous avons pu constater que
la MMAE libre était seulement capable de ralentir la croissance des tumeurs MDA-MB-231 et
MIA-PaCA2 comparée aux animaux traités uniquement avec le solvant (Figures 51A et B,
respectivement). A l’inverse, le vecteur MMAE-Alb entraine une inhibition totale et durable du
développement des tumeurs et même une régression complète des tumeurs puisqu’à la fin de
l’expérience, 33 et 50 % des animaux sont en rémission pour les tumeurs MIA-PaCa2 et MDA-
MB-231, respectivement.
Figure 51. Suivi par bioluminescence in vivo de la croissance des tumeurs MDA-MB-231 (A) et
MIA-PaCa2 (B). Des xénogreffes ont été implantées de manière orthotopique à des souris nude
Balb/c. Les jours indiqués par les flèches noires, les animaux ont reçu par voie intraveineuse 0,5
mg/kg de MMAE ou 4 mg/kg de MMAE-Alb. Moyennes ± s.e.m. des tumeurs de 6 animaux, test
statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-
value ≤ 0,001.
7e Partie – Travaux collaboratifs
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
101
Chez l’homme, le cancer du pancréas est généralement détecté à un stade avancé. Pour
mimer cette condition, des xénogreffes de tumeurs MIA-PaCa2 ont été implantées à des souris
nude comme dans le paragraphe précédent. En revanche, le traitement des souris n’a débuté que
lorsque les masses tumorales eurent atteint une taille comprise en 2,5 et 3,5 cm² (Figure 52A).
Alors que le traitement des animaux avec le solvant aboutit rapidement à la mort de la totalité
des souris (Figure 52B), le vecteur MMAE-Alb entraine une régression très importante de
presque 99 % de la croissance tumorale permettant la survie de 60 % des animaux.
L’ensemble de ces travaux fait l’objet d’un article actuellement soumis dans la revue
Angewandte Chemie et dont voici la référence :
An Enzyme-Responsive Drug Delivery System Targeting the Tumor
Microenvironment for Efficient Therapy of Breast and Pancreatic Cancers
Renoux B., Raes F., Legigan T., Péraudeau E., Eddhif B., Poinot P., Tranoy-Opalinski I.,
Asarraf J., Lerondel S., Le Pape A., Clarhaut J., et Papot S.
Angewandte Chemie, soumis.
En conclusion, le ciblage de la β-galactosidase par des vecteurs anticancéreux
glucuronylés est une stratégie largement validées (Renoux et al., 2011 ; Grinda et al., 2012 ;
Legigan et al., 2013 ; Bensalma et al., 2015). Cependant ces molécules sont rapidement
éliminées de l’organisme et l’obtention d’une efficacité thérapeutique nécessite l’administration
de quantités importantes de composé. Lors de cette étude, nous avons démontré que la liaison à
l’albumine plasmatique était une approche viable pour augmenter la demi-vie plasmatique de ces
composés. Dans ce contexte, l’une des molécules vectorisées reposant sur ce principe et dont le
développement est le plus avancé est l’INNO-206. Il s’agit d’une prodrogue composée de
doxorubicine reliée par un espaceur de type hydrazine à un groupement maléïmide permettant la
liaison avec l’albumine plasmatique. L’acidité observée dans le microenvironnement tumoral
entraine le clivage de l’espaceur et la libération de la doxorubicine (Mita et al., 2015). L’INNO-
206 a été testé avec succès en phase 2b pour le traitement des sarcomes des tissus mous et est
actuellement en étude de phase 3 (Chawla et al., 2015 ; référence des études : NCT01514188
pour la phase 2b et NCT02049905 pour la phase 3 , source : « clinicaltrials.gov »). Il a également
été testé en phase 2 pour le traitement des cancers pancréatiques avancés, mais les résultats de
Figure 52. Des xénogreffes de tumeurs MIA-PaCa2 ont été implantées de manière orthotopique
à des souris nude Balb/c. Lorsque les tumeurs ont atteint une taille comprise entre 2,5 et 3,5 cm²,
les animaux ont reçu par voie intraveineuse 4 mg/kg de MMAE-Alb les jours indiqués par les
flèches noires. La croissance tumorale (A, bioluminescence) et la survie des animaux (B) ont
alors été étudiées. Moyennes ± s.e.m. des tumeurs de 5 animaux. (B) Survie des animaux au
cours de l’étude.
7e Partie – Travaux collaboratifs
9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral
102
cette étude n’ont pas encore été publiés (référence de l’étude : NCT01580397, source :
« clinicaltrials.gov »).
Le vecteur MMAE-Alb que nous avons développé repose sur la même stratégie de liaison
à l’albumine. En revanche, du fait de la présence de la gâchette glucuronylé et de la structure de
l’espaceur central, notre composé pourrait présenter une stabilité plus importante que celle de
l’INNO-206. Le MMAE-Alb présente par ailleurs une efficacité antitumorale sur les cancers
pancréatiques et les cancers mammaires triple-négatifs qui sont caractérisés par une forte
agressivité et un mauvais pronostic et pour lesquels il n’existe pas de traitement efficace. Dans
ce contexte, notre molécule pourrait venir augmenter l’arsenal thérapeutique mis à disposition
des médecins pour le traitement de ces cancers. Le MMAE-Alb a été protégé par un d’un brevet
(n° PCT/IB2011/052184) et une licence d’exploitation a été achetée par la société SYNDIVIA
pour son développement préclinique. Cette étape est, à l’heure de la rédaction, en cours
d’achèvement et les très bons résultats obtenus sont encourageants quant à la réalisation d’une
étude clinique de phase 1 contre les cancers mammaires triple-négatifs qui devrait commencer
début 2018.
7e Partie – Travaux collaboratifs
10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique
103
10E CHAPITRE
Autres stratégies de ciblage thérapeutique
Au cours de ces trois années de thèse, j’ai eu l’opportunité de travailler en collaboration
avec différentes équipes de chimistes sur d’autres stratégies de ciblage et/ou de libération de
principe actif. L’objectif de ces travaux était de valider des concepts de synthèse chimique et de
vérifier biologiquement le fonctionnement des molécules développées. Pour cette raison, ces
deux études ne seront pas développées ici.
Au cours d’un de ces projets, j’ai participé en collaboration avec le Dr Luisa Ronga
(INSERM U1212, UMR CNRS 5320, Bordeaux) au développement de peptides mimétiques du
VEGF, un des acteurs principaux de l’angiogenèse tumorale. Ces peptides agissent comme des
compétiteurs du VEGF pour la fixation sur son récepteur, le VEGFR-2 (Vascular Endothelial
Growth Factor Receptor-2) et présentent ainsi des propriétés anticancéreuses prometteuses. Ce
travail a donné lieu à la publication d’un article dont la référence est la suivante :
Diminished Oligomerization in the Synthesis of New Anti-Angiogenic Cyclic
Peptide Using Solution Instead of Solid-Phase Cyclization
Rubio S., Clarhaut J., Péraudeau E., Vincenzi M., Soum C., Rossi F.,
Guillon J., Papot S., Ronga L.
Peptide Science, 2016, 106 (3), 368-375
Un autre de ces travaux a consisté à développer avec le groupe du Pr Papot un complexe
de molécules entrelacées appelé rotaxane. Ce rotaxane est programmé pour libérer une molécule
de paclitaxel (un agent anticancéreux bloquant la dépolymérisation des microtubules) en réponse
à une série d’activations enzymatiques. Cette étude, dont un exemplaire est fourni ci-après, a été
publiée dans la revue Chemical Science avec la référence suivante :
7e Partie – Travaux collaboratifs
10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique
104
A Mechanically Interlocked Molecular System Programed for the
Delivery of an Anticancer Drug.
Barat R., Legigan T., Tranoy-Opalinsky I., Renoux B., Péraudeau E., Clarhaut J., Poinot
P., Fernandes A. E., Aucagne V., Leigh D. A. et Papot S.
Chemical Science, 2015, 6, 2608-2613.
8E PARTIE
BIBLIOGRAPHIE
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RESUME
Evaluation et optimisation de l’efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs de l’acide folique
En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies, le cancer demeure un problème majeur
de santé publique. La plupart des chimiothérapies conventionnelles exploitent les propriétés
cytotoxiques d’agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles soient
cancéreuses ou non, ce qui peut aboutir à une toxicité importante et de sévères effets secondaires. Pour
pallier à ce problème, l’utilisation de ligands de ciblage pour délivrer spécifiquement l’agent
cytotoxique aux cellules malignes tout en épargnant les tissus sains est une approche prometteuse.
Parmi les différents ligands exploités, l’acide folique fait l’objet d’une attention particulière due à la
surexpression préférentielle de son récepteur par de nombreux types de cellules cancéreuses.
Cependant, les essais cliniques menés sur des molécules reposant sur cette stratégie indiquent que leur
efficacité dépend surtout du niveau d’expression du récepteur ciblé.
Dans ce contexte, j’ai développé deux approches permettant d’augmenter l’efficacité du
ciblage des récepteurs à l’acide folique. D’une part, j’ai réalisé la validation biologique de nouveaux
conjugués conçus pour délivrer conjointement deux agents anticancéreux. D’autre part, j’ai mis au
point un traitement capable d’augmenter, in vitro et in vivo, l’expression des récepteurs à l’acide
folique à la surface des cellules tumorales. Cela aboutit à l’internalisation d’une plus grande quantité
de vecteur, qui se traduit in vivo, par une inhibition plus importante de la croissance tumorale, sans
toxicité sur les cellules saines.
Mots clés : Chimiothérapie vectorisée, ciblage thérapeutique, acide folique, récepteurs à l’acide
folique, dexaméthasone, acide valproïque.
Ecole doctorale Biosanté n°524
Discipline Biologie, Médecine, santé
Secteur Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique