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DEATH SIGNAL-INDUCED LOCALISATION OF P53 TO MITOCHONDRIA
Natalie D. Marchenko, Alexander Zaika, and Ute M. Moll
Claire BOUYER, Adrien LEMAIRE
MSBi105, 2009
The Journal of Biological Chemistry, 2000
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Rôle et Régulation de P53
Tiré du cours 2009 de F.RENAUD
Structure de P53
Domaine de transactivation
Domaine de liaison à l’ADN
Domaine d’oligomérisation : Homotétramérisation
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Voie de l’apoptose indépendante de P53
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Voie de l’apoptose dépendante de P53
INTRODUCTIONINTRODUCTION
ETUDE DE LA VOIE NON GENOMIQUE DE P53
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Expérience 1 :
ML-1 : cellule de leucémie myéloide
RKO : cellule de cancer du colon
La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible entre différents types de lignées cellulaires lors d’une apoptose médié par P53
Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie
Western-blot dans les cellules RKO
Campthothécine : Dommage de l’ADN
RESULTATSRESULTATS
Western-blot dans les cellules ML-1
La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible après induction de différents types de stress cellulaire dans l’apoptose médié par P53
Expérience 1 :
Campthothécine : Dommage de l’ADN
Desferroxamine (DXE) : stress hypoxique
RESULTATSRESULTATS
Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie
Western-blot dans les cellules ML-1
Expérience 2a :
La voie de P53 induite dépend de la drogue utilisée
Actinomycine D : arrêt du cycle cellulaire en G1, pas d’activation de l’apoptose.
Camptothécine et Etoposide : Activation de l’apoptose médiée par P53.
RESULTATSRESULTATS
Choix de la voie induite par P53 après un stress
Cytométrie en flux des cellules ML-1
Expérience 2b :
TNF : Activation de l’apoptose indépendante de P53Actinomycine D : Activation de l’arrêt du cycle cellulaire par P53Campthomycine : Activation de l’apoptose dépendante de P53
La localisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène spécifique de la mort cellulaire par apoptose médiée par P53
RESULTATSRESULTATS
P53 se localise à la mitochondrie uniquement lorsqu’il induit l’apoptose
WB des cellules ML-1
Expérience 2c :
Etude de la localisation de P53 après induction de l’apoptose médiée par P53 ou de l’arrêt du cycle cellulaire
Actinomycine D : induction de l’arrêt du cycle cellulaire
Camptothécine et Etoposide : Activation de l’apoptose médiée par P53
Il n’y a pas de P53 qui relocalise à la mitochondrie lors de l’activation de l’arrêt du cycle cellulaire par P53
RESULTATSRESULTATS
Accumulation spécifique de P53 à la mitochondrie lors de l’apoptose médiée par P53
Western-blot dans les cellules ML-1
Expérience 3a :
Etude de la cinétique de localisation de P53 à la mitochondrie et du relargage du cytochrome c
Accumulation de P53 à la mitochondrie dès 1h d’incubation en présence de Campthomécine
Relargage du cytochrome c après 4h
Activation des caspases après 4h
RESULTATSRESULTATS
Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie
Western-blot dans les cellules ML-1
Expérience 3b:
La localisation de P53 à la mitochondrie précède l’apoptose et n’est pas une conséquence de l’apoptose
Etude de la cinétique de la variation du potentiel de membrane de la mitochondrie
Rhodamine 123 : marqueur lipophile sonde du potentiel membranaire
Cytométrie en flux
Changement de potentiel de membrane après 4h dans les cellules apoptotiques
RESULTATSRESULTATS
Cinétique de l’accumulation de P53 à la mitochondrie
Expérience 4a:
Cytométrie en flux de mitochondries isolées des cellules ML-1
Cyto ox IV : marqueur protéique de la membrane interne de la mitochondrie
Avant apoptose : Cyto ox à l’intérieur de la mitochondrie donc non accessible à l’Anticorps
Après apoptose : degradation de la membrane externe de la mitochondrie, Cyto ox IV dans la membrane interne de la mitochondrie est accessible
On observe un profil identique des Anticorps anti-P53 et anti-Cyto ox IV
RESULTATSRESULTATS
Localisation de P53 à la mitochondrie
Expérience 4b:
Microscopie Electronique des particules d’or Anti-P53
Quantification des particules d’or Anti-P53 avant ou après traitement à la campthothécine à la mitochondrie
RESULTATSRESULTATS
Localisation de P53 à la mitochondrie
P53 à la mitochondrie se situe dans l’espace inter membranaire
Expérience 4c:
Etude de l’association de P53 à la mitochondrie
Mthsp70 (Anticorps monoclonal)=Grp75 (Anticorps polyclonale) : moteur de la transclocation des protéines à l’intérieur de la mitochondrie
Co-IP de P53 et mthsp70
Immunoprécipitation et WB dans des mitochondries de ML-1
La localisation principale de P53 à la mitochondrie est interne à la mitochondrie après translocation de la membrane par mtHSP70
RESULTATSRESULTATS
Localisation de P53 à la mitochondrie
Expérience 5b:
Système EB1 : une lignée cellulaire du colon humain stable
- Expression de P53 sous contrôle de la Métallothionine (ZnCl2)
- Homozygotes mutants pour la déletion de P53 pas d’apoptose médiée par P53
Avantages : - La réponse apoptotique sera uniquement due à l’expression de P53 et non à l’induction d’un stress ce qui évite les effets pléiotropes des dommages de l’ADN- Régulation précise de l’expression de P53- Les cellules EB1 sont un bon type cellulaire pour l’étude de l’apoptose médiée par P53
RESULTATSRESULTATS
Induction de l’apoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53
Expérience 5b:
Pas de P53 si non induction du système
Présence de P53 après son induction (8,5h) par ZnCl2
Présence de P53 à la mitochondrie à un niveau similaire au ML-1 caractérise l’induction de l’apoptose
Les cellules déficientes pour P53 pourraeint entrer en apoptose médiée par P53 après induction de l’expression de P53 et accumulation de P53 à la mitochondrie
RESULTATSRESULTATS
Induction de l’apoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53
Expérience 5c :
Surexpression de Bcl-xL et Bcl-2 anti apoptotique dans les cellules 32D de souris
Diminution de la mort cellulaire après surexpression de Bcl-xL
La famille Bcl-2 annule l’effet apoptotique de P53 à la mitochondrie
Pas de P53 si surexpression de Bcl-2 ou Bcl-xL contrairement au contrôle
Il y a un lien direct ou indirect entre P53 et les protéines de la famille de Bcl-2 au niveau de la mitochondrie
RESULTATSRESULTATS
Etude du rôle des régulateurs mitochondriaux de l’apoptose sur la localisation de P53 à la mitochondrie
Expérience 6 :RESULTATSRESULTATS
Induction de l’apoptose lors d’un d’un adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient
Expérience 6 : suiteRESULTATSRESULTATS
Induction de l’apoptose lors d’un d’un adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient
CONCLUSIONSCONCLUSIONS
•Une fraction de p53 se localise à la mitochondrie en cas d’apoptose médiée par p53.
•Phénomène reproductible dans un large spectre de cellules et de stress.
•Absence de cet évènement en cas d’apoptose p53-indépendante. •De même lors d’un arrêt du cycle en G1 médié par p53.
•Phénomène rapide (environ 1h) précédant les évènement mitochondriaux.
•Bcl-2 et Bcl-xL capables de bloquer localisation mitochondriale de p53 lors d’un stress induit et apoptose dépendante de p53.
•p53 capable d’induire l’apoptose en l’absence d’action transcriptionnelle (attention au contexte de surexpression)
•Ce serait un enhancer de la voie principale qui repose sur les activités de facteur de transcription de P53.
PERSPECTIVESPERSPECTIVES
•Ils posent en perspective quelles sont les protéines susceptibles d’interagir avec p53 et quels sont les régulateurs de l’apoptose qui sont activés en réponse.
•p53 agirait en monomère pour son action non-transcriptionnelle.
•Des études récentes ont montré que p53 peut directement induire la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe et permettre ainsi le relargage du cytochrome c et l’apoptose.
