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Activation de la protéine p53 par l’irradiation laser

dans l’ultraviolet lointain

Catherine Chapel1, Evelyne May2, Monique Vacher3

et D. Courant1

1 DSV/DRR/SRBF, CEA, Fontenay aux Roses2CNRS UPR 9045, Institut André Lwoff, Villejuif

3Laboratoire de Radiobiologie de l’ADN, DSV/DRR, CEA, Fontenay aux Roses,

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posterior

anterior

Coupe histologique de cornée humaine

Epithelium

Endothelium

Stromakeratocytes

• Le rayonnement à 193 nm émis par le laser à excimères ArF estutilisé en ophtalmologie pour la chirurgie de la réfraction (PKR, et LASIK).

• La photoablation élimine ou endommage :L’épithélium cornéen et la membrane basaleLe stroma cornéen et les kératocytesLes cellules endothéliales

• Données partielles voire contradictoires

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Objectif

• La photoablation par laser UV 193 nm expose les cellules viables, autour de la zone traitée, à des doses sub-ablatives d’un rayonnement constituéde photons de haute énergie (6.4 ev)

0 400 J.m-2150 1800 2500

Zone de photoablationEn chirurgie réfractive

Fluence seuilcette étude

Fréquence 10-20 Hz

Fréquence 5 Hz

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L’absence de p53 augmente la sensibilité à l’irradiation Laser

Cellular Type D37 Laser 193nm

D37 254 nm

H1299 62,1 J. m-2 12,6 J. m-2

RKO 174,5 J. m-2 28,1 J. m-2

p53 statut

absence

Wild type

H1299 : Human non-small lung carcinoma cellsRKO: Human colorectal carcinoma cells

D37 : Dose at which 37% of surviving cells

60 J.m-2

L’absence de p53 induit une réductionde la capacité à former des colonies après irradiation.Observé après UVC 254 nm, corrélé àune diminution des mécanismes de réparation. Smith et al., 2000

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La protéine P53

Stratégies possibles

ou

Réparations

Arrêt du cycle cellulaireG1 ou G2/M

P53

UV, rayonnements ionisants, agents chimiques,LASER ?

•Antisens•inhibiteur (PFT)

Activation non possibleP53

cycle Apoptoseréponse

P53

P53

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Approche expérimentale

t -1

•Mise

en

cultu

re

t 24 h t 48 h t 72h•I

mmun

omar

quag

es•P

rolif

érat

ion c

ellul

aire

•Mar

quag

e de

l’ap

opto

se

•Imm

unom

arqu

ages

•Cyc

le •Pro

lifér

atio

n ce

llulai

re

•Cyc

le

•Cyc

le/

P53

24 ht 0

•Irr

adiat

ion L

aser

193

nm

(ou

UVC

254

nm)

± Pifithrinecyclique

7DSV/DRR/SFRP Bordeaux 14/04/04

La pifithrine : un inhibiteur réversible de p53• La pifithrine est un inhibiteur réversible de la p53. Komarov et al., 1999

• Pifithrin-α permet de démontrer l ’implication de p53 suite à un stress

• Gammes utilisées : 10-50 µM

• Forme cyclique utilisée plus stable

• Dans notre étude : Non toxique pour les cellules(WST-1 et BrdU)

•Pifithrin cyclique2-(4-methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-

tetrahydrobenzothiazole,HBrCalbiochem

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Activation de la P53 après irradiation Laser 1/2

0

10

20

30

40

0 60

Irradiation Laser (J/m²)

% P

53

KHKH+PFT

Marquage P53 24 heures après irradiation Laser (n=500)

Non irradiées

Laser 60 J. m-2

Ac: Anti p53 DO7Gift from E. May

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Non irradiées avec ou sans

PFT

Activation de la P53 après irradiation Laser 2/2

60J/m²

Marquage P5372 heures après irradiation Laser

Protocole selon Bassi et al., 2002

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

6h 24h 48h 72h

% n

oyau

x m

arqu

és P

53 non irradiées60 J.m-2

Cinétique d’expression de p53 après irradiation LaserImmunofluorescence

300<Nb noyaux analysés<1000Mesure de l’activation par cytométrie de flux

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L’irradiation Laser entraîne une augmentation des phases S et G2

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 0+PFT 60 60+PFT

Irradiation Laser (J/m²)

G2/MSG0/G1

Pourcentage des différentes phases du cycle cellulaire des kératocytes humains 72h

après irradiation Laser

Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150

Num

ber

020

040

060

0

Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150

Num

ber

090

180

270

360

DebrisAggregatApoptosisDip G1Dip G2Dip S

60 J/m²Non irradié

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L’irradiation Laser à 193 nm déclenche la mort cellulaireMarquage TUNEL

24 heures après irradiation Laser (n=500)

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Cytotoxicité du rayonnement Laser : Apoptose

Mockirradiated

C. Chapel

CEA/DSV/DRR

05

1015202530354045

0 0+PFT 60 60+PFT

Irradiation Laser (J/m²)

% s

ubG1

Pourcentage de sub-G1 72h après irradiation LaserCytométrie de flux

Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150

Num

ber

090

180

270

360subG1

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La protéine p21• La protéine p53 se lie avec le promoteur du gène WAF1 / Cip1 (pour Wild Type p53-activated fragment et cdk2 inhibiting protein) codant pour la protéine p21

• La liaison de la protéine p21 aux kinases cdk2, inhibe leur activité et bloque le cycle cellulaire

• Rôles clé dans la croissance et la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN

14DSV/DRR/SFRP Bordeaux 14/04/04

Cinétique d’expression de p21 après irradiation Laser

0

5

10

15

20

25

30

35

40

6h 24h 48h 72h

% n

oyau

x m

arqu

és P

21

non irradiées60 J.m-2

Immunofluorescence

Nb noyaux analysés>1000Ac: Anti WAF1 (Ab6)

15DSV/DRR/SFRP Bordeaux 14/04/04

ConclusionLASER UV-C 193 nm

Accumulation de P53.Arrêt en phases S et G2/M.Augmentation de l ’apoptose.

Accumulation de P21.

LASER 193 nm + Inhibition de p53

Augmentation plus importante de l’arrêt en phase G2/M.Apoptose plus élevée.Accumulation de P21 autres voies d’activation ?

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193 nmMembrane cellulaire

193 nm193 nm

apoptose

Survie cellulaire

MMP

P21

193 nm

ROS

Photovieillissement

P73, P63*

FASCaspases

TNF-α

193 nm

Dommages de l ’ADN

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Activation après irradiation à 30 J.m-2 UV-C 254 nm

Présence des protéines de la famille P53

P73 P63