Actualités diagnostiques des années 2010

en dermatomycologie

Dr Anne DEBOURGOGNELaboratoire de Parasitologie Mycologie

Journée Dermatophytes du 20 mai 2014

Technologies disponibles

Microscopie

Spectrométrie de masse

Biologie moléculaire

Les limites …

Examen direct

Culture

Identification

Sensibilité modérée

Sensibilité modéréeLente, pls semaines

ExpérienceSouches avec peu

ou pas de fructifications

Les attentes …

Délai

• Plus rapide que la culture

• Sur le prélèvement sans culture intermédiaire

Spécificité

• Espèces difficiles

• Culture sans fructifications

Typage

• Enquêtes épidémiologiques

• Phylogénie

• Nouvelles espèces

BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

Objectifs

• Détection d’un dermatophyte

• Identification genre ou espèce

Prélèvement primaire

• Identification

• Typage moléculaire

Culture

• PCR en point final

• Kit commercial

• PCR en duplex• pandermatophytes• Trichophyton rubrum

PCR en point final

PCR en point final

Révélation par électrophorèse en gel d’agarose avec un agent intercalant

Agent intercalant

Soit BET : toxique !

Nouvelles molécules : GelRed

Visualisation sous UV

T+ dermatophytes

T+ Trichophyton rubrum

T -

Exemples de patients

… conséquences sur la prise en charge

• Détection des dermatophytes (PCR)

• Identification par RFLP

PCR - RFLP

PCR suivie d’une digestion enzymatique par des enzymes de restriction

• Extraction automatique à partir ongles, peau, …

• Détection des dermatophytes par qPCR

• Identification Trichophyton rubrum / Trichophyton mentagrophytes par point de fusion

Extraction ADN

PCR SYBR Green

PCR en temps réel avec agent intercalant

PCR SYBR Green

Courbe de fusion � spécificité

• Détection dermatophytes par qPCR avec sonde TaqMan

PCR TaqMan

Sonde� Spécificité

Très large étude : 1437 prélèvements

Identification des cultures par hybridation in situ

Stratégie diagnostique

Stratégie diagnostique

• Etablir la position exacte de la PCR à partir des prélèvements primaires

• Identification moléculaire post culture si difficulté par techniques phénotypiques

� séquençage

Séquençage

Séquençage

SPECTROMÉTRIE DE MASSE

Principe

Spécificité

Délai

Création d’une base de données à partir de 50 souches de référence

(12 espèces de dermatophytes, 2 espèces de Neoscytalidium)

caractérisées par microscopie et biologie moléculaire)

Evaluation en routine sur 6 mois

• Pas d’effet de l’addition de cycloheximide dans les milieux de culture� Utilisation en pratique de routine sans repiquage

• Identification possible sur une colonie de petite taille, après seulement 3 à 6 jours de culture� Précocité par rapport à la microscopie

AUTRES TECHNIQUES

SP : échantillon

RP : réactifDP : détection

AP : absorption

Pré-traitement de l’échantillon dans une solution d’extraction pendant 5 min

RéactifConjugué marqué avec des particules d’or colloïdales

Anticorps spécifique fixé sur la bandeletteDirigé contre Trichophyton rubrum mais réaction avec les espèces des genre Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton

Durée 15 min

Perspectives intéressantes en routine …Perspectives intéressantes en routine …

• Examen direct � PCR ?• Identification microscopique � SM ?

Mais peu de plus values aujourd’hui …Mais peu de plus values aujourd’hui …

• Examen dermatologique et interrogatoire approfondi• Bonne qualité du prélèvement• Examen direct de qualité• Expérience en identification morphologique