N° d’ordre 01 ISAL 0023 Année 2001

THÈSE présentée DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES DE LYON pour obtenir LE GRADE DE DOCTEUR FORMATION DOCTORALE: BIOCHIMIE ÉCOLE DOCTORALE INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTÉ

par

Zury Ana DOMINGUEZ DELGADO Pharmacienne

MSc Ciencia de los Alimentos

ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L'ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE.

MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE

Soutenue publiquement le 25 juin 2001 devant la Commission d’Examen

Directeur de thèse: M. le Pr. M. LAGARDE et Mme. le Dr. A.F. PRIGENT

JURY

M. le Dr. P. CALDER (Rapporteur)

M. le Dr. Y. LEBRANCHU (Rapporteur)

Mme. le Dr. O. MACOVSCHI

M. le Pr. M. LAGARDE (Président) Mme. le Dr. A.F. PRIGENT

Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie de l’INSA de LYON (INSERM U352)

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REMERCIEMENTS

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Les recherches qui font l'objet de ce mémoire ont été réalisées dans le laboratoire de

Biochimie et Pharmacologie dddeee lll '''IIINNNSSSAAA dddeee LLLyyyooonnn, Unité de Recherche IIINNNSSSEEERRRMMM UUU333555222

Biochimie et Pharmacologie de la Médiation Lipidique.

DIRECTEUR: Professeur Michel Lagarde

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à Monsieur le Professeur Michel LAGARDE. Pour la confiance qu’il ma témoignée en m'accueillant dans son laboratoire pour développer ce travail de recherche. Directeur de thèse, ses suggestions et ses critiques scientifiques ont été déterminantes dans la formulation des hypothèses de travail et dans la concrétisation des objectifs spécifiques qui ont permis l’évolution satisfaisante de ma formation doctorale. à Madame le Docteur Annie-France PRIGENT, Directeur de recherche INSERM. Pour sa compétence et ses qualités scientifiques et humaines qu'elle m'a témoignées tout au long de ces années. Directeur de thèse, sa rigueur dans la mise en place des manipulations et sa capacité d’analyses des résultats expérimentaux ont permis la prise de décisions opportunes pour le développement de ce travail de recherche et l’aboutissement à des conclusions solides. à Madame le Docteur Olga MACOVSCHI, Maître de Conférence INSA. Pour ses qualités scientifiques et humaines. Pour son savoir faire dans la transmission d’information ce qui m'a permis de comprendre rapidement les techniques de biologie cellulaire. Ses explications m'ont permis d'acquérir une grande autonomie pour la réalisation et l’adaptation des protocoles expérimentaux à notre modèle expérimental in-vitro. Pour la solidarité humaine qu'elle m'a témoignée dès mon arrivée au laboratoire ainsi que pour son esprit joyeux porteur de bonheur. à Monsieur le Professeur Yvon LEBRANCHU Pour l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être rapporteur de cette thèse, me permettant ainsi de bénéficier de sa compétence et de ses connaissances. Pour l’intérêt qu’il a porté à ce sujet, témoigné par les critiques détaillées dans son rapport scientifique. Qu'il soit assuré de ma respectueuse considération et de ma sincère gratitude. to Doctor Philip CALDER For the honour he gave me by agreeing to review my work. For his interest in reading the manuscript and the comments in his report. For the opportunity of this exchange, which has enriched my scientific knowledge. Be assured of my grateful respect. à Monsieur le Docteur Georges Némoz et à Monsieur le Docteur Fabio Nero Pour l’intérêt qu’ils ont porté à l’évolution de ce travail, pour les discussions scientifiques qui ont été toujours profitables. al Consejo de Desarrollo Científico e Humanístico, CDCH de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de mi formación doctoral.

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Expreso mi agradecimiento A mi familia, a mi mami Elia Antonia quién supo apoyar mi partida del seno del hogar y aguardar con paciencia y confianza la culminación exitosa de esta empresa profesional que me mantuvo alejada del beneficio de sus caricias y amor maternal, to my parents Patricia and George for their love always present, for being side by side to us all the way through this experience, to Gary for his mind support, a mi hija, Rebecca Marie quién supo aceptar mi decisión de partir para acompañarme en esta aventura, a mi hermana Milagro por su solidaridad al asumir mis responsabilidades en Venezuela, a mi hermana Rubelia Maria por su entusiasmo frente a mi carrera profesional y el regalo de su presencia en este nuevo hogar que significa para mi la France, a mi hermano Hernán Guillermo por sus pensamientos que han sido presentes a lo largo de estos años, a mis sobrinos Katerine, K, por su madurez que me enorgullece, Nélson Anibal, Carmen Rubelia, Stella Maris y Maya Ixmucané por sus palabras siempre entusiastas, a mi cuñado Anibal Rubén. A Chantal quién me adoptó como hermana hace tantos años, gracias por todos esos momentos de felicidad que hemos pasado en el seno de la familia. Á mon cher cousin Bernard Santelli qui m’a aidé à retrouver mes racines corses. A todos mis seres queridos que me observan , me protegen e iluminan mi sendero con la luz de la eternidad. A la academia, a mis compañeros de la Cátedra de Patología General y Fisiopatología por el apoyo solidario a estos años de trabajo invertidos fuera del seno de la cátedra. En especial, al Profesor Marcelo Alfonso, Jefe de la Cátedra de Patología General y Fisiopatología y a la Profesora Itala Becemberg por su confianza y estímulo que supieron motivar y renovar mis energías en los momentos difíciles. A mis amigas y compañeros de la Sección de Lipidología, Venezuela, Carmencita, MariIsabel, Hilda, la señora Paula, por su presencia continua a través del correo electrónico. En especial al Profesor Virgilio Miguel Bosch Román, Director de la Sección de Lipidología, maestro y tutor quién me inició en el mundo de los lípidos y me abrió las puertas a una carrera de investigador y de docente. A mis amigas y compañeras de la UCV, Dayssi, Yury, Nathalie, Adelaida, Nilda, Himara, Magdalena, Olga en fin ese corazón que conforma las cátedras de Bioquimica y Fisiología por su presencia continua y sus dosis de buen humor en particular a tí, Lela. A mis amigos Jinny Emily, Yoly, Octavio, Raiza, Liu, Giovanni, MariIsabel «madrina», Pandemonium, Vivian, Felipe, Alfredo, Israel, Mireya, Sonia, Ale, Pata, Hernán, Edwin, por su continua presencia, À ma nouvelle famille française, puisque je suis arrivée avec ma fille. Bientôt, je partirai en laissant tout un groupe de gens qui sont devenus proches et chers à mon cœur. Il n’y a qu'un seul mot qui puisse traduire cette réalité: famille. Merci pour m’avoir permis de vivre cette expérience qui m’a fourni une énergie si forte qu'elle va rendre mon départ très difficile à vivre. Merci à Jacques et Bernard qui sont déjà partis, libérés des limites corporelles en s’envolant vers l’infini, ils restent pour toujours dans ma mémoire et dans mon cœur. À Papa Patrick qui a su prendre la place de grand frère en trouvant la solution de toutes ces petites choses qui ont rendu possible la naissance de mon nouveau chez moi, merci pour ta gentillesse, ta disponibilité inconditionnelle, merci à toi Caro pour ta solidarité et ton amitié et à ma petite Pauline pour la beauté de ton sourire musical. À Fabi, pour ton ouverture d'esprit, ton humour, ta complicité et ta touche artistique qui m'a laissée de beaux souvenirs et à Christophe pour ta joie de vivre. À Sam, pour ton innocence, ton regard d’enfant toujours avec un mot gentil et à Hélène, pour ta sensibilité si délicate qu'elle t’oblige à porter un vêtement de rigueur des fois très amusant, des fois trop pragmatique, ce qui m'a fait constater de nouveau que l’essentiel est invisible aux yeux. À Shaliha, mi amiga del alma, pour ton ouverture d'esprit qui nous touche de la lumière de tes grands yeux. À Nata, pour ta capacité d’observation qui reconnaît tout de suite l'essentiel, my shiny étoile qui clignote vers l’univers, puissante petite poupée qui connaît la valeur de l’amitié…, l’Atlantique est petit. Merci de m’avoir permis la joie de faire partie de ta famille, merci a Josette et Jean-Pierre, à Pepe ton grand père, à Fany, à Ivan, à Véro et à la petite et pétillante Marine, un deuxième noyaux de ta famille; à David, pour ta gentillesse et ta profondeur d’esprit. À Faten pour ton calme, ta profondeur et ta force intérieure, ce sont des qualités à imiter, à Momo et le

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petit coquin Mr. Karan. À Magdalena, la grande, pour ta sensibilité aux besoins des autres, pour ton sens de la protection, ta rigueur douce qui surveille la sécurité de nous tous, pour notre maison de retraite et nos tomates. À Magdalena, la chiquita, pour ton intérêt au bien être des autres, cette façon anonyme de donner des solutions, pour ta sensibilité artistique et ta complicité dans le Jazz. À Muriel, pour ta confiance, ta sérénité et ces moments de réflexion que nous avons partagés à Roland pour ton charisme et à ce petit garçon qui se prépare à sortir à la vie extérieur. À Patricia, Patou pour ta force, ta capacité de décision, ton esprit humanitaire, ta sensibilité et ton amour pour la danse, à François et le petit soleil, Alex. À Chantal, pour ton imaginaire, pour la fantaisie qui fait que le côté dur de la vie soit moins difficile à traverser. À Isabelle pour ta facilité de trouver la simplicité dans des choses et ton ingéniosité. À Evelyne, pour ta disposition à l’aide d'un congénère, pour les longues discussions philosophiques qui m'ont enrichie l’esprit, pour les échanges merveilleux dans la parole. À Cathy, pour ta grâce et ta bonne humeur que tu laisses partir par surprise. À Jean Lecerf, pour ta gentillesse et cette façon de rire qui remplissait le labo de bonheur. À Hélène, pour ta disposition à partager tes connaissances. À Véro, pour ta douceur et ton mélange de spontanéité et ta timidité qui touche comme une caresse, à Philippe, à Lucie et Antoine pour la joie des moments vécus. À Céline, pour ton enthousiasme et ton optimisme pour ta "main amie" sincère et à Laurent pour ton charme de gentleman qui exalte la féminité. À Lolo, pour ton sourire, le brillant de tes yeux et ton humanité qui déborde. À Corinne pour ta pensée vivace et agile, ta profonde solidarité, ton charme et cette façon élégante d’exprimer l’opposition «en revanche». À André, pour ce ton de passivité imperturbable même pas par un autre gémeaux. À Martine, pour ta candeur et ta franchise. À Caro, pour ton charme, tes yeux pétillants et ton rire mélodieux. À Laurent, pour ton calme, ta volonté d’aide, ta curiosité scientifique et ton regard au style Richard. À Olivier, mon Comte charmant, pour ta délicatesse et tes clins d’yeux si sympathiques. À Pierre, pour ton énergie aussi vivace qu'une chute d’eau, pour la musique partagée. À Daniel, por tu mano amiga y franca, por mantener vivo el son latinoamericano. À Marc, pour ces discussions éclatantes d’intellectualité. À Anne-Marie, pour ta joie de vivre qui dégage tant d’amour. À Alain pour ces moments de discussions scientifiques et philosophiques qui n’ont jamais manqué de bonne humeur. À Dominique, Michel Guichardant, Alain Savani, Abdel, Roger Santini, Christian Laugier, Jeef, Christian, Anne, Valérie, Eduard, Mario, Patricia, Clarisse, Ulrich, Elise, Lisiana, Audrey, Monique, Sandrine, Dennis, Martine Croset, Sophie, David, Marie Thèrese, Mathias, Alexia, Nadia, Samira, Hibba, Joanna, Amal, pour leur disponibilité . À ma petite fille «ma blonde», Lucie, à Marikensa, Sandrine merci pour les petites mot clés, Bertrand, Demian, Nicolás, Julien, Franki mon maître de "fonétic", Olivier, François Jr, François, Loïc «Pepite» pour cet entourage de jeunesse qui m'a fait tant de bien. À Fred, pour tous ces moments d’aventure. À Patricia, Delphine, Annie, Claude, Felipe, Pascale, Virginie, Vincent, Sandre, Sandrine, Jennifer, Demian, Alonis, Katia, Florence, Beatrix, pour ces rêves de danse faits réalité. À Louis, Gilles, Julien, Israel, Olivier, François, John, Stéphane, Didier mes amis guitaristes pour l’inspiration que chacun de vous a apporté à ma passion pour la guitare. À mes copains Jean-Claude, Jean Mimi, Jean-Luc, Pierre et Catherine, Hank, Jaime, pour les bons moments partagés. À Aurora, ma petite sœur, c’est très très difficile de mettre dans des mots toutes tes qualités, donc je vais seulement remercier la vie pour m’avoir permise cette rencontre, merci à Jeff pour ta présence « clef » à ma toute petite nièce, Ema et à t’adorable famille. J’aimerais bien finir avec deux phrases de quelqu’un pour qui j’ai une profonde admiration

El sentido de la ciencia no es más que el refinamiento del pensamiento diario

Imagination is more important than knowledge

AAAlllbbbeeerrrttt EEEiiinnnsssttteeeiiinnn

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AVANT-PROPOS

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Le travail présente dans ce mémoire a fait l'objet de publications parues et soumises.

Publications scientifiques:

DOMINGUEZ Z*., MERHI-SOUSSI F, MACOVSCHY O, NEMOZ G, LAGARDE, M,

PRIGENT AF. Endothelial cell prostacyclin synthesis induced by lymphocytes is

independent of the membrane fatty acid composition of both cell types and of E-selectin,

VCAM-1 or ICAM-1-mediated adhesion. British Journal of Haematology 2001, vol 113,

n°2, p 521-532.

MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z*, MACOVSCHY O, DUBOIS M, SAVANI A,

LAGARDE, M., PRIGENT AF. Human lymphocytes stimulate prostacyclin synthesis in

human umbilical vein endothelial cells. Invollvement of endothelial cPLA2. Journal of

leukocyte Biology, 2000, vol 68, p 881-889.

MERHI-SOUSSI F†, DOMINGUEZ Z*†, MACOVSCHY O, DUBOIS M, NEMOZ G,

LAGARDE, M., PRIGENT AF. Mechanism involved in the stimulation of prostacyclin

synthesis by human lymphocytes in human umbilical vein endothelial cells, en

préparation. †M-S F et DZ sont co- auters dans ce papier.

* Cátedra de Patología General y Fisiopatología, Escuela de Medicina Luis Razzetti

Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria, Caracas,

Venezuela.

Communication oral:

DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, SOUSSI F, LAGARDE M, PRIGENT AF. Increased

PGI2 output in HUVEC-Lymphocyte coculture is partially dependent on adhesion

molecules. 1er Congrès annuel de la Société Française d'Athérosclérose. Arcachon,

France, juin, 1999.

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Communications affichées:

DOMINGUEZ Z, SOUSSI F, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF. Human

lymphocyte-induced endothelial cell prostacyclin output is independent of ELAM-1,

VCAM-1 or ICAM-1 pathways and membrane fatyy acid composition. 4th Congress of the

International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids (ISSFAL), Tsukuba, Japon,

juin, 2000.

MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF.

Human lymphocytes stimulate prostacyclin production via activation of cytosolic

phospholipase A2 in human umbilical vein endothelial cells. 11 th International Conférence

of advances in Prostaglandin and Leukotriene Research, Florence, Italy, juin, 2000.

DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, SOUSSI F, LAGARDE M, PRIGENT AF. Increased

PGI2 output in HUVEC-Lymphocyte coculture is partially dependent on adhesion

molecules. 1er Congrès annuel de la Société Française d'Athérosclérose. Arcachon,

France, juin, 1999.

MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF.

Stimulation of prostacyclin syntheses in human umbilical vein endothelial cells by human

lymphocytes. 3th Congress of the International Society for the Study of Fatty Acids and

Lipids (ISSFAL), Lyon, France, juin, 1998.

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SOMMAIRE

________________________________________________________________

TABLE DES ILLUSTRATIONS..................................................................... 18

ABREVIATIONS .............................................................................................. 20

INTRODUCTION............................................................................................. 22

PARTIE I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES............................................. 28

1. L’ENDOTHÉLIUM-UNE BARRIÈRE MÉTABOLIQUE ...................... 29 1.1 LES CELLULES ENDOTHÉLIALES...................................................................... 29

1.1.1.ORIGINE................................................................................................................. 29

1.1.2 ANATOMIE ............................................................................................................. 31

1.1.3 FONCTION.............................................................................................................. 32

1.1.4 LE CIRCUIT SANGUIN............................................................................................. 33

1.2 PROPRIÉTÉS ANTITHROMBOTIQUES DE L’ENDOTHÉLIUM.................... 35

1.2.1 FACTEURS ANTIPLAQUETTAIRES .......................................................................... 35

1.2.1.1 La prostacycline............................................................................................... 35

1.2.1.2 Le monoxyde d’azote ....................................................................................... 36

1.2.1.3 Les exonucléotidases ....................................................................................... 37

1.2.2 LES FACTEURS ANTICOAGULANTS ........................................................................ 37

1.2.2.1. La thrombomoduline ...................................................................................... 37

1.2.2.2 Les héparanes sulfates..................................................................................... 38

1.2.3 FACTEURS FIBRINOLYTIQUES ............................................................................... 38

1.2.3.1 Activateur tissulaire du plasminogène............................................................ 38

1.3 PROPRIÉTÉS PROCOAGULANTES DE L’ENDOTHÉLIUM........................... 39

1.3.1 FACTEURS PROCOAGULANTS ................................................................................ 39

1.3.1.1 Le Facteur von Willebrand ............................................................................. 39

1.3.1.2 Facteur V et récepteurs des facteurs plasmatiques de coagulation............... 40

1.3.1.3 Le facteur tissulaire ......................................................................................... 40

1.4 LES INTERACTIONS CELLULAIRES .................................................................. 40

2. LES EICOSANOÏDES D’ORIGINE ENDOTHÉLIALE..........................42 2.1 HÉTÉROGÉNÉITÉ DE L’ENDOTHÉLIUM ......................................................... 42

2.2 ACIDES GRAS ESSENTIELS .................................................................................. 43

12

2.3. TYPE D’EICOSANOÏDES........................................................................................ 44

2.3.1. LES PROSTANOÏDES .............................................................................................. 44

2.3.1.1 Actions générales des prostanoïdes................................................................. 46

2.3.2 LES LEUCOTRIÈNES .............................................................................................. 47

2.3.3 VOIE DU CYTOCHROME P450................................................................................ 47

2.4 EFFETS BIOLOGIQUES .......................................................................................... 48

2.4.1 LES PROSTANOÏDES ET LA RÉPONSE DÉPENDANT DU FLUX.................................. 48

2.4.2 EICOSANOÏDES ET LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE ............................................... 48

3. BIOSYNTHÈSE DES PROSTANOÏDES: LES PROSTACYCLINES....50 3.1.DESCRIPTION DES LIPIDES MEMBRANAIRES............................................... 50

3.1.1 LES PHOSPHOLIPIDES ............................................................................................ 50

3.1.2 COMPOSITION DES PHOSPHOLIPIDES DANS LA CELLULE ENDOTHÉLIALE.......... 50

3.2 MÉCANISME DE LIBÉRATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE................ 51

3.2.1 LES PHOSPHOLIPASES A2 ...................................................................................... 51

3.2.1.1 Les phospholipase A2 sécrétées ....................................................................... 51

3.2.1.2 Les Phospholipase A2 cytosoliques ................................................................. 53

3.2.1.2.1 Les iPLA2 calcium-indépendantes ............................................................... 53

3.2.1.2.2 La cPLA2-calcium-dépendante .................................................................... 54

3.2.2 LES PHOSPHOLIPASE C ......................................................................................... 57

3.2.2.1 Les PLC spécifiques des PI ............................................................................. 57

3.2.2.2 Les PLC spécifiques des PC ............................................................................ 57

3.2.3 LES PHOSPHOLIPASES D........................................................................................ 58

3.3 OXYGÉNATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE: SYNTHÈSE DE

PROSTACYCLINE ................................................................................................. 59

3.3.1 LES PROSTAGLANDINES ENDOPEROXYDE H SYNTHASES: DEUX ISOFORMES...... 60

3.3.1.1 Localisation et structure.................................................................................. 61

3.3.1.2 Rôle des deux isoformes .................................................................................. 63

3.2 LA PROSTACYCLINE SYNTHASE ....................................................................... 64

3.3.3 EFFETS DE L’ASPIRINE SUR LA SYNTHESE DES EICOSANOÏDES ............................ 64

3.4 PERSPECTIVES......................................................................................................... 65

4. LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE...............................66 4.1 LE SYSTÈME DE DÉFENSE.................................................................................... 67

4.1.1 IMMUNITE INNÉE................................................................................................... 67

13

4.1.2 IMMUNITE SPÉCIFIQUE ......................................................................................... 67

4.1.3 LA TOLÉRANCE IMMUNE....................................................................................... 68

4.1.4 AUTO-IMMUNITÉ ................................................................................................... 68

4.2 RÔLE FONCTIONNEL DES SOUS-TYPES DE LYMPHOCYTES.................... 68

4.2.1 LE LYMPHOCYTE T ............................................................................................... 69

4.2.2 LES LYMPHOCYTES B............................................................................................ 70

4.2.3 LYMPHOCYTES LARGES GRANULEUX ................................................................... 70

4.3 DOMICILIATION DES LYMPHOCYTES............................................................. 71

5. MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES................................. 73 5.1 L’ADHÉSION CELLULAIRE .................................................................................. 73

5.2 LES LIAISONS INTERCELLULAIRES DU CIRCUIT SANGUIN..................... 73

5.2.1 MOLÉCULES DES JONCTIONS INTERCELLULAIRES............................................... 73

5.2.1.2 Les jonctions serrées et adhérentes................................................................. 74

5.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALE.................................................. 75

5.3.1 SÉLECTINES ........................................................................................................... 76

5.3.1.1 Signalisation par les sélectines........................................................................ 78

5.3.2 LES INTÉGRINES.................................................................................................... 80

5.3.2.1 Signalisation via les Intégrines ....................................................................... 83

5.3.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION CELLULAIRE ............................................................... 85

5.3.3.1 Molécule d’adhésion intercellulaire-1, ICAM-1 ............................................ 85

5.3.3.1.1 Signalisation via ICAM-1............................................................................. 86

5.3.3.2 Molécule d’adhésion intercellulaire-2, ICAM-2 ............................................ 86

5.3.3.3 Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire, VCAM-1 .................................... 86

5.3.3.4 Molécule d’adhésion cellulaire plaquette-cellule endothéliale, PECAM-1 .. 87

5.4 INTERACTION LYMPHOCYTE-CELLULE ENDOTHÉLIALE ...................... 88

6. ACIDES GRAS ω−3 ET LES MALADIES CARDIO-VASCULAIRES..89

6.1 SOURCES ALIMENTAIRES DES ACIDES GRAS ω−3 ....................................... 89

6.2 LA RÉVOLUTION INDUSTRIELLE ET LES MALADIES

CARDIOVASCULAIRES .................................................................................... 89

6.3 L’ATHÉROSCLEROSE UNE DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES...... 90

6.3.1 ATHEROGENÈSE .................................................................................................... 90

6.3.1.1 L’évolution de la plaque athéromateuse......................................................... 91

14

6.4 LES ACIDES GRAS ω−3 ET L’ATHÉROSCLEROSE ......................................... 93

6.4.1 EFFETS ANTITHROMBOTIQUES DES ACIDES GRAS ω−3 ....................................... 93

6.4.2 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA SYNTHÈSE DE PROTÉINES ....................... 94

6.4.3 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA RÉPONSE IMMUNE................................... 96

6.5 PERSPECTIVES .......................................................................................................... 97

PARTIE II. MATÉRIELS ET MÉTHODES ..................................................98

1. MATÉRIELS ...............................................................................................99

1.1 MATÉRIEL POUR LA CULTURE CELLULAIRE .............................................. 99

1.2 ANALYSES LIPIDIQUES ......................................................................................... 99

1.3 MATÉRIELS POUR IMMUNOCHIMIE ................................................................ 99

1.4 MATÉRIELS POUR IMMUNOEMPREINTE...................................................... 100

1.5 ANALYSES DE LA PROSTACYCLINE ............................................................... 100

1.6 REACTIFS ET SOLVANTS DIVERS.................................................................... 100

1.7 PRODUIT RADIOACTIF........................................................................................ 100

1.8 APPAREILS .............................................................................................................. 101

2. MÉTHODES ..............................................................................................101

2.1 CULTURE PRIMAIRE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES HUMAINES .. 101

2.1.1 REMISE EN CULTURE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES ..................................... 102

2.1.2 CARACTERISATION DU PHENOTYPE ENDOTHÉLIAL........................................... 102

2.2 PRÉPARATION DES LEUCOCYTES ET DES PLAQUETTES HUMAINES 103

2.2.1. PRÉPARATION DES CELLULES MONONUCLÉÉES................................................ 103

2.2.2 PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE............................. 104

2.2.3 PRÉPARATION DES PLAQUETTES SANGUINES ..................................................... 104

2.2.4 PRÉPARATION DES CELLULES POLYMORPHONUCLÉAIRES................................ 105

2.2.5 VIABILITÉ DES CELLULES ................................................................................... 105

2.3 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC ..................................................... 106

2.3.1 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES CONDITIONS DE ROTATION

CONTINUE............................................................................................................ 106

2.4 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE DES LYMPHOCYTES ADHÉRENTS

A L’ENDOTHÉLIUM .................................................................................................... 106

2.5 ÉTUDE AVEC DIFFERENTS INHIBITEURS ..................................................... 106

2.5.1 ÉTUDE D’INHIBITION AVEC LA SURAMINE, LA GÉNISTÉINE, LA TOXINE

PERTUSSIQUE LE PP1 ET LE PD98056............................................................... 107

15

2.6 ÉTUDE DE L’ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM...... 107

2.7 ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3....................... 107

2.7.1 PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE ENRICHI EN ACIDES GRAS ................... 108

2.7.2. ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3 ................................... 108

2.8 ANALYSES BIOCHIMIQUES................................................................................ 108

2.8.1 DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE DE LA 6-OXO-PGF1α ..................................... 108

2.8.2 ANALYSES DE LA MAPK ENDOTHÉLIALE PAR IMMUNOEMPREINTE ................ 110

2.8.2.1 Dosage des protéines selon la méthode de Bradford.................................... 110

2.8.2.2 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS................... 111

2.8.2.3 Transfert semi-sec.......................................................................................... 111

2.8.2.4 Immunodetection ........................................................................................... 111

2.8.3 ANALYSES LIPIDIQUES ........................................................................................ 111

2.8.3.1 Extraction lipidique ....................................................................................... 112

2.8.3.2 Séparation des différentes classes de lipides ................................................ 112

2.8.3.3 Analyse des acides gras des phospholipides totaux...................................... 112

2.9 ANALYSES FONCTIONNELLES ......................................................................... 113

2.9.1 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES............................... 113

2.9.2 DOSAGE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES ... 114

2.10 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................... 114

PARTIE III. RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ET DISCUSSION ....... 115

CHAPITRE 1. LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE

ENDOTHÉLIALE EST INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES

HUMAINS...............................................................................................116 1.1 CARACTÉRISATION DES CELLULES ENDOTHÉLIALES........................... 116

1.2 AUGMENTATION DE LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE

ENDOTHÉLIALE PAR LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE

.................................................................................................................................... 118

1.2.1 ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE PAR LES

LYMPHOCYTES .................................................................................................... 118

1.2.2- SPÉCIFICITE DE LA RÉPONSE ENDOTHÉLIALE AU CONTACT DE

LYMPHOCYTES………………………………………………………………… 119

1.2.2.1 Le contact lymphocyte-HUVEC augmente de façon spécifique la production

16

de prostyacycline endothéliale................................................................................... 119

1.2.2.2 Caractérisation des lymphocytes adhérents à l’endothélium après la

coincubation............................................................................................................... 121

1.3 ÉTUDE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION

ENDOTHÉLIALE - ECAMs- ............................................................................ 122

1.3.1 EFFET DU CONTACT LYMPHOCYTE-HUVEC SUR L’EXPRESSION DES ECAMS 122

1.4 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES................ 124

1.4.1 ÉTUDE DU BLOCAGE DE LA SÉLECTINE-E, VCAM-1 ET ICAM-1.................... 124

1.4.1.1 Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes .................... 124

1.4.1.2 Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline endothéliale

induite par les lymphocytes ....................................................................................... 126

1.5 EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES

CONDITIONS DE ROTATION CONTINUE ...................................................... 126

1.6 CONCLUSIONS ET DISCUSSION ........................................................................ 128

CHAPITRE 2. DÉTERMINATION DES VOIES DE SIGNALISATION

IMPLIQUÉES DANS LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE

INDUITE PAR LE CONTACT LYMPHOCYTES-CELLULES

ENDOTHÉLIALES .............................................................................. 134 2.1 ÉTUDE DE L’IMPLICATION D’UNE VOIE PROTÉINE G-TYROSINE-

KINASE-MAPK DANS LA SYNTHÈSE DE PGI2 ENDOTHÉLIALE INDUITE

PAR LE CONTACT DES LYMPHOCYTES ....................................................... 134

2.1.1 EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RÉCEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES

PROTÉINES Gi...................................................................................................... 135

2.1.2 EFFET DE L’INHIBITION DES PROTÉINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE

KINASES DE LA FAMILLE Src............................................................................... 136

2.1.3 EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE ET MISE EN ÉVIDENCE DE LA

PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE.................... 137

2.2 CONCLUSIONS ET DISCUSSION ........................................................................ 139

CHAPITRE 3. LES ACIDES GRAS ω−3 ET LA FONCTION

CELLULAIRE ...................................................................................... 143

17

3.1 INCORPORATION DES ACIDES GRAS ω−3 DANS LES PHOSPHOLIPIDES

CELLULAIRES ....................................................................................................... 144

3.2 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHÉSION

DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM ........................................................... 147

3.3 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA

PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE INDUITE PAR LES

LYMPHOCYTES............................................................................................................ 148

3.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS ........................................................................ 149

PARTIE IV. CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES............ 153

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES...................................................... 160

RÉSUME EN ANGLAIS ................................................................................ 199

18

TABLE DES ILLUSTRATIONS

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

FIGURE 1: ORIGINE DES CELLULES ENDOTHELIALES.................................................................................... 30

FIGURE 2: MICROPHOTOGRAPHIES EN CONTRASTE DE PHASE QUI MONTRENT LA REORGANISATION DES CELLULES EXPOSEES AU FLUX .................................................... 31

FIGURE 3: LA CASCADE DE LA COAGULATION SANGUIN .............................................................................. 34

FIGURE 4: ADHESION DES LEUCOCYTES A LA PAROI VASCULAIRE ......................................................... 41

FIGURE 5: LES TROIS SERIES DE PROSTANOÏDES ET LEUR ORIGINE BIOSYNTHETIQUE................... 46

FIGURE 6: VOIES DE LIBERATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE PAR LES DIFFERENTES PHOSPHOLIPASES ............................................................................................................................ 52

FIGURE 7: PROSTANOÏDES SYNTHETISES A PARTIR DE L'ACIDE ARACHIDONIQUE........................... 60

FIGURE 8: RECIRCULATION DES LYMPHOCYTES............................................................................................. 66

FIGURE 9: MIGRATION A TRAVERS L'ENDOTHELIUM .................................................................................... 72

FIGURE 10: ARCHITECTURE DES PROTEINES AUX JONCTIONS CELLULE-CELLULE.......................... 75

FIGURE 11: STRUCTURE DES TROIS SELECTINES ............................................................................................. 77

FIGURE 12: MOLECULES D'ADHESION ENDOTHELIALES............................................................................... 82

FIGURE 13: FONCTION DES INTEGRINES.............................................................................................................. 84

FIGURE 14: EFFET DE LA REVOLUTION INDUSTRIELLE SUR L'APPORT CALORIQUE………………..90

FIGURE 15: DISTRIBUTION NON-ALEATOIRE DES LESIONS ATHEROMATEUSES.................................. 92

FIGURE 16: REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU DOSAGE DE LA 6-OXO-PGF1α. ............................... 109

FIGURE 17: CELLULES ENDOTHELIALES DE VEINE DE CORDON OMBILICAL A ENVIRON 75% DE CONFLUENCE................................................................................................................................... 117

FIGURE 18: CELLULES ENDOTHELIALES DE VEINE DE CORDON OMBILICAL MARQUEES AVEC UN ANTICORPS ANTI-FACTEUR VON WILLEBRAND COUPLE A LA FLUORESCEÏNE..... 117

FIGURE 19: CINETIQUE DE PRODUCTION DE LA PROSTACYCLINE DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURE DES CELLULES ENDOTHELIALES COINCUBEES AVEC LES LYMPHOCYTES............................................................................................................................................................ ..119

FIGURE 20: EFFET SPECIFIQUE DES LYMPHOCYTES SUR LA SYNTHESE DE PROSTACYCLINE ENDOTHELIALE .............................................................................................................................. 120

FIGURE 21: LYMPHOCYTES ADHERENTS AUX HUVEC .................................................................................. 121

FIGURE 22: EFFET DU BLOCAGE DES ECAMs SUR L’ADHESION DES LYMPHOCYTES AUX HUVEC............................................................................................................................................................... 125

19

FIGURE 23: EFFET DU BLOCAGE DES ECAMS SUR LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHELIALE INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES .......................................................... 126

FIGURE 24: EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC EN CONDITION DE ROTATION CONTINUE SUR LA PRODUCTION DE PGI2 INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES ......... 127

FIGURE 25: EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RECEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES PROTEINES Gi .......................................................................................................................................................... 136

FIGURE 26: EFFET DE L’INHIBITION DES PROTEINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE KINASES DE LA FAMILLE Src...................................................................................................... 137

FIGURE 27: EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE............................................................. 138

FIGURE 28: MISE EN EVIDENCE DE LA PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE .................................................................................................................... 139

FIGURE 29: EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHESION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHELIUM........................................................................................ 147

FIGURE 30: EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA PRODUCTION DE PGI2.... 148

TABLEAU I: EFFET DE LA COINCUBATION AVEC DES LYMPHOCYTES OU DE LA STIMULATION AVEC DU LPS DURANT 4 H SUR L’EXPRESSION DES ECAMS DES CELLULES ENDOTHELIALES............................................................................................................................ 123

TABLEAU II: COMPOSITION EN ACIDES GRAS DES PHOSPHOLIPIDES TOTAUX (% MOLAIRE) DANS LES HUVEC APRES 3 j DE CULTURE DANS UN MILIEU ENRICHI EN ACIDES GRAS….............................................................................................................................................................. 145

TABLEAU III: COMPOSITION EN ACIDES GRAS DES PHOSPHOLIPIDES TOTAUX (% MOLAIRE) DANS DES LYMPHOCYTES APRES 3 j DE CULTURE DANS UN MILIEU ENRICHI EN ACIDES GRAS ................................................................................................................................................... 146

20

ABRÉVIATIONS _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

AA acide 5,8,11,14-eicosatétraénoïque ou acide arachidonique

ADN acide désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

AGE acides gras essentiels

ARN acide ribonucléique

ARNm ARN messager

BHT butyl-hydroxy-toluène

BSA sérum albumine bovine

Ca2+ calcium

CCM chromatographie couche mince

DAG diacylglycérol

DHA acide docosahexaénoïque

EDTA acide éthylènediamine tétraacétique

ECAMs molécules d’adhésion endothéliales

EGF epidermal growth factor

EGTA acide éthylèneglycol tétraacétique

EPA acide eicosapentaénoïque

HEPES acide hydroxy-2-éthyl-4-pipérazinyl-1,2-éthane-sulfonique

HUVEC human umbilical vein endothelial cells

IL interleukine

J jour

IP3 inositol trisphosphate

MAPK MAP-kinase

NO monoxyde d’azote

PA acide phosphatidique

L lymphocyte du sang périphérique

LPS lipopolysacharide

PBMC cellules mononucléées du sang périphérique

PBS phosphate buffer saline

PC phosphatidylcholine

PE phosphatidyléthanolamine

PG prostaglandine

PGE2 prostaglandine E2

PGHS prostaglandine endoperoxyde H synthase

PGI2 prostacycline I2

PGI3 prostacycline I3

PGIS prostacycline synthase

21

PHA phytohémaglutinine

PI phosphatidyl inositol

PKC protéine kinase C

PL phospholipide

PLA2 phospholipase A2

PLC phospholipase C

PLD phospholipase D

PMN cellules polymorphonucléaires

PRP plasma riche en plaquettes

PS phosphatidyl sérine

PTK protéine tyrosine kinase

PTX toxine pertussis

TNF tumor necrosis factor

TRIS tris (hydroxyméthyl)-amino-méthane

22

IIINNNTTTRRROOODDDUUUCCCTTTIIIOOONNN

23

La recherche fondamentale sur l’endothélium vasculaire est aussi importante pour

la médecine que pour la pharmacologie. Elle apporte des éléments essentiels pour la

compréhension de la physiologie ainsi que des mécanismes physiopathologiques mis en

route lors d’une altération de la fonction endothéliale. Elle pourrait déboucher sur des

innovations stratégiques thérapeutiques ou la mise au point de molécules plus efficaces

pour le rétablissement de la fonction vasculaire.

L’endothélium artériel des gros et moyens vaisseaux est le site privilégié de

localisation des lésions athéromateuses. La présence de lymphocytes T dans les lésions

athéromateuses naissantes a été mise en évidence par immunohistochimie, chez l’Homme

(Emeson et Robertson, 1988) et dans des modèles expérimentaux comme le lapin et le rat

(Stemme et Hansson, 1994., Haraoka et al., 1995). Au sein de la lésion, les lymphocytes

représentent plus de 20 % des cellules mononucléées (Yokota et Hansson, 1995). Dans

certains modèles expérimentaux le pourcentage de lymphocytes peut atteindre 60% durant

la phase initiale de formation de la lésion. Le rôle fonctionnel des lymphocytes T dans la

pathogénie de l’athérosclérose est ambigu. Des effets inhibiteurs (Hansson et al., 1991)

ainsi que stimulateurs (Emeson et al., 1996) de la formation de la lésion athéromateuse ont

été suggérés par des résultats obtenus avec des modèles expérimentaux in vivo. Il semble

que la réponse, positive ou négative, des lymphocytes T sur l’évolution du processus

athéromateux soit dépendante du type de lésion initiale (Hansson, 1997).

Les lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de prostacycline au

contact de l’endothélium sain, in vitro; cet effet stimulateur n’est pas dépendant de la

préactivation des lymphocytes (Merhi-Soussi et al., 2000). La prostacycline (PGI2) est le

prostanoïde endothélial majoritaire des macrovaisseaux. A ces effets vasodilatateurs et

anti-agrégeants plaquettaires classiques, s’ajoute l’effet inhibiteur de l’activation et de

l’adhésion des leucocytes (Vane et Botting, 1995), l’inhibition de la prolifération des

cellules musculaires lisses (Nakaki et al., 1991), la diminution de la production d’IL-6

(Della-Bella et al., 1997) et la réduction de l’accumulation des esters de cholestérol dans

les cellules vasculaires (Pomerantz et al., 1995).

La prostacycline I2 (PGI2) est synthétisée à partir de l’acide arachidonique (AA) par

l’action de la prostaglandine endoperoxyde synthase (PGHS) et de la prostacycline

synthase (PGIS). La PGHS catalyse la formation de PGH2 à partir de l’AA et la PGIS

transforme la PGH2 en PGI2. La production de ce prostanoïde dépend de la disponibilité en

AA libéré à partir des phospholipides membranaires par l’action directe des

phospholipases A2 (PLA2) ou de façon indirecte par les phospholipase C et D. Parmi les

24

phospholipases, la PLA2 cytosolique (cPLA2) joue un rôle essentiel dans la formation des

prostanoïdes. Elle est considérée comme le facteur limitant de la libération de l’AA (Sa et

al., 1995). Hormis les lymphocytes B et T matures, la cPLA2 est une enzyme largement

distribuée dans les tissus humains incluant les thymocytes et les cellules B immatures

(Gilbert et al., 1996). La synthèse de PGI2 dépend aussi des actions successives de la

PGHS et de la PGIS. Deux isoformes de PGHS on été décrites dans les cellules

endothéliales de veine de cordon ombilical, (human umbilical vein endothelial cells:

HUVEC), l’isoforme–1, forme constitutive responsable de la production physiologique des

prostaglandines et l’isoforme-2, forme inductible régulée par des mitogènes et cytokines

pro-inflamatoires (Lee et al., 1992; Jones et al., 1993). L’expression de la PGHS-2 étant

induite par des médiateurs inflammatoires dans les cellules vasculaires et immunitaires et

étant régulée par les glucocorticoïdes, cette isoforme pourrait être responsable de la

formation des prostanoïdes dans des conditions physiopathologiques (Masferrer et al.,

1994; Seibert et al., 1994). La PGHS présente une spécificité de substrat et requiert trois

doubles liaisons en positions 8, 11, 14 des acides gras à 20 atomes de carbones. Les

substrats correspondants sont l’acide dihomo-γ-linolénique (20:3 ω−6), l’AA (20:4 ω−6) et

l’acide eicosapentaénoïque (20:5 ω−3). Ces trois acides gras sont les précurseurs respectifs

des séries 1, 2, et 3 des prostanoïdes. Cependant, l’activité de la PGH synthase peut être

inhibée par les acides gras ω−3. La production de PGI2 in vitro ainsi que l’expression des

ARNm de la PGHS-1 est diminuée après enrichissement des cellules endothéliales en

acides eicosapentaénoïque et docosahexaénoïque (Achard et al., 1997). Bien que la

production de PGI2 soit diminuée dans plusieurs modèles de cellules isolées (Spector et al.,

1983; Hadjiagapiou et Spector, 1987; Achard et al., 1997; Yerram et al., 1989), les études

conduites in vivo ne montrent pas de modification (von Schacky et al., 1985) ou même une

augmentation de la production de PGI2 (De Caterina et al.,1990) après une

supplémentation du régime alimentaire en acides gras ω−3 à longue chaîne. Ces acides

gras sont considérés comme protecteurs du système cardiovasculaire.

Il avait été montré que la coincubation de monocytes humains isolés à partir de

sang veineux périphérique avec des HUVEC augmentent la production de PGI2

endothéliale. Le même effet inducteur, avait été observé dans des cellules endothéliales

vasculaires cérébrales cocultivées avec des lymphocytes autologues isolés à partir de

ganglions lymphatiques chez le rat (Hakkert et al., 1992; Mc Carron, 1992). Cependant

aucune étude concernant l’influence des lymphocytes humains sur la synthèse de PGI2 par

25

les HUVEC n’avait été publiée. Nous avons montré pour la première fois que les

lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de PGI2 par les HUVEC (Merhi-

Soussi et al., 2000). Cette augmentation observée dans des conditions de culture statique

est fonction du nombre de lymphocytes ajoutés aux HUVEC et dépendante du contact

direct entre les deux types cellulaires et de l’activité de la cPLA2.

Le premier objectif de ce travail a été d’étudier la cinétique de la production de

PGI2 endothéliale induite par les lymphocytes ainsi que la spécificité des lymphocytes sur

cette réponse. Pour ce faire, nous avons coincubé les deux types cellulaires et mesuré la

PGI2 dans les surnageants de culture collectés entre 20 min et 20 h. Pour vérifier

l’hypothèse de la spécificité du contact lymphocytes-HUVEC sur la réponse endothéliale

nous avons coincubé les HUVEC avec d’autres types cellulaires tels que les

polymorphonucléaires, les plaquettes ou avec des matériaux non biologiques comme les

billes de latex. Dans un second temps, nous avons entrepris l’étude des mécanismes

responsables de l’augmentation de la synthèse de PGI2 par les cellules endothéliales lors de

leur interaction avec les lymphocytes. La possibilité de la participation des molécules

d’adhésion endothéliale, (ECAMs), dans l’augmentation de la production de PGI2 induite

par le contact des lymphocytes a été étudiée en coincubant les lymphocytes avec des

HUVEC préalablement traitées par des anticorps anti-ECAMs. Nous avons également

vérifié l’effet de la dynamique des fluides dans cette réponse étant donné que la synthèse

de PGI2 est aussi induite par les forces de cisaillements (Grabowski et al., 1985; Doroudi et

al., 2000). Pour ce faire, nous avons coincubé les deux types cellulaires sous rotation

continue pour mimer les forces de cisaillements. L’ensemble de ces résultats constitue le

chapitre 1 de la Partie III: Résultats Expérimentaux.

Dans une deuxième étape de ce travail expérimental (chapitre 2) nous avons

cherché à identifier la voie de signalisation en amont de l’activation de la cPLA2 qui est à

l’origine de la libération de l’AA dans notre système de coincubation (Merhi-Soussi et al.,

2000). L’implication des protéines G et des kinases telles que la kinase régulée par des

signaux extracellulaires, mitogen-activated protein kinases (MAPK) et la protéine kinase C

dans l’activation de la cPLA2 a été démontrée (Leslie, 1997; Hirabayashi et Shimizu,

2000). Certains ligands de récepteurs couplés à la protéine Gi stimulent les MAPK et cette

activation est dépendante des tyrosine kinases de la famille Src (English et al., 1999; Wan

et al., 1996). Nous avons étudié la possibilité d’une activation de la p42/p44MAPK

endothéliale par une voie de signalisation impliquant les protéines Gi et les tyrosine

kinases de la famille Src. Nous avons constaté à l’aide d’inhibiteurs le caractère essentiel

26

des protéines tyrosine kinases du type Src dans la réponse endothéliale au contact de

lymphocytes et nous avons démontré que l’inhibition de la phosphorylation de

p42/p44MAPK par un inhibiteur spécifique de MAPK Kinase bloque la réponse

endothéliale induite par les lymphocytes. Enfin, nous avons mis en évidence une

phosphorylation de p42/p44MAPK dans les HUVEC après la coincubation avec des

lymphocytes.

Dans la dernière partie du travail (chapitre 3) nous avons étudié l’effet de

l’enrichissement des cellules en EPA ou DHA sur l’adhésion des lymphocytes aux

HUVEC et sur la production de PGI2 endothéliale lors de la coincubation lymphocytes-

HUVEC. Nous avons contrôlé l’enrichissement des cellules par l’analyse de la

composition en acides gras des phospholipides membranaires.

La première partie de ce mémoire, consacrée aux Rappels Bibliographiques

comporte six paragraphes. Le premier rapporte les données concernant l’endothélium et

son rôle de barrière métabolique; dans un deuxième paragraphe les eicosanoïdes d’origine

endothéliale sont détaillés; le troisième résume la biosynthèse des prostanoïdes et en

particulier celle de la prostacycline. Puis un quatrième paragraphe est dédié aux

lymphocytes du sang périphérique, leur rôle dans la fonction immune et leur domiciliation.

Dans le cinquième paragraphe nous décrivons les molécules d’adhésion endothéliales et

leur participation à la signalisation cellulaire. Enfin, le dernier paragraphe est consacré aux

acides gras ω−3, considérant leurs effets sur la fonction cellulaire et leur relation avec les

maladies cardiovasculares, en particulier l’athérosclérose.

Le reste de ce mémoire, réservé au travail personnel, s’articule autour de trois

parties distinctes: la partie II. Matériels et Méthodes; la partie III. Résultats

Expérimentaux et Discussion scindée en trois chapitres:

⎬ La synthèse de prostacycline endothéliale est induite par les lymphocytes

humains (Chapitre 1).

⎬ Détermination des voies de signalisation impliquées dans la synthèse de

prostacycline induite par le contact lymphocytes-cellules endothéliales (Chapitre 2).

⎬ Les acides gras ω−3 et la fonction cellulaire (Chapitre 3)

27

Chacun de ces trois chapitres comporte une brève introduction et un rappel des objectifs

préalablement à l’exposé des résultats, ceux-ci étant discutés en fin de chapitre. Enfin, le

mémoire se termine par la partie IV. Conclusion Générale et Perspectives.

28

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

29

PARTIE I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1. L’ENDOTHÉLIUM -UNE BARRIÈRE MÉTABOLIQUE-

L’endothélium représente une barrière de 5000 m2 de surface entre le sang et les

tissus. C’est un réseau d’informations qui varie d’une façon structurelle et fonctionnelle

selon le type de tissus qu’il irrigue. Ceci reflète l’adaptation des cellules endothéliales à

leur environnement. La cellule endothéliale est une cellule polarisée. Le côté basal est

ancré sur la matrice thrombogène car le sous-endothélium est composé de macromolécules

procoagulantes, synthétisées par la cellule endothéliale: le collagène, le facteur von

Willebrand. La face apicale est en contact avec le sang circulant et représente la surface

non thrombogène du fait de son organisation et de sa production de substances

anticoagulantes et antiagrégantes.

1.1 LES CELLULES ENDOTHÉLIALES

Les cellules endothéliales tapissent la surface intérieure de tous les vaisseaux

sanguins. Elles forment une monocouche continue qui représente la barrière métabolique la

plus grande de l’organisme. L'endothélium occupe une position anatomique stratégique

dans la paroi vasculaire, car il est localisé entre le sang circulant et les cellules musculaires

lisses vasculaires. Il peut répondre à des signaux mécaniques et hormonaux provenant du

sang; en effet, le sang est source de médiateurs qui peuvent moduler l'état contractile et les

réponses prolifératives des cellules musculaires lisses vasculaires, les fonctions

plaquettaires, la coagulation ainsi que l'adhésion des leucocytes à la surface endothéliale.

Dans les conditions physiologiques, l'endothélium joue un rôle protecteur en

prévenant l'adhésion des cellules sanguines circulantes. Il maintient les vaisseaux dans un

état de vasodilatation et inhibe la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.

Dans les états pathologiques comme l'athérosclérose, le dysfonctionnement des cellules

endothéliales entraîne une augmentation des réponses vasoconstrictrices, l'adhésion des

plaquettes et des monocytes, et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.

1.1.1.ORIGINE

Au cours de l’embryogénèse le premier système qui se développe est l’organe cardio-

vasculaire. Pendant la gastrulation, les cellules du mésoderme migrent vers le feuillet

30

primitif (Figure 1). Les cellules endothéliales souches, appelées angioblastes, sont définies

par leur potentiel de différenciation mais elles n'ont pas encore les marqueurs

caractéristiques des cellules endothéliales, ni la capacité de former du lumen.

Ultérieurement, la vasculogenèse est mise en place grâce à la différenciation in situ des

angioblastes vers le phénotype endothélial permettant par la suite, la fusion et la formation

du lumen, et aboutissant à la formation d’un réseau vasculaire primaire. La prolifération

des cellules endothéliales, en formant des nouveaux capillaires, permet l’extension du

réseau par élongation et ramification; la morphogenèse vasculaire est ainsi mise en place.

L’angiogenèse, très active pendant l’embryogenèse et le développement de l’enfant, est

ralentie chez l’adulte (Engerman et al., 1967; Risau, 1995).

L’endothélium vasculaire est une interface dynamique mutable, avec des propriétés

structurales et fonctionnelles qui lui permettent de répondre à une variété de stimuli locaux

et systémiques.

Figure 1. Origine des cellules endothéliales. A) Vue schématique de la différenciation du

mésoderme et de la migration dans un embryon de poussin (environ 17 h d'incubation). B) Coupe

schématique d'une section d'un îlot sanguin dans l'aire opaque (AO) et des angioblastes dans l'aire

pellucide (AP) (d'après Risau, 1995).

B

A

31

1.1.2 ANATOMIE.

L’endothélium, constitué par les cellules endothéliales, la membrane basale et le

sous-endothélium, forme une surface relativement imperméable qui limite le transfert

passif de solutés, de macromolécules et d’éléments cellulaires ou de fluides entre le sang et

l’espace interstitiel. Ce flux est le produit de la transcytose, qui peut être ligand-spécifique

ou pas, et du passage du fluides à travers des liaisons intercellulaires. Des conditions

pathologiques, comme l’inflammation aiguë ou chronique, entraînent la perte de la barrière

et conduisent à l’œdème extracellulaire.

Les cellules endothéliales mesurent entre 0.3-0.5 µm d’épaisseur, 100 µm de long et 10µm

de large. Elles ont une forme en losange et leur juxtaposition forme un tapis en mosaïque.

Elles sont orientées dans la direction du débit sanguin (Figure 2).

Figure 2. Microphotographies en contraste de phase montrant la réorganisation des

cellules exposées au flux. La monocouche en A) a été cultivée en condition statique, sans flux,

alors que la monocouche en B) a été exposée pendant 24 h au flux (forces de cisaillements

laminaires 10 dyn/cm2). On remarque en B l'allongement individuel des cellules et leur orientation

dans la direction du flux indiquée par la flèche (d'après Topper et Gimbrone, 1999).

(A) (B)

32

Les cellules endothéliales in vivo s’attachent à la surface du vaisseau sanguin par

interaction avec le sous-endothélium. Celui-ci forme une matrice de molécules

parfaitement organisée comprenant collagène, élastine, fibronectine, laminine,

thrombospondine, intégrine, vibronectine, facteur von Willebrand et glycosaminoglycanes

comme le dermatane sulfate, l’héparane sulfate, la chondroïtine sulfate. Le sous-

endothélium est responsable de l’intégrité structurale, de la tension mécanique (mechanical

strength) et de l’élasticité des vaisseaux. Le collagène, sécrété majoritairement par les

cellules endothéliales, représente un des composés fondamentaux du sous-endothélium. Il

se lie à la surface endothéliale par interaction avec les β-intégrines, VLA-2 et VLA-3,

exprimées par les cellules endothéliales, la liaison avec le collagène permettant d’établir

des sites d’attachement. L’intégrine VLA2 est particulièrement importante car elle peut se

lier avec le collagène, la laminine et la fibronectine, et elle peut également s’associer aux

fibres d’actine. Celles-ci sont essentielles dans le mécanisme de mécanotransduction de

l’endothélium.

Le renouvellement du sous-endothélium est très faible. Cependant, il est soumis à

un processus de dégradation et de resynthèse qui est finement régulé par les cellules

endothéliales. L’endothélium se continue anatomiquement par la limitante élastique

interne, tout en formant la couche intime de la paroi vasculaire. Hormis les capillaires,

autour de l’intima se trouvent des cellules musculaires lisses, constituant une deuxième

couche anatomique appelée média. La média est la couche centrale de la paroi vasculaire.

Elle contient aussi des fibres élastiques disséminées, des feuillets d’élastine et des fibrilles

de collagène. La media participe également au remodelage de la matrice extracellulaire.

Son rôle principal vient de sa capacité de contraction qui lui permet de modifier le tonus de

l’arbre vasculaire. A l’extérieur, le vaisseau est limité par l’adventice qui entoure les

cellules musculaires lisses. L’adventice contient des fibroblastes et des adipocytes. La

structure globale de la paroi des vaisseaux varie selon le type de vaisseau. Par exemple, les

grandes artères qui assurent le transport du sang depuis le cœur vers les autres organes, ont

une paroi constituée de nombreuses cellules musculaires lisses, ce qui leur donne leur

élasticité. Le retour du sang au cœur, assuré par les veines, est un phénomène beaucoup

plus passif et les parois veineuses possèdent peu de cellules musculaires lisses. Dans les

capillaires, l’adventice et la média proprement dites ont disparu, et sont remplacées par des

cellules spécifiques appelées péricytes.

33

1.1.3 FONCTION

La recherche sur l’endothélium représente une branche relativement jeune de la

science cardio-vasculaire. Il y a seulement 40 ans l’endothélium était considéré comme une

barrière non-thrombogénique relativement inerte; cependant Florey en 1966 affirme que

l’endothélium est beaucoup plus qu’une feuille de cellophane nucléée. Plus tard, la mise en

route de cultures de cellules endothéliales in vitro a permis de mettre en évidence la

fonction endothéliale et d’étudier sa capacité de réponse aux changements

d’environnement, de type mécanique, chimique et humoral. Les cellules endothéliales

saines maintiennent une balance très fine entre

⎬ la promotion et l’inhibition de la croissance,

⎬ la vasoconstriction et la vasodilatation,

⎬ l’adhésion et la non-adhésion des cellules sanguines,

⎬ l’anticoagulation et la procoagulation, «l’hémostase».

De cette façon, l’endothélium contrôle le tonus vasomoteur, régule la structure vasculaire,

maintient les fluides du sang, et régule la réponse inflammatoire et immunologique.

1.1.4 LE CIRCUIT SANGUIN

Toutes les cellules de l’organisme puisent leur énergie et libèrent leurs déchets dans

le circuit sanguin dont aucune n’est éloignée de plus de 100 à 200 microns. La libre

circulation du fluide et des cellules à l’intérieur de ce circuit vasculaire est essentielle à la

survie de l’organisme et aucune fuite ne doit apparaître. L’hémostase englobe l’ensemble

des mécanismes qui permettent:

⎬ la libre circulation des cellules dans le circuit sanguin, «antithrombogénicité»

⎬ de colmater une éventuelle brèche du vaisseau, «thrombogénicité»

⎬ d’empêcher l’obstruction des vaisseaux, «fibrinolyse»

L’endothélium assure l’antithrombogénicité du circuit sanguin, favorise la

formation d’un caillot en cas de brèche vasculaire et initie les processus de destruction du

caillot par fibrinolyse puis antifibrinolyse qui limite l’intensité de cette réaction.

34

L’endothélium normalement antithrombogénique peut devenir prothrombotique

dans certaines circonstances, par exemple au cours d’un traumatisme ou d’un processus

inflammatoire. Normalement, le risque majeur est celui d’une hémorragie. La nature a

préparé toute une batterie de moyens de lutte efficaces et rapides conduisant à la formation

d’un caillot. Le rôle des plaquettes est primordial dans le colmatage d’une brèche

vasculaire. Quelques secondes après l’apparition de la brèche, elles adhèrent au sous-

endothélium, s’étalent à sa surface, s’agrègent les unes aux autres grâce à la présence de

glycoprotéines membranaires qui régissent les interactions inter-plaquettaires, et entre les

plaquettes et le sous-endothélium, formant ainsi le caillot plaquettaire; on parle

d’hémostase primaire. Immédiatement, les facteurs de coagulation plasmatiques sont

activés, et les phospholipides plaquettaires servent d’ancrage à ces facteurs. Un schéma

général de la coagulation est présenté dans la figure 3. La cascade de la coagulation

comprend une série de réactions qui culminent avec la formation de thrombine. Celle-ci est

capable de convertir une petite quantité de fibrinogène plasmatique en fibrine qui, par son

réseau périplaquettaire, consolide le caillot plaquettaire; on parle d’hémostase secondaire.

Chacune de ces réactions a besoin de la formation d’un complexe lié à la surface cellulaire

et la conversion des protéines précurseurs en protéases actives par une protéolyse limitée.

35

Figure 3. La cascade de la coagulation sanguine. Les zymogènes et les pro-cofacteurs sont

désignés par les chiffres romains. L'enzyme et le co-facteur dérivé ont l' indice a. (Dans:

Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological significances. The report of the British

Nutrition Foundation's Task Force. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation. 1err ed

1992, Chap.13, Fig. 13.8, p 109, ISBN 0 412 45750 4. Modifiée par Dominguez, 2001).

1.2 PROPRIÉTÉS ANTITHROMBOTIQUES DE L’ENDOTHÉLIUM

Les cellules endothéliales exposent à leur surface et sécrètent différentes molécules

qui, soit s’opposent à l’agrégation plaquettaire, soit ont des propriétés antithrombotiques

ou fibrinolytiques.

1.2.1 FACTEURS ANTIPLAQUETTAIRES:

C’est un groupe hétérogène comprenant des molécules dérivées des acides gras, des

aminoacides et des protéines enzymatiques qui s’opposent à l’activité plaquettaire.

INTRINSIC SYSTEM (contact)

EXTRINSIC SYSTEM

36

1.2.1.1 La prostacycline

Les cellules endothéliales synthétisent de la prostacycline (PGI2) à partir de l’acide

arachidonique et la sécrètent dans le sang. Cette molécule est un puissant antiagrégant

plaquettaire et un vasodilatateur. Elle se lie à un récepteur spécifique sur les plaquettes

stimulant l’adénylate cyclase, entraînant ainsi la formation d’Adenosine Monophosphate

cyclique (AMPc). L’AMPc inhibe le changement de forme, la sécrétion, et l’agrégation

plaquettaire, et la liaison du fibrinogène aux récepteurs membranaires. La PGI2 a donc un

rôle anticoagulant. La demi-vie de la PGI2 est relativement courte, environ 2 min,

prolongée jusqu’à 30 min par la liaison à l’apolipoprotéine A-1. La synthèse et la sécrétion

de prostacycline sont modulées par un grand nombre de substances (thrombine, histamine,

ADP, ATP, cytokines, entre autres), par des variations de la force de cisaillement, ainsi que

par l’altération de l’endothélium.

Les cellules endothéliales peuvent convertir, grâce au métabolisme transcellulaire,

la PGH2, (principal précurseur de la synthèse des prostaglandines), d’origine plaquettaire

par exemple en PGI2. L’endothélium produit une quantité basale de PGI2, comme le

témoigne l’excrétion urinaire de son métabolite, la 2,3-dinor-6-oxo-prostaglandin F1α.

L’aspirine, la cyclosporine, les antiinflamatoires non stéroïdiens inhibent la

synthèse de PGI2 en inactivant la cyclooxygénase ou prostaglandine endoperoxyde H

synthase (PGHS), enzyme responsable de la synthèse de PGH2. La synthèse de la

prostacycline sera expliquée en détail ultérieurement dans le paragraphe 3, Biosynthèse

des prostanoïdes.

1.2.1.2 Le monoxyde d’azote

Comme la PGI2, le monoxyde d’azote (NO) synthétisé par les cellules

endothéliales, est un puissant vasodilatateur et un inhibiteur de l’adhésion et de

l’agrégation plaquettaire. La synthèse basale de NO est assurée par la NO synthase (NOS)

endothéliale constitutive, à partir de l’acide aminé L-arginine. NO inhibe aussi la

prolifération des cellules musculaires lisses. La production de NO induite par la

bradykinine est régulée par l'enzyme de conversion de l'angiotensine, enzyme localisée sur

la membrane plasmique des cellules endothéliales. En effet, l'enzyme non seulement active

la transformation de l'angiotensine I en angiotensine II, mais inactive également la

bradykinine. Le NO synthétisé, diffuse dans les cellules adjacentes où il agit de façon

paracrine. La PGI2 et le NO agissent en synergie, suggérant que, in vivo, des concentrations

37

faibles, inefficaces séparément, puissent ensemble supprimer l’agrégation plaquettaire.

Depuis la description initiale du NO comme le facteur de relaxation endothéliale (EDRF)

par Furchgott et Zawadzki en 1980, il est reconnu que le NO et la PGI2, à moindre degré la

PGE2, partagent un grand nombre de propriétés. Plusieurs des stimuli qui libèrent le NO

sont aussi des stimuli puissants pour la libération des prostaglandines (PG). La

vasodilatation induite par la bradykinine et par l’acétylcholine est dépendante de la

production de NO et de PG (Lamontagne et al., 1992).

Certaines études récentes suggèrent que les voies biosynthétiques du NO et des PG sont

modulables entre elles. Par exemple l’induction de PGE2 par l’endotoxine bactérienne

lipopolysaccharide (LPS) chez le rat est inhibée par les inhibiteurs de NOS; de plus, le

nitroprussiate de sodium mime l’effet activateur du LPS (Sautebin et DiRosa., 1994)

suggérant l’entrecroisement de ces deux voies métaboliques. Il a été suggéré que la

stimulation de la production endothéliale de NO stimule la production d’eicosanoïdes, par

activation de la PGHS (Davidge et al., 1995). De plus, il a été démontré que les

eicosanoïdes modulent la libération de NO et l’expression de la NOS. Ainsi dans les

plaquettes et dans les neutrophiles, l’acide arachidonique et le LTB4 stimulent la

production de NO (McCall et al., 1989).

Le mécanisme moléculaire d’interaction entre ces deux voies n’est pas connu

jusqu’à présent. Cependant, la plupart des effets du NO sont dus à l’interaction avec le fer

ou des protéines à fer héminique. Par exemple, les effets anti-plaquettaires et

vasodilatateurs du NO sont dus à la liaison du NO au groupe prosthétique hème-Fe2+ de la

guanylyle cyclase soluble. Cette interaction, conduit à l’activation de l’enzyme et à

l’augmentation du GMPc, second messager de NO pour ses effets relaxants et

antiagrégants (Ignarro, 1991). La cytotoxicité du NO à fortes concentrations semble être

due à l’interaction avec les clusters Fe-soufre de certains enzymes clés du cycle

respiratoire et de la synthèses d’ADN (Nathan, 1992). La PGHS, enzyme comportant un

groupement hème est une cible potentielle pour le NO (Kalyanaraman et al., 1982).

1.2.1.3 Les exonucléotidases

Les exonucléotidases sont exprimées à la surface des cellules endothéliales. Elles

sont capables de dégrader l’ATP et l’ADP en AMP et adénosine. Ces enzymes pourraient

jouer un rôle antiagrégant in vivo détruisant l’ADP relargué par les plaquettes sanguines

lors de la phase de sécrétion.

38

1.2.2 LES FACTEURS ANTICOAGULANTS

A la surface de l’endothélium deux facteurs principaux s’opposent à l’action

procoagulante de la thrombine, la thrombomoduline (TM) et les héparanes sulfates (HS).

Ils agissent de façon différente:

La TM est un protéoglycane transmembranaire à chondroïtine-sulfate (CS) qui

possède la propriété d’inverser l’activité procoagulante de la thrombine.

Les HS accélèrent l’inactivation de la thrombine par l’antithrombine III (ATIII).

1.2.2.1. La thrombomoduline

La thrombomoduline par sa partie protéique sert de récepteur à la thrombine qui,

une fois complexée à la TM, active la protéine C par protéolyse, déclenchant ainsi un

puissant système anticoagulant. La protéine C activée (PCa) empêche la formation de

nouvelles molécules de thrombine en inactivant les facteurs de coagulation Va et VIIa

(Figure 3, p 34). Elle désamorce la cascade explosive de la coagulation. Pour cela elle agit

en synergie avec un cofacteur qui est aussi, comme elle, vitamine K-dépendant: la protéine

S. Cette protéine est synthétisée et sécrétée par les cellules endothéliales. La protéine S se

lie à la fois à la membrane des cellules endothéliales et à la PCa, formant un complexe sur

la membrane cellulaire. La protéine C activée en présence de protéines S fixées sur les

surfaces cellulaires inactive les facteurs Va et VIIIa. Les déficits congénitaux en protéines

C ou S ainsi que certaines mutations sur le gène de la TM s’accompagnent de thromboses.

Ces conditions pathologiques démontrent le rôle primordial de ces molécules dans le

maintien de l’antithrombogénicité de l’endothélium.

1.2.2.2 Les héparanes sulfates

Il a été récemment démontré que des HS à activité antithrombique sont présents à la

surface vasculaire des cellules endothéliales et dans la matrice sous-endothéliale. Ces

molécules à activité «Heparin-like» ont été isolées. Leur fonction anticoagulante a été

démontrée par le fait qu’elle disparaît sous l’effet de l’héparinase, enzyme qui coupe les

séquences hépariniques. Ces molécules se lient à l’antithrombine III (ATIII) et accélèrent

l’inactivation des sérine protéases de la coagulation. L’ ATIII plasmatique est le principal

inhibiteur circulant de la thrombine. Le déficit congénital en ATIII entraîne une maladie

thrombotique et démontre le rôle important de cette protéine in vivo. L’ATIII seule

39

n’inhibe que très faiblement la thrombine, le facteur Xa et les autres sérine protéases de la

coagulation mais ce processus est accéléré fortement par la présence d’héparine ou d’HS.

Une petite fraction de l’ATIII est liée aux HS à la surface endothéliale et lors de

perméabilité endothéliale accrue, les HS présents en grande quantité dans la matrice sous-

endothéliale seraient disponibles pour l’ATIII afin de constituer une barrière

antithrombotique efficace. L’ATIII s’exprime de façon constitutive sur l’endothélium.

L’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) est aussi synthétisé par les cellules

endothéliales. Le TFPI inhibe le facteur VIIa complexé au facteur tissulaire (Figure 3, p

34) dans un complexe quaternaire avec le facteur Xa. Il est présent en faible concentration

dans le plasma. L’héparine augmente considérablement la sécrétion du TFPI.

1.2.3 FACTEURS FIBRINOLYTIQUES

La fibrinolyse intervient dans la dissolution des dépôts fibrineux formés en

permanence à la surface des vaisseaux. Les cellules endothéliales synthétisent et sécrètent

à la fois les activateurs du plasminogène et les inhibiteurs de ces activateurs. De plus, elles

ont des récepteurs membranaires pour le plasminogène, la plasmine, l’activateur tissulaire

du plasminogène (tPA), l’activateur de l’urokinase (uPA) et l’inhibiteur du tPA dans le

plasma, le PAI-1.

1.2.3.1 Activateur tissulaire du plasminogène

Les cellules endothéliales constituent le site majeur de synthèse du tPA. Il est

sécrété en réponse à un grand nombre de stimuli, comme par exemple la thrombine, les

forces de cisaillement, l’exercice physique, l’augmentation de la pression veineuse,

l’acidose et l’hypoxie. Le tPA libre une fois fixé à la surface endothéliale devient

inaccessible à son inhibiteur physiologique, le PAI-1. De même que le tPA, le

plasminogène et le PAI-1 ne peuvent pas être efficaces en solution, les activités

fibrinolytiques ne pouvant s’exercer qu’in situ, sur la fibrine ou à la surface des cellules

endothéliales.

40

1.3 PROPRIÉTÉS PROCOAGULANTES DE L’ENDOTHÉLIUM

Toute lésion vasculaire responsable d’une rupture de la continuité de l’endothélium

entraîne le processus d’activation des plaquettes et de la coagulation.

1.3.1 FACTEURS PROCOAGULANTS

En cas de brèche vasculaire, les cellules endothéliales changent leur phénotype pour

fournir avec le sous-endothélium, des substances à activité vasoconstrictrice comme

l’endothéline-1, (ET-1), des facteurs procoagulants, proagrégeants et adhésifs, nécessaires

au colmatage de la lésion. Elles fourniront également divers facteurs et inhibiteurs de

croissance qui permettront l’adaptation de cellules migratoires, musculaires lisses ou

fibroblastes, et des facteurs contractants comme le thromboxane A2 et la prostaglandine H2,

pour la réparation de l’endothélium détruit. Contrairement au thromboxane A2 et à la

prostaglandine H2 qui activent les plaquettes, l'ET-1 n'a pas d'effet direct sur les plaquettes

mais a des propriétés vasoconstrictrices et induit la prolifération des cellules musculaires

vasculaires.

1.3.1.1 Le Facteur von Willebrand

Les cellules endothéliales synthétisent, stockent et sécrètent le facteur von

Willebrand (FvW), glycoprotéine plasmatique multimérique hétérogène. Il a deux

fonctions principales:

⎬ stabiliser l’adhésion plaquettaire

⎬ transporter le facteur VIII «facteur antihémophilique»

Le FvW est indispensable à l’adhésion plaquettaire. Il accomplit cette fonction par

la formation d’un lien entre la glycoprotéine Ib/IX plaquettaire et les fibrilles de collagène

sous-endothéliales. Il peut parfois jouer le même rôle entre les plaquettes, par exemple en

présence de forces de cisaillement élevées. Le FvW au départ est un monomère de 250

KDa qui subit d’importantes modifications post-traductionnelles et une multimérisation. Le

FvW est synthétisé de façon constitutive. Dans la cellule endothéliale il est stocké dans les

granules de Weibel-Palade.

L’anomalie d’un des allèles du gène du FvW conduit à trois types différents de la

maladie de vW. Ce désordre génétique a une fréquence de 1 sur 800 à 1000 individus.

Hormis le type III de la maladie, elle est héritée sur le mode autosomique dominant. La

41

maladie peut être symptomatique ou pas. Quand elle est symptomatique, même si elle est

hétérogène, l’epitaxis spontané ainsi que l’hémorragie des muqueuses orales, gastro-

intestinales, ou génitales et urinaires sont des signes communs aux différents phénotypes

de ce désordre hémorragique héréditaire. Environ, 1 individu sur 1 million a une forme

sévère de la maladie. Le type III, qui est phénotypiquement récessif, se présente avec des

hémorragies sévères des muqueuses; le FvW n’est pas détectable, et le facteur VIII est

présent en très faible concentration.

1.3.1.2 Facteur V et récepteurs des facteurs plasmatiques de coagulation

Les cellules endothéliales synthétisent le facteur V et présentent à leur surface des

récepteurs membranaires pour les facteurs V, IXa, Xa, et le kininogène de haut poids

moléculaire. La fixation de cette dernière molécule permettrait le lancement de la voie

d’activation du facteur «contact» ou voie intrinsèque (Figure 3, p 34).

1.3.1.3 Le facteur tissulaire

Le facteur tissulaire (FT) est une lipoprotéine ubiquitaire présente dans la

membrane cellulaire qui s’expose en cas de lésion cellulaire. Le FT déclenche la voie

extrinsèque de la coagulation (Figure 3, p 34). Le FT va générer la thrombine par le biais

de l’activation des sérine protéases. Il semble que le complexe FT-facteur VII soit actif en

continu et responsable principal de la coagulation basale.

1.4 LES INTERACTIONS CELLULAIRES

L’agression de l’endothélium a pour conséquence l’induction de l’expression des

récepteurs d’adhérence qui jouent un rôle essentiel dans les interactions cellulaires:

Adhérence plaquettes/endothélium par le biais des intégrines de type β3.

Adhérence leucocytes/endothélium par le biais de plusieurs molécules: les

sélectines P ou E et trois membres de la superfamille des immunoglobulines,

ICAM-1, ICAM-2 et VCAM-1.

42

Les leucocytes possèdent les ligands et les récepteurs pour ces protéines. Dans la

Figure 4 on observe l’adhésion des leucocytes à la paroi du vaisseau sanguin. Les

interactions adhésives s’accompagnent d’une activation des leucocytes qui permet de

déclencher le processus de coagulation à la surface endothéliale. L’activation des

leucocytes induit la coagulation par l’intermédiaire de FT et active directement le facteur X

par le biais d’une intégrine.

Figure 4. Adhésion des leucocytes à la paroi vasculaire. Microphotographie montrant

l'adhésion des leucocytes à une veinule dans un tissu enflammé. X 16000. (d'après M.J Karnovsky.

Dans: Roitt, Brostoff et Male, Immunology 4th ed., 1996. Chap.1 Introduction to the Immune

System, Fig. 1.16, p 1.9., ISBN 0 72342178 1).

42

2. LES EICOSANOÏDES D’ORIGINE ENDOTHÉLIALE.

Les eicosanoïdes sont des autacoïdes synthétisés à partir des acides gras essentiels à

longues chaînes. Les prostanoïdes sont les principaux eicosanoïdes produits par les cellules

endothéliales. Ce sont des molécules dérivées des acides gras à vingt atomes de carbone

ayant au moins 3 doubles liaisons en position 8, 11, 14 par la voie enzymatique de la

cyclooxygénase.

2.1. HÉTÉROGENÉITE DE L’ENDOTHÉLIUM

L’endothélium est sensible aux éléments circulants du sang et aux stimuli locaux. Il

répond de façon judicieuse par des changements de fonction et de nature des médiateurs

secrétés. L’endothélium est à la fois cible et source d’autacoïdes (PAF, PG), facteurs de

croissance, cytokines, radicaux oxygénés (NO, anion superoxyde), et facteurs

hémostatiques (FvW). Même si l’endothélium forme une monocouche continue le long du

circuit sanguin, celui-ci est loin d’être homogène. Il y a d’importantes différences

structurales dans les jonctions endothéliales, des interactions avec la membrane basale et

les autres cellules de la paroi vasculaire ainsi qu’une grande diversité dans la nature des

récepteurs exprimés. De plus, les cellules endothéliales ont des fonctions enzymatiques

spécifiques du type d'endothélium dont elles sont issues.

L’essentiel des connaissances initiales sur le rôle physiologique de l’endothélium

provient d’une seule source cellulaire: les cellules endothéliales de la veine du cordon

ombilical humain (HUVEC). Les résultats obtenus avec ces cellules ainsi que ceux obtenus

avec d’autres cellules endothéliales des larges vaisseaux, isolées de l’aorte et l’artère

pulmonaire, ont été à la base de conclusions inexactes sur l’endothélium. Un exemple, est

la cascade de l’acide arachidonique, voie métabolique qui a été généralisée à tout

l’endothélium à partir d’études réalisées sur les HUVEC et les cellules endothéliales des

larges vaisseaux. L’extrapolation des résultats obtenus dans ces études a conduit à

considérer la PGI2 comme la prostaglandine majeure produite par l’endothélium. Bien que

ceci soit vrai pour les gros et moyens vaisseaux, ce n’est pas le cas des microvaisseaux qui

produisent majoritairement de la PGE2 (Gerritzen et Cheli, 1983; Charo et al., 1984;

Carley et al., 1992).

43

Dans les petits vaisseaux placentaires il semble que la production de thromboxane

A2 soit importante étant donnée la forte immunoréactivité de la thromboxane synthase

trouvée à ce niveau. (Wetzka et al., 1994; Nusing et al., 1990). Par ailleurs, l’augmentation

de l’expression de la PGHS-1 peut être impliquée dans la physiopathologie de la pré-

eclampsie (Wetzka et al., 1997). La cellule endothéliale a le potentiel de générer des

médiateurs puissants qui affectent: le tonus vasculaire, la perméabilité, la libération

d’autres médiateurs, la fonction plaquettaire, l’activation des lymphocytes, le

chimiotactisme des leucocytes, la cytoprotection, la fonction rénale et le transport des ions.

2.2 ACIDES GRAS ESSENTIELS

Les acides linoléique 18:2 ω−6 et α-linolénique, 18:3 ω−3 ne peuvent être

synthétisés par l’Homme leur présence dans l’alimentation est indispensable. Les autres

acides gras polyinsataurés (AGPI) comme l’acide arachidonique, (AA), l’acide

eicosapentaénoïque (EPA) et l’acide docosahexaénoïque (DHA) peuvent provenir de

l’alimentation ou de la conversion métabolique des acides linoléique et α-linolénique

précurseurs des séries ω−6 et ω−3, respectivement.

Les acides gras essentiels (AGE) sont des molécules indispensables au maintien de

la compartimentation cellulaire; ils produisent des métabolites actifs, les eicosanoïdes, et

participent au transport/oxydation du cholestérol. Les travaux de Burr et Burr (1929, 1930)

ont clairement démontré le caractère essentiel des acides gras polyinsaturés et en

particulier des acides linoléique (18:2 ω−6) et arachidonique (20:4 ω−6). Plus tard,

Crawford (1976) démontra le caractère essentiel des acides gras (AG) de la série ω−3 pour

le développement du cerveau. Le rôle essentiel du DHA, 22:6 ω−3 pour la fonction

visuelle chez l’Homme a été mis en évidence par Neuringer et al., 1988; Connor et al.,

1988; Birch et al., 1992. Il a été montré que le contenu en DHA de la rétine est maintenu

constant par un mécanisme de recyclage très raffiné qui assure un pool de stockage dans la

matrice interphotorécepteurs, à disposition de la synthèse des membranes photoréceptrices

(Anderson et al., 1992; Bazan et al., 1992).

Ces deux familles d’acides gras se trouvent dans les triglycérides des huiles

alimentaires. Dans la plupart des huiles d’origine végétale, la série ω−6 est majoritaire,

tandis que la série ω−3 est plus restreinte. Cependant, celle-ci est importante dans les

huiles de poisson qui sont particulièrement riches en EPA et DHA, les produits

d’élongation de l’acide α-linolénique. Il y a cependant, une différence dans le rapport

44

EPA/DHA selon le type de poisson; le rapport augmente dans les huiles d’origine marine

tandis qu'il diminue dans les huiles de poissons d’eaux douces. (Simopoulos, 1991; Ortiz et

Bosch., 1993).

Les besoins journaliers en acides gras de la série ω−6 sont de l’ordre de 3% des calories

totales alors que ceux en acide gras de la série ω−3 représentent seulement 0.5% (British

Nutrition Foundation, 1992; Bjerve et al., 1987; Pascaud et Brouard, 1991).

2.3 TYPE D’EICOSANOÏDES

Les eicosanoïdes sont les dérives hydroxylés des acides gras polyinsaturés de la

famille ω−6 et ω−3, comprenant 20 atomes de carbones. Ils se répartissent en quatre

groupes:

⎬produits cycliques, formés initialement par une réaction de peroxydation. Ils sont

désignés de façon globale par le terme prostanoïdes et incluent les prostaglandines,

les prostacyclines et les thromboxanes.

⎬produits linéaires, issus du métabolisme de la 5-lipoxygénase: les leucotriènes (LT)

incluant les substances d’hypersensibilité retardée, peptido- leucotriènes (LTC4, TD4 et

LTE4) qui sont synthétisés lors du choc anaphylactique.

⎬produits formés par d’autres lipoxygénases: acide 12 Hydroxyperoxy-

eicosatétraénoique (12-HPETE) formé par action de la 12-lipoxygénase sur l’AA, et

15-HPETE dont la formation est catalysée par la 15-lipoxygénase.

⎬les produits mono-oxygénés dérivés des acides gras polyinsaturés (AGPI)

formés par l’hydroxylation de l’AA sur l’extrémité méthylée, sur le carbone

adjacent ou aux dépens d’une doubles liaisons sous la forme d’époxydes, sous

l’action du cytochrome P450.

2.3.1. LES PROSTANOÏDES

Il s’agit d’un groupe de composés biologiquement actifs dérivés des AGE,

synthétisés dans tous les tissus. Les prostanoïdes s'arrangent dans une structure

cyclopentanique à deux chaînes latérales, l’une contenant l’extrémité carboxyle (COOH),

45

l’autre contenant l’extrémité méthyle (CH3) ainsi que le groupe hydroxyle sur le carbone

15. Par conséquent les prostanoïdes peuvent être considérés comme des acides gras

hydroxylés cycliques. Selon la configuration de la partie cyclique, les prostanoïdes peuvent

être divisés en:

prostaglandines, prostacyclines, contenant un cycle à cinq carbones

thromboxanes contenant un héterocycle à oxygène et cinq carbones

Les prostanoïdes sont considérés comme des substances analogues aux hormones.

Cependant, elles ont des caractéristiques différentes des hormones. Les prostaglandines ont

des effets différents selon les types cellulaires, tandis que les hormones ont le même effet

sur toutes les cellules cibles. Les prostaglandines agissent seulement sur les cellules où

elles ont été synthétisées et/ou sur des cellules voisines (effet autocrine et/ou paracrine);

alors que les hormones peuvent avoir des effets sur toutes les cellules de l’organisme (effet

systémique).

Les prostaglandines, agissent sur la fonction immunitaire, sur le système nerveux et

sur les sécrétions gastro-intestinales. De plus, certaines prostaglandines font baisser la

pression sanguine. Elles peuvent stimuler la contraction ou la relaxation du muscle lisse.

Les prostanoïdes sont présents dans tous les tissus animaux où ils sont synthétisés à partir

des acides suivants:

⎬ acide dihomo-γ-linoléinique, 20:3 ω−6 à l’origine de la sséérriiee 11 des

prostanoïdes, caractérisée par une seule double liaison

⎬ acide arachidonique, 20:4 ω−6, précurseur de la sséérriiee 22 contenant deux

doubles liaisons

⎬ acide eicosapentaénoïque, 20:5, ω−3, précurseur de la sséérriiee 33 possédant

trois doubles liaisons.

La cyclooxygénase ou prostaglandine endoperoxyde synthase (PGHS) est l’enzyme

catalysant la production des trois séries de prostanoïdes (Figure 5). Les PGG sont

synthétisées par l’action de la PGHS qui a également une activité peroxydase aboutissant à

la formation de PGH, précurseur des PGE, PGD, PGF, PGI et TXA, TXB. La différence

46

structurale entre ces dernières est le nombre de double liaison indiquée en indice, tels que 2

(deux doubles liaisons) pour la PGE2.

2.3.1.1 Actions générales des prostanoïdes

Les résultats concernant l’action des prostanoïdes montrent que la PGE2 et la PGF2

ont des effets antagonistes. La PGE2 provoque une relaxation du muscle lisse des bronches

ainsi qu’une dilatation des vaisseaux sanguins, alors que la PGF2α a des effets opposés dans

les mêmes tissus. La PGE2 a un effet inhibiteur sur le chimiotactisme tandis que PGF2α est

stimulatrice. Les prostacyclines synthétisées par la paroi vasculaire sont de puissants

inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire. Elles induisent la dilatation de la paroi artérielle ce

Figure 5. Les trois séries de prostanoïdes et leur origine biosynthétique.

Molécule moins réactive. (Dans: Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological

Significances. The report of the British Nutrition Foundation's Task Force. Chap.19, fig. 19..2, p

140. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation. Première édition 1992, ISBN 0 412

45750 4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.

qui entraîne la diminution de la pression artérielle. Le thromboxane A2, synthétisé par les

plaquettes sanguines stimule l’activation et l’agrégation plaquettaire, un des mécanismes

essentiel dans la réparation des tissus. De plus, il induit la contraction de la paroi artérielle

SÉRIE 1 SÉRIE 2 SÉRIE 3

Eicosapentaenoic acid (EPA) 20 :5 n-3

47

et conduit à l’élévation de la pression artérielle. La balance entre ces activités opposées est

essentielle pour la physiologie vasculaire.

2.3.2 LES LEUCOTRIÈNES

Bien qu’il ait été établi que les cellules endothéliales ne possèdent pas de 5-

lipoxygénase, donc ne synthétisent pas de leucotriènes, elles peuvent cependant générer les

leucotriènes C4 et D4 par un métabolisme transcellulaire. Au moment d’une activation

leucocytaire l’excès de LTA4 produit peut être converti en LTC4 et LTD4 par la GSH-S

transférase endothéliale, dont l’activité métabolique peut être notamment diminuée par le

blocage de la sélectine-L et des intégrines CD11b/CD18 (MAC-1) (Brady et Serhan,

1992). Le contact entre les deux types cellulaires est donc essentiel pour l’activité de la

transférase. En revanche, la 12-lipoxygénase est présente dans les HUVEC et autres

endothélia vasculaires (Nishiyama et al., 1993; Shannon et al., 1991). Le 15-HETE est

aussi synthétisé par les cellules endothéliales, cependant il semble être synthétisé par la

PGHS et non par la 15-lipoxygénase car l’inhibition pharmacologique la PGHS inhibe la

production de 15-HETE (Gorman et al., 1985).

2.3.3 VOIE DU CYTOCHROME P450

Les cellules endothéliales métabolisent l’AA par la voie du cytochrome P-450. Ce

système de monooxygénation enzymatique comporte une famille unique d’hémoprotéines

qui servent d’accepteurs terminaux du système d’oxydation NADPH-dépendant. Le

système, en présence de NADPH et oxygène moléculaire métabolise l’AA en divers

métabolites oxygénés tels que :

⎬ des époxydes régioisomériques les acides (5,6; 8,9; 11,12; 14,15)

epoxyeicosatetraénoïques (EET). Le 14,15 EET est majoritaire dans

l’endothélium vasculaire (Harder et al., 1995; Pritchard et al., 1990). Les EETs

sont ensuite hydrolysés en leur dérivés diol correspondants;

⎬ acides mono-hydroxyeicosatétraénoïques (HETEs) conjugués. Il a été suggéré

que le 12(R)-HETrE, stimule directement la prolifération des microvaisseaux et

la formation néocapillaire in vitro (Stoltz et al., 1996).

⎬ ω et ω−1 alcools.(Capdevila et al., 1992., Capdevila et al., 2.000).

48

Un des produits dérivés de l’oxydation de l’AA par la cytochrome P450 pourrait être le

médiateur de l’activité hyperpolarisante dépendant de l’endothélium (EDHF) (Bauersachs

et al., 1994; Campbell et al., 1996). L’EDHF agit sur les cellules musculaires lisses par

ouverture des canaux potassiques provoquant une hyperpolarisation de la cellule.

2.4 EFFETS BIOLOGIQUES

2.4.1 LES PROSTANOÏDES ET LA RÉPONSE DÉPENDANT DU FLUX

En cas d’occlusion temporaire d’une artériole, la vélocité des érythrocytes dans les

artérioles proches et parallèles augmente et cette augmentation de la vitesse du flux est

suivie ultérieurement par une augmentation du diamètre artériolaire; cette réponse

s’appelle dilatation flux-dépendant. Au moment de l’apparition de l’occlusion, la vitesse

du flux augmente. Pendant cette période le diamètre de l’artériole est initialement diminué

ce qui augmente par conséquent la force de cisaillement «wall shear stress». Après 6-15

secondes le diamètre de l’artériole augmente, et le flux érythrocytaire est rétabli à la valeur

basale. Il a été montré que la vasodilatation dépendante du flux était dépendante de

l’endothélium (Kuo et al., 1990; Koller et Kaley, 1991a,b). Il a été suggéré qu’un des

métabolites de l’AA serait le principal médiateur de la réponse (Koller et Kaley, 1990).

L’application d'inhibiteurs de la synthèse du monoxyde d'azote n’a pas d’effet sur la

dilatation tandis que les inhibiteurs de la cyclooxygénase, tels que l’indométacine ou le

méclofénamide inhibent complètement la dilatation de l’artériole en réponse à

l’augmentation du flux érythrocytaire. La synthèse des prostaglandines dérivées de

l’endothélium dans les endroits proches de l’occlusion jouerait un rôle importent dans ce

mécanisme de régulation qui peut augmenter considérablement le flux sanguin.

2.4.2 EICOSANOÏDES ET LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE

Etant donné que l’activité PGHS est la première impliquée dans le processus

catalytique de conversion des AGE à vingt atomes de carbones en prostaglandines, elle

joue un rôle clé dans la génération des médiateurs de l’inflammation. Le traitement des

cellules endothéliales par des agonistes comme la bradykinine, l'ATP, l'angiotensine II,

l'endothéline ou la thrombine, entraîne une libération immédiate de prostaglandines.

Cependant d’autres stimuli comme les cytokines et les mitogènes induisent une formation

de prostanoïdes retardée qui dépendent en effet, d’une synthèse de protéines plus tardive.

49

La réponse inflammatoire aiguë est caractérisée par une séquence d’événements qui

s’additionnent: (11) une vasoconstriction artériolaire suivie (22) d'une vasodilatation et d'une

augmentation de la perméabilité venulaire qui entraîne la fuite de macromolécules et la

formation d’œdème (33) la migration de leucocytes vers la zone de lésion et leur diapédèse.

Dans cette séquence de réponse inflammatoire, les eicosanoïdes jouent plusieurs rôles. La

PGE2 et la PGI2 contribuent à la vasodilatation et augmentent la perméabilité induite par le

premier stimulus comme l’histamine, la bradykinine, les neuropeptides sensoriels et les

leucotriènes. Cependant, les PG peuvent aussi réduire la libération de médiateurs. La

PGE2, par exemple réduit in vivo la libération d’histamine induite par un antigène.

L’indométhacine, un inhibiteur de la cyclooxygénase, peut augmenter substantiellement la

libération d’histamine induite par des antigènes (Hedqvist et al., 1990).

La réponse vasoconstrictrice initiale est induite, au moins en partie, par les

leucotriènes LTC4 et LTD4. Les inhibiteurs de lipoxygénase offrent une certaine

protection, diminuent la fuite du plasma et le nombre de leucocytes qui migrent. De plus, la

vasoconstriction initiale est aussi inhibée. Les leucotriènes libérés soit par les cellules

circulantes, soit par les cellules du tissu, ainsi que les leucotriènes potentiellement générés

par le métabolisme transcellulaire, jouent certainement un rôle important durant la réponse

inflammatoire aiguë. Les lipoxines peuvent aussi jouer un rôle contre-régulateur important

en inhibant l’adhésion des neutrophiles à la cellule endothéliale ainsi que le chimiotactisme

des neutrophiles et des éosinophiles (Papayianni et al., 1996; Soyombo et al 1994; Takata

et al., 1994).

50

50

3. BIOSYNTHÈSE DES PROSTANOÏDES: LES PROSTACYCLINES La première étape dans la biosynthèse des prostanoïdes, dont la prostacycline, est la

libération de l’AGE à partir des phospholipides membranaires où il est stocké. Ceci est

réalisé par une famille d’enzymes cellulaires, les phophospholipases de type A2, ainsi que

par celles de types C et D agissant de concert avec les diglycérides lipases.

La deuxième étape, est la synthèse de la PGH, précurseur de tous les prostanoïdes:

prostaglandines, prostacyclines et thromboxanes. Cet intermédiaire est synthétisé par la

PGHS qui constitue l’étape limitante dans la biosynthèse des prostanoïdes.

3.1.DESCRIPTION DES LIPIDES MEMBRANAIRES

Les membranes cellulaires forment une mosaïque fluide constituée par un

agencement de lipides et de protéines. Parmi les lipides, les phospholipides représentent la

classe majoritaire. Les structures membranaires renferment aussi d’autres lipides

quantitativement moins importants tels que les lipides neutres (20-25%) comprenant le

cholestérol, quelques acides gras non estérifiés ainsi que des glycolipides (2-5%).

3.1.1 LES PHOSPHOLIPIDES

Les phospholipides sont constitués par un résidu glycérol acylé en position sn-1 par

un acide gras généralement saturé ou monoinsaturé, et en position sn-2 par un acide gras

polyinsaturé, comme l’acide arachidonique. La position sn-3 est occupée par un groupe

polaire, contenant une liaison phosphate. On distingue plusieurs classes de phospholipides

selon la nature de ce groupement polaire: les phosphatidylcholines (PC), les

phosphatidyléthanolamines (PE), les phosphatidylsérines (PS) et les phosphatidylinositols

(PI). L’inositol peut porter un ou deux groupements phosphates supplémentaires, le

phospholipide correspondant étant alors le phospatidylinositol (4) phosphate (PIP) ou le

phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2). PI représente plus de 80% des

phosphoinositols totaux. PC et PE sont divisés en sous-classes selon la nature de la liaison

reliant la chaîne hydrocarbonée en position sn-1 au squelette glycérol.

3.1.2 COMPOSITION DES PHOSPHOLIPIDES DANS LA CELLULE ENDOTHÉLIALE

Au sein des cellules endothéliales humaines en culture les PC représentent 36,6%

des phospholipides totaux, les PE 10,2%, les PS 7,1%, les PI 3,1%, le reste étant composé

de: sphingomyéline 10,8%, choline plasmalogène 3,7%, éthanolamine plasmalogéne 7,6%,

lysophosphatidylcholine 7,5%, lysophosphatidyl-ethanolamine 3,6%, phosphatidylinositol

51

4,5 biphosphate 1,8%, acide phosphatidique 1,9%, phosphatidylinositol 4-phosphate 1,5%,

et cardiolipines 1,9% (Murphy et al., 1992).

3.2 MÉCANISME DE LIBÉRATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE

Les cellules de mammifères contiennent l’acide arachidonique estérifié presque

exclusivement au niveau de la position sn-2 des phospholipides. Dans les cellules

endothéliales il est incorporé majoritairement dans les PC, (Takayama et al., 1987;

Takayama et al., 1989). Le taux d’AA libre dans les cellules au repos est très faible car il

est rapidement réestérifié dans les phospholipides par les acyl-CoA-transférases. Par

conséquent, pour le rendre disponible, l’hydrolyse des phospholipides par les

phospholipases est nécessaire.

Plusieurs phospholipases sont, directement ou indirectement, responsables de la libération

de l’AA. (Figure 6)

La PLA2 hydrolyse les phospholipides en position sn-2 et libère l’AA ainsi qu’un

lyso PL. C’est la voie principale de libération de l’AA.

Une voie indirecte impliquant une PLC et une diacyl ou monoacyl glycérol lipase

conduit également à la libération d’AA.

La voie de la PLD et de la PLA1 représentent des voies mineures.

3.2.1 LES PHOSPHOLIPASES A2

Les PLA2, sont classiquement répertoriées en trois grandes familles: les sPLA2 ou

PLA2 sécrétées, les cPLA2 ou PLA2 cytosoliques, et les iPLA2 cytosoliques calcium-

indépedantes (Murakami et al.,1997a), chacune comprenant plusieurs isoformes.

3.2.1.1 Les phospholipase A2 sécrétées

Les sPLA2

Ce sont des protéines de faible masse moléculaire (14KDa) qui sont sécrétées en

réponse à une stimulation. L’activité catalytique se développe pour des concentrations en

calcium de l’ordre du millimolaire et à pH 8-9. Elles n’ont pas de sélectivité vis a vis de

l’acide gras estérifié en position sn-2.

Chez l’Homme la sPLA2 de type IB est la plus importante. C’est une enzyme digestive,

présente dans le jus pancréatique sous forme de pro-enzyme, qui est activée par la trypsine

lors du processus de digestion auquel elle participe via le métabolisme des phospholipides.

52

Elle est également présente dans les organes non digestifs tels que la rate, les poumons, les

reins.

Figure 6. Voies de libération de l’acide arachidonique par les différentes

phospholipases.

La sPLA2 IIA est présente de manière constitutive dans divers tissus tels que le

foie, le thymus, la moelle osseuse, les amygdales et la rate (Murakami et al., 1995a). Elle

est induite par des stimuli pro-inflammatoires. En fait, elle est présente en quantité

importante dans le sang de patients ayant des maladies inflammatoires (Nevalainen et al.,

1993) sinon elle est présente en petite quantité et de façon constitutive dans certaines

cellules immunitaires telles que les PMN, les mastocytes, les macrophages.

PLA1

R1 C

O

O CH2

CHOCR2

O CH2 O P

O

O X

O-

PLC PLD

PLA1

PLA2

R1 C

O

O- + Lyso PL

R2 C

O

O- + Lyso PL

PLC

X + DAG Phosphatidate + XOH

PLD

DAG lipase

Monoacylglycérol (MAG) + R1 C O-

O

MAG lipase

Glycérol + R2 C

O

O-

P

PLA2

(acide arachidonique)

53

La sPLA2 V est fortement exprimée dans le cœur, le placenta et un peu moins dans

les poumons et le foie.

Le rôle des sPLA2 II et V dans la régulation de l’hydrolyse de l’AA a été récemment

examiné (Murakami et al., 1999). Ces enzymes fonctionnent en concertation avec la

cPLA2. Les cytokines inflammatoires comme le TNFα, l’IL-1, L’IL-6 et ou le LPS

induisent l’expression du gène de la sPLA2 type II. La protéine sécrétée dans le milieu

extracellulaire peut se lier à la membrane et libère l’AA à partir des phospholipides

membranaires. La participation respective de la sPLA2 et de la cPLA2 dans la synthèse

d’eicosanoïdes varie en fonction du type cellulaire, de l’agent initiateur, et de la cinétique

d’activation cellulaire. Dans les HUVEC, stimulées ou non par la thrombine, la cPLA2

interviendrait seule dans la libération d’AA. En revanche, dans ces mêmes cellules

stimulées par le TNFα, la sPLA2, serait également responsable de la libération d’AA.

(Murakami et al., 1993) Dans les mastocytes murins activés, la synthèse de PGD2

comporte 2 phases: l’une rapide pour laquelle la libération d’AA est catalysée par une

sPLA2, l’autre plus lente pour laquelle seule la cPLA2 est impliquée (Reddy et Herchman,

1997) Au sein de la lignée cellulaire macrophagique P388D1, la libération d’AA après

stimulation comporte également 2 phases. Cependant, la phase précoce est due à

l’intervention d’une cPLA2, tandis que la phase tardive à une sPLA2 (Balsinde et Dennis,

1996).

3.2.1.2 Les Phospholipase A2 cytosoliques

Les cPLA2

A la différence des sPLA2, la masse moléculaire de ce groupe de PLA2 est

beaucoup plus élevée, environ 80 KDa. Ces enzymes peuvent être ou non Ca2+-

dépendantes.

3.2.1.2.1 Les iPLA2 calcium-indépendantes

Une voie Ca2+-indépendante d’activation d'une PLA2 cytoplasmique a été mise en

évidence dans plusieurs types cellulaires dont les cellules endothéliales (Kaya et al., 1989).

Cette voie d’activation impliquerait la synthèse de novo d’une enzyme activatrice de la

PLA2 (Buckley et Whorton, 1994).

Les iPLA2 cytosoliques peuvent être classées en deux catégories: la iPLA2 groupe

VI de masse moléculaire 80 KDa qui semble être impliquée dans le remodelage des

54

phospholipides membranaires et deux autres iPLA2 (groupes VII et VIII) de masse

moléculaire 29 KDa qui se caractérisent par l’hydrolyse des phospholipides à chaînes

carbonées courtes (environ 9) et/ou à chaînes oxydées en position sn-2 excluant la

possibilité de libération des acides gras à longues chaînes comme l’AA.

Contrairement aux deux autres familles de PLA2, l’élévation du taux de calcium

intracellulaire n’active pas les iPLA2, induisant même une inhibition de leur activité.

3.2.1.2.2 La cPLA2-calcium-dépendante

Cette enzyme libère l’AA de façon préférentielle bien que d’autres acide gras

puissent être libérés lors de l’activation cellulaire. De nombreux stimuli extracellulaires

tels que les facteurs de croissance, les mitogènes, les peptides vasoactifs, les cytokines, les

interferons, les ligands des intégrines et des récepteurs Fc, activent la cPLA2. Cependant,

elle peut aussi être activée par des stimulations n’impliquant pas de récepteur comme les

stimuli de stress incluant l’oxydation, l’hyperglycémie, les rayons UV, les forces de

cisaillement (Kramer et Sharp, 1997). La masse moléculaire est de 85 KDa, elle est

constituée de deux domaines qui fonctionnent indépendamment:

Un domaine de liaison au calcium (CaLB) dans la séquence N terminale. Ce

domaine est en interaction avec les phospholipides membranaires par

l’intermédiaire de résidus hydrophobes, mais il n’est pas nécessaire pour l’activité

catalytique (Nalefski et al., 1994)

Un domaine catalytique à l’extrémité C terminale calcium-indépendant qui

contient le site actif de l’enzyme, une sérine nucléophile (Ser 228) (Huang et al.,

1996)

L’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, de l’ordre du µM,

induit l’activation et la translocation de la cPLA2 vers la membrane plasmique où elle se lie

via son domaine CaLB aux phospholipides. Après la formation du complexe enzyme-

substrat, la Ser 228 attaque la liaison ester sn-2 pour former un acyl (arachidonoyl)-enzyme

qui est alors hydrolysé par une molécule d’eau, ce qui génère l’AA libre. Ce cycle

catalytique est répété successivement jusqu’à ce que les concentrations d’acide gras libres

55

et de lysophospholipides augmentent, entraînant alors une diminution de l’affinité de

l’enzyme pour son substrat. La cPLA2 hydrolyse préférentiellement PC et PE, tandis que

PI ne semble pas être un bon substrat (Diez et Mong, 1990).

Bien que la cPLA2 montre une certaine spécificité pour des phospholipides qui possèdent

l’AA en position sn-2, elle fonctionne également quand cette position est occupée par

d’autres acides gras polyinsaturés comme l’acide α−linolénique (18:3 ω−3) ou l’acide

eicosapentaénoïque (EPA, 20:5 ω−3) (Diez et al, 1994).

La phosphorylation de la cPLA2 joue un rôle important dans la régulation de son

activité. Elle possède de nombreux sites de phosphorylation: 12 sites sérine/thréonine et 4

sites tyrosine. La Ser 505 est présente dans la séquence Pro-Leu-Ser-Pro reconnue par les

MAP-Kinases (Cobb et Goldsmith, 1995). La Ser 727 est entourée de résidus arginine

(Arg-Arg-(X)4-Arg-X-Ser-(X)8-Arg-Arg), sites préférés des PKC et PKA. Plusieurs voies

de phosphorylation de la cPLA2 ont été décrites :

Une voie dépendante des p42/p44 MAP-kinases

Plusieurs études ont montré que la cPLA2 est un substrat des p42/p44 MAP-

kinases, appelées aussi Extracellular-Regulated kinase ou ERK-1 et -2. La phosphorylation

de la Ser 505 in vitro augmente son activité et induit un retard caractéristique de la mobilité

électrophorétique ou gel shift (Nemenoff et al., 1993; Lin et al., 1993). Certaines études

ont montré que les cellules CHO transfectées avec une cPLA2 mutée qui ne possède pas ce

site de phosphorylation (Ser505-Ala cPLA2) libèrent moins d’AA, en réponse à divers

agonistes, que des cellules contrôles exprimant la cPLA2 non mutée (Lin et al., 1993).

L’activation de la cPLA2 peut être protéine kinase C (PKC)-indépendante ou PKC-

dépendante selon le type cellulaire (Kramer et Sharp, 1997). Ainsi, dans les cellules

musculaires lisses de lapin les lipoprotéines de haute densité (HDL) augmentent la

synthèse de prostacycline par un mécanisme faisant intervenir une MAP-kinase kinase ou

MEK mais indépendamment d’une activation de PKC (Vinals et al., 1999). De même, dans

les cellules endothéliales de lapin, l’acétylcholine induit la synthèse de prostacycline par

activation de la p42 MAP-kinase et de la cPLA2 via un mécanisme indépendant de la PKC

(Kan et al., 1996). Par contre, la lyso-PC augmente la sécrétion d’AA dans les HUVEC via

une activation de cPLA2 par un mécanisme impliquant une activation de PKC et de p42

MAP kinase (Wong et al., 1998). Dans les macrophages murins, le zymosan et le PMA

activent fortement les ERK-1/2 via la PKC (Gijon et Leslie, 1999). La PKC joue un rôle

56

dans l’activation de la cPLA2 en initiant une cascade de phosphorylations menant à une

activation de la MAP-kinase (Qiu et Leslie, 1994).

Des voies indépendantes des p42/p44 MAP-kinases

Il a été démontré dans des neutrophiles activés par le LPS ou par le TNFα et dans

des plaquettes stimulées par la thrombine que la phosphorylation de la cPLA2 est

indépendante de l’activation des ERK-1/2 (Fouda et al., 1995; Waterman et Sha'afi, 1995).

Récemment, il a été décrit que les kinases de stress JNK/SAPK (c-jun-N-terminal kinase

ou stress activated protein kinase) et la p38-MAPK, membres de la famille ERK,

pourraient intervenir dans la régulation de la phosphorylation de la cPLA2 (Gijon et Leslie,

1999). La kinase p38 serait responsable de la phosphorylation de la Ser 505 de la cPLA2

plaquettaire. Dans les macrophages, le zymosan active non seulement les ERK-1/2 mais

aussi la JNK et la p38- MAPK qui peuvent phosphoryler la cPLA2 in vitro et induire un gel

shift suggérant une phosphorylation sur la Ser505 (Gijon et al., 1999). Des voies de

signalisation Ras-JNK (Jo et al., 1997; Li et al., 1996) et Ras-p38 MAPK (Berk et al.,

1995; Li et al., 1996) ont été décrites.

Dans les cellules sf9 non stimulées, la cPLA2 est phosphorylée préférentiellement

sur les Ser 454 et 505 et plus faiblement sur les Ser 437 et Ser 727 (Gijon et Leslie, 1999).

Les cellules sf9 surexprimant la cPLA2 libèrent de l’AA en réponse à l’ionophore calcique

A23187 et à l’acide okadaïque (de Carvalho et al., 1996). L’acide okadaïque augmenterait

préférentiellement la phosphorylation de la cPLA2 sur la Ser 727 en bloquant les

phosphatases qui déphosphorylent normalement l’enzyme et/ou en induisant la

phosphorylation sur cette sérine via des kinases dont la nature reste à définir. Une

phosphorylation de la cPLA2 sur la Ser727 a aussi été observée dans les macrophages

murins et les monocytes humains en réponse à l’acide okadaïque (Qiu et al., 1998; de

Carvalho et al., 1996) et dans les plaquettes stimulées à la thrombine (Borsch-Haubold et

al., 1995). La phosphorylation de la Ser727 n’a pas de rôle fonctionnel dans l’activation de

la cPLA2. En effet, le remplacement de la sérine 727 par une alanine (Ser727A) n’affecte

pas l’activité cPLA2 des cellules Sf9 stimulées par l’ionophore A23187 ou l’acide

okadaïque. De plus, la délétion des acides aminés 721 à 749 au niveau de la région C-

terminale n’a pas de conséquence sur la libération d’AA alors que la substitution de la Ser

505 par l’alanine diminue de 50% la libération d’AA induite par l’A23187 ou par l’acide

okadaïque. Ces résultats montrent que dans les cellules sf9, la phosphorylation de la cPLA2

sur la Ser 505 augmente sa capacité à libérer l’AA mais aucun des sites de phosphorylation

identifiés n’est essentiel à l’activité de la cPLA2 dans ce modèle.

57

3.2.2 LES PHOSPHOLIPASE C –PLC-

Les PLC comprennent un grand nombre d’isoformes pouvant être soit

membranaires, soit solubles. Ces dernières sont probablement transloquées vers la

membrane plasmique lors de leur activation. Parmi les PLC, certaines hydrolysent

préférentiellement les PI (PI, PIP, PIP2) et conduisent à la formation d’Inositol phosphates

(IP, IP2, IP3 ) et DAG; d’autres hydrolysent sélectivement les PC en phosphocholine et

DAG.

3.2.2.1 Les PLC spécifiques des PI

Les PI-PLC

Les PLC spécifiques des PI renferment plusieurs isoformes regroupées en 4

familles principales dénommées α, β, γ et δ selon leurs poids moléculaires et leurs

analogies de séquences. Cette diversité de structure est associée à une pluralité des modes

de régulation. Les PLC sont activées par des agents spécifiques selon deux voies

principales. L’une fait intervenir des récepteurs couplés aux protéines G, l’autre implique

des récepteurs possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque. Ces activités

phospholipasiques assurent la synthèse (rapide et transitoire) de DAG et d’IP3 (inositol 1,

4, 5 triphosphate) à partir du PIP2. Le DAG et l'IP3 sont des seconds messagers impliqués

directement ou indirectement dans la libération de l’AA par la cPLA2. L’IP3 est à l’origine

de la libération du Ca2+ depuis les compartiments intracellulaires (réticulum

endoplasmique). Cette augmentation du taux de Ca2+ dans le cytosol induit la translocation

de la PKC vers la membrane plasmique qui acquiert une forme active par liaison avec le

DAG formé. La PKC ainsi activée et la hausse de calcium intracellulaire activent à leur

tour la cPLA2. D’autre part, la PKC régule négativement les PLC spécifiques des PI tandis

qu’elle active dans certains cas la PLC spécifique de PC (Exton, 1994).

3.2.2.2 Les PLC spécifiques des PC

Les PC-PLC

Peu d’études ont porté sur la purification des PLC spécifiques des PC dont les

caractéristiques sont encore peu connues. Les formes purifiées hydrolysant spécifiquement

les PC, fonctionnent à pH neutre, et sont activées par des protéines G de façon Ca2+-

dépendante. Selon les types cellulaires, la PLC peut être activée par la PKC ou peut être

PKC indépendante (Billah et Anthes, 1990). La PKC étant elle-même activée lors du

métabolisme des PI, l’hydrolyse des PI et celle de PC seraient donc séquentielles.

58

L’hydrolyse des PC, au contraire de celle des PI, conduit à une synthèse de DAG plus lente

mais prolongée et permet ainsi une activation soutenue de la PKC, qui active alors la

cPLA2 entraînant la libération de l’AA (Exton, 1994). Certaines études montrent un rôle de

cette enzyme dans l’apoptose (Hannun et Obeid, 1995). La PC-PLC participerait à la

production de céramides, molécules impliquées dans l’apoptose, en activant des

sphingomyélinases, en réponse au TNF (Schütze et al., 1992) ou via le récepteur Fas/APO-

1 (Cifone et al., 1995). Malgré ces observations, l’existence de cette enzyme est remise en

cause. Récemment, il a été suggéré qu’une sphingomyéline synthase (SMS) serait

probablement responsable des multiples fonctions attribuées dans les études antérieures à

une PC-PLC car le D609, composé utilisé comme inhibiteur spécifique de la PC-PLC dans

plusieurs travaux, inhibe l’activité de la SMS (Luberto et Hannun, 1998).

3.2.3 LES PHOSPHOLIPASES D-

Les PLD

La PLD libère la tête polaire du phospholipide et du PA. Cette phospholipase est

une source indirecte de DAG suite à l'hydrolyse du PA par une phosphatidate

phosphohydrolase. L’activité PLD existe à la fois au niveau membranaire et au niveau

cytosolique. Les formes associées aux membranes hydrolyseraient uniquement les PC,

tandis que les formes cytosoliques hydrolyseraient à la fois PC, PE et PI (Billah, 1993). La

PLD est activée par des récepteurs couplés aux protéines G, elle est réguléee positivement

par la PKC et sa dépendance vis à vis du calcium varie d’un type cellulaire à l’autre (Billah

et Anthes, 1990) Les facteurs de croissance dont les récepteurs possèdent une activité

protéine tyrosine kinase intrinsèque activent la PLD. Ces récepteurs ne phosphorylent pas

directement l’enzyme. Il est possible que la PKC et/ou la famille des petites protéines G

Rho soit impliquées. D’autre part, des agonistes dont les récepteurs activent des protéines

tyrosine kinases (PTK) solubles appartenant aux famille Src ou Pyc peuvent conduire à

l’activation de l’enzyme (Exton, 1999).

Par ailleurs, la PLD est capable d'assurer le transfert du groupement phosphatidyl

sur un alcool primaire (éthanol ou butanol), donnant naissance à un phosphatidylalcool.

Cette propriété particulière de transphosphatidylation a été mise à profit pour détecter

l’activité PLD dans divers types cellulaires.

59

3.3 OXYGENATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE: SYNTHÈSE DE

PROSTACYCLINE

Une fois libéré des phospholipides membranaires, l’AA est accessible aux enzymes

qui le convertissent en eicosanoïdes, les prostaglandine endoperoxyde H synthases

(PGHS). La PGHS est un polypeptide d’environ 70 KDa contenant deux groupes hème par

molécule. L'enzyme a une activité bifonctionnelle, elle catalyse:

⎬ l’insertion des atomes d’oxygène dans la partie pliée de l’acide gras

formant un endoperoxyde cyclique, la prostaglandine G (PGG)

⎬ la réduction de la fonction peroxyde de la PGG en hydroxyle donnant la

prostaglandine H (PGH)

Ces deux activités catalytiques ont lieu à deux sites actifs distincts de la protéine. Ceci fut

suggéré par le fait que les anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l’aspirine, de même

que le 22:6 ω−3 (DHA) sont des inhibiteurs compétitifs de la cyclooxygénase sans affecter

l’activité hydroperoxydase (Marshall et Kulmacz, 1988; Picot et al.,1994).

La PGH est l’intermédiaire clé pour la conversion en une vaste gamme

d’eicosanoïdes. La figure 7 illustre une variété des produits qui peuvent être synthétisés

quand l'AA est le substrat de la PGHS. La balance entre les activités des enzymes qui

catalysent ces réactions détermine la répartition des eicosanoïdes synthétisés dans un tissu

donné. L’alimentation est un facteur exogène qui peut affecter cette répartition.

La PGG et la PGH sont des précurseurs instables de tous les membres de la famille des

prostanoïdes. Ainsi dans les plaquettes et certains autres tissus contenant l’enzyme

thromboxane synthase, les endoperoxydes intermédiaires sont convertis en thromboxane

A2 (TXA2) composé instable, aussitôt converti en TXB2, un composé inerte. Dans d’autres

tissus, la prostacycline synthase forme la PGI2 à partir des endoperoxydes instables. La

PGI2, est elle aussi instable, cependant moins que le TXA2. Elle est aussi dégradée en une

forme inerte, la 6-oxo-PGF1 α. D’autres tissus peuvent contenir des enzymes qui

isomérisent les endoperoxydes en PGE, PGF et PGD. Cependant, cette réaction peut aussi

se produire par des réarrangements non enzymatiques.

60

3.3.1 LES PROSTAGLANDINE ENDOPEROXYDE H SYNTHASES: DEUX ISOFORMES

La PGHS, enzyme intracellulaire, aussi nommée cyclooxygénase (COX) existe

sous deux isoformes. L’une appelée PGHS-1 ou COX-1, constitutive et ubiquiste, a été

initialement isolée et clonée dans des sources murine, ovine et humaine. (DeWitt et Smith,

1988; Hemler et Lands, 1976; Yokoyama et Tanabe, 1989). L’isoforme inductible,

désignée PGHS-2 ou COX-2, a été initialement identifiée dans les cellules Swiss 3T3

(fibroblastes de souris) comme le produit d’un gène précoce induit par les esters de phorbol

( Kujubu et al., 1991). Ces deux enzymes ont une masse moléculaire similaire, environ 70

KDa et présentent 60 % d’homologie pour les acides aminés (aa) incluant les aa essentiels

de l’activité catalytique. Les PGHS-1 et 2 sont codées par deux gènes distincts, situés

respectivement sur le chromosome 9 et le chromosome 1. Ils sont transcrits en ARNm de

tailles différentes: 2.8 kb (PGHS-1) et 4.1 kb, (PGHS-2). Sur gel SDS-PAGE, la PGHS-1

présente une masse moléculaire de 70 kDa (Raz et al., 1988).

Figure 7. Prostanoïdes synthétisés à partir de l'acide arachidonique (d'après Jhonson et al.,

1983. Dans: Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological significances. The report of the

British Nutrition Foundation's Task Force. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation,

1992. Chap.8, Fig. 8.4, p 58. ISBN 0 412 45750 4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.

61

La différence entre la valeur de la masse moléculaire calculée (65 kDa) et celle déterminée

expérimentalement serait due, en partie, à la présence d’oligosaccharides liés à des résidus

asparagine. La PGHS-2 apparaît sous forme d’un doublet de masse moléculaire d’environ

72 kDa (Habib et al., 1993, Lecomte et al., 1994). Ce doublet pourrait être dû à un

phénomène de N-glycosylation post-traductionnelle s’opérant de manière hétérogène, la

PGHS-2 possédant un site de glycosylation supplémentaire par rapport à la PGHS-1

(Smith, 1992). La PGHS-1 présente une spécificité de substrat assez étroite et requiert la

présence de trois doubles liaisons, toutes en configuration cis, dans les position 8, 11, 14

des acides gras à 20 carbones :

⎬ acide cis, 8,11,14 eicosatriénoïque, dihomo-γ-linolénique, 20:3 ω−6

⎬ acide cis, 5,8,11,14 eicosatétraénoïque, arachidonique, 20:4 ω−6

⎬ acide cis, 5,8,11,14,17 eicosapentaénoïque, EPA, 20:5 ω−3

L’AA est le substrat préférentiel de cette enzyme, dont le Km pour cet acide gras se situe

vers 5µM (Marshall et Kulmacz, 1988). Hormis le 20:5 ω−3, les AGPI des séries ω−9 et

ω−3, ne sont pas substrats de l’enzyme mais peuvent être des inhibiteurs efficaces de la

PGHS. C’est notamment le cas du 22:6 ω−3 (DHA) (IC50 de 11µM) (Meade et al., 1993)

A la différence de la PGHS-1, la PGHS-2 ne montre pas une grande spécificité de substrat.

En plus des acides gras déjà mentionnés pour la PGHS-1, les acides linoléique (18:2 ω−6),

α-linolénique (18:3 ω−3) ou γ-linolénique (18:3 ω−6) sont efficacement oxygénés

(Laneuville et al.,1995).

3.3.1.1 Localisation et structure

La PGHS-1 est une enzyme ubiquiste. L’AA, substrat utilisé préférentiellement par

les cellules endothéliales, peut être d'origine endogène (libéré par des phospholipases) ou

exogène. Les PGHS sont localisées dans le réticulum endoplasmique et sur les membranes

internes et externes de l’enveloppe nucléaire. (Smith et Marnett, 1991). La PGHS est

localisée sur la face luminale du réticulum qui serait donc le lieu de synthèse de la PGH

(Otto et Smith, 1994). Les études réalisées par diffraction des rayons X (Picot et al.,1994;

Garavito et al., 1995) ont permis de confirmer les résultats des études biochimiques

réalisées auparavant, en particulier, le fait que la protéine se trouve sous forme d’un

homodimère « tête-bêche », et que les deux isoformes la constitutive, PGHS-1 et

l'inductible PGHS-2 comportent trois régions communes:

62

Une région N-terminale contenant un motif « EGF-like » localisé à l’interface entre les

deux monomères.

Une région permettant la fixation de la protéine à la membrane, domaine d’ancrage ou

« membrane binding domaine, MBD». Elle comporte quatre hélices α dont les

chaînes latérales des résidus aa hydrophobes interagissent avec une seul feuillet des

bicouches lipidiques membranaires, permettant l’ancrage de la protéine.

Une région contenant les deux sites actifs de la cyclooxygénase et de

l’hydroperoxydase, le site de fixation du groupe hème (His207 et His388) et l’Arg277

qui constitue un site de clivage par la trypsine (Marnett et al., 1988).

Il existe cependant des différences entre les structures des deux PGHS, en particulier au

site actif de l’activité cyclooxygénase. Les études par diffraction des rayons X (Luong et

al., 1996; Kurumbail et al., 1996) ont montré que le site actif de la PGHS-2 est plus

volumineux que celui de la PGHS-1. Il possède une cavité latérale accessible en raison

d’une différence en aa sur la position homologue 523 de la PGHS-1: la chaîne latérale de la

Val509 de la PGHS-2 étant plus petite que celle de l’Ile de la PGHS-1. Il semble

également que l’entrée du site actif de la PGHS-2 soit plus flexible (Luong et al., 1996).

Ces résultats pourraient expliquer la spécificité plus large de la PGHS-2 vis à vis des

substrats. Par ailleurs, Lecomte et al. (1994) ont montré que l’acétylation de la PGHS-2 par

l’aspirine mène à la formation d’une enzyme capable de catalyser l’oxygénation de l’AA

en 15R-HETE, et non à une inhibition totale de l’activité enzymatique comme c’est le cas

pour la PGHS-1. Enfin, des études de mutagenèse dirigée montrent l’importance de la

substitution Ile523 par une Val et l’implication pharmacologique vis à vis de la spécificité

des inhibiteurs de PGHS-2 (Gierse et al., 1996; Guo et al 1996; Wong et al., 1997). Il

existe également une autre différence structurale entre les deux PGHS. Malgré l’homologie

de séquence du site de clivage des deux isoformes, l’Arg277 de la PGHS-2 n’est pas

sensible à l’action de la trypsine (Otto et Smith, 1994; Guo et al., 1997). Ceci suggère donc

que la conformation de cette région est différente dans les deux isoformes.

63

3.3.1.2 Rôle des deux isoformes

Les PGHS interviennent dans des processus physiologiques et cellulaires différents.

La PGHS-1 conduit à la production rapide de prostanoïdes en réponse à des variations des

conditions physiologiques ou physiopathologiques. Ainsi, pour des fonctions telles que la

réabsorption d’eau par le rein ou l’hémostase qui exigent une réponse adaptative rapide,

l’enzyme constitutive a un rôle essentiel. De même, au cours des réactions

d’hypersensibilité par exemple, la PGHS-1 est responsable de la production rapide des

médiateurs de l’inflammation. Au contraire, la PGHS-2 n’intervient pas dans la production

précoce de prostanoïdes. La synthèse de novo de l’enzyme, induite par différents stimuli,

(facteurs de croissance, cytokines, endotoxines bactériennes) nécessite un temps de

latence. La PGHS-2 est considérée comme l’isoforme responsable de la synthèse des

prostaglandines qui entretiennent la réaction inflammatoire. Par ailleurs, elle est impliquée

dans l’ovulation (Wong et al., 1989) et dans le contrôle du cycle cellulaire (Tsujii et

DuBois, 1995).

Des expériences réalisées sur des macrophages (Reddy et Herschman, 1994) ou des

fibroblastes (Shitashige et al., 1998) murins montrent que les deux isoformes utilisent l’AA

provenant de compartiments différents. L’AA endogène serait préférentiellement

métabolisé par la PGHS-2, alors que PGHS-1 métaboliserait de préférence l’AA exogène.

En outre, il a été montré, que la production de PGD2 dans des mastocytes activés comporte

deux phases: la première rapide, est dépendante de la PGHS-1, alors que la seconde,

tardive, est due à la PGHS-2 (Murakami et al., 1995b; 1997b; Ashraf et al.,1996; Bingham

et al., 1996). L’ensemble de ces résultats confirme l’existence de deux systèmes de

production de prostaglandines, indépendants l’un de l’autre. Sur cette base, la PGHS-1

serait responsable de la synthèse des prostanoïdes pour la signalisation extracellulaire,

alors que la PGHS-2 serait responsable de la synthèse des prostanoïdes pour la

signalisation nucléaire (Otto et Smith, 1995). Etant donné que les deux isoformes ont la

même localisation sub-cellulaire (Spencer et al., 1998), il semble que les différences dans

le devenir des prostanoïdes synthétisés par les deux isoformes de PGHS soient dues à des

différences de cinétique enzymatique (concentration en hydroperoxydes requise pour

l’activité, régulations allostérique négative de la PGHS-1 à des concentrations faibles de

substrat (Spencer et al, 1998; Shitashige et al., 1998).

64

3.3.2 LA PROSTACYCLINE SYNTHASE

La prostacycline synthase (PGIS), est un nouveau membre de la superfamille des

cytochromes P450, donc une hémoprotéine, qui métabolise spécifiquement la PGH2 en

PGI2 (Figure 7, p 60). Au contraire de la PGHS qui est distribuée dans des tissus variés, la

PGIS est localisée de façon plus restreinte. Notamment, elle est prépondérante dans

l’endothélium, ce qui fait de ce tissu la source principale de prostacycline. La PGIS est

localisée sur les membranes nucléaires et du réticulum endoplasmique (Smith et al., 1983;

Hara et al., 1994). Le cDNA de la PGIS humaine a été cloné et séquencé à partir d'un

poly(A)+ARN extrait de cellules endothéliales d'aorte (Miyata et al., 1994). Le gène de la

PGIS est localisé sur le chromosome 20 chez l’Homme; il est d’environ 60 kb et contient

10 exons. Le site d’initiation de la transcription a été déterminé et une séquence d’environ

3kb dans la région 5’ a été obtenue. La région séquencée présente les caractéristiques de

gènes exprimés de façon constitutive. Elle ne comporte pas de boîte TATA, et possède une

région riche en GC. Elle possède des sites potentiels de liaison à des facteurs de

transcriptions tels que SP1, AP2, NF-Κb ainsi qu’un élément de réponse aux forces de

cisaillement. L’induction de production de la prostacycline par les forces de cisaillement a

été mise en évidence dans des cellules endothéliales en culture. (Frangos et al., 1985;

Bhagyalakshmmi et Frangos, 1989)

Une hypothèse a été émise récemment (Iwai et al., 1999) concernant le rôle du

polymorphisme du gène de la PGIS dans l’hypertension essentielle. Dans une population

japonaise une corrélation positive a été trouvée entre un polymorphisme répété dans la

région du promoteur du gène de la PGIS et la présence d’hypertension. Les auteurs ont

déduit de cette étude que le polymorphisme est un facteur de risque pour l’hypertension

systolique dans la population japonaise.

3.3.3 EFFETS DE L’ASPIRINE SUR LA SYNTHÈSE DES EICOSANOÏDES

Les études sur le mécanisme d’action de l’aspirine ont beaucoup aidé à la

compréhension du rôle des eicosanoïdes. Vane (1971) a été le premier à démontrer que ce

dérivé de l’acide salicylique inhibe fortement la synthèse de prostaglandines. Puis, il a été

démontré que cet effet inhibiteur était dû à l’acétylation irréversible de la sérine du site

actif de la PGHS. Cependant, l’isoforme inductible de la PGHS, la PGHS-2 acétylée par

l’aspirine synthétise du 15-R-HETE. (Lecomte et al.,1994). Celui-ci est aussi synthétisé à

partir de l’AA par la voie du cytochrome P450. Donc, le traitement des cellules avec de

65

l’aspirine peut dériver le métabolisme de l’AA vers la production de produits comme le 15-

HETE sous l’influence d’un stimulus inflammatoire ou mitogènique.

Le processus de diapédése est aussi modulé par les produits du métabolisme de

l’AA. Plusieurs métabolites de l’AA comme le LTB4, et l’acide 12(R)-

hydroxyeicosatriénoïque (12(R)-HETrE) sont chimiotactiques. Des études in vitro

montrent que LXA4 peut inhiber le chimiotactisme du PMN stimulé par LTB4 ou par le

fMLP (Lee et al., 1989).

3.4 PERSPECTIVES

La communauté scientifique continue de s’intéresser aux eicosanoïdes depuis les

premières observations de vonEuler et al., il y a presque 70 ans. Les techniques de biologie

moléculaire ont permis de mettre en évidence les mécanismes de régulation de la

biosynthèse d’eicosanoïdes, du "cross-talk" entre les voies de la NOS et des PGHS, et

d'elucider les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de certaines maladies qui

conduisent à un dysfonctionnement de la synthèse et du métabolisme endothélial des

eicosanoïdes. L’élucidation du rôle des facteurs de transcription impliqués dans la

régulation de la synthèse d’eicosanoïdes et de NO en réponse aux forces de cisaillement, à

la pression, aux lésions tissulaires et aux cytokines inflammatoires représente un large

champ d'investigations pour de nouvelles recherches. La caractérisation des phénotypes de

souries déficientes en PGHS-1 et PGHS-2 a commencé. Les souris knock-out pour le gène

de la PGHS-1 ont peu d’anomalies phénotypiques. Les homozygotes sont stériles,

cependant l’homozygote croisé avec un hétérozygote produit des souris viables. Cette

observation n’est pas surprenante compte tenu du rôle bien connu des prostaglandines dans

l’ovulation, la spermatogenèse et la parturition. De plus, chez les souris KO pour la PGHS-

1, l’AA exogène ne provoque pas l’agrégation plaquettaire (Langenbach et al., 1996). En

revanche, les souris KO pour la PGHS-2 ne sont pas saines. Elles souffrent de

néphropathie progressive, évidente à six semaines, et meurent entre 8-16 semaines. Le

défaut semble être dû à l’arrêt prématuré de la différenciation et de la maturation du rein.

Ceci sous-entend qu’un petit pourcentage de néphrons sont fonctionnels (Morham et al.,

1996).

La disponibilité de modèles génétiquement modifiés représente une nouvelle étape

dans la biologie des eicosanoïdes. La biologie moléculaire et la physiologie permettront de

déterminer les mécanismes moléculaires des régulations impliquant les eicosanoïdes et de

valider les hypothèses émises à partir des modèles in vivo.

66

4. LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE

Les lymphocytes du sang périphérique (PBL) représentent 2% du total des

lymphocytes de l’organisme. La majorité des lymphocytes, se trouvent dans le canal

thoracique ainsi que dans les ganglions lymphatiques et, en proportion mineure, dans les

organes lymphoïdes secondaires. Les lymphocytes T représentent 70-80% des lymphocytes

totaux, les lymphocytes B matures entre 10-15 %, les lymphocytes larges granulaires

(LGL) environ 5-10 %. La figure 8 représente le trafic des lymphocytes entre les organes

lymphoïdes et les tissus.

Figure 8. Recirculation des lymphocytes. Les lymphocytes matures entrent dans le circuit

sanguin, les ganglions lymphatiques et les organes associés aux tissus lymphoïde via des cellules

endothéliales spécialisées localisées dans les veinules postcapillaires (HEV). Ils traversent les

vaisseaux lymphatiques efférents et continuent vers d'autres ganglions, pour arriver au canal

thoracique et entrent dans la circulation sanguine par la veine subclaviaire gauche. Les

lymphocytes entrant dans les différentes zones de la rate, sortent par la veine splénique. (Dans:

Roitt, Brostoff et Male, Immunology 4th ed., 1996. Chap. 3, Fig. 3.26, p 3.9. ISBN 0 72342178 1).

Modifiée par Dominguez Z, 2001).

67

4.1 LE SYSTÈME DE DÉFENSE

Le système de défense immunitaire a évolué pour protéger l’organisme contre les

infections. On distingue:

l'immunité innée, non-spécifique, ou non-adaptative.

l'immunité spécifique, ou adaptative.

4.1.1 IMMUNITE INNEÉ

L’immunité innée, aussi appelée non-immune ou non-adaptative, est un système de

réponse immédiate qui n’est pas spécifique de l’antigène qui est à l’origine de l’activation

du système. La réponse s’installe peu de minutes après l’invasion de l’agent agresseur sans

avoir besoin de la mémoire antigènique. Ce processus est appelé inflammation. Les

neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les cellules «natural killer» (NK), les

monocytes, et les macrophages sont les médiateurs cellulaires de ce système de réponse.

Ces cellules jouent aussi un rôle dans le développement de la réponse immune-spécifique

4.1.2 IMMUNITE SPÉCIFIQUE

L’immunité spécifique ou adaptative, est caractérisée par une réponse antigène-

spécifique contre un antigène étranger ou pathogène. En général, la réponse immune exige

plusieurs jours, même plus, pour se mettre en place. Le signe distinctif de cette immunité

est la mémoire pour l’antigène qui est à l’origine de l’activation du système. Ceci permet

l’élaboration d’une réponse beaucoup plus rapide, et souvent plus forte, au moment d’une

deuxième exposition à l’agent infectieux.

Les lymphocytes T matures, les lymphocytes B, les monocytes et les cellules

présentatrices d’antigènes, comme les cellules dentritiques (Langerhans) ou les

macrophages entre autres, sont les responsables de l’installation de la réponse. Ces cellules

rentrent dans la circulation et se domicilient dans les organes lymphoïdes périphériques

(ganglions lymphatiques, rate), les organes associés au tissu lymphoïde (amygdales,

plaques de Peyer, appendice ) vers la peau et les muqueuses où elles attendent l’activation

induite par un antigène étranger ou pathogène.

68

4.1.3 LA TOLÉRANCE IMMUNE

La tolérance immune est une caractéristique fondamentale du système immunitaire

qui prévient la réactivité lymphocytaire contre les tissus du soi. Un processus

d’apprentissage, de reconnaissance des antigènes propres, assure ainsi une population

circulante et résidente de lymphocytes T et B non réactive aux auto-antigènes. La sélection

clonale faite sur les lymphocytes T dans le thymus, et sur les cellules B, dans la moelle

osseuse élimine les lymphocytes hyper-réactifs. Une deuxième sélection est faite à la

périphérie. Dans la circulation ou dans les tissus, les lymphocytes qui ont échappé à la

première sélection sont éliminés ou deviennent anergiques. Cette incapacité de répondre

aux auto-antigènes détermine la tolérance immune.

4.1.4 AUTO-IMMUNITÉ

La tolérance immune peut s'altérer et ainsi conduire à l’auto-immunité et à la

destruction du tissu corporel par le système immunitaire. L’auto-immunité peut apparaître

par exemple, après une forte co-stimulation de lymphocytes T par une cellule présentatrice

d’antigène. L’antigène dérivé du micro-organisme envahisseur peut croiser avec des auto-

antigènes et conduire à la perte de la tolérance immune. Une puissante stimulation des

lymphocytes T qui étaient auparavant anergiques aux auto-antigènes, les rend réactifs,

menant à une condition pathologique auto-immune dont le diabète type I fait partie.

4.2 RÔLE FONCTIONNEL DES SOUS-TYPES DE LYMPHOCYTES

Les lymphocytes sont les cellules entièrement responsables de la reconnaissance

immune-spécifique des pathogènes. Ce sont eux qui vont initier la réponse immune

adaptative. Les lymphocytes sont dérivés des cellules souches de la moelle osseuse; les

lymphocytes T se développent dans le thymus, tandis que les lymphocytes B restent dans

la moelle osseuse pour leur développement. Le système immunitaire est bifonctionnel:

l'immunité humorale est assurée par les lymphocytes B

l’immunité cellulaire est assurée par les lymphocytes T

D’autres cellules effectrices et régulatrices du système immunitaire sont les

lymphocytes larges granulaires, les monocytes-macrophages et les cellules

dentritiques/Langerhans.

69

4.2.1 LES LYMPHOCYTES T

Les cellules CD34+ pro-T- sont les cellules souches de la moelle osseuse qui

caractérisent la lignée T, ces cellules migrent vers le thymus où elles vont subir le

processus de maturation vers l'une ou l'autre des deux lignées de lymphocytes T. Le

récepteur à l'antigène des cellules T (TCR) est constitué soit des chaînes γ δ soit des

chaînes α β.

Seulement 1−10% des lymphocytes T expriment le récepteur γ δ TCR. Dans le

thymus, les lymphocytes γ δ TCR n’expriment ni la molécule CD4 ni CD8 mais au niveau

périphérique ils peuvent exprimer la molécule CD8. Les lymphocytes TCR γ δ ont une

fonction de surveillance des surfaces épithéliales et de défense contre des micro-

organismes et autres bactéries intracellulaires.

Les lymphocytes αβ TCR représentent de 90 à 99 % des lymphocytes intra-

thymiques totaux. Initialement les lymphocytes à récepteur αβ TCR immatures expriment

sur leur surface les deux molécules CD4 et CD8. Au fur et à mesure de leur maturation

thymique, et sous l’influence du processus de sélection auto-antigènique, ils vont réguler

négativement la molécule CD8 pour devenir lymphocyte T CD4+ (helper) ou il cessent

d’exprimer la molécule CD4 pour devenir CD8+ (cytotoxique).

Les lymphocytes αβ T CD4+ qui rentrent dans la circulation ont été sélectionnés pour

reconnaître des fragments de peptides associés aux molécules CMH de classe II des

cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules matures αβ T CD4+ induisent la

différenciation des lymphocytes B, la prolifération des cellules CD8+ cytotoxiques,

synthétisent un nombre important de cytokines et régulent certaines étapes de

l’érythropoïèse. Les lymphocytes α β T CD8+ ont été sélectionnés pour reconnaître des

fragments antigèniques en association aux molécules de classe I du CMH.

Une fois le contact établi entre le lymphocyte T CD4+ ou CD8+ et le fragment antigénique

via les molécules CMH classe I ou classe II, la liaison est stabilisée par l’intermédiaire de

molécules d’adhésion non-antigène-spécifiques appartenant à la superfamille des

immunoglobulines et des intégrines. La stabilisation de la liaison mène à l’activation

cellulaire et à la transmission des signaux qui vont réguler la fonction lymphocytaire.

L’activation des tyrosine kinases de la famille Src, fyn et lck, la phosphorylation de la

chaîne CD3 ζ, l’activation des tyrosine kinases ZAP-70 et syk, l’activation de la voie de

Ras et des MAP kinases sont des processus déclenchés à la membrane plasmique, qui enfin

aboutissent à l’activation de facteurs de transcription NF-AT, fos et jun, et rel/NF-κB.

70

L’expression de l’IL-2 et de son récepteur, de l’IL-4, du TNF ou d’autres médiateurs

synthétisés par le lymphocyte T est ainsi induite. L’activation du lymphocyte T nécessite

également une co-stimulation comme celle de CD2 activé par le CD58 ou celle de CD28

activé par CD80. La signalisation via CD28 semble importante car le blocage de CD28

entraîne l’anergie ou l’inactivation du lymphocyte T (Joss et al., 2000)

4.2.2 LES LYMPHOCYTES B

Les lymphocytes B expriment sur leur surface des récepteurs d’antigènes: les

molécules d’immunoglobulines (Ig). À la différence des lymphocytes T, dont la

reconnaissance antigènique est restreinte aux fragments d’antigènes associés aux

molécules de classe I ou II du CMH, les lymphocytes B grâce à leur Ig de surface sont

capables de reconnaître des antigènes complets. Par ailleurs, les lymphocytes B expriment

aussi des récepteurs pour la fraction Fc des IgG (CD32) ainsi que des récepteurs pour les

composants actifs du système du complément (C3d ou CD21, C3b ou CD35). La fonction

principale des lymphocytes B est la production des anticorps. Les lymphocytes B

fonctionnent aussi comme des cellules présentatrices d’antigènes (APC) efficaces. La

fonction d’APC peut être augmentée par une variété de cytokines.

4.2.3 LYMPHOCYTES LARGES GRANULEUX

Ce sont des cellules non-adhérentes, non-phagocytaires comportant une grande

quantité de granules azurophiles. Certains lymphocytes larges granuleux (LGL) expriment

le récepteur pour la région Fc des IgG ce qui leur permet d’éliminer des cellules opsonisées

par des IgG, (cytotoxicité facilitée par anticorps). Un autre type de LGL, a une activité

cytotoxique du type NK. Celle-ci ne dépend pas de la mémoire immune, et est

fondamentale pour la surveillance immune et la destruction des cellules qui pourraient

devenir malignes de façon spontanée. Certains virus et cancers down-régulent l’expression

de la molécule CMH-I. La cellule infectée ou transformée n’est alors plus capable

d’induire une réponse cytotoxique de type T CD8+ restreinte par le CMH-I restrictif, d’où

l’importance de l’activité NK.

71

Certains LGL expriment des marqueurs de la lignée T, notamment CD8 et

prolifèrent en réponse à l’IL-2. Plusieurs récepteurs ont été identifiés sur les lymphocytes

NK. Ils représentent un groupe hétérogène de protéines, appartenant à deux familles

principales:

la super famille des immunoglobulines

la famille des protéines transmembranaires de type lectine.

4.3 DOMICILIATION DES LYMPHOCYTES

L’expression des molécules d’adhésion sur la surface des lymphocytes et des

cellules endothéliales contrôle la rétention et la sortie subséquente des lymphocytes des

sites de stimulation antigénique et prévient le retour des lymphocytes activés dans le pool

de lymphocytes circulants. Le processus de migration le mieux connu est la domiciliation

lymphocytaire ou «homing». Celle-ci comprend la recirculation des lymphocytes entre le

sang et les organes lymphoïdes secondaires (Figure 8, p 66). Différentes sous-populations

de lymphocytes migrent à travers les différents tissus lymphoïdes, la plupart vers les

ganglions lymphatiques, tandis que certains migrent préférentiellement vers les plaques de

Peyer dans l’intestin grêle, par exemple. Cette caractéristique permet de constituer des

sous-systèmes de lymphocytes organes-spécifiques. Le sous-type de lymphocytes localisé

dans les plaques de Peyer est spécialisé pour monter une réponse contre des antigènes qui

rentrent dans l’organisme par la voie intestinale. La recirculation des lymphocytes est

contrôlée par l’interaction lymphocyte/cellule endothéliale par l’intermédiaire des

récepteurs de domiciliation lymphocytaires et ses contre-récepteurs endothéliaux dans

certaines zones spécialisées des vaisseaux, appelée high endothelial venules (HEV). Ainsi,

la première étape du processus d’interaction est l’attachement et le roulement, ou rolling

des leucocytes sur la surface endothéliale. Le roulement des lymphocytes est facilité par la

molécule sélectine-L (CD62L); les contre-récepteurs exprimés par les HEV sont des

oligosaccharides sulfatés présents dans trois molécules différentes: la molécule dépendant

des glycosylaminoglycanes, glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 (GlyCAM-

1), le CD34, et l’adressine, mucosal cell adhesion molecule 1 (MAdCAM-1), qui

conduisent à l’adhésion des lymphocytes aux HEV. Le roulement des lymphocytes ralentit

le transit cellulaire à travers les veinules, ce qui assure un temps de contact bref mais

suffisant pour permettre l’activation des cellules qui ont adhéré. Ensuite, un deuxième

système d’adhésion dépendant de certains membres de la famille des intégrines comme

72

CD11b/CD18 (MAC-1) ou CD11a/CD18 (LFA-1) se met en place. Ceci permet une

interaction beaucoup plus forte qui conduit à l’arrêt des lymphocytes et leur migration vers

l’organe lymphoïde secondaire.

La première étape d’attachement des lymphocytes aux HEV ne dure que quelques

secondes, alors que la migration à travers l’endothélium (illustré dans la figure 9) requiert

environ 10 min. La molécule CD44 (H-CAM) des HEV ainsi que le glycocalix (matrice

extracellulaire) peuvent jouer un rôle important dans la migration. Finalement, l’expression

de métalloprotéases capables de digérer la membrane basale sous-endothéliale, riche en

collagène, est nécessaire pour la pénétration des cellules lymphoïdes vers les sites

extravasculaires. Les figures 4 (paragraphe 1, p 41). et 9 illustrent l’adhésion et la

migration des leucocytes, respectivement.

Figure 9. Migration à travers l'endothélium. La microphotographie montre la migration d'un

lymphocyte-T activé sur l'endothélium rétinien in vitro. La cellule migratoire s'attache à

l'endothélium et se projette par pseudopode (d'après Greenwood J dans: Roitt, Brostoff et Male

Immunology 4th ed., 1996. Chap. 14. Cell Migration and Inflamation, Fig. 14.1, p 4.1).

Des anomalies des HEV et des molécules d’adhésion, comme celles mentionnées

ci-dessus ont été impliquées dans la physiopathologie d’un certain nombre de maladies

inflammatoires chroniques comme l’arthrite rhumatoïde, la thyroïdite de Hashimoto, la

maladie de Graves, la sclérose multiple, la maladie de Crohn, la colite ulcérative et le

diabète sucré insuline dépendant (IDDM). Dans des modèles animaux de IDDM,

MAdCAM-1 et GlyCAM-1 sont fortement exprimés dans les HEV des îlots pancréatiques

enflammés. Le traitement des animaux avec des inhibiteurs de la sélectine-L et d’α-4

intégrines bloque le développement du diabète (Yang et al., 1994).

73

5. MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES Il est bien connu à présent que la différenciation et prolifération cellulaire ainsi que

l’apoptose sont des processus dépendant de l’adhésion cellulaire. L’adhésion a donc une

dualité fonctionnelle, morphogénétique et de signalisation qui explique le rôle

pléiotropique de ce processus dans la physiologie et la physiopathologie.

5.1 L’ADHÉSION CELLULAIRE

L’adhésion cellulaire se produit quand le récepteur d’adhésion exprimé sur la

membrane plasmique d’une cellule interagit avec une molécule de la matrice

extracellulaire ou avec celle d’une cellule voisine. La réversibilité de ce processus, qui se

traduit par des cycles d’adhésion et de détachement permet aux cellules de se déplacer

l’une par rapport à l’autre ou vers la matrice extracellulaire. Des processus fondamentaux

comme la fécondation, l’embryogenèse, la morphogenèse, la structuration et la réparation

des tissus sont dépendants de l’adhésion tout comme l’hémostase et les réponses

inflammatoires et immunes. Les interactions cellule-cellule et/ou cellule-matrice

extracellulaire, induisent la production de messages lors de l’activation des molécules de

signalisation cellulaire qui sont ancrées dans les sites d’adhésion.

5.2 LES LIAISONS INTERCELLULAIRES DU CIRCUIT SANGUIN

Les cellules endothéliales sont fortement liées entre elles, ce qui leur permet de

maintenir leur intégrité. Les interactions avec l’espace sous-endothélial et avec les cellules

voisines, cellules musculaires lisses, fibroblastes et cellules du sang sont également

importantes. De plus, l’innervation sensorielle de l’endothélium permet d’établir une

liaison entre les espaces intra et extra vasculaires. Des changements de la pression et du

flux, par exemple, sont détectés par l’endothélium. Les interactions intercellulaires et celles

avec la matrice extracellulaire déterminent la nature de la réponse biochimique ou

mécanique qui sera mise en place.

5.2.1 MOLÉCULES DES JONCTIONS INTERCELLULAIRES

La limitation des échanges entre le sang et les tissus est due aux caractéristiques

structurales de l’endothélium. Les jonctions intercellulaires sont à la base de la fonction de

«barrière» attribuée aux cellules endothéliales.

74

5.2.1.1 Les jonctions serrées et adhérentes

Les jonctions serrées sont particulièrement importantes dans l’endothélium de la

barrière hémato-encéphalique. Elles se différencient de celles des cellules endothéliales

d’autres tissus par leur complexité. L’occludine est une protéine transmembranaire qui

constitue les filaments des jonctions serrées. Elle s’exprime en forte proportion et se

distribue de façon continue aux jonctions des cellules endothéliales des capillaires

cérébraux. Dans les autres tissus, son expression est beaucoup plus faible et sa distribution

aux contacts cellule-cellule est discontinue (Hirase et al., 1997). Les claudines, sont des

protéines qui font aussi partie des jonction serrées. Ce sont des protéines intégrales de

membrane avec quatre domaines transmembranaires. La claudine 5 est exprimée dans la

cellule endothéliale de certains segments du vaisseau sanguin. D’autres protéines qui sont

aussi associées aux jonctions serrées sont les protéines cytoplasmiques Zonula occludens

ZO-1 ZO-2 et ZO-3. Cette large famille de molécules semble être impliquée dans la

fonction d’organisation des zones spécifiques de la surface cellulaire. ZO-1 et ZO-2

peuvent se lier directement aux jonctions adhérentes.

Les jonctions adhérentes, un des types de jonctions d’ancrage, relient les cellules entre

elles ainsi qu’à la matrice extracellulaire par l’intermédiaire du cytosquelette. Ce sont des

sites de connexion pour les filaments d’actine. Les cadhérines sont des composants

structuraux des jonctions adhérentes. (Figure 10). Ce sont des protéines

transmembranaires, sensibles au Ca2+ (Takeichi, 1991). Elles s’associent via leur domaine

cytoplasmique, aux caténines, protéines d’attachement intracellulaire ainsi qu’à la p120, un

substrat des tyrosine kinases (Shibamoto et al.,1995). Les caténines permettent

l’interaction de la cadhérine avec l’actine du cytosquelette. Une perturbation des jonctions

adhérentes, provoquée par exemple par une déplétion en Ca 2+ extracellulaire, induit une

augmentation de la perméabilité des jonctions serrées. Les cadhérines établissent

l’adhésion cellule- cellule par un mécanisme homophylique et lient les cytosquelettes des

cellules jointes. Les cadhérines sont une famille de plus de 15 protéines transmembranaires

avec 5 domaines extracellulaires homologues, une seule région transmembranaire et une

queue cytoplasmique qui interagit avec l’actine du cytosquelette via les protéines

d’attachement intracellulaire. L'E-cadhérine épitheliale est la plus connue, elle est aussi

exprimée dans l'endothélium. En outre, la N-cadhérine assure le contact entre les cellules

endothéliales et les cellules musculaires lisses ou les péricytes (Navarro et al., 1998). Les

HUVEC expriment la VE-cadhérine qui diffère des autres cadhérines essentiellement dans

la séquence cytoplasmique. La VE-cadherine constitue un marqueur des cellules

75

endothéliales, car elle s’exprime pendant les étapes très précoces du développent

vasculaire, sur les angioblastes.

Figure 10. Architecture des protéines aux jonctions cellule-cellule (d'après Staddon et

Rubin, 1996).

5.3.MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALE

Les mécanismes endocrines sont apparus pour permettre des interactions entre

cellules de différente localisation anatomique. Les mécanismes paracrines ont raccourci la

distance qu’une molécule de signalisation doit traverser pour joindre son récepteur dans la

cellule cible. Le mécanisme le plus simple, s'opére quand une molécule d’adhésion dans

une cellule lie son contre-récepteur dans une autre cellule, en établissant le contact cellule-

cellule et la transmission de signaux. Le message transmis va altérer la fonction de la

deuxième cellule. Ceci est appelé signalisation juxtacrine.

Les facteurs d’adhésion vasculaire: sélectines, intégrines et certains membres de la

superfamille des immunoglobulines et leurs contre-récepteurs interagissent de façon

directe ou indirecte avec les systèmes de transduction de signaux intracellulaires. La

signalisation outside-in assurée par les intégrines est l’exemple le mieux connu. Elle a été

décrite initialement pour les interactions avec la matrice extracellulaire (Juliano et Haskill,

1993).

76

5.3.1 SÉLECTINES

La famille des sélectines comprend trois molécules d’adhésion, les sélectines-L, E et

P. La lettre désigne le type cellulaire où la molécule a été identifiée pour la première fois.

Ainsi

la plupart des leucocytes expriment la sélectine-L

l’endothélium activé la sélectine-E

les α-granules plaquettaires et les corps de Weibel-Palade endothéliaux la sélectine-P.

Ces molécules sont spécialisées dans la capture des leucocytes depuis la voie

sanguine vers la paroi du vaisseau. Le contact initial entre le leucocyte et la cellule

endothéliale est suivi par le ralentissement des leucocytes circulants et leur roulement.

C’est la première étape d’une cascade d’interactions moléculaires qui aboutit à

l’extravasation des leucocytes

La figure 11 représente la structure des sélectines. La partie extracellulaire est

composée de trois domaines différents. L’extremité NH2-terminale (120 aa)

particulièrement conservée, représente le domaine Ca2+ dépendant de type lectine C. Il lie

un oligosaccharide spécifique. Ce domaine, est suivi par une séquence répétée de 35-40 aa,

appelé EGF domain. La structure se continue avec un nombre variable de modules de

séquences courtes bien conservées de +/- 60 aa, homologues aux protéines régulatrices du

système de complément. Ce domaine nommé complement binding element (CB) domain

comporte six résidus cysteinyl capables d’établir des ponts disulfures. Il est suivi par un

segment transmembranaire et une queue cytoplasmique qui comporte l’extrémité

carboxyterminale. L’éclaircissement de la relation structure-fonction des sélectines, a

établi l’importance des domaines lectine et EGF. La plupart des anticorps monoclonaux

bloquants de l’adhésion reconnaissent des épitopes localisés dans ces régions (Waltz et al.,

1990; Siegelman et al., 1990; Pigott et al., 1991). Par contre, la fonction des modules

homologues des protéines régulatrices du complément est moins connue. Il a été montré

que l’élimination d’un nombre croissant de ces domaines affecte l’efficacité avec laquelle

la sélectine-P peut assurer le roulement des leucocytes (Patel et al., 1995). La différence de

taille entre les trois sélectines est due à la présence d’un nombre différent de domaines CB

dans leur séquence.

77

Bien que les trois sélectines aient une structure et des fonctions similaires, leur

profil d’expression sur la surface cellulaire est par contre bien diffèrent. L’expression de la

sélectine-E est restreinte à l’endothélium activé par des endotoxines ou par des cytokines

inflammatoires. L’expression maximale après 4-6 heures d’activation, retourne à la valeur

basale vers les 24-48 heures (Bevilacqua et al., 1989; Bevilacqua et al., 1987). La synthèse

de novo d’ARN et de protéines est obligatoire.

Figure 11. Structure des trois sélectines. Elles possèdent un domaine lectine qui lie des

saccharides exprimés sur les cellules indiquées (d'après: Roitt, Brostoff et Male. Immunology 4th

ed., 1996. Chap. 14 Cell Migration and Inflamation, Fig. 14.8, p 14.5). Modifiée par Dominguez Z,

2001.

En plus des facteurs solubles, le contact entre le leucocyte et la surface endothéliale

peut moduler l’expression de la sélectine-E. La coincubation des HUVEC avec des

monocytes humains du sang périphérique induit une expression de sélectine-E soutenue

pendant plus de 24 heures (Rainger et al., 1996). Le contact entre les cellules est

nécessaire, et les anticorps anti-TNF-α n’inhibent que partiellement la réponse (Noble et

al., 1996). De la même façon, l’expression de la sélectine-E est induite lors de la coculture

avec des lymphocytes T provenant de souris infectées avec Leishmania, ou sensibilisés aux

allergènes de contact (trinitrochlorbenzene) (Sunderkötter et al., 1996). De nouveau, le

contact entre les cellules est nécessaire et les anticorps anti-TNFα n’ont pas d’effet. Il

Sélectine-P Sélectine-E Sélectine-L

DomaineLectine

Domaine EGF

Domaine CB

STRUCTURE DES TROIS SÉLECTINES

saccharides exprimés surPlaquettes, PMN, leucocytes HEVendothélium endothélium

78

semble possible que la molécule CD40 soit partiellement responsable étant donné que la

liaison d’une forme soluble recombinante du ligand de CD40 au CD40 endothélial conduit

à l’induction de sélectine-E (von Hollenbaugh et al., 1995; Yellin et al.,1995).

Contrairement à la sélectine-E, la sélectine-P est synthétisée de façon constitutive et

stockée dans des compartiments intracellulaires. Les plaquettes sanguines ou les cellules

endothéliales stimulées peuvent mobiliser rapidement le pool intracellulaire à la surface de

la cellule. Dans la plaquette, l’expression de la sélectine P à la surface cellulaire se produit

en quelques secondes tandis que ce processus peut prendre quelques minutes dans la

cellule endothéliale. L’expression est de courte durée, maximale entre 5-10 min après la

stimulation, et retourne à l’état basal après 30-60 min. Récemment, il a été montré que la

synthèse de sélectine-P peut être induite, comme celle de sélectine-E, par l’IL-1 et le TNF

(Weller et al., 1992; Sanders et al., 1992). Par ailleurs, les deux sélectines endothéliales

peuvent être exprimées de façon constitutive dans certains tissus. L’expression constitutive

de la sélectine-E dans l’endothélium de tissus hématopoïétiques humains a été démontrée

par immunohistochimie (Schweitzer et al., 1996). D’une façon similaire, dans les veinules

de la peau non enflammée un rolling des lymphocytes en partie dépendant de la sélectine-P

a été mis en évidence. Ces résultats montrent que certains vaisseaux sanguins n’ont pas

besoin d’un stimulus inflammatoire pour exprimer la sélectine-P.

Parmi les trois sélectines, seule la sélectine-L est exprimée de façon constitutive à

la surface des cellules. Après activation, les sélectines sont rapidement clivées à la surface

cellulaire (Jung et al., 1988), un processus nommé shedding. Il semble donc, que l’activité

des sélectines puisse être contrôlée par leur apparition/disparition sur la surface cellulaire.

Le rolling est facilité par les trois sélectines tandis que le homing des lymphocytes aux

ganglions lymphatiques dépend exclusivement de la sélectine-L.

5.31.1 Signalisation par les sélectines.

Les premières observations montrant un rôle de la sélectine-L dans la transduction

des signaux ont été décrites dans des cellules humaines activées. Une augmentation du

Ca2+ cytosolique libre ainsi que de l’expression des ARNm du TNF-α et de l’IL-8

(Laudanna et al.,1994) a été observée dans les PMN, après liaison des résidus sulfatides à

la surface de la cellule. Les mêmes auteurs montrent une augmentation du Ca2+

intracellulaire induite par un anticorps monoclonal anti-sélectine-L. La liaison de

l’anticorps stimule aussi, en présence de concentrations sub-optimales de FMLP, la

production de H2O2 (Waddell et al., 1994). Des expériences réalisées sur des PMN

79

montrent que la liaison de la sélectine-L avec trois anticorps différents augmente la

phosphorylation de la tyrosine dans plusieurs protéines incluant la MAP kinase (Waddell et

al., 1995).

D’autre part, Crockett Torabi et al. (1995) ont été les premiers à montrer que la

liaison de la sélectine-L avec des anticorps augmente l’expression de la β2 intégrine, Mac-

1. Plusieurs travaux, ont ensuite démontré qu’il existe une séquence d’événements qui

conduit à l’activation des intégrines une fois que la voie des sélectines a été activée. Ainsi,

Hwang et al. (1996) ont démontré que la liaison de GlyCAM-1 à la sélectine-L des

lymphocytes humains induit l’activation de Mac-1 qui, par la suite, lie son contre-récepteur

ICAM-1. De la même manière, dans des PBL ou des cellules Jurkat T, il a été montré que

GlyCAM-1 peut aussi activer la liaison de la β1-intégrine à la fibronectine (Giblin et al.,

1997). L’activation des intégrines par la sélectine-L semble donc physiologique.

La liaison de la sélectine-E avec des anticorps permet la coprécipitation des

protéines du cytosquelette comme l’α-caténine, la vinculine, la paxilline, la filamine, et la

kinase d’adhésion focale (FAK). Ces protéines ne copurifient pas si l’étape de cross-

linking est omise (Yoshida et al.,1996). L’activation des plaquettes par des agonistes

comme la thrombine ou le collagène mène aussi à des changements de la forme de la

plaquette et à la phosphorylation/déphosphorylation rapide de la sélectine-P (Crovello et

al., 1993).

L’adhésion des monocytes à l’endothélium activé par des cytokines stimule

l’expression du facteur tissulaire. Ceci est partiellement inhibé par des anticorps anti-

sélectine-E. Certaines étapes de la cascade de transduction des signaux déclenchés par le

PSGL-1 ont été identifiées. La liaison de lymphocytes T humain provenant du sang

périphérique à la sélectine-P immobilisée stimule la tyrosine phosphorylation de FAK

(Haller et al., 1997). Les anticorps anti-PSGL-1 ainsi que l’addition de PMN à la sélectine-

P immobilisée stimulent la phosphorylation de certaines protéines, notamment la p42-44

MAPK, sur des résidus tyrosine (Hidari et al., 1997). Très récemment, Hu et al. (2000) ont

étudié l’importance, pour la transduction des signaux, de la partie transmembranaire de la

sélectine-E. Cette partie peut potentiellement agir sur de multiples événements incluant la

régulation des gènes des cellules endothéliales durant la première phase de la réponse anti-

inflammatoire, le recrutement des leucocytes. Des expériences in-vitro sur des HUVEC

activées (0-30’) par l’IL-1 β, montrent que des anticorps anti-sélectine-E, augmentent

80

substantiellement l’activité de la MAPK alors que des anticorps anti-HLA-1 dont

l’expression a été aussi forte que celle de la sélectine-E, n’ont pas d’effet.

Les anticorps anti-sélectine-E induisent la formation du complexe macromoléculaire

Ras/Raf-1/phospho-MEK, ainsi que l’augmentation de l'ARNm du gène précoce, c-fos, qui

dépend de l’activation de MAPK. Le domaine cytoplasmique de la sélectine-E peut être

essentiel pour le mécanisme de transduction du signal, car sa délétion partielle supprime

l’activation de la MAPK, la formation du complexe Ras, Raf-et phosphoMEK et

l’induction des ARNm de c-fos en réponse aux anticorps anti-sélectine-E (Hu et al., 2000).

En plus, l’expression de la sélectine-E dans les HUVEC induite par IL-1 ou le TNFα est

inhibée de façon dose-dépendante par les inhibiteurs de tyrosine kinases, la génistéine et

l’herbimycine (May et al.,1996). Dans les mêmes conditions, la génistéine inhibe

l’expression de VCAM-1 mais pas celle d’ICAM-1.

5.3.2 LES INTÉGRINES

Les intégrines forment une large famille de glycoprotéines homologues

transmembranaires. Elles fonctionnent comme récepteur cellulaire principal de la plupart

des protéines extracellulaires. Toutes les intégrines sont des hétérodimères constitués de

deux sous-unités α et β. Les domaines extracellulaires s’associent de façon non covalente

pour former des héterodimères α et β. Les deux sous-unités comportent des sites de

fixation pour des cations divalents et participent à la reconnaissance du ligand. Les deux

parties N-terminales des sous-unités α et β s’associent pour former une tête unique qui

reconnaît le ligand. L'association α/β détermine la spécificité pour le ligand

extracellulaire (Hynes, 1992). La plupart des intégrines reconnaissent dans leur ligand une

séquence Arg-Gly-Asp (RGD). Cependant, toutes les protéines contenant une séquence

RGD ne sont pas forcément reconnues par une intégrine. En général, les intégrines peuvent

interagir avec plusieurs ligands distincts, mais certaines ne peuvent en reconnaître qu'un

seul. Les cellules endothéliales expriment différentes intégrines, et sont donc capables de

se lier avec différentes protéines de la matrice extracellulaire (Hynes, 1992). Dans certains

cas, deux intégrines qui partagent le même ligand reconnaîtront chacune un site différent

de la même molécule ; dans d'autres cas, deux intégrines auront une affinité commune pour

la même région de leur ligand. L'expression des intégrines peut sembler redondante, mais

des explications commencent à être envisagées. Il se pourrait, tout d'abord, que de

multiples interactions de la cellule avec la même molécule matricielle soient requises pour

la stabilité du processus d'adhésion. Ensuite, deux intégrines différentes qui se lient à la

81

même région d'un ligand pourraient ne pas transmettre la même information dans la

cellule. Cette hypothèse est basée sur le fait que les domaines cytoplasmiques des

intégrines, en particulier ceux des sous-unités α, sont très variés; ceci pourrait indiquer

que chaque sous-unité contribue à des fonctions intracellulaires différentes, encore mal

connues. Il existe au moins 16 sous-unités α et 8 sous-unité β. Elles s’associent pour

former 21 hétérodimères, αβ, différents. L’expression de ces différentes combinaisons des

sous-unités d’intégrines permet la reconnaissance et la réponse à toute une variété de

protéines extracellulaires dans différentes conditions physiologiques. Par exemple, l’αvβ1

et l’α5β1 fonctionnent comme récepteur de la fibronectine. Ces intégrines sont fortement

exprimées dans les cellules endothéliales quiescentes. Au contraire, l’integrine αvβ3 qui

est aussi récepteur de la fibronectine et de la vitronectine est exprimée exclusivement

pendant le processus d’angiogénèse (Brooks et al 1994a). L'intégrine αvβ3 est aussi

significativement surexprimée durant la cicatrisation tissulaire (Brooks et al., 1994a). Le

fait que l'intégrine αvβ3 soit surexprimée durant les processus d'angiogenèse et de

vasculogenèse suggère qu'elle y joue un rôle important. Des expériences réalisées avec des

anticorps anti-αvβ3 confirment que cette intégrine intervient lors de la néovascularisation

(Brooks et al., 1994a,b; Friedlander et al., 1995). La liaison de l'intégrine αvβ3, en

particulier lors de l'angiogenèse tumorale, pourrait conduire à l'inactivation du gène p53

(Strömblad et al., 1996), et induire un signal de survie dans la cellule en l'empêchant de

rentrer en apoptose (Strömbald et Cheresh, 1996).

Pour simplifier, les intégrines connues sont classées en sous-familles qui ont en

commun la même sous-unité β. Plusieurs familles d’intégrines sont exprimées sur la

surface de la cellule endothéliale; elles incluent les récepteurs pour des composants de la

matrice extracellulaire: fibronectine, laminine, collagène. Elles appartiennent au groupe

des β−1 intégrines connues sous le nom de VLA pour very late antigen car elles ont été

identifiées pour la première fois, sur des lymphocytes T durant la phase tardive de la

réponse immune.

Les familles β1, β2 et β7 sont exprimées sur les lymphocytes. L’intégrine

α4β1(VLA-4) est la seule intégrine du groupe des β1-intégrines présente sur les

lymphocytes. Outre la fibronectine, elle reconnaît la protéine transmembranaire

endothéliale vascular cell adhesion molécule, VCAM-1. Celle-ci est une protéine

inductible qui appartient à la superfamille des immunoglobulines. Les intégrines β-1 sont

aussi exprimées sur les monocytes, les basophiles et les éosinophiles.

82

Les intégrines β2 sont présentes sur les leucocytes et phagocytes mononucléés. Les

membres de cette famille reconnaissent de façon sélective les ICAMs, Intercellular

adhesion molecule et les protéines C3b et C4b qui sont des composantes de la cascade

d’activation protéolytique du système du complément (Figure 12).

Figure 12. Molécules d'adhésion endothéliales. Les molécules ICAM-1, ICAM-2, VCAM-

1et MadCAM-1 sont illustrées dans le diagramme avec leurs domaines du type immunoglobuline.

MadCAM possède un segment fortement glycosylé qui peut se lier à la sélectine-E. Les intégrines

contre-récepteurs sont indiquées au dessus (d'après Roitt, Brostoff et Male. Immunology 4th ed.,

1996. Chap. 14 Fig. 14.6, p14.4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.

Toutes les cellules T expriment une intégrine du sous groupe β2, LFA-1 ou αΛβ2,

pour lymphocyte function antigen. Cependant, cette intégrine s’exprime plus fortement sur

les cellules T RO+ (mémoire) que sur les cellules T RA+ (naïves). Les interactions entre

les intégrines LFA-1 leucocytaires et leur contre-récepteurs sur l’endothélium déterminent

l’adhésion ferme. Les leucocytes une fois ralentis par leur mouvement de roulement

peuvent alors répondre aux agents chimiotactiques et aux autres molécules exprimées sur

l’endothélium et la matrice extracellulaire. Ceci modifie la conformation de LFA-1 et

débute le processus de migration cellulaire.

ICAM-1 ICAM-2 VCAM-I MadCAM-1

Intégrines contre-récepteurs

LFA-1, CR3 LFA-1 VLA-4 (LPAM-1) LPAM-1=α4β7

83

La liaison des intégrines à la matrice extracellulaire est caractérisée par des

changements de conformation dans le domaine extracellulaire, la réorganisation du

cytosquelette et l’agrégation des intégrines. Dans plusieurs types cellulaires, l’agrégation

des intégrines conduit à la formation du complexe d’adhésion focal (FAC) qui contient des

protéines du cytosquelette et de nombreuses enzymes impliquées dans la signalisation.

5.3.2.1 Signalisation via les Intégrines

Bien que les intégrines n'aient pas les caractéristiques structurales classiques des

récepteurs de signalisation (pas d'activité kinase ou phosphatase par exemple), elles sont

néanmoins capables de transmettre des signaux depuis la matrice extracellulaire jusqu'au

compartiment intracellulaire (Jockusch et al., 1995) par l’interaction de complexes de

signalisation appelés points focaux d'adhésion (figure 13). Les protéines du cytosquelette

associées aux points focaux d’adhésion sont essentiellement l'α-actinine, la vinculine, la

taline, la tensine et la paxilline; les protéines de signalisation incluent les kinases focal

adhesion kinase (FAK), Src, et la protéine kinase C (PKC). Plusieurs cascade de

signalisation sont activées lorsque les intégrines se lient à leur ligand extracellulaire

(Juliano et Haskill, 1993; Miyamoto et al., 1995; LaFlamme et Auer, 1996). La diversité

des signaux qui résultent du nombre et du type d'intégrines liées, suggère qu'ils peuvent

être envoyés à différents compartiments de la cellule, y compris le noyau, et moduler

l'expression de gènes (Jockusch et al., 1995; Clark et Brugge, 1995). Un exemple de ces

différences de signalisation liées à l’intégrine mise en jeu est donné par Friedlander et al.

(1995), dans des expériences d'induction de l'angiogenèse dans la cornée de lapin. En effet,

l'induction de l'angiogenèse par le TNF-α ou le bFGF conduit à une néovascularisation

principalement αvβ3-dépendante, alors que l'induction de l'angiogenèse par le VEGF et le

TGF-α aboutit à une angiogenèse αvβ5-dépendante. De plus, ces auteurs ont montré que

l'angiogenèse dépendante de l'intégrine αvβ5, mais pas celle dépendante de l'αvβ3,

pouvait être inhibée par la calphostine C (un inhibiteur de la PKC); ces résultats mettent en

évidence que plusieurs voies de signalisation, selon le type d'intégrine mise en jeu, peuvent

intervenir dans la morphogenèse capillaire. Les intégrines αvβ3 et αvβ5, bien que

relativement proches d'un point de vue structural conduiraient cependant à deux voies de

signalisation différentes.

La liaison des intégrines à leur contre-récepteur active une variété de voies de

signalisation incluant des protéine kinases, des inositol lipide kinases, des protéines G et

l’antiport Na+/H+ qui sont normalement associés à des voies de stimulation par des facteurs

84

de croissance (Ingber et al., 1990). Dans plusieurs types cellulaires, la liaison des

intégrines induit la phosphorylation de FAK, et de la paxiline, une protéine adaptatrice. La

FAK joue un rôle dans la régulation des changements dynamiques d’organisation de

l’actine du cytosquelette pré-requis pour la migration cellulaire. La tyrosine-

phosphorylation de FAK est stimulée par le intégrines β1 et β3 (Guan et Shalloway, 1992).

Figure 13. Fonction des intégrines. Les intégrines (α,β) maintiennent les cellules par une

extrémité aux protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine, collagène) ou à d'autres

molécules des cellules voisines. Par l'autre extrémité, les intégrines se lient aux protéines du

cytosquelette (actine, taline, tensine, vinculine, α-actine) et de la signalisation telles que les kinases

focal adhesion kinase (FAK), Src (d'après Horwitz A F, 1997). Modifiée par Dominguez Z, 2001.

PROTÉINES DE SIGNALISATION

PROTÉINES DU CYTOSQUELETTE

INTÉGRINES

MATRICE EXTRACELLULAIRE

FAK

85

De nombreux travaux montrent une convergence entre la signal généré par les intégrines et

la signalisation via Ras. (Chen et al., 1994). De la même façon, l’adhésion via des

intégrines active les MAPK. L’activation des MAPK se situe en aval de la signalisation via

Ras. Dans les HUVEC et les ECV304, il a été montré que la phosphorylation des MAPK

est dépendante de l’ancrage des cellules endothéliales à la fibronectine (Short et al., 1998).

Les mêmes auteurs ont montré que l’activation de MAPK induite par les mitogènes est

aussi dépendante des intégrines

5.3.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION CELLULAIRE

Un certain nombre de molécules d’adhésion endothéliales appartient à la super-

famille des immunoglobulines: Intercellular adhesion molecule-1 et 2 (ICAM-1 et ICAM-

2), vascular cellular adhesion molecules-1 (VCAM-1), mucosal addressin cellular

adhesion molecule (MadCAM-1).

5.3.3.1 MolÉcule d’adhÉsion intercellulaire-1, ICAM-1-

ICAM-1 est exprimée de façon constitutive (à faible concentration) sur la cellule

endothéliale et elle est aussi présente dans d’autres types cellulaires incluant les

lymphocytes T (Dustin et al., 1986; Pober, 1988). ICAM-1 est une protéine fortement

glycosylée qui comporte cinq domaines extracellulaires, un segment transmembranaire et

une queue cytoplasmique (Figure 12, p 82). Dans des tissus vasculaires, in vivo,

l’expression d’ICAM-1 augmente significativement durant la réponse inflammatoire

(Munro et al., 1989). In vitro, son expression est rapidement régulée positivement par les

cytokines inflammatoires telles que l’IL-1, le TNF, l'INF-γ et l’endotoxine bactérienne,

LPS.

Au cours de la reconnaissance antigénique par les lymphocytes, l’expression d’ICAM-1 est

régulée positivement (Rothlein et al., 1988). L’utilisation des mAbs contre ICAM-1 et

LFA-1 a démontré que l’interaction ICAM-1/LFA-1 joue un rôle principal dans des

fonctions leucocytaires dépendant de l’adhésion ainsi que dans la réponse immunitaire. Il a

été montré que le blocage d’ICAM-1 bloque l’activation des lymphocytes B dépendant du

lymphocyte T, la reconnaissance de cibles par les lymphocytes T-cytotoxiques ainsi que la

réponse inflammatoire.

86

5.3.3.1.1 Signalisation via ICAM-1

Il était admis que la fonction d’ICAM-1 était restreinte à l’adhésion étant donné son

rôle dans l’adhésion ferme. Cependant, de nombreuses évidences ont établi sa participation

dans la signalisation. Dans des lymphocytes B de souris, la liaison d’ICAM-1 et de CMH

II induit l’expression des récepteurs de l’IL-2 (Poudrier et Owens, 1994). Dans les PMN, la

liaison d’ICAM-1 conduit à l'explosion respiratoire.

La transduction de signaux via les récepteurs de surface est régulée par des

changements dans l’activité de kinases et phosphatases spécifiques. La structure

moléculaire d’ICAM-1 ne prédit pas une activité tyrosine-kinase intrinsèque. Cependant,

dans une lignée de lymphocytes B, la phosphorylation de plusieurs protéines tyrosine-

kinase incluant la famille Src Kinase, Raf-1 et MAP kinase a été induite par l’activation

d’ICAM-1 (Holland et Owens, 1997). Les auteurs proposent que la liaison d’ICAM-1

permet l’association et/ou l’activation de Lyn, une des protéines de la famille Src,

induisent la tyrosine phosphorylation des protéines cellulaires. Les effets de l’activation de

Lyn, Raf-1 et MAP Kinases induits par la liaison d’ICAM-1 ne sont pas connus à présent.

Dans d’autres systèmes, la MAP kinase active plusieurs protéines cytoplasmiques telles

que les phospholipases C, A2 et des facteurs de transactivation nucléaire: facteur nucléaire

IL-6, c-Fos, cMyc entre autres (Thomas et al., 1992).

De plus, dans les HUVEC, la liaison d’ICAM-1 induit l’expression de VCAM-1 par

un mécanisme diffèrent de celle induit par le TNF ( Lawson et al., 1999).

5.3.3.2 MolÉcule d’adhÉsion intercellulaire-2, ICAM-2

ICAM-2 est un autre membre de la superfamille des immunoglobulines Elle

possède une masse moléculaire 55-65 kDa. Son expression sur l’endothélium est forte et

constitutive. Au contraire d’ICAM-1, l’expression n’est pas régulée par les médiateurs

inflammatoires (De Fougerolles et al., 1991). ICAM-2 est aussi présente dans les

lymphocytes et les monocytes. C’est un ligand constitutif de l’intégrine

CD11a/CD18(LFA-1), son contre-récepteur dans le mécanisme d’adhésion forte.

5.3.3.3 MolÉcule d’adhÉsion cellulaire vasculaire, VCAM-1

VCAM-1 est une protéine faiblement exprimée sur les cellules endothéliales au

repos mais son expression est rapidement induite par les médiateurs proinflammatoires.

Elle est aussi exprimée par des cellules présentatrices d’antigènes ainsi que, de façon

87

constitutive, dans la moelle osseuse. En général, la cinétique d’expression de VCAM-1,

induite par le LPS ou l’INF-γ montre un maximum après 3 h de stimulation. Avec le

TNFα, le pic est plus tardif, (6-8 h après la stimulation) et l’expression se poursuit pendant

72 h (Swerlick et al., 1992). L’amplitude de l’expression et sa cinétique varient selon le

type de stimulus et le type de cellules endothéliales considérés. Par exemple, l’expression

de VCAM-1 induite par le LPS ou le TNFα est plus forte et maintenue plus longuement

dans les HUVEC que dans les cellules endothéliales des microvaisseaux de l’intestin

humain. Ceci est aussi vrai pour l’ICAM-1 (Haraldsen et al., 1996). VCAM-1 est

impliquée dans l’adhésion ferme des leucocytes, mais également dans le roulement (Alon

et al., 1995). Ses contre-récepteurs sont les intégrines VLA-4 (α4β1) et (α4β7) exprimées

sur les cellules mononucléés, les monocytes et les lymphocytes.

La présence de VCAM-1 dans la lésion athéromateuse humaine est bien connue.

L’expression semble en relation avec l’augmentation du nombre de cellules mononuclées

dans la plaque athéromateuse (O’Brien et al, 1996).

5.3.3.4 MolÉcule d’adhÉsion cellulaire plaquette-cellule endothÉliale, PECAM-1

Une des protéines de contact inter-endothélial dont l’expression n’est pas restreinte

aux structures des jonctions est la PECAM-1, platelet endothelial cell adhesion molecule-

1. En plus des cellules endothéliales, elle est présente dans les plaquettes, les PMN, les

monocytes et dans quelques sous-types de lymphocytes T.

Dans les cellules endotheliales sub-confluentes, PECAM-1 est distribuée de façon diffuse.

Après établissement du contact cellule-cellule, elle est concentrée aux sites de jonctions

intercellulaires où elle participe à des interactions de type homophilique. Le blocage des

PECAM-1, leucocytaires et endothéliales, bloque la migration trans-endothéliale des

leucocytes (Muller et al., 1993).

Récemment Newman (1999) a présenté des arguments permettant de classer

PECAM-1 dans une sous-famille composée d’environ 30 membres. Ces protéines sont

caractérisées par la présence d’un ou plusieurs motifs ITIM pour immunoreceptor tyrosine-

based inhibitory motif dans leur domain cytoplasmique. La phosphorylation des différents

résidus tyrosine des ITIM permet le recrutement des tyrosine phosphatase SHP-1 et SHP-2

et inhibe la phosphorylation des tyrosine présentes dans les ITAM du CD3 (Vestweber,

2000). Le blocage de PECAM-1 avec des anticorps active les intégrines β-1, β-2 et β-3

(Varon et al., 1998; Tanaka et al., 1992; Piali et al., 1993).

88

5.4 INTERACTION LYMPHOCYTE-CELLULE ENDOTHELIALE

Le lymphocyte est une des cellules qui a le potentiel d’influer sur le recrutement

des leucocytes aux sites de la lésion. Grâce à sa capacité de sécrétion de cytokines et

d’autres médiateurs, il pourrait réguler l’expression des ECAMs (Vassalli, 1992). Le rôle

des lymphocytes dans l’amplification de la réponse inflammatoire a été bien étudié

(Jordan, 1991; Stutman, 1986).

Des résultats récents indiquent que plusieurs populations de leucocytes circulants

peuvent participer à la régulation de l’expression des ECAMs. Par exemple, Noble et al.

(1996) ont montré l’induction de l’expression de la sélectine-E lors de la coculture

d’HUVEC avec des monocytes du sang périphérique. Le contact cellule-cellule est

nécessaire pour observer l’effet. Un effet similaire, dépendant du contact, a été également

décrit pour différents ECAMs des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux.

L’expression d’ICAM-1, VCAM-1 et de sélectine-E est induite par les membranes

plasmiques de lymphocytes T activés (Lou et al., 1996). La même étude montre que le

contact cellule-cellule augmente la production endothéliale d’IL-6 et d’IL-8. L’expression

des ECAMs et la production d’IL-6 est partiellement diminuée (<45%) en présence

d’inhibiteurs du TNFα.

89

6. ACIDES GRAS ω−3 ET LES MALADIES CARDIO-VASCULAIRES

L’intérêt pour les acides gras de la famille ω−3 en relation avec les maladies

cardiovasculaires (MCV) a démarré après les travaux de Bang et Dyerberg dans les années

70. Ces travaux ont montré chez les Inuites l’absence de MCV malgré une très forte

consommation de graisse (40% des calories totales journalières).

6.1 SOURCES ALIMENTAIRES DES ACIDES GRAS ω−3

La principale source d’acide α-linolénique (18:3 ω−3) trouvée dans la chaîne

alimentaire provient du règne végétal. Dans les feuilles vertes il représente 56 % des AG

totaux. Les légumes verts sont donc la principale source alimentaire de 18:3 ω−3 chez

l’Homme avec certains fruits (banane) et huiles végétales (soja). Les sources d’acides

eicosapentaénoïque (EPA, 20:5 ω−3) et docosahexaénoïque (DHA, 22: 6 ω−3) se trouvent

dans le règne animal. Les poissons marins sont particulièrement riches en EPA, notamment

la sardine. Un huile de sardine contient environ 21% d’EPA par rapport aux AG totaux,

(Dominguez et Bosch, 1994) une proportion largement supérieure aux 15% trouvés dans la

plupart des spécialités pharmaceutiques. Les poissons d’eaux douces sont par contre

relativement plus riches en DHA (Ortiz et Bosch., 1993).

6.2 LA RÉVOLUTION INDUSTRIELLE ET LES MALADIES

CARDIOVASCULAIRES

La révolution industrielle a sans doute marqué le point de départ vers une

augmentation des MCV. L’athérosclérose est une des MCV, qui a été longtemps

considérée comme liée au processus du vieillissement. Cependant des facteurs autres que

le vieillissement peuvent prédisposer à la maladie de façon précoce. La consommation

d’aliments contenant des acides gras saturés et des acides gras poly-insaturés de la famille

ω−6 a augmenté depuis l’industrialisation alimentaire. Ceci a eu pour conséquence de

modifier le rapport des acides gras ω6/ω3 de l’alimentation. Dans la Figure 14

l'estimation de cette modification est illustrée.

Des études épidémiologiques ont montré que les MCV sont pratiquement

inexistantes dans les populations consommatrices de produits d’origine marine (Kromhout

et al., 1985; Bjerregaard et Dyerberg, 1988; Keli et al., 1994; Hirai et al, 1989; Kromhout,

1989; Feskens et al., 1993).

90

Figure 14. Effet de la révolution industrielle sur l'apport calorique. Estimation de la

consommation de calories dérivées des lipides et de la modification du rapport des acides gras

ω6/ω−3 entre les périodes paléolithique et industrielle (d'après Eaton et Konner, 1985. Paleolitic

Nutition: a consideration of its nature and current implications. N Engl J Med. 312:283-289.

6.3 L’ATHÉROSCLÉROSE UNE DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES

L'athérosclérose est une maladie atteignant les gros et moyens vaisseaux. Elle est à

l’origine de la plupart des coronaropathies, des anévrismes aortiques et des artériopathies

des membres inférieurs et joue également un rôle déterminant dans les artériopathies

cérébrales. L’épaississement et le durcissement de la paroi artérielle ont une forme en

plaque nodulaire. Les lésions sont habituellement classées en lésions précoces (lésions

initiales et stries lipidiques), en lésions intermédiaires, en plaques fibreuses et en lésions

compliquées. La formation de cette plaque est associée à des changements entraînant la

dégénérescence de la média et de l'adventice. Certaines plaques sont largement fibreuses,

d'autres sont molles, graisseuses et prédisposées à des complications additionnelles

(calcification, ulcération avec thrombose et hémorragie intraplaquettaire) qui rétrécissent

davantage la lumière ou même provoquent une occlusion totale. Le centre de ces plaques

contient des débris riches en lipides contenant du cholestérol (CH) et des esters de CH. Ces

plaques sont nommées athéromes, elles sont le signe pathognomonique de l’athérosclérose.

91

6.3.1 ATHÉROGENÈSE

Basée sur plusieurs données expérimentales, l’hypothèse de la réaction à un

traumatisme est une des théories sur la pathogénie de l’athéromatose généralement admise.

Selon cette hypothèse, les cellules endothéliales bordant l’intima sont exposées à des

agressions continues ou répétées menaçant leur intégrité. Á certains endroits du système

artériel, les cellules endothéliales lésées exposeraient le tissu sous-endothélial à des

concentrations croissantes des constituants plasmatiques. Le traumatisme de l’endothélium

peut être discret ou important provoquant pour ces cellules la perte de leurs fonctions

normales et de leur rôle de barrière. Á l’extrême, les cellules peuvent desquamer. Cela peut

amorcer toute une série d’événements comme l’adhésion des monocytes et des plaquettes,

la migration de monocytes dans l’intima et leur différenciation en macrophages,

l’agrégation des plaquettes et la formation de microthrombi. La libération de substances

sécrétées par les plaquettes et les macrophages, ainsi que des constituants du plasma

comme des lipoprotéines et des hormones telle que l’insuline pourraient stimuler la

prolifération des cellules musculaires lisses dans les endroits lésés. Parmi les exemples

d’agression de l’endothélium, on note les traumatismes d’origine métabolique comme une

hypercholestérolémie chronique ou l’homocystéinémie, ceux d’origine mécanique comme

dans l’hypertension, et ceux d’origine immunologique observés après une transplantation

cardiaque ou rénale ou dans les maladies autoimmunes.

6.3.1.1 L’évolution de la plaque athéromateuse

Le recrutement des leucocytes est un facteur déterminant dans la formation des

stries lipidiques. Ceci représente le stade précoce de l’athéromatose. Les lymphocytes et

les monocytes sont préférentiellement recrutés et conditionnent l’évolution de la lésion

athéromateuse. Ainsi, les cellules musculaires lisses répondent aux facteurs stimulants

sécrétés par les cellules recrutées, prolifèrent et synthétisent une matrice conjonctive, et se

chargent en lipides. Ce processus peut être accéléré par l’hyperlipidémie. Les macrophages

provenant des monocytes peuvent également se charger en lipides, qui pour la plupart

d’entre eux sont sous la forme de lipoprotéines oxydées. Ces modifications chimiques

produites par oxydation et glycation non-enzymatique des lipoprotéines complexées aux

protéoglycanes, ont un rôle important dans l’athérogénèse. Les macrophages sont aussi

capable de modifier les lipoprotéines in situ, favorisant leur captation par des récepteurs

éboueurs (scavengers). Les cellules endothéliales et les macrophages peuvent synthétiser

92

une protéine chimioattractante qui accélère l’accumulation de macrophages dérivant des

monocytes.

Les forces de cisaillement de type laminaire qui sont présentes dans la plupart des

artères suppriment l’expression des ECAMs, dont VCAM-1 et augmentent la production

endothéliale de monoxyde d’azote (NO) et de PGI2. Ces molécules vasodilatatrices

produites de façon constitutive par l’endothélium artériel peuvent agir localement comme

des autacoïdes anti-inflammatoires. L’altération locale des forces hémodynamiques peut

modifier ces mécanismes cellulaires de protection contre la formation d’une lésion

athéromateuse et expliquer ainsi sa distribution focale. En fait, les points de bifurcation des

vaisseaux où le flux est turbulent sont des sites préférentiels de développement de la lésion

athéromateuse (Figure 15).

Figure 15. Distribution non-aléatoire des lésions athéromateuses. Modèle expérimental

de d'hyperlipidémie de type II chez le lapin Watanabe. Les lésions riches en lipides dans la paroi

artérielle sont visualisées par le colorant Oil-Red-0. (d'après Topper et Gimbrone, 1999. Modifiée

par Dominguez Z, 2001).

Arche de l'aorte thoracique

Nature localisée des lésions

93

Trois types d’altération vasculaires se succéderaient de façon séquentielle:

l‘altération fonctionnelle des cellules endothéliales sans changements

morphologiques significatifs,

la dénudation endothéliale avec l’altération de l'intima, mais la média et la

lamina sont intactes, et

la dénudation endothéliale avec altérations de l'intima et de la média.

Ces altérations facilitant la brisure ou fissure de la plaque athéromateuse conduisent à la

thrombose. Celle-ci, joue un rôle important dans l'évolution de l'athérosclérose et dans les

manifestations des maladies coronariennes aiguës (Meyers et Maloley, 1993).

6.4 LES ACIDES GRAS ω−3 ET L’ATHÉROSCLÉROSE

L’apport essentiel des travaux menés par le groupe de Bang et Dyerberg chez les

Eskimos, a été l’établissement d’un relation de cause à effet entre la forte consommation

d’AGPI de la famille ω−3 et la faible incidence des MCV observée dans cette population.

Ces premières observations ont été le point de départ de différents travaux de recherche

visant à trouver des mécanismes susceptibles d’expliquer la protection contre les MCV

induite par les acides gras (AG) ω−3. Entre 1980 et 2000, les ω−3 ont fait l’objet de plus

de 3000 publications.

6.4.1 EFFETS ANTITHROMBOTIQUES DES ACIDES GRAS ω−3

Les eicosanoïdes dérivés des AG de la série ω−3 ont un effet inhibiteur de la

coagulation. Le temps de saignement qui est un index négatif du risque thrombotique

augmente significativement après une supplémentation en EPA et DHA. Chez les Eskimos

il est d’environ 8 min, le double de la moyenne trouvée chez les occidentaux (Dyerberg et

Bang, 1979). Dans les plaquettes sanguines, l'EPA inhibe le métabolisme de l’AA,

précurseur du thromboxane A2 (TXA2), le plus puissant agrégeant plaquettaire. La

libération de l’EPA à partir des phospholipides de la membrane plaquettaire en réponse

aux agonistes entraîne la synthèse de TXA3 qui n’est pas agrégeant plaquettaire, ainsi que

la diminution de la synthèse de TXA2. (Tamura et al., 1987). Dans le

polymorphonucléaire, la libération de l’EPA conduit à la synthèse de leucotriène B5

(LTB5) à activité chimiotactique très faible comparée à celle du LTB4, puissant

chimiotactique dérivé de l’AA.

94

La substitution partielle de l’AA par l’EPA dans les lipides membranaires induit la

diminution de la production des eicosanoïdes actifs par deux voies :

la production d’eicosanoïdes moins actifs, et

l’inhibition de la synthèse des dérivés de l’AA

Le DHA inhibe la PGHS, mais il peut aussi, après rétroconversion en EPA devenir

substrat pour la synthèse endothéliale de PGI3. Celle-ci est, comme la PGI2 un eicosanoïde

vasodilatateur et antiagrégeant plaquettaire (Sanders, 1989). Au contraire de l’effet observé

sous anti-inflammatoires non-stéroïdiens, la supplémentation orale en EPA et DHA de

l’ordre de 3-5 g/j conduit à la diminution de TXA2 et LTB4 sans diminution de PGI3

(Fischer et al., 1986).

La balance hémostatique après enrichissement des phospholipides en EPA et DHA

s’incline vers l’antithrombogénèse. La production d’eicosanoïdes des séries 3 et 5 assure

une moindre réactivité plaquettaire due à la diminution du rapport TXA2/TXA3 ainsi

qu’une faible chimiotaxie due à la production de LTB5. En revanche, la production de

prostacyclines biologiquement actives, PGI2 et PGI3 est globalement maintenue, (Fischer et

Weber, 1984; Hornstra et al.,1990; von Schacky et al., 1985), la diminution de PGI2 étant

partiellement compensée par la formation de PGI3 (Bordet et al., 1986).

Cependant, certains changements hématologiques, comme la diminution du nombre

de plaquettes et de la concentration en hémoglobine ont été montrés chez l’Homme après

la supplémentation en AGPI ω−3 (von Houwelingen et al, 1987., Sanders et Hinds, 1992).

Chez le rat, une anémie a été observée après 15 jours d’un régime contenant 10 ou 15 %

d'huile de poisson (Dominguez et Bosch, 1994) et un cas d’anémie sévère chez l’Homme a

été rapporté (Sinclair, 1981).

6.4.2 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA SYNTHÈSE DE PROTÉINES

Concernant la synthèse de protéines, l’enrichissement des cellules en AGPI ω−3 a

des effets opposés suivant le gène considéré:

un effet inhibiteur sur la synthèse de certaines cytokines: IL-1(α, β), ΙL2, TNFα

(Endres et al., 1989; Endres et al., 1993 ; Wallace et al., 2001), IL-6 (Meydani et

al., 1991; Khalfoun et al., 1997). Ceci entraîne la diminution de la fonction

95

immune spécifique et non-spécifique ou un déséquilibre entre les réponses de type

Th-1 (cellulaire) et Th-2 (humorale) (Wallace et al., 2001).

un effet inducteur de la synthèse de certaines enzymes: catalases, superoxyde-

dismutase, gluthation-peroxydase (Chandrasekar et Fernandez, 1994) enzymes clés

du système antioxydant protéique.

La régulation de la synthèse de protéines par les AGPI ω−3 a été mise en évidence

in-vivo. Il a été montré que les AGPI ω−3 sont les plus puissants répresseurs du gène de la

synthase des acides gras (FAS), du gène S14. (Clarke et al., 1990a.; Clarke et al., 1990b;

Blake et Clarke, 1990; Clarke et Jump, 1994), acyl-CoA carboxylase (ACC) et stearoyl-

CoA desaturase (SCD) (Pegorier, 1998). Les gènes de FAS, ACC et SCD sont sous le

contrôle de SREBP sterol regulatory element-binding proteins. Les AGPI ω−3 régulent

négativement l’expression de SREBP-1c ARNm; ceci a été proposé comme un des

mécanismes moléculaires responsable de l’inhibition de la lipogenèse induite par les AGPI

ω−3 (Kim et al., 1999). De cette façon, la régulation négative de la synthèse de lipides en

conjonction à la stimulation de leur oxydation peut expliquer la forte diminution de la

concentration de triglycérides plasmatiques induite par les AGPI ω−3 chez les

hypertriglyceridémiques (Rambjør et al., 1996; Roche et Gibney, 1999). En fait,

l’induction par les acides gras ω−3 d’enzymes régulatrices de l’oxydation des lipides telles

que la lipoprotéine lipase, l’acyl-CoA synthétase, la carnitine palmitoyltransférase1, l’acyl-

CoA dehydogenase et l’acyl-CoA oxydase a été démontrée (Clarke et Jump, 1994; Louet et

al., 2001). Le mécanisme moléculaire d’induction de l’oxydation peut s’expliquer au

moins en partie par l’induction de PPARα et la subséquente induction de l’acyl-CoA

oxydase microsomale et la cytochrome P450 4A2 peroxisomales, enzymes dépendant de

PPARα.

Il a été démontré que les AG de la série ω−3 régulent négativement l’expression

des ECAMs (Weber et al., 1995; Collie-Duguid et Wahle, 1996; Κhalfoun et al, 1996; De

Caterina et Libby, 1996; Sanderson et Calder, 1998) et celle des récepteur éboueurs du

macrophage de souris (Miles et al., 2000). Cette régulation est prétraductionnelle et semble

liée à la présence des doubles liaisons dans la chaîne hydrocarbonée. Les AGPI de la série

ω−3 ont la plus forte activité inhibitrice par rapport à la série ω−6 ou aux acides gras

monoinsaturés (De Caterina et al., 2000).

96

L’adhésion des lymphocytes au repos aux cellules endothéliales (Κhalfoun et al.,

1996 , Dominguez et al., 2001) ou à des macrophages (Sanderson et Calder, 1998) au

repos diminue après enrichissement des cellules en AGPI ω−3. Cet effet sur l’adhésion est

également observé dans différents modèles avec pré-activation des cellules (Weber et al.,

1995; De Caterina et Libby, 1996; Sanderson et Calder, 1998). Ces mécanismes

moléculaires et cellulaires peuvent expliquer les propriétés anti-athérogénes et anti-

inflammatoires attribuées au acides gras ω−3.

6.4.3 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA RÉPONSE IMMUNE

Le but thérapeutique dans la plupart des maladies immunes chroniques est de

rétablir la tolérance aux autoantigènes pour surmonter la contrainte d'une

immunosuppression pharmacologique. Il n’existe aucune évidence que la manipulation des

acides gras de l’alimentation influence les réponses immunes essentielles telles que la

mémoire immunologique ou l’induction de la tolérance immunologique. Néanmoins,

différentes manipulations chez des patients montrent un effet immunosuppresseur induit

par des régimes riches en AGPI ω−3 (Stenson et al., 1992; Lawrence et Sorrell, 1993).

Des modèles expérimentaux montrent également des résultats prometteurs d'une utilisation

thérapeutique des AGPI ω−3. La diminution de médiateurs de l’inflammation synthétisés

par des macrophages isolés de souris traitées avec des régimes riches en AGPI ω−3 a été

démontrée (Yaqoob et Calder, 1995). Plus récemment la diminution de NO, TNFα,

monocyte chemoatractan proteine-1 dans des macrophages alvéolaires ainsi que la

diminution de l’activité NK ont été décrites chez le rat après 5 semaines d’un régime riche

en AGPI ω−3 (Sasaki et al., 2000).

La suppression de la réaction d’hypersensibilité retardée et de la prolifération des

lymphocytes T induite par des mitogènes après un régime riche en EPA et DHA a été

montrée chez la souris. La réduction de la capacité proliferative des lymphocytes T est

corrélée à la diminution des ARNm du récepteur de l’IL-2 et de la sécrétion de IL-2. Ceci

suggère que les acides gras EPA et DHA bloquent l’activation autocrine mediée par l’IL-2

(McMurray et al., 2000). Les mêmes auteurs montrent l’amoindrissement in vitro de la

production des seconds messagers, tels que DAG et céramides après stimulation

mitogénique. Un effet immunosuppresseur sélectif du DHA sur la réaction

d’hypersensibilité par contact chez des souris sensibilisées avec le 2,4-dinitro-1-

fluorobenzène a été décrit. Le DHA mais pas l’EPA a été efficace pour réduire

97

l’infiltration des lymphocytes T CD4+ ainsi que l’expression des ARNm de interferon-γ,

IL-6, IL-1β, et IL-2 au site de la lésion (Tomobe et al., 2000). Enfin, la fonction

présentatrice d'antigènes des monocytes activés aux lymphocytes autologues, in vitro, est

significativement réduite par l’inhibition de l’expression de molécules MHC classe II

induite par les AGPI ω−3 (Hughes et Pinder, 2000).

6.5 PERSPECTIVES

De nombreux arguments indiquent que l’athérogenèse est liée à un processus

immuno-inflammatoire (Wick et al., 1997; Emeson et al., 1996; Zhou et al., 1996). Des

données sur les aspects cellulaires et moléculaires montrent qu’une des premières étapes

dans l’athérosclérose chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux est l’adhésion de

monocytes et lymphocytes T à la surface endothéliale ainsi que leur subséquente migration

à l’intima (Duplaa et al., 1996; Watanabe et al., 1997; Campbell et Campbell., 1997). Ce

processus peut être dynamiquement régulé par l’état d’activation et d’expression des

molécules d’adhésion endothéliales. Les effets inhibiteurs des AGPI ω−3 sur l’expression

des ECAMs et sur l’adhésion des cellules mononucléées à l’endothélium vasculaire

pourraient faire partie des mécanismes de protection attribuée aux AGPI ω−3.

La révision et discussion des effets des acides gras ω−3 sur la prévention et le

traitement des MCV a fait l’objet d’une publication récente (Schmidt et al, 2.000) dans

laquelle les auteurs émettent les conclusions suivantes:

⎬ La consommation de poisson peut être recommandée pour réduire les risques de MCV

chez les sujets sains ainsi que chez les patients ayant de hauts risques de MCV ou chez

les malades CV.

⎬ L’utilisation des concentrés d'huiles de poisson ne peut pas être recommandée de

façon générale mais elle doit être considérée chez les patients hypertriglyceridémiques

et après un infarctus de myocarde.

⎬ L’augmentation de la consommation de poisson peut avoir des implications

substantielles en terme de santé publique et d’économie par la réduction du risque des

événements coronariens et de la morte subite.

98

MMMAAATTTÉÉÉRRRIIIEEELLLSSS EEETTT MMMÉÉÉTTTHHHOOODDDEEESSS

99

PARTIE II. MATÉRIELS ET MÉTHODES

1.MATÉRIELS 1.1 MATÉRIEL POUR LA CULTURE CELLULAIRE

Biomedia:

Sérum de Veau fœtal

Falcon:

Boites de culture (25mm et 75mm), plaques de 24 puits (mm) gélatinées.

Gibco:

Antibiotiques (peniciline/streptomycine), Collagènase de type I A, L-glutamine, Milieu de

culture (M-199), RPMI 1640 avec 25 mmoles/L HEPES et 2g/L bicarbonate, Milieu de

congélation des cellules, Phosphate Buffer Saline (PBS) avec et sans Ca2+-Mg2+, Trypsine-

EDTA.

Sigma-Aldrich:

Acides gras libres: acide docosahexaénoïque, acide eicosapentaénoïque, acide oléique,

facteur de croissance pour les cellules endothéliales, gélatine type B, sérum de veau

nouveau né décompleménté.

1.2 ANALYSES LIPIDIQUES

Merck:

Plaque de silice Gel 60 (200 x 200 x 0.5 mm)

Sigma-Aldrich:

Phosphatidylcholine diheptadécanoyl (PC-di 17:0), standard des lipides, Trifluorure de

bore (BF3) 10% dans le méthanol.

1.3 MATERIELS POUR IMMUNOCHIMIE

Chemicon:

anti-facteur von Willebrand, clone LM 609

Coulter:

anti-CD8 conjugué à la fluorescéine (SFCI21Thy2D3, IGG1 souris

anticorps secondaire (F(ab')2) couplé à la fluorescéine (FITC)

Dako:

1,4-diazobicyclo(2,2,2)-octane.

100

Sigma

colorant Hoechst N°33258

1.4 MATÉRIELS POUR IMMUNOEMPREINTE

Amersham-Pharmacia Biotech:

Hyperfilm, Kit ECL, Rainbow (standard de poids moléculaires).

Biorad:

Bio-Ready gels polyacrylamide 10%.

Sigma-Aldrich:

Albumine de sérum bovine, anticorps de souris anti-IgG humain couplé à la peroxidase de

raifort, aprotinine, leupeptine.

Tebu:

anti ERK1/2 non phosphorylé

anti p42-p44 phosphorylé, p-ERK (E-4) sc-7383

Zymed

Anti p42-p44 (ERK-708)

1.5 ANALYSES DE LA PROSTACYCLINE

SPIbio:

Kit de dosage de la 6-oxo-PGF 1α (Cayman Chemical Company).

1.6 RÉACTIFS ET SOLVANTS DIVERS

Prolabo:

Glycerol.

SDS:

Solvants organiques.

Sigma-Aldrich:

Dextran, ficoll, NaCl, lipopolysacharide (LPS), toxine pertussique (Bordetella pertussis),

suramine, Tris–HCL, Trisma base, tween-20, butylhydroxytoluène (BHT).

1.7 PRODUIT RADIOACTIF

NEN-Life Science Products:

Na251CrO4

101

1.8 APPAREILS

Balances (Mettler), centrifugeuses (Jouan), chromatographe (HP 6890 Series, (Hewlett

Packard), compteur gamma (Packard), lecteur de plaques multipuits (Logiciel; Bioelisa-

Labsystems IEMS Reader MF), stéricult (Bioblock) système d’électrophorèse (Bio-Rad),

système de transfert Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instrument), microcentrifugeuse

microscope optique (Nikon), microscope à fluorescence ( Olympus BX60).

2 MÉTHODES 2.1- CULTURE PRIMAIRE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES HUMAINES

Dans notre modèle expérimental nous utilisons des cellules endothéliales provenant

de la veine ombilicale humaine, isolées selon la méthode de Jaffe et al. (1973). Les

cordons ombilicaux proviennent du Service Maternité de la Clinique du Tonkin

(Villeurbanne, France). Un segment de cordon ombilical, de 25 cm en moyenne est prélevé

lors d'un accouchement normal et stocké à 4 °C dans un flacon stérile contenant une

solution isotonique (NaCl 0,15 moles/L). Il est utilisé dans les 12 h qui suivent la

récupération du cordon. Les manipulations sont réalisées dans des conditions stériles. Le

cordon est d’abord rincé avec du PBS préchauffé à 37 °C, et essuyé avec de la gaze stérile.

Les éventuelles marques de clamp aux extrémités sont coupées car elles sont génératrices

de contamination par des cellules musculaires lisses et fibroblastes. La veine ombilicale est

identifiée, canulée et clampée par une extrémité. La veine est rincée par 20 ml de PBS pour

éliminer les cellules sanguines contaminantes, puis une autre canule est placée et fixée à

l'autre extrémité de la veine. Après un nouveau rinçage, 2 seringues de 10 mL sont placées

sur chacune des canules, l'une d'elles contenant 10 mL de collagénase (225 U/mL) dans le

M-199. En jouant sur les 2 seringues la solution de collagénase remplit la veine. Le cordon

est incubé dans du NaCl (0,15 moles/L) à 37 °C pendant 10 à 13 min. A la fin de

l’incubation, le cordon est massé délicatement pour décoller les cellules endothéliales qui

sont restées accrochées à la matrice sous-endothéliale, puis la solution de collagénase

contenant les cellules endothéliales est récupérée dans un tube conique de 50 ml et la veine

est lavée 3 fois avec du PBS. Les tubes sont centrifugés à 200 g pendant 5 min, le culot

cellulaire est repris dans le milieu de culture M-199 contenant 20% de sérum de veau

nouveau-né décomplémenté, 100 µg/mL de streptomycine, 100 UI/mL de pénicilline, 2

mmoles/L de L-glutamine, 0,8 x106 cellules/cordon ombilical sont récupérées en moyenne.

Les cellules en suspension sont distribuées dans des boîtes (25 cm2) de culture traitées à la

102

gélatine, à une densité d’environ 1,5 x104cellules/cm2. Les cellules sont incubées pendant

24 h à 37 °C dans une atmosphère 95% air et 5% CO2 puis le milieu est changé pour

éliminer les cellules non viables non fixées. Les cellules sont alors cultivées dans un milieu

complet contenant le facteur de croissance des cellules endothéliales (50 ng/mL). Le milieu

est changé toutes les 48 h, les cellules atteignent la confluence après 4 jours en moyenne,

leur densité étant alors 5 x104cellules/cm2. Les cellules sont conservées à –200 °C dans le

milieu de congélation 90% SVF-10%-DMSO. La cryoconservation n’altère pas

l’expression constitutive d’ICAM-1, CMH classe I ou II (Ono et al, 1999). Dans toutes les

expériences, les cellules sont utilisées au premier passage (P1) à environ 90% de

confluence

2.1.1 REMISE EN CULTURE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES

Le suspension cellulaire est remise en culture (P1) dans le milieu de culture

contrôle ou dans le milieu enrichi en acides gras (voir détails dans le paragraphe 2.7.1

enrichissement, p 108). La suspension est répartie dans des puits (plaque 24 puits

gélatinés) à une densité de 4 x104cellules/puits. Dans cette condition, les cellules arrivent à

confluence après 72 h. À confluence, le nombre de cellules dans les puits est de l’ordre de

105 cellules/puits. Pour les expériences d’analyse par western blotting des MAPK, les

cellules endothéliales sont réensemencées dans des boîtes de culture prégélatinées de 25

cm2. Dans cette condition le nombre de cellules à confluence est de l’ordre de 106

cellules/boîte.

2.1.2 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE ENDOTHÉLIAL

Lors de la mise en culture en P1, des aliquotes de la suspension cellulaire sont

dispersées dans des puits dans lesquels des lamelles de verre de 12 mm de diamètre ont été

disposées. Les cellules adhèrent à la lamelle et sont cultivées comme décrit ci-dessus.

Après 2 jours elles atteignent 90% de confluence, le milieu est enlevé et les cellules sont

rincées 2x avec du PBS. Les cellules sont ensuite fixées au paraformaldéhyde (3% dans du

PBS) pendant 30 min à température ambiante (T.A). Après rinçage, les cellules sont

incubées pendant 10 min avec NH4Cl (50 mmoles/L) pour enlever les traces de

paraformaldéhyde et rincées 3 fois avec du PBS. La monocouche est ensuite incubée

pendant 30 min dans un tampon de PBS-albumin 1% afin de saturer les sites de liaison non

spécifiques. La monocouche est rincée et les cellules sont incubées pendant 1 h à 4 °C avec

une solution d'anticorps primaire anti-facteur von Willebrand (monoclonal, clone LM 609,

103

Chemicon). Après lavage avec du PBS, le marquage fluorescent est obtenu en incubant

l'échantillon 45 minutes à 4 °C avec un anticorps secondaire (F(ab')2) couplé à la

fluorescéine (FITC coulter). Ensuite les cellules son incubées 10 min avec le colorant

Hoechst N°33258 pour visualiser les noyaux. Finalement, les cellules sont rincées 3 fois à

température ambiante avec du PBS, puis avec de l'eau. Les lamelles sont montées sur

lames de microscope avec un mélange de glycérol, contenant 2,5% de 1,4-

diazobicyclo(2,2,2)-octane (Dako), pour préserver le fluorochrome et ralentir son

extinction au moment de l’analyse par microscopie à fluorescence.

Nous avons vérifié que le marquage obtenu était spécifique, car aucun marquage n'a

été observé en employant l'anticorps secondaire directement.

2.2 PRÉPARATION DES LEUCOCYTES ET DES PLAQUETTES HUMAINES

Les polynucléaires, les cellules mononucléées et les plaquettes sont préparés à

partir de sang veineux périphérique d’un donneur sain, n’ayant eu aucun traitement

pharmacologique depuis au mois dix jours. Le sang est recueilli au centre de transfusion

sanguine de Lyon, sur l’anticoagulant citrate phosphate dextrose [CPD (acide citrique 15,6

mmoles/L, citrate de sodium 89,4 mmoles/L, phosphate monosodique 16,1 mmoles/L,

dextrose 128,7 mmoles/L, pH 5,6)] à raison d’un volume de CPD pour 7 volumes de sang.

2.2.1. PRÉPARATION DES CELLULES MONONUCLÉÉES

Au laboratoire dans des conditions stériles, le sang est immédiatement distribué

dans des tubes coniques par 40 mL de volume et centrifugé pendant 20 min à 120 g, sans

frein, pour éviter l’activation des plaquettes. La phase supérieure contenant le plasma riche

en plaquettes (PRP) est récupérée et la phase inférieure contenant le reste des constituants

sanguins est ajustée au volume initial par l’addition de NaCl 0,15 moles/L:EDTA

1mmole/L pH 7,3. Un volume de 10 mL d’une solution de dextran (1% concentration

finale dans NaCl 0,15 moles/L:EDTA 1mmole/L pH 7,3) est alors ajouté à chaque tube et

le tout est mélangé par inversion. Les tubes sont incubés à 37 °C pendant 30 min pour

faciliter la sédimentation des érythrocytes. Le surnageant contenant les leucocytes est

séparé par centrifugation sur un gradient de Ficoll Hypaque pendant 20 min à 600 g. Les

cellules mononucléées (PBMC), collectées à l’interface, sont lavées 3 fois dans du RPMI

1640 par centrifugation à 300 g pour éliminer le maximum de plaquettes contaminantes.

Les cellules sont ensuite resuspendues dans du RPMI 1640 et comptées au microscope

104

optique sur une cellule de Neubauer. On récupère en moyenne 400 x 106 PBMC pour 500

mL de sang total.

L’analyse par cytométrie de flux (FACS-Star, Becton Dickinson) des préparations

cellulaires montre que 65-70% des cellules sont des lymphocytes T CD3+ (clone T3,

Coulter), 4-6% sont des lymphocytes B CD19+ (clone B4, Coulter), 15-20% sont des

monocytes CD14+(clone UCHM-1, Sigma) et 2-4% sont des plaquettes CD41a+ (GP11b

IIIa, clone P2, Immunotech).

2.2.2 PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE

Les PBMC sont resuspendues à 106cellules/mL dans du RPMI 1640 contenant 10

% de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2

mmoles/L de glutamine. La déplétion en monocytes s’effectue par deux cycles d’adhésion

sur le polystyrène des boîtes de culture. Les PBMC sont incubées pendant 1 h à 37°C dans

des boîtes de culture de 162 cm2 (Costar), dans une atmosphère humide à 95% air et 5% de

CO2, avec un changement de boîtes de culture entre les incubations. La suspension

cellulaire ainsi enrichie en lymphocytes est récupérée et réincubée pendant 72 h, dans des

boîtes de culture de 162 cm2, dans le milieu contrôle ou dans le milieu enrichi en acides

gras (voir détails dans le paragraphe 2.7 «enrichissement», p 107). A la fin de la période

d’incubation, les lymphocytes sont récupérés, purifiés sur gradient de Ficoll-hypaque,

lavés et resuspendus à 1,8 x 106cellules/mL dans du RPMI 1640 contenant 100 U/mL de

pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2 mmoles/L de glutamine (milieu de

coincubation standard).

L’analyse par cytométrie de flux de cette suspension cellulaire enrichie en lymphocytes

montre qu’elle contient moins de 1% de monocytes CD14+ (Leu M3, Becton Dickinson).

2.2.3 PRÉPARATION DES PLAQUETTES SANGUINES

Le PRP récupéré après la première centrifugation du sang total est acidifié à pH 6,4,

par l’acide citrique 0,15moles/L afin d’éviter l’agrégation spontanée des plaquettes. Le

PRP est réparti par fractions de 7 mL dans des tubes coniques et aussitôt centrifugé

pendant 12 min à 900 g. Le surnageant est éliminé et le culot plaquettaire est remis en

suspension dans 5 mL de Tyrode-HEPES (NaCl 140 mmoles/L-KCL 2,7mmoles/L,

NaHCO3 12 mmoles/L, NaH2PO4 0,41 mmoles/L, MgCl2 1 mmole, glucose 5,5

mmoles/LHEPES 5 mmoles/L pH 7,35). Les plaquettes sont comptées et une aliquote de la

105

suspension plaquettaire est reprise dans un volume de milieu de coincubation pour avoir

1,8 x 106 cellules/mL.

2.2.4 PRÉPARATION DES CELLULES POLYMORPHONUCLÉAIRES

Les cellules polymorphonucléaires (PMN) sont récupérés dans le culot obtenu après

centrifugation sur gradient de Ficoll Hypaque Les érythrocytes contaminants sont lysés par

choc hypotonique et éliminés dans le surnageant après 5 min de centrifugation à 400 g. Les

PMN sont ensuite lavées 2 fois dans du PBS par centrifugation à 400 g, comptés et

resuspendus à 1,8 x 106cellules/mL dans le milieu de coincubation.

2.2.5 VIABILITE DES CELLULES La viabilité de tous les types cellulaires déterminée par le test d’exclusion au bleu

Trypan est supérieure à 95%.

2.3 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC

Lorsque les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits, elles arrivent à

environ 90% de confluence en 72 h et leur densité est d’environ 105 cellules/puits. À ce

moment, le milieu est enlevé, la monocouche est lavée 2 fois avec du RPMI et les HUVEC

sont mises en coincubation avec les lymphocytes qui ont été resuspendus dans le milieu de

coincubation à une densité de 1,8 x 106cellules/mL. Un volume de 0,5 mL de la suspension

de lymphocytes est ajouté à chaque puits pour avoir un rapport L/HUVEC 9:1. Le milieu

de coincubation standard (RPMI 1640, 100 U/mL pénicilline, 100 µg/mL streptomycine,

2 mmoles/L glutamine) ne contient pas de sérum. Les deux types cellulaires en contact

sont coincubés en conditions statiques à 37 °C dans une atmosphère humide contenant

95% air et 5% CO2.

La durée de la coincubation varie selon l’étude réalisée. Pour l’étude de la cinétique de

production de la prostacycline, les deux types cellulaires ont été coincubés pendant des

périodes allant de 0 à 20 h. Pour l’identification de la sous-population de lymphocytes qui

adhérent aux cellules endothéliales, la coincubation a duré 1 h. Pour l’analyse de la MAPK

endothéliale, la coincubation a duré 1, 2, 4, 8 et 20 h. Pour le reste des études, le temps de

coincubation à été fixé à 4 h. Dans toutes les expériences, les HUVEC témoins ont été

incubées dans les mêmes conditions sans addition d’autres types cellulaires. A la fin des

différents périodes d’incubation, les milieux de culture sont prélevés, les lymphocytes non

106

adhérents sont éliminés par centrifugation 1 min à 5000 rpm et les surnageants sont stockés

à –20 °C jusqu’au dosage de la 6-oxo-PGF1α.

2.3.1 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES CONDITIONS DE ROTATION

CONTINUE

Pour évaluer l’effet des forces de cisaillement sur la production de prostacycline

induite par les lymphocytes l’expérience de coincubation décrite ci-dessus a été réalisée sur

une plate-forme de rotation. La plate-forme est maintenue à une rotation constante de 9

révolutions par minute. Les cellules sont maintenues à 37 °C dans l’incubateur à

5%CO2/95% air dans une atmosphère humide. Après 4 h de coincubation avec rotation

continue, les milieux de culture sont prélevés, et les surnageants sont stockés pour doser la

6-oxo-PGF1α. La production basale de prostacycline est déterminée dans des HUVEC

témoins incubées seules dans la même condition de rotation.

2.4 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE DES LYMPHOCYTES ADHÉRENTS

A L’ENDOTHÉLIUM

Le phénotype des lymphocytes adhérant à la monocouche de cellules endothéliales

après la coincubation a été étudié par immunofluorescence.

Les HUVEC sont ensemencées sur des lamelles en verre et cultivées jusqu’à pré-

confluence dans du milieu 199 contenant 20% en sérum. Elles sont alors coincubées avec

des lymphocytes selon le protocole décrit dans le paragraphe 2.3 Coincubation

lymphocyte-HUVEC (page précédente). Après 1 heure de coincubation, les lamelles sont

rincées pour enlever les lymphocytes non adhérents et les cellules sont fixées selon le

protocole décrit dans le paragraphe 2.1.2 Caractérisation du phénotype endothélial, p 102.

Elles sont ensuite incubées pendant 1h à 4 °C avec un anticorps anti-CD8 conjugué à la

fluorescéine (SFCI21Thy2D3, IgG1 souris, Coulter clone).

2.5 ÉTUDE AVEC DIFFERENTS INHIBITEURS

Pour évaluer le rôle de la protéine Gi et des protéines tyrosine kinases dans la voie

de signalisation conduisant à la production de prostacycline induite par les lymphocytes

nous avons utilisé dans un premier temps, des inhibiteurs à large spectre comme la

suramine et la génistéine, et dans un deuxième temps des inhibiteurs spécifiques comme la

toxine pertussique le PP1 et le PD98059.

107

2.5.1 ÉTUDE D’INHIBITION AVEC LA SURAMINE, LA GÉNISTÉINE, LA TOXINE

PERTUSSIQUE LE PP1 ET LE PD98059.

Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% de

confluence. Ensuite, elles sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec la suramine

1mmolel/L, la génistéine 0,1mmole/L, la toxine pertussique 50 ng/mlL le PP1 50 µmoles/L

ou le PD98059 25 µmoles/L (concentrations finales). Après, cette période de pré-

incubation, les lymphocytes sont ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) et la coincubation est

maintenue pendant 4 h à 37 °C. Pour l'étude d'inhibition avec la toxine pertussique et le

PP1, avant de procéder à la coincubation, les inhibiteurs sont enlevés et la monocouche est

rincée 3 fois avec du RPMI. Ensuite, les lymphocytes sont ajoutés et la coincubation est

suivie comme décrit ci-dessu. Pour l'étude d'inhibition avec le PD98059, la coincubation a

été réalisée en présence ou en absence de l’inhibiteur. Par la suite, les milieux de culture

sont récupérés, et la 6-oxo-PGF1α. est déterminée dans les surnageants.

2.6 ÉTUDE DE L’ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM

L’adhésion des lymphocytes à l’endothélium a été déterminée à l’aide de

lymphocytes marqués au 51Cr. Les lymphocytes sont incubés pendant 60 min à 37 °C avec

925 KBq de Na251CrO4/106 cellules. Ils sont ensuite lavés 3 fois avec du PBS et remis en

suspension dans le milieu de coincubation à une concentration de 1,8x 106cellules/mL puis

coincubés avec des HUVEC cultivées dans le milieu contrôle ou dans le milieu enrichi en

acides gras. La coincubation se déroule selon le protocole décrit dans le paragraphe 2.3

coincubation lymphocytes-HUVEC, (p 105 ) pendant 4 h. A la fin de la coincubation, le

surnageant est récupéré, les puits sont lavés 4 fois avec du PBS sans Ca2+-Mg2+ et les

cellules endothéliales + lymphocytes adhérents sont solubilisés avec 0,5 mL de NaOH

0,1mole/L. Les lysats sont récupérés et la radioactivité est mesurée dans un compteur

gamma (Riastar, modèle 5410). L’adhésion des lymphocytes est exprimée en pourcentage

de la radioactivité totale des lymphocytes ajoutés à chaque puits.

2.7 ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3

Pour étudier les effets des acides gras ω−3 sur la production de PGI2 et sur

l’adhésion des lymphocytes à l’endothélium chacun des types cellulaires, HUVEC et

lymphocytes, a été cultivé séparément dans un milieu enrichi en l’acide gras ω−3 d’intérêt,

l’EPA ou le DHA. L’acide oléique a été utilisé comme témoin négatif.

108

2.7.1 PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE ENRICHI EN ACIDES GRAS

Le milieu de culture enrichi en acides gras a été préparé par substitution du sérum

contrôle par le sérum enrichi en l’acide gras d’intérêt. Le sérum de veau nouveau-né

décomplémenté (SVNN) utilisé pour la culture des HUVEC ou le sérum de veau fœtal

décomplémenté (SVF) utilisé pour les lymphocytes ont été incubés en agitation continue

pendant 4 h à 37 °C avec l’EPA, le DHA ou l’acide oléique. La concentration finale en

acide gras dans les milieux de culture enrichis est de 60 et 30 µmoles/L pour les HUVEC

et les lymphocytes, respectivement. Le rapport molaire final acide gras/albumine est de

0,5.

2.7.2. ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3

Les HUVEC en P1 ou les lymphocytes sont cultivés pendant 3 j dans leur milieu

contrôle ou enrichi respectif. L’incorporation de l’acide gras d‘intérêt dans les

phospholipides totaux est vérifiée par analyse en chromatographie phase gazeuse. Le

pourcentage de l’acide gras d‘intérêt augmente, par rapport aux cellules témoins, de 1,3

fois pour l’acide oléique, 37,5 fois pour l’EPA et 5 fois pour le DHA dans les HUVEC.

Dans le cas des lymphocytes l’augmentation est de 1,4 fois pour l’acide oléique, 10 fois

pour l’EPA et 4,4 fois pour le DHA.

2.8 ANALYSES BIOCHIMIQUES

2.8.1 DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE DE LA 6-OXO-PGF1α

L’immunodosage est basé sur une réaction antigène (Ag)-anticorps (Ac) qui permet

la détermination quantitative d’une espèce moléculaire grâce à la spécificité du complexe

Ag-Ac formé.

La détermination immunoenzymatique de la 6-oxo-PGF1α, métabolite stable de la PGI2, est

réalisé à l’aide d’un kit de dosage commercial. La figure 16 montre le principe de l’essai

immunoenzymatique. Les différents réactifs sont ajoutés dans les puits selon le protocole

du Kit. Les mesures sont réalisées directement sur une plaque de 96 puits au fond desquels

un anticorps monoclonal anti-lapin est fixé. Le principe du dosage repose sur la

compétition entre l’antigène 6-oxo PGF1α libre à doser dans les échantillons et le traceur,

l’antigène commercial 6-oxo PGF1α conjugué à l’acétylcholinestérase, vis à vis d’un

nombre fixe de sites de liaison sur l’anticorps anti-6-oxo-PGF1α. La concentration du

109

traceur est maintenue constante dans tous les puits tandis que la quantité de 6-oxo-

PGF1α dans les échantillons varie. La quantité de traceur qui se lie à l’anticorps anti-6-

oxoPGF1α est donc inversement proportionnelle à la concentration de la 6-oxo-PGF1α libre

contenue dans chaque échantillon. Le complexe Ag-Ac, [6-oxo-PGF1α (traceur ou libre)-

anti-6-oxoPGF1α (antisérum de lapin)], se fixe à l’anticorps monoclonal anti-lapin qui

recouvre chaque puits. La plaque est incubée pendant 18 h à 4°C. Après l’incubation la

plaque est lavée 5 fois avec 200 µL de tampon de lavage contenant 1% de Tween 20 pour

éliminer les réactifs non fixés. Ensuite, 200 µL de réactif d’Ellman contenant

Figure 16. Représentation schématique du dosage de la 6-oxo-PGF1α

l’acétylcholine, substrat de l’acétylcholinestérase et du 5,5’-dithio-bis-(acide 2-

nitrobenzoique) sont ajoutés. L’hydrolyse de l’acétylcholine par l’acétylcholinestérase

produit de la thiocholine qui réagit de façon non enzymatique avec le 5,5’-dithio-bis-(acide

2-nitrobenzoique). Le produit formé, l’acide 5-thio-2-nitrobenzoique développe une

A) puits pré-enduits B) addition du traceur, de l'anticorps anti-6-oxo-PGF1α et de l'échantillon à doser. Incubation

C) Lavages de puits D) Développement avec le réactif d'Ellman

ANTICORPS MONOCLONAL PROTEINES BLOQUANTES TRACEUR (Acétylcholinestérase conjugué à la 6-oxo-PGF1α ANTICORPS anti-6-xo-PGF1α libre 6-xo-PGF1α LIBRE

110

coloration jaune qui absorbe à 416 nm. Les mesures spectrophotométriques de la densité

optique (DO) sont effectuées dans un lecteur de plaque multipuits.

Une gamme étalon de 6-oxo-PGF1α (de 3,9 à 500 pg/mL) est mesurée en parallèle

avec les échantillons. La fixation non spécifique du traceur au puits en absence d’anticorps

spécifique (NSB, ou Non spécifique Binding), la liaison maximale du traceur à l’anticorps

spécifique en absence de 6-oxo-PGF1α (BO, Maximum Binding) et l’activité enzymatique

maximale de l’acétylcholinesterase (TA, ou Total Activity) sont également déterminées.

Pour chaque échantillon ou standard le % de liaison est calculé à l’aide d’un logiciel

BIOLISE:

(DO (échantillon) – DO (NSB)/ DO (Bo) – DO (NSB)] x 100.

La concentration en 6-oxo-PGF1α des échantillons est déterminée par comparaison avec la

gamme étalon de 6-oxo-PGF1α.

2.8.2 ANALYSES DE LA MAPK ENDOTHÉLIALE PAR IMMUNOEMPREINTE

Pour l’analyse par immunoempreinte (western blotting) de la MAPK endothéliale,

les HUVEC sont coincubées avec les lymphocytes pendant différentes périodes 1, 2, 4, 8 et

20 h ou incubées seules pendant 4 h (condition basale). A la fin des différents temps

d’incubation, les surnageants sont récupérés, les HUVECs sont lavées plusieurs fois avec

du PBS sans Ca2+/Mg2+ pour éliminer le maximum de lymphocytes non-adhérents. Les

HUVEC sont décollées par traitement avec le mélange trypsine (0,5 g/L)/EDTA (0,2 g/L),

centrifugées pendant 5 min à 400 g à 4 °C et les cellules sont ensuite homogénéisées dans

du tampon RIPA [ Tris-HCl 50 mmoles/L, NaCl 150 mmoles/L, NP-40 1%, EDTA 1

mmoles/L, EGTA 1 mmoles/L, Na-deoxycholate 0,25 % (aproptine, leupeptine, pepstatin 1

µg/mL, Na3VO4 1 mmmoles/L, NaF 1 mmoles/L, H2O q.s.p 100 mL] à l’aide d’un potter

verre jusqu’à la lyse totale des cellules. Les échantillons sont congelés à –20 °C jusqu’à

l’analyse par western blotting.

2.8.2.1 Dosage des protéines selon la méthode de Bradford

La quantité de protéines dans les homogènats d'HUVEC est déterminée par la

méthode de Bradford adaptée par Pierce et Suelter (1977). La lecture spectrophotométrique

est effectuée à 595 nm.

111

2.8.2.2 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS

Les échantillons, (20 µg de protéines totales) et des standards de poids moléculaires

sont ensuite déposés dans les puits des minigels de polyacrylamide (10 % pour le gel de

séparation et 4% pour le gel de concentration) et séparés par électrophorèse, dans un

tampon dénaturant en présence de SDS ( pH 8,3) à 120V pendant 90 min.

2.8.2.3 Transfert semi-sec

Le protéines sont alors électrotransférées sur une membrane Immobilon-pII en

polyvinyldifluorure (PVDF) (Milipore). Le transfert se déroule à 0.8mA/cm2 pendant 1h

dans un tampon contenant 25mmoles/L Tris, 0,19 moles/L de glycine et 20 % de méthanol

à pH 8,3 dans un appareil de transfert semi-sec Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instruments).

2.8.2.4 Immunodétection

Toutes les étapes sont réalisées sous agitation orbitale dans un tampon salin TBS

(Tris base 20 mmoles/L, NaCl 137 mmoles/L pH 7,6) contenant 0,1 % de Tween-20,

(TBS-T). A l’issue du transfert, la membrane est incubée dans du TBS-T contenant 1 % de

BSA pendant une nuit à 4 °C pour limiter les fixations non spécifiques. Après 3 lavages de

10 min, la membrane est incubée à température ambiante, pendant 90 min en présence de

l’anticorps primaire: l'anticorps monoclonal anti-p42-p44 MAPK ou anti-phospho p42-p44

MAPK (dilution 1:2000).La membrane est lavée plusieurs fois puis incubée 1 h avec

l’anticorps secondaire couplé a la peroxydase de raifort: anti-IgG de souris (1:5000). La

membrane est soumise ensuite à une dernière série de lavages pendant 90 min avant la

révélation spécifique des protéines par une réaction chimioluminescente (détection ECL).

La solution contenant de l’eau oxygénée, du luminol et des amplificateurs chimiques de

chimioluminescence est ajoutée sur toute la surface de la membrane et laissée en contact

pendant 1 min. La membrane est ensuite exposée à un film (hyperfilm, Amersham).

2.8.3 .ANALYSES LIPIDIQUES

La composition en acides gras des phospholipides totaux est analysée dans les

HUVEC et dans les lymphocytes après 3 j de culture dans un milieu contrôle ou un milieu

enrichi en l’acide gras d’intérêt: EPA, DHA ou oléique (témoin négatif).

112

2.8.3.1 Extraction lipidique

Les lipides cellulaires sont extraits selon la technique de Boukhchache et Lagarde

(1982) par le système chloroforme/éthanol (6:3 v/v) contenant du butyl-hydroxytoluène

(BHT) comme antioxydant à la concentration finale de 5 x 10-5 moles/L. Le mélange est

mis à décanter pendant une nuit à 4 °C. La phase organique est recueillie, évaporée jusqu’à

300 µL de volume et conservée sous azote

2.8.3.2 Séparation des différentes classes de lipides

La séparation des différentes classes lipidiques est effectuée par chromatographie

sur couche mince (CCM). Les extraits lipidiques des cellules endothéliales sont évaporés à

sec sous azote et repris dans de faibles volumes (50-100µL) du mélange éther/méthanol

(9:1, v/v) et déposés sur une plaque de silice gel 60 préalablement lavée au méthanol et

séchée sous hotte. La migration est développée dans le système hexane:éther:acide

acétique (70:30:1, v/v). Les différentes classes de lipides sont identifiées après coloration à

la dichlorofluorescéine et exposition aux UV par comparaison avec des standards. Les

phospholipides, très polaires, restent à l’origine (Rf=0), alors que les lipides neutres

(cholestérol, acides gras libres, mono-, di- et triacylglycérol, esters de cholestérol) migrent

plus loin selon des Rf différents.

2.8.3.3 Analyse des acides gras des phospholipides totaux

Après séparation par CCM, la bande de silice correspondant aux phospholipides est

grattée. Les phospholipides sont transméthylés, sous une atmosphère d’azote, par 1 mL

d’H2SO4 à 5 % dans le méthanol, à 100 °C pendant 90 min. La réaction est arrêtée en

plongeant les tubes dans la glace pendant 5 min. Les esters méthyliques ainsi formés sont

traités par 1.5 mL de K2CO3, à 5% dans l’eau afin de neutraliser le milieu, puis extraits 2

fois par 3 mL d’isooctane. Après centrifugation à 500 g pendant 5 min les phases

organiques sont récupérées, rassemblées, puis évaporées à sec sous un courant d’azote. Les

extraits secs sont repris par un volume d’isooctane puis analysés par chromatographie

gazeuse (CPV) (HP 6890 Séries, Hewlett Packard), sur une colonne capillaire de 30 m x

0,32 mm (SP 2380, Supelco) sous une pression de 0,45 bars. Les esters méthyliques

d’acides gras injectés dans la colonne sont entraînés par le gaz vecteur, l’hélium C. La

température du four dans laquelle se trouve la colonne augmente selon un gradient de

113

températures programmé de 145 °C (5 min) à 215 °C à 2 °C/min Les produits sont

volatilisés dans l’injecteur à 230°C, et sont détectés en sortie de colonne par un détecteur à

ionisation de flamme dont la température est 250 °C.

La séparation s’effectue selon la polarité des acides gras. Cette technique permet

ainsi de séparer les acides gras selon le nombre d’atomes de carbone, le nombre

d’insaturations et la position de ces insaturations. La surface des pics est proportionnelle à

la masse d’acide gras. Les esters méthyliques d’acides gras individuels ont été identifiés

par la comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des esters méthyliques d’acides

gras d’un mélange standard.

2.9 ANALYSES FONCTIONNELLES

Différentes expériences fonctionnelles ont été réalisées pour évaluer les

mécanismes qui pourraient expliquer l’induction de la production de la prostacycline

endothéliale lors de la coincubation avec les lymphocytes.

2.9.1 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES

Les molécules d’adhésion endothéliales sélectine-E, ICAM-1 et VCAM-1 ont été

bloquées avec des anticorps monoclonaux bloquants, provenant d'hybridomes. Ces

hybridomes, propriétés du Prof. Gimbrone M Jr, ont été aimablement donnés par le Dr. De

Caterina R. Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec 300 µL du surnageant

d’hybridome contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-sélectine-E), E1/6 (anti-

VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1). 200 µL d'une suspension de lymphocytes,

prémarqués au 51Cr, à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ajoutés pour avoir un

rapport L/HUVEC 9:1. La coincubation se déroule pendant 4 h. Des HUVEC témoins sont

incubées avec le surnageant d'un hybridome témoin. A la fin de la période de coincubation

les milieux de culture sont prélevés, les lymphocytes non adhérents sont éliminés par

centrifugation 1 min à 5000 rpm. Les surnageants sont stockés à –20 °C pour doser la 6-

oxo-PGF1α. La concentration de 6-oxo-PGF1α determinée dans des surnageants provenant

de cellules HUVEC incubées avec le milieu de coincubation standard (sans sérum) ne

diffère pas de celle obtenue quand les HUVEC sont incubées avec le surnageant de

l’hybridome témoin. Les lymphocytes adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et

la radioactivité est comptée. L’adhésion est exprimée en pourcentage par rapport à

l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC témoins.

114

2.9.2 DOSAGE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES

L’expression des molécules d’adhésion endothéliales sélectine-E, ICAM-1 et

VCAM-1 a été evaluée par ELISA (Takami et al, 1998) sur des HUVEC incubées avec du

lipopolysacharide (LPS) (1µg/mL ou 10 µg/mL dans le milieu de coincubation standard)

utilisé comme témoin positif d’induction de l’expression des ECAMs (Schleimer et

Rutledge, 1986) ou coincubées avec les lymphocytes selon le protocole décrit dans le

paragraphe 2.3 coincubation lymphocytes-HUVEC, p 105. Des HUVEC témoins ont été

incubées dans le milieu de coincubation standard sans autre addition.

Après 4 h d’incubation, le milieu est enlevé, la monocouche de cellules

endothéliales est rincée 3 fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite fixées avec une

solution de PBS-paraformaldehyde 1% à température ambiante pendant 15 minutes, lavées

3 fois avec du PBS et bloquées avec une solution de PBS-BSA 2% à 4 °C pendant une

nuit. La monocouche est ensuite rincée pour enlever la BSA et les anticorps monoclonaux

H18/7 (anti-sélectine-E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1) sont ajoutés et

incubés pendant 1 h à 37°C. Les cellules sont ensuite lavées et incubées pendant 1h à 37

°C avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (Sigma AO168), dilué 1:1000

dans 1% BSA-PBS. La monocouche est lavée 4 fois avec du PBS, le dernier lavage est

éliminé par aspiration à l’aide d’une pompe à vide pour enlever tout liquide résiduel. Par la

suite, 300 µL du substrat 3,3’,5’(-tetramethylbenzidine (TMB) Sigma T8665 sont ajoutés

dans chaque puits et la plaque est incubée 30 min à l’obscurité. Ensuite 150 µL d'H2SO4

0,5 M sont ajoutés pour arrêter la réaction. Les mesures spectrophotométriques de la

densité optique (DO) sont effectuées à 450 nm dans un lecteur de plaque. Les DO obtenues

sont corrigées par les DO correspondant aux cellules incubées seulement avec l’anticorps

secondaire pour tenir compte du marquage non spécifique.

2.10 ANALYSES STATISTIQUES

Les résultats représentent les moyennes ± SEM de n déterminations indépendantes.

Les comparaisons entre les différents groupes de valeurs ont été effectuées après analyse

de la variance à une voie. Les moyennes ont été comparées par un test t protégé (précisé

dans la légende de chaque figure ou tableau). Les différences sont considérées comme

significatives quand P < 0,05.

115

RRRÉÉÉSSSUUULLLTTTAAATTTSSS EEEXXXPPPÉÉÉRRRIIIMMMEEENNNTTTAAAUUUXXX EEETTT

DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSIIIOOONNN

116

PARTIE III. RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ET DISCUSSION

Chapitre 1. LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE

EST INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES HUMAINS

L’adhésion des cellules mononucléées à l’endothélium vasculaire est un pré-réquis

à la migration cellulaire vers les tissus ou à l’éventuelle accumulation de ces cellules dans

l’espace sous-endothélial. Notre premier objectif a été d’étudier l’influence du contact

entre les cellules endothéliales de veine de cordon ombilical (HUVEC) et les lymphocytes

humains sur la synthèse de PGI2. Pour étudier l’effet spécifique des lymphocytes de sang

périphérique sur la production de PGI2 endothéliale nous avons mis au point un modèle

mimant une concentration focalisée de lymphocytes sur l’endothélium saine. La méthode

de Jaffe et al. (1973) a été suivie pour l’isolement des HUVEC. En ce qui concerne les

lymphocytes, nous avons suivi la méthode d’isolement des cellules mononucléées à partir

de sang veineux périphérique de sujets sains, technique pratiquée en routine au laboratoire.

A partir des cellules mononucléées nous avons obtenu une suspension cellulaire enrichie

en lymphocytes (<1% de monocytes) (voir méthodes, paragraphe 2.2.2, p 104).

1.1 CARACTÉRISATION DES CELLULES ENDOTHÉLIALES Les cellules endothéliales sont des cellules adhérentes qui se disposent en

monocouche. Cette disposition est assurée grâce au phénomène d’inhibition par contact qui

bloque leur croissance quand elles entrent en proximité. Á confluence, leur juxtaposition

forme un tapis arrangé en mosaïque caractéristique des cellules endothéliales. Cette

morphologie permet de les distinguer par exemple des fibroblastes qui sont des cellules

très allongées. Le noyau des cellules endothéliales occupe une position centrale. Dans le

cytoplasme se trouvent des inclusions typiques, les corps de Weibel-Palade. Ce sont des

bâtonnets parallèles au grand axe de la cellule stockant le facteur von Willebrand. Celui-ci

est fondamental pour l’hémostase primaire ainsi que pour l’hémostase secondaire car il

stabilise et transporte le facteur VIII de la coagulation sanguine.

Nous avons vérifié la nature endothéliale de nos cellules en culture par des critères:

⎬ morphologique: au cours de la culture des cellules, l’examen au microscope

inversé à contraste de phase a permis de vérifier l’aspect polygonal arrangé

en mosaïque typique des cellules endothéliales à confluence (Figure 17),

117

Figure 17. Cellules endothéliales de veine de cordon ombilical à environ 75% de

confluence. Les cellules endothéliales vasculaires sont isolées à partir de la veine de cordon

ombilical après digestion à la collagènase IA et ensemencées dans des boîtes de 25cm2 gélatinées

(voir méthodes, paragraphe 2.1, p 101 ). Á confluence, les cellules sont détachées et réensemencées

dans des puits prégélatinés (P1). La photo représente des cellules endothéliales (P1) à 70% de

confluence (microscopie optique, grossissement x 100).

⎬ physiologique: ces cellules synthétisent de la prostacycline, prostanoïde

majeur synthétisé par les cellules endothéliales des macrovaisseaux, et

⎬ immunohistochimique: notre étude par immunofluorescence montre qu’elles

expriment le facteur von Willebrand (Figure 18).

Figure 18. Cellules endothéliales de veine de cordon

ombilical marquées avec un anticorps anti-facteur von

Willebrand couplé à la fluorescéïne. Les cellules sont

cultivées dans des puits (4x 104 cellules/puits) contenant une

lamelle de verre de 12 mm Ø. (voir méthodes, paragraphe

2.1.2, p 102). À confluence, les cellules sont fixées au

paraformaldehyde (3% dans du PBS) et marquées avec

l’anticorps primaire anti-facteur vonWillebrand (voir détails

dans méthodes, paragraphe 2.1.2, p 102). La photo

représente des cellules endothéliales (P1) à 90% de

FvW

118

confluence (microscopie à fluorescence, grossissement x

100).

1.2 AUGMENTATION DE LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE

ENDOTHÉLIALE PAR LES LYMPHOCYTES DU SANG

PÉRIPHÉRIQUE. Les résultats d’une étude menée au sein de notre équipe (Merhi-Soussi et al., 2000)

montrent clairement que les cellules endothéliales humaines de veine de cordon ombilical,

incubées à confluence seules pendant 20 h produisent de faibles quantités de prostacycline

(280 ± 24 pg / 105 cellules). Les lymphocytes non activés ou activés pendant 3 jours par la

lectine mitogénique phytohémaglutinine 1µg/ml (PHA) puis lavés et incubés dans les

mêmes conditions, ne produisent pas de quantités détectables de prostacycline. En

revanche, la coincubation des cellules endothéliales et des lymphocytes non activés ou

activés par la PHA augmente significativement la synthèse de prostacycline. Il a été

observé que cette augmentation est fonction du nombre de lymphocytes ajoutés (rapport

lymphocytes/cellule endothéliale (L/HUVEC) 1 à 15 et non dépendante de l’activation

préalable des lymphocytes. Sur la base de ces résultats nous avons décidé de réaliser les

expériences avec un rapport L/HUVEC de 9:1.

1.2.1 ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE PAR LES

LYMPHOCYTES.

La synthèse de prostacycline dans les cellules endothéliales peut être rapide (<20

min) ou nécessiter plusieurs heures de stimulation selon les agonistes. Par exemple, la

thrombine et l’histamine induisent une synthèse rapide de prostacycline alors que les

cytokines inflammatoires telles que le TNF, (tumor necrosis factor) et l’IL-1, interleukin-1

augmentent significativement la production de prostacycline après plusieurs heures de

stimulation des cellules endothéliales (Murakami et al., 1993). Afin de déterminer le temps

nécessaire aux lymphocytes pour stimuler la synthèse de prostacycline endothéliale, nous

avons mesuré la production de prostacycline en fonction du temps de contact entre les

deux types cellulaires. Les cellules endothéliales sont incubées seules (condition basale) ou

en présence de lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1). L’augmentation de la synthèse de

prostacycline est significative dès 20 minutes de coincubation (300%) et presque maximale

après 4 h de coincubation (augmentation de 500%) (Figure 19). Une faible augmentation

supplémentaire est observée entre 4 et 20 h de coincubation (20%). Ces résultats montrent

que la stimulation de la synthèse de prostacycline dans les cellules endothéliales par les

119

lymphocytes est un processus rapide. Une cinétique similaire a été observée lors de la

coincubation de cellules endothéliales avec des lymphocytes activés par la PHA (résultats

non montrés).

Figure 19. Cinétique de production de la prostacycline dans les surnageants de

culture des cellules endothéliales coincubées avec les lymphocytes. Les cellules

endothéliales sont incubées seules (HUVEC) (105 cellules/puits) ou en présence de lymphocytes

(rapport L/HUVEC 9:1) dans le milieu de coincubation standard (sans sérum). Les surnageants

sont collectés après 20 min et jusqu’à 20 h de coincubation. Les résultats sont exprimés en pg de 6-

oxo-PGF1α/puits et représentent les moyennes ± SEM des valeurs de 4 expériences indépendantes.

1.2.2 SPÉCIFICITE DE LA RÉPONSE ENDOTHÉLIALE AU CONTACT DES LYMPHOCYTES

Pour établir si la réponse endothéliale aux lymphocytes est due à des interactions

spécifiques entre la surface de ces deux cellules, les HUVEC ont été coincubées avec

d’autres types cellulaires: des polymorphonucléaires, des plaquettes non activées ou avec

un matériel non-biologique tel que les billes de latex.

0

500

1000

1500

2000

2500

6-ox

o-PG

F1α

(pg/

puits

)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Time (h)

HUVEC + L

HUVEC

Temps (h)

120

1.2.2.1 Le contact lymphocyte-HUVEC augmente de façon spécifique la production de

prostyacycline endothéliale.

Les HUVEC sont coincubées dans le milieu de coincubation standard selon le

protocole décrit dans le paragraphe 2.3 p 105 (méthodes) avec des lymphocytes (L), des

plaquettes (PLQ), des polymorphonucléaires (PMN) ou des billes de latex de 2,5 et 9,5 µm

de diamètre. Après 4 h de coincubation, la PGI2 produite lors de la coincubation avec des

cellules autres que les lymphocytes, ou avec des billes de latex ne diffère pas (P > 0,05) de

celle produite dans des conditions basales (HUVEC seules) (Figure 20). Ce résultat

suggère qu’il existe une interaction spécifique entre les lymphocytes et les cellules

endothéliales qui est responsable de l’augmentation de la production de la PGI2 lors de la

coinbutation. Une modeste augmentation, non significative, de la production de PGI2 est

observée lors de la coincubation avec des billes de latex de 2,5 µm. Celle-ci, peut être

considérée comme une réponse au distress cellulaire induite par le contact avec du matériel

non-biologique. En fait, on a constaté par observation au microscope en contraste de phase,

la présence de billes de latex de 2,5 µm à l'intérieur des cellules alors que celles de 9.5 µm

de diamètre n’ont pas été phagocytées. La phagocytose de ces micro-sphères a pu activer,

de façon non-spécifique les HUVEC et augmenter ainsi la synthèse de PGI2. Ces résultats

sont en bon accord avec ceux de Rouzer et al. (1980) qui ont observé chez des

macrophages une augmentation de 2,5 fois de la production de PGE après l’internalisation

de billes de latex.

Figure 20. Effet spécifique des lymphocytes sur la synthèse de prostacycline

endothéliale. Les cellules endothéliales sont incubées seules (Basal) (105 cellules/puits) ou en

présence de lymphocytes, polymorphonucléaires, plaquettes ou billes de latex (2,.5 et 9,5 µm Ø)

(rapport L/HUVEC9:1) dans le milieu de coincubation standard (sans sérum). Les surnageants sont

0

1

2

3

Basal L PMN Plaquettes Latex 2,5 Latex 9,5

6-ox

o PG

F 1a

(aug

men

tatio

n re

lativ

e)

†

121

collectés après 4 h de coincubation pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par

rapport à la production basale de PGI2. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM des valeurs

de 4-5 expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont

comparées par le test de Bonferroni. †P<0.001 vs Basal

1.2.2.2 Caracterisation des lymphocytes adhérents à l’endothélium après la

coincubation.

Les HUVEC sont coincubées dans le milieu de coincubation standard selon le

protocole décrit dans le paragraphe 2.3 p 105 (méthodes) avec des lymphocytes (rapport

L/HUVEC 9:1). Après 1 h de coincubation, les lymphocytes CD8+ sont visualisés par

immunochimie (voir méthods, paragraphe 2.4 p 106). Nous avons constaté que 50% des

lymphocytes adhérents sont CD8+ (Figure 21)

Figure 21. Lymphocytes adhérents aux HUVEC. Les cellules sont cultivées dans des puits

(4x 104 cellules/puits) contenant une lamelle de verre de 12 mm Ø. (voir méthodes, paragraphe

NOYAUXHUVEC

NOYAUXlymphocyte

CD8+

122

2.1.2, p 102). A confluence, les cellules sont fixées au paraformaldehyde (3% dans du PBS) et

marquées avec l’anticorps anti-CD8 et les noyaux sont visualisés avec le colorant Hoechst No

33258 (voir détails dans méthodes, paragraphe 2.4.p 106). La photo représente des cellules

endothéliales (P1) à 90% de confluence et les lymphocytes adhérents (microscopie à fluorescence,

grossissement x 100).

1.3 ÉTUDE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION

ENDOTHÉLIALE - ECAMS- Les molécules d'adhésion endothéliales sélectines, intégrines et certains membres

de la superfamille des immunoglobulines sont des facteurs d’adhésion vasculaire qui

participent de façon directe ou indirecte à la transduction de nombreux signaux

intracellulaires. Lors de l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales ces molécules

peuvent activer différentes protéines telle que la PLC γ (Etienne-Manneville et al., 2000) et

voies de signalisation comme la cascade de MAPK (Hu et al., 2000). L'idée d'un effet

régulateur positif sur l'expression des ECAMs induit par certaines sous-populations des

leucocytes circulants est étayée par des résultats expérimentaux. Noble et al. (1996) ont

montré une augmentation de l'expression de la sélectine-E dans des HUVEC induite par

des monocytes humains du sang périphérique. Cet effet est dépendant du contact entre les

deux types cellulaires et partiellement dépendant du TNFα. De même, le caractère

essentiel du contact entre les cellules pour induire l'expression des ECAMs à été aussi

décrit dans des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux. Les lymphocytes T

activés induisent l’expression de différentes ECAMs (ICAM-1, VCAM-1 et sélectin-E),

cet effet étant là encore partiellement dépendant du TNFα (Lou et al., 1996)

La sélectine-E et VCAM-1 sont des molécules d’adhésion inductibles dont

l’expression est minimale dans des conditions physiologiques alors que ICAM-1 est

exprimée de façon constitutive sur l’endothélium au repos. Pour évaluer l'influence des

lymphocytes sur l'expression de ces molécules d'adhésion, les HUVEC ont été coincubées

pendant 4 h avec des lymphocytes et l’expression des ECAMs a été mesurée par ELISA.

1.3.1 EFFET DU CONTACT LYMPHOCYTE-HUVEC SUR L’EXPRESSION DES ECAMS

Les HUVEC sont coincubées avec des lymphocytes ou incubées avec du LPS (1

µg/mL ou 10 µg/mL) pendant 4 h, temps correspondant à la production maximale de PGI2,

et les ECAMs sont dosées par ELISA selon le protocole décrit dans le chapitre méthodes,

paragraphe 2.9.2, p 114). Les résultats présentes dans le Tableau I montrent que les

123

lymphocytes induisent l’expression de la sélectine-E et que cette expression est similaire à

celle obtenu après traitement par 1µg/mL de LPS. Une expression plus forte de la

sélectine-E est observée avec 10 µg/mL de LPS. De même, l’expression de VCAM-1 et

ICAM-1 augmente de 2 fois après la coincubation avec les lymphocytes et après traitement

au LPS.

Tableau I. Effet de la coincubation avec des lymphocytes ou de la stimulation avec du

LPS durant 4 h sur l’expression des ECAMs des cellules endothéliales

Les HUVEC ont été incubées dans le milieu de coincubation standard (sans sérum) toutes

seules (témoins) ou avec des lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1) ou du LPS (1µg/mL) ou

10µg/mL pendant 4 h à 37 °C dans des conditions statiques (voir méthodes, paragraphe 2.3, p 105).

Les monocouches sont lavées et incubées avec des anticorps anti-sélectine-E, VCAM-1 ou VCAM-

1 durant 1 h à 37 °C et l’expression des ECAMs est déterminée par EIA (voir méthodes,

paragraphe 2.9.2, p 114). Les valeurs représentent les moyennes ± SEM des valeurs de 3

DENSITÉ OPTIQUE SP ÉCIFIQUE (UNITES ARBITRAIRES)

TRAITEM ENT Sélectine-E VCAM -1 ICAM -1

HUVEC seules 0,02 ± 0,01 0,53 ± 0,12 0,94 ± 0,13

HUVEC + L 0,78 ± 0,13*(39)

1,11 ± 0,04*(2,1)

1,73 ± 0,10*(1,8)

HUVEC + LPS1 µg/mL

0,58 ± 0,09*

(29)

0,76 ± 0,11

(1,4)

1,41 ± 0,18*

(1,5)

HUVEC + LPS10 µg/mL

1,07 ± 0,18*

(53)

1,12 ± 0,18*

(2,1)

1,48 ± 0,18*

(1,6)

124

expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont

comparées par le test de t de Fisher *P<0,05 vs la valeur correspondant aux HUVEC incubées

seules. Les chiffres entre parenthèses correspondent au facteur de multiplication de l’expression par

rapport aux HUVEC témoins.

1.4 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES-

ECAMS- Le contact lymphocytes-cellules endothéliales est nécessaire pour observer l’effet

activateur des lymphocytes sur la synthèse de prostacycline endothéliale (Merhi-Soussi et

al., 2000). En effet, quand les lymphocytes sont incubés dans des inserts microporeux à

distance des cellules endothéliales, il n’y a pas d’augmentation de la synthèse de la PGI2.

Ces inserts empêchent le contact entre les cellules endothéliales et les lymphocytes mais

permettent le passage de molécules solubles telles que les cytokines. Ces observations

indiquent que le contact cellule/cellule est une condition essentielle pour déclencher la

réponse endothéliale. Afin de déterminer si l’effet des lymphocytes sur la synthèse de

prostacycline endothéliale dépend des ECAMs, trois des principales molécules d’adhésion

endothéliales, sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1 ont été bloquées avec des anticorps

monoclonaux bloquants lors de la coincubation lymphocyte-HUVEC

1.4.1 ÉTUDE DU BLOCAGE DE LA SÉLECTINE-E, VCAM-1 ET ICAM-1

Afin de préciser quelle molécule d’adhésion pourrait être impliquée dans ce

mécanisme de production de prostacycline dépendant du contact, les principales molécules

d'adhésion sélectine-E, VCAM-1 ou ICAM-1 ont été bloquées indépendamment.

Les HUVEC sont incubées séparément avec chacun des anticorps anti-ECAMs pendant 30

min à 37 °C. Ensuite, elles sont coincubées, toujours en présence de l’anticorps, avec des

lymphocytes préalablement marqués au 51Cr (selon les protocoles décrits dans la partie II,

méthodes paragraphes 2.6, p 107 et 2.9.1 p 113). Après 4 h de coincubation, les

surnageants sont récupérés pour mesurer la 6-oxo-PGF1α, témoin de la production de

prostacycline, et la radiactivité du 51Cr, dans les lysats cellulaires, directement

proportionnelle à la quantité de lymphocytes ayant adhéré aux HUVEC.

1.4.1.1 Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes

Le pourcentage de lymphocytes adhérant aux cellules endothéliales dans nos

conditions expérimentales représente en moyenne 12% du total des lymphocytes ajoutés.

125

Cette valeur est considérée comme le 100% d'adhésion des lymphocytes aux HUVEC

témoins, non traitées par les anticorps bloquants.

Le blocage de la sélectine-E ou de VCAM-1 avec les anticorps H18/7 et E1/6,

respectivement ne modifie pas significativement l’adhésion des lymphocytes aux cellules

endothéliales; (86 et 71 % du témoin, respectivement (P >0,05). Le faible effet des

anticorps bloquants anti-selectine-E et anti-VCAM-1 ne peut pas être expliqué par

l’absence ou l’expression minimale de ces molécules d’adhésion dans des HUVEC non-

activées puisque leur expression augmente lors de la coincubation avec des lymphocytes.

D'autre part, l’adhésion diminue significativement quand ICAM-1 est bloqué avec

l’anticorps anti-ICAM-1, HU5/3. Dans ces conditions, l’adhésion des lymphocytes aux

HUVEC représente 66% de celle obtenue avec des HUVEC contrôles non traitées.

(P<0,05) (Figure 22).

Figure 22. Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC.

Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec 300 µL du surnageant d’hybridome

contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-Sélectine-E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-

ICAM-1). Les lymphocytes sont marqués pendant 1h avec 925 KBq de Na251CrO4/106 cellules à

37°C. Après 3 lavages, 200 µL de la suspension de lymphocytes resuspendus à une concentration

de 4,5x106 cellules/mL sont ensuite ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) aux HUVEC préalablement

bloquées et aux HUVEC témoins. Après 4 h de coincubation dans des conditions statiques, les

puits sont lavés trois fois avec du PBS pour éliminer les lymphocytes non adhérents. Les

lymphocytes adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et la radioactivité est comptée.

L’adhésion est exprimée en pourcentage par rapport à l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC

contrôles considérée égale à 100. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 6 expériences

0

20

40

60

80

100

120

Témoin anti-sélectine-E anti-VCAM-1 anti-ICAM-1

Adh

esio

n(%

du

tém

oin) *

126

indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par un test

de t de Fisher. *P<0,05 vs la valeur correspondant au témoin.

1.4.1.2 Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline endothéliale

induite par les lymphocytes.

La coincubation des lymphocytes avec des HUVEC augmente de 2,5 fois (P<0,01)

la production de PGI2 par rapport à celle obtenue avec des HUVEC incubées seules. Cet

effet n’est pas modifié par les différents anticorps bloquants utilisés (Figure 23).

Particulièrement, le blocage d’ICAM-1 qui diminuait significativement l’adhésion des

lymphocytes aux HUVEC n’a pas altéré la production de PGI2 induite par les lymphocytes.

Ce résultat indique que la production de PGI2 induite par les lymphocytes est indépendante

des molécules d'adhésion considérées dans cette étude.

Figure 23. Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline

endothéliale induite par les lymphocytes. Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37°C

avec 300 µL de surnageant d’hybridome contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-sélectine-

E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1). Ensuite, 200 µL de la suspension de

lymphocytes à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) aux

HUVEC préalablement bloquées et aux HUVEC témoins. Après 4 h de coincubation les

surnageants sont collectés pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par rapport à

la production basale de PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ±

SEM de 6 expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes

sont comparées par un test de t de Fisher.

0

1

2

3

4

Basal L anti -Sé le ctine -E anti -VC AM-1 anti -IC AM-1

6-ox

o PG

F 1α

(aug

men

tatio

n re

lativ

e

Basal

C oincubation * * * *

127

1.5 EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS

DES CONDITIONS DE ROTATION CONTINUE Les cellules endothéliales vasculaires sont influencées in vivo par deux types de

forces hémodynamiques, la tension circulaire (cyclical strain) due à la distension de la

paroi vasculaire induite par la pression transmurale, et les forces de cisaillement (shear

stress) générées par la friction du flux sanguin. Ces forces agissent sur la surface apicale

des cellules et les orientent dans la direction du flux (Fig. 2. Partie I, paragraphe 1, p 31).

In vitro, les forces de cisaillement induisent une réorganisation rapide du cytosquelette et

l'activation de différentes cascades de signalisation dans les cellules endothéliales qui

conduit à la libération de NO et PGI2 (Fisslthaler et al., 2000; Bhagyalakshmi et Frangos,

1989; Hanada et al., 2000). La régulation positive de l'expression des ARNm des PGHS,

PGHS-1 et PGHS-2 par les forces de cisaillement a été décrite (Doroudi et al., 2000;

McCormick et al., 2000).

Nous avons comparé la production de PGI2 induite par le contact des lymphocytes

dans des conditions statiques et non-statiques (voir protocole décrit dans la partie II

méthodes, paragraphe 2.3.1 rotation continue, p 106). Quand les HUVEC (seules) sont

incubées pendant 4 h dans des condition non-statiques la production basale de PGI2 est

légèrement augmentée (30%) par rapport à celle mesurée en condition statique. De même,

la production de PGI2, induite par les lymphocytes est légèrement supérieure quand la

coincubation lymphocytes-HUVEC est réalisée dans la condition de rotation continue

(Figure 24 ).

Figure 24. Effet de la coincubation Lymphocytes-HUVEC en condition de rotation continue

sur la production de PGI2 induite par les lymphocytes. Les HUVEC sont incubées seules (basal)

dans le milieu de coincubation standard ou coincubées avec des lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1) en

condition statique ou sur une plate-forme de rotation continue (9 révolutions par minute), à 37 °C pendant 4 h

0

1

2

3

Statique Rotation Statique Rotation

6-ox

o-PG

F 1α

(aug

men

tatio

n re

lativ

e)

Basal Coincubation

**

128

et la 6-oxo-PGF1α est mesurée dans les surnageants de culture. Les résultats sont exprimés par rapport à la

production basale de PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 3

expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par le test

de t-Scheffé. *P< 0,05 par rapport à la valeur basale dans la condition statique.

Ce résultat suggère que les effets de la rotation et du contact des lymphocytes sont

additifs et que l’effet des lymphocytes per se n’est pas modifié dans des conditions qui

miment les forces de cisaillements.

1.6 CONCLUSIONS ET DISCUSSION A l’aide d’un modèle in vitro nous avons étudié l’effet du contact entre les

lymphocytes humains et l'endothélium de moyens vaisseaux. Comme approche de

l’interaction de ces cellules in vivo, nous avons coincubé des lymphocytes provenant du

sang périphérique avec des cellules endothéliales isolées de la veine du cordon ombilical.

Les résultats présentés dans ce chapitre montrent que les lymphocytes humains sont

capables de stimuler la production de prostacycline par les HUVEC. Cette réponse

physiologique est observée lors de la coincubation dans un milieu dépourvu de sérum et

sans activation préalable des cellules. L’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse

de prostacycline endothéliale est un processus rapide. Le résultat de l’étude cinétique

réalisée entre 20 min-20h, montre qu'il n’y a pas de variation de la production basale de

PGI2 quand les HUVEC sont incubées seules. Par contre, en présence de lymphocytes 60%

de la réponse maximale sont déjà obtenus après 60 min de coincubation et le maximum est

observé après 4 h de coincubation (Figure 19, p 119). Cette cinétique est différente de

celle observée par Hakkert et al., (1992) lors de la coincubation des HUVEC avec des

monocytes humains. En effet, dans le cas des monocytes, 4 h de coincubation sont

nécessaires pour observer une augmentation significative de la synthèse de prostacycline et

le pic maximal de la réponse apparaît après 24 h de coincubation (Hakkert et al., 1992). La

comparaison des deux cinétiques suggère fortement que l’augmentation de la synthèse de

PGI2 endothéliale induite par le contact des cellules mononucléées, lymphocyte ou

monocyte, met en jeu des mécanismes différents.

Même si le contact lymphocytes–cellules endothéliales est capable d’induire la

synthèse de cytokines telles que l’IL-2 et l’INF-γ (Johnson et al., 1998), nos résultats

suggèrent que l’effet de la coincubation lymphocytes-HUVEC sur la synthèse de

prostacycline n’implique pas de cytokines. Premièrement, l’étude cinétique montre une

129

augmentation très rapide de la synthèse de prostacycline qui est déjà significative après 20-

30 minutes de coincubation. Ce résultat exclut l’effet de cytokines dont la synthèse requiert

plusieurs heures. De plus, aucune augmentation de synthèse de prostacycline n’est

observée lorsque les lymphocytes sont coincubés à distance des cellules endothéliales

(Merhi-Soussi et al., 2000). De même aucune induction de la PGHS-2 endothéliale,

isoforme inductible par les cytokines (Ristimäki et Viinikka., 1992; Mantovani et al., 1992;

Rossi et al., 1985), n’a pu être observée dans les lysats de cellules endothéliales après

coincubation avec des lymphocytes (Merhi-Soussi et al., 2000).

Nous pouvons conclure que l’augmentation de la synthèse de prostacycline lors de

la coincubation des lymphocytes avec les cellules endothéliales n’implique pas une

synthèse de cytokines solubles mais implique le contact direct entre les deux types

cellulaires. Ceci n’exclut pas un effet éventuel de cytokines fortement liées à la surface des

lymphocytes ou de cytokines transmembranaires. En effet, il a été montré que les

lymphocytes humains expriment une forme transmembranaire de la cytokine TNFα,

capable d’induire l’expression du facteur tissulaire dans les HUVEC via des interactions

avec le récepteur endothélial du TNFα de masse moléculaire 75 kDa (Reverdiau-Moalic et

al., 1998). Il faut noter que la synthèse du facteur tissulaire requiert, comme la synthèse de

PGI2, un contact direct entre les lymphocytes et les HUVEC et exige un temps

d’interaction de 4 h pour une synthèse maximale. D’autre part, le contact entre cellules est

essentiel pour induire l’expression des ECAMs ainsi que la production d’IL6 et IL8. Dans

un modèle de cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux humain en contact avec

des lymphocytes activés, le TNF-transmembranaire exprimé sur les lymphocytes active les

cellules endothéliales (Lou et al., 1996). Nous ne pouvons donc pas exclure la possibilité

d’une interaction entre le TNF membranaire lymphocytaire et son récepteur sur les

HUVEC qui activerait une cascade de signalisation conduisant à la synthèse de PGI2.

Compte tenu du besoin de contact direct entre les deux types cellulaires dans le

mécanisme d’augmentation de la PGI2 nous avons vérifié la spécificité des lymphocytes

sur cette réponse endothéliale. La coincubation des HUVEC avec des cellules

polymorphonucléaires (PMN), des plaquettes non activées ou des billes de latex

(microsphères de 2,5 ou 9,5 µm de ∅) n’induit pas de synthèse de PGI2 contrairement à ce

qui est observé avec les lymphocytes. La concentration de PGI2 est restée du même ordre

que celle observée dans les conditions basales (HUVEC seules), particulièrement quand les

HUVEC ont été coincubées avec des plaquettes (Figure 20, p 120). Schaub et al. (1990)

130

ont montré une augmentation de la synthèse de PGI2 lors de la coincubation (0-4h)

d’HUVEC avec une suspension de leucocytes (PMN 80-85%, monocytes 15-20%). Dans

leurs expériences, 4 h de coincubation sont nécessaires pour augmenter de 2-3 fois la

production endothéliale de PGI2. En outre, l'effet des leucocytes est indépendent du contact

entre les cellules car il est conservé quand les cellules ont été séparées par un insert (0,4

µm). Les auteurs attribuent la hausse de PGI2 à l’IL-1 produite par les monocytes, les PMN

ou la combinaison des deux. L’absence de réponse endothéliale aux PMN que nous avons

observée démontre d’une part l’absence de monocytes dans notre préparation et d’autre

part indique que s’il y a eu production d’IL-1 par les PMN, celle ci, a été insuffisante pour

augmenter significativement la synthèse de PGI2.

En revanche, le contact lymphocytes-HUVEC augmente de 2,5 fois la production

basale de PGI2 lors de la coincubation. Cette augmentation semble être dépendante des

interactions spécifiques entre les lymphocytes et les HUVEC et non pas d'une interaction

non-spécifique imposée par le contact physique dans les puits. Ce résultat suggère que dans

des conditions statiques, le contact lymphocytes-HUVEC est capable d’activer

l’endothélium. En effet, l’expression des molécules d’adhésion endothéliales inductibles

telles que la sélectine-E et VCAM-1, ainsi que celle d’ICAM-1, molécule constitutive,

augmente lors de la coincubation avec des lymphocytes. L’effet du contact des

lymphocytes sur l’expression des ECAMs est similaire à celui observé pour le LPS. Les

lymphocytes et le LPS, augmentent de 2 fois l’expression de VCAM-1 et ICAM-1 et

stimulent très fortement l’expression la sélectine-E (Tableau I, p 123 ). Ces résultats

indiquent que les HUVEC s’activent au contact des lymphocytes. Ces résultats sont en bon

accord avec ceux de Doukas et Pober (1990) montrant une induction de l’expression

d’ICAM-1 ainsi que d'autres marqueurs d’activation endothéliale telles que les molécules

de classe I et II du complexe majeur d’histocompatibilité sur des HUVEC mise au contact

de lymphocytes. En outre, Reverdiau-Moalic et al. (1998) ont montré dans des conditions

proches des nôtres, une augmentation de l’expression du facteur tissulaire, un autre

indicateur d’activation de l’endothélium, lors de la coincubation de cellules endothéliales

avec des lymphocytes.

Etant donné que le contact spécifique lymphocytes/cellules endothéliales est

essentiel pour déclencher la synthèse de PGI2, et que l’expression des ECAMs est régulée

positivement par le contact des lymphocytes, nous avons recherché si ces molécules

d’adhésion sont impliquées dans le mécanisme de production de PGI2 induite par les

lymphocytes.

131

A l’aide d'anticorps monoclonaux anti-ECAMs nous avons montré que seule le

blocage d’ICAM-1 inhibe significativement l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC. Le

blocage spécifique de VCAM-1 ou de la sélectine-E est sans effet. Des résultats similaires

montrant que anti-VCAM-1 ou anti-sélectine-E n’ont pas d’effet sur l’adhésion des

lymphocytes T, activés par la PMA à des HUVEC non activées ont été décrits par Shimuzu

et al (1990). En revanche, le blocage de LFA-1, le contre-récepteur d’ICAM-1, inhibe

efficacement l’adhésion. Néanmoins, il a été aussi montré que le blocage d’ICAM-1 sur

des HUVEC non activées, n’a pas d’effet sur l’adhésion des lymphocytes (Dustin et

Springer, 1988). Cette différence d’effet pourrait être liée à l’état fonctionnel des cellules

endothéliales. Dustin et Springer, (1988) ont utilisé des cellules au passage 25, alors que

dans nos expériences les HUVEC ont toujours été utilisées au premier passage. Dans nos

conditions, la densité des molécules d’ICAM-1 qui est encore augmentée par le contact des

lymphocytes peut être suffisante pour observer une inhibition significative avec l’anticorps

monoclonal anti-ICAM-1.

L’inefficacité des anticorps monoclonaux anti-VCAM-1 et anti-sélectine-E pour

diminuer l’adhésion des lymphocytes à l’endothélium n’exclut pas la possibilité que ces

molécules d’adhésion soient effectivement utilisées durant le processus complexe

d’adhésion. Nos résultats suggèrent que l’interaction entre les intégrines CD11a/CD18

exprimées sur les lymphocytes et leur contre-récepteur endothélial ICAM-1 a un rôle

important dans l’adhésion de lymphocytes au repos à des HUVEC non activées

préalablement. Contrairement, aux résultats observés sur l’adhésion aucun des anticorps

monoclonaux bloquants utilisés dans notre étude n'a été efficace pour bloquer la synthèse

de PGI2 déclenchée par les lymphocytes. Ce résultat suggère que les molécules d’adhésion

qui ont été évaluées dans cette étude ne participent pas à la cascade de signalisation qui

déclenche la synthèse de PGI2 suite au contact des lymphocytes. Pourtant, dans le

mécanisme de production de PGI2 induit par les lymphocytes, le contact lymphocytes-

HUVEC est un pré-réquis. D’autres molécules probablement exprimées de façon sélective

par les lymphocytes et non par les PMN ou les plaquettes au repos pourraient expliquer

cette réponse endothéliale dépendante du contact. Ce mécanisme semble être indépendant

de facteur solubles, comme l’IL-1, qui induisent une réponse plus tardive. Six heures sont

nécessaires à l’IL-1 pour induire la synthèse de PGI2 dans des cellules endothéliales

(Dejana et al., 1984; Rossi et al., 1985).

D’autre part, il est bien connu que l’exposition des cellules endothéliales aux forces

de cisaillement induit une réponse rapide impliquant la régulation ou la réorganisation de

132

protéines préexistantes, suivie par une réponse moléculaire plus tardive mettant en jeu la

modulation de l’expression de gènes et une synthèse subséquente de protéines (Topper et

Gimbrone, 1999; Bongrazio et al., 2000). Parmi les réponses aiguës qui apparaissent dans

les secondes ou minutes l’augmentation rapide et de courte durée de la production de PGI2

a été bien caractérisée dans les cellules endothéliales provenant de différentes sources et

sous différentes conditions expérimentales. Il a été montré que les BAEC répondent aux

augmentations de forces de cisaillement par une surproduction de PGI2 maximale dans les

deux minutes et qui décline ensuite à la concentration basale (Grabowski et al., 1985). De

façon similaire, dans des HUVEC soumises à une force de cisaillement constante, deux

phases de production de PGI2 sont observées. L’augmentation initiale et transitoire est

suivie par une production soutenue de plusieurs fois supérieure à la production basale

(Bhagyalakshmi et Frangos, 1989). Dans des HUVEC perfusées avec différents gradients

de force de cisaillement pendant une période de 6 h, le taux de PGI2 augmente seulement

durant la première heure de perfusion (Doroudi et al., 2000). Lorsque les HUVEC sont

placées sur une plate-forme de rotation continue à 9 r.p.m pendant 4 h en absence de

lymphocyte une augmentation modérée (30%) de la production de PGI2 est observée par

rapport aux témoins incubés dans des conditions statiques. De plus, une augmentation de

l’effet stimulateur des lymphocytes sur la production de PGI2 est observée quand la

coincubation est réalisée en rotation continue par rapport à la coincubation statique (Figure

24, p 127). Donc, l’effet de conditions dynamiques de culture mimant les forces de

cisaillement et celui des lymphocytes semblent être additifs en terme de synthèse de PGI2.

Par ailleurs, il a été montré que la production de PGI2 dans les BAEC stimulées par l’acide

arachidonique exogène est similaire quelle que soit les conditions de culture, statiques ou

en présence des forces de cisaillement (Grabowski et al., 1985). Nos résultats suggèrent

que le stress mécanique et les lymphocytes activent des voies de signalisation différentes

qui convergent dans la libération de l’acide arachidonique. En effet, la production de PGI2

induite par les lymphocytes n’est pas sensible à l’inhibiteur de DAG lipase RHC80267

(Merhi-Soussi et al., en préparation) tandis que l’induction due aux forces de cisaillement

y est très sensible (-66%) (Hagyalakshmi et Frangos, 1989). Ces auteurs ont aussi montré

que les forces de cisaillement stimulent le turnover des phospholipides et activent la

phospholipase C PI-spécifique (Bhagyalakshmi et al., 1992). Nous avons observé que

l’effet stimulateur induit par les lymphocytes est dépendant de PI-PLC. Cependant le DAG

n’est pas la source d’acide arachidonique (Merhi-Soussi et al., en préparation). Donc, le

stimulus mécanique peut induire la libération d’arachidonate par activation de PI-PLC et

133

hydrolyse du DAG par la DAG lipase, alors que les lymphocytes activent essentiellement

la phospholipase A2 cytosolique (Merhi-Soussi et al., 2000). La participation de PI-PLC

dans nos conditions peut être liée à la production d’IP3 et à l’augmentation de Ca2+

intracellulaire car la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes est complètement

dépendante du calcium comme nous l’avons montré précédemment (Merhi-Soussi et al.,

2000).

Compte tenu de l’activation du métabolisme de l’acide arachidonique vers la

production de PGI2 endothéliale induite par le contact spécifique des lymphocytes, nous

avons émis l’hypothèse que le contact direct lymphocytes/cellules endothéliales augmente

l’activité de la cPLA2 par la voie de la MAPkinase. Les travaux réalisés pour tester cette

hypothèse sont rapportés dans le chapitre suivant (chapitre 2).

134

Chapitre 2. DÉTERMINATION DES VOIES DE SIGNALISATION

IMPLIQUÉES DANS LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE

INDUITE PAR LE CONTACT LYMPHOCYTES-CELLULES

ENDOTHÉLIALES.

En réponse à de nombreux agonistes, la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2)

libère sélectivement l’acide arachidonique de la position sn-2 des phospholipides

membranaires. Cette enzyme, qui fonctionne en présence de quantités submicromolaires de

Ca2+, est considérée comme la principale responsable de la libération de l’acide

arachidonique. L’activité cPLA2 représente la voie enzymatique la plus directe de

libération de l’acide arachidonique, substrat principal pour la biosynthèse des eicosanoïdes.

Certaines études réalisées sur différents types cellulaires (Seufferlein et Rozengurt,

1994; Cazaubon et al., 1993) incluant les cellules endothéliales (Fleming et al., 1995)

indiquent que les agonistes qui opèrent via des récepteurs couplés aux protéines G

augmentent aussi la phosphorylation de l’isoforme p42 MAPK (mitogen-activated protein

kinases). En plus, quelques études ont montré que la cPLA2 est un substrat des p42/p44

MAP-Kinases. D’ailleurs, il a été montré dans des HUVEC que la production de PGI2

induite par la thrombine, activateur connu de la cPLA2 dans les plaquettes (BorshHaubold

et al., 1995; Kramer, et al., 1996) est complètement supprimée par l’inhibiteur spécifique

de MAPKKinase (MAPKK ou MEK), le composé PD98059 (Wheeler-Jones et al., 1997).

Les mêmes auteurs suggèrent que l’activation de cPLA2 et la synthèse de PGI2 induite par

le VEGF sont dépendantes de la voie de signalisation p42/p44 MAPK.

2.1 ÉTUDE DE L’IMPLICATION D’UNE VOIE PROTÉINE G-TYROSINE-

KINASE-MAPK DANS LA SYNTHÈSE DE PGI2 ENDOTHÉLIALE INDUITE

PAR LE CONTACT DES LYMPHOCYTES.

Nos résultats précédents confirment l’hypothèse de la spécificité du contact des

lymphocytes dans le mécanisme de production de PGI2 endothéliale. Cependant, ces

résultats montrent que les récepteurs impliqués dans ce mécanisme dépendant du contact

sont distincts des ECAMs étudiées dans la première partie de ce travail. Nous avons

examiné, dans un second temps, la possibilité que le mécanisme de signalisation mettre en

jeu des récepteurs liés aux protéines G, l’activation des protéines tyrosine-kinases et la

135

phosphorylation des MAPK. Dans ce but, les cellules endothéliales ont été traitées avec

des inhibiteurs des voies potentiellement impliquées et la phosphorylation de

p42/p44MAPK a été évaluée par immunoempreinte (western blotting).

2.1.1 EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RECEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES PROTÉINES

Gi.

Plusieurs types cellulaires répondent aux ligands de récepteurs couplés aux

protéines G, tels que la thrombine, l’histamine et aux récepteurs à activité tyrosine kinase

par une production immédiate et de courte dure d’eicosanoïdes, incluant la PGI2.

Certains ligands de récepteurs couplés à la protéine Gi stimulent les MAP kinases

par différents mécanismes (English et al., 1999). Ainsi la p42/p44MAPK est activée par de

nombreux agonistes tels que la vasopressine, l’angiotensine II, les agonistes α-

adrénergiques ou l’acide lysophosphatidique par une voie sensible à la toxine pertussique

(PTX) (Melien et al., 1998; Mclees et al.,1995). De plus, la capacité d’activation de

MAPK par des protéines G, du type Gi et Gq est réduite si les cellules n’ont pas de

tyrosine kinase de la famille Src (Wan et al., 1996). Afin de préciser si les interactions

ligands-récepteurs et la signalisation via des récepteurs couplés aux protéines Gi sont

potentiellement impliquées dans la réponse endothéliale observée dans notre système de

coincubation lymphocytes-HUVEC, nous avons bloqué, à l’aide de la suramine, les

interactions ligands-recepteurs entre les surfaces de deux types cellulaires et nous avons

inhibés les protéines Gi par la toxine pertussique (PTX), (voir protocoles décrits dans la

Partie II méthodes, paragraphe 2.5.1, p 107).

Les résultats montrent que chez les HUVEC incubées seules, la présence continue

de suramine dans le milieu de coincubation ou le pré-traitement avec la PTX ne modifie

pas la production de PGI2 basale. Par contre, la suramine bloque complètement l’effet

inducteur des lymphocytes sur la synthèse de PGI2 (Figure 25). Ceci indique que des

interactions ligands-récepteurs sont primordiales dans le mécanisme dépendant du contact

des lymphocytes. En revanche, lors de la coincubation avec les lymphocytes le pré-

traitement des HUVEC avec la PTX n’inhibe pas l’effet activateur des lymphocytes sur la

production de PGI2 (-20%) ce qui indique que la synthèse de PGI2 induite par les

lymphocytes ne suit pas une voie sensible à la PTX.

136

Figure 25. Effet de l’inhibition ligands-récepteurs et de l’inhibition des protéines Gi.

Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% confluence. Ensuite, elles

sont pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec la suramine, 1mmole/L ou la PTX, 50 ng/mL. Les

HUVEC témoins sont incubées pendant la même période de temps sans inhibiteur. Les

lymphocytes sont ajoutés pour la coincubation (rapport L/HUVEC 9:1) qui est maintenue pendant

4 h à 37 °C. La Suramine est maintenue dans le milieu pendant la coincubation avec les

lymphocytes. La PTX est éliminée par lavage avant la coincubation. Les milieux de culture sont

récupérés, et la 6-oxo-PGF1α est mesurée dans les surnageants par EIA. Les valeurs représentent les

moyennes ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les données sont analysées par ANOVA et les

moyennes sont comparées par le test-t de Fisher. * P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin

dans la condition basale.

2.1.2 EFFET DE L’INHIBITION DES PROTEINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE

KINASES DE LA FAMILLE Src.

Les protéines tyrosine kinases sont impliquées dans une diversité de voies de

signalisation cellulaire. La famille des protéines tyrosine kinase Src est activée par

différents stimuli tels que la thrombine (Liebenhoff et al., 1993; Chen et al.,1994), la

bradykinine (Lee et Villereal, 1996), le VEGF (He et al, 1999). Ces stimuli ont en commun

la capacité d’induire la synthèse de PGI2.

Afin de préciser si la signalisation induite par le contact des lymphocytes implique

les protéines tyrosine kinases et plus spécifiquement celles de la famille Src, nous avons

traité les cellules endothéliales avec la génistéine qui est un inhibiteur spécifique de

tyrosine kinase à large spectre fonctionnant par compétition directe avec l’ATP et

parallèlement, nous avons inhibé la voie de Src avec le PP1 qui est un inhibiteur sélectif de

la famille Src-tyrosine kinase.

0

400

800

1200

1600

Basal (HUVEC)

Coincubation(HUVEC+L)

6-ox

o-PG

F 1α

(pg

/pui

ts)

TémoinSuraminePTx

**

137

Les résultats montrent que le traitement des HUVEC avec les inhibiteurs ne modifie

pas la production basale de PGI2. En revanche, la génistéine aussi bien que le PP1 inhibent

fortement (-88 et -90%, respectivement) l’effet stimulateur des lymphocytes (Figure 26).

Ceci indique un rôle essentiel des protéines tyrosine kinases et particulièrement la famille

Src dans le mécanisme de production de PGI2 induit par le contact des lymphocytes.

Figure 26. Effet de l’inhibition des protéine tyrosine kinases et de tyrosine kinases de

la famille Src. Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% confluence.

Ensuite, elles sont pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec la génistéine (0,1mmol/L) ou le PP1

(50 µmoles/L) concentration finale. Les HUVEC témoins sont incubées pendant la même période

de temps sans inhibiteur. Les lymphocytes sont ajoutés pour la coincubation (rapport L/HUVEC

9:1) qui est maintenu pendant 4 h à 37 °C. La génistéine est maintenue dans le milieu pendant la

coincubation avec les lymphocytes. Le PP1 est éliminée par lavage avant la coincubation.. Les

milieux de culture sont récupérés, et la 6-oxo-PGF1α. est mesurée dans les surnageants par EIA. Les

valeurs représentent les moyennes ± SEM des 3 expériences indépendantes. Les données sont

analysées par ANOVA et les moyennes sont comparées par le test-t de Fisher. *P<0.05 vs la valeur

correspondant au témoin dans la condition basale.

2.1.3 EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE ET MISE EN ÉVIDENCE DE LA

PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE

Nous avons montré (Merhi-Soussi et al., 2000) que la cPLA2 est la principale

phospholipase engagée dans la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes. La voie en

amont de la cPLA2 peut être la p42/p44MAPK car la cPLA2 a été décrite comme un

substrat de cette enzyme (Leslie, 1997;. Sa et al., 1995). La MAPKK active la p42MAPK

(Berck et al., 1995) et son inhibition résulte en une inhibition de p42MAPK. Pour évaluer

si la cascade de la MAPK est impliquée dans l’activation de la cPLA2 déclenchée par le

0

400

800

1200

1600

Basal(HUVEC)

Coincubation(HUVEC+L)

TémoinGénistéine

PP1

*

6-ox

o-PG

F 1a

(pg/

puits

)

138

contact des lymphocytes, les HUVEC sont pré-traitées avec l’inhibiteur de MAPKK

PD98059 avant leur coincubation avec les lymphocytes. Ce composé prévient l’activation

de p42/p44MAPK qui phosphoryle à son tour des substrats spécifiques in vitro ainsi que

dans des cellules intactes (Dudley et al., 1995., Alessi et al., 1995). Les résultats de la

figure 27 indiquent que le pré-traitement avec l’inhibiteur de MAPKK diminue

significativement la synthèse de PGI2 induite par le contact des lymphocytes. En plus, cette

synthèse est totalement supprimée quand l’inhibiteur est maintenu dans le milieu de

coincubation. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes sont capables d’induire la

phosphorylation et l’activation de p42/44MAPK dans les cellules endothéliales.

Figure 27. Effet de l’inhibition de la MAP kinase kinase. Les HUVEC à 90% confluence sont

pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec 25 µmoles/L de PD98085 concentration finale. Les

lymphocytes sont ajoutés (L/HUVEC 9:1) et la coincubation est maintenue pendant 4 h à 37 °C en

absence ou présence de l’inhibiteur. Les milieux de culture sont récupérés, et la 6-oxo-

PGF1α. est mesurée dans les surnageants par EIA. Les résultats sont exprimés en pg de 6-oxo-

PGF1α et sont les moyennes ± SEM de 5 expériences indépendantes. Les données sont analysées

par ANOVA et les moyennes sont comparées par le test-t de Scheffé. *significativement différent

des HUVEC incubées seules, significativement différent des HUVEC coincubées avec les

lymphocytes en absence de l’inhibiteur. *P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin dans la

condition basale. †P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin dans la condition coincubation.

0

500

1000

1500

2000

Basal (HUVEC)

Coincubation (HUVEC+ L)

6-ox

o-PG

F 1α

( pg/

puits

)

TémoinPD98059PD98059

*

**

˕

139

Pour vérifier cette hypothèses, l’expression des formes non phosphorylées et

phosphorylées de la p42/44MAPK a été évaluée dans les HUVEC seules ou coincubées

avec des lymphocytes pendant 1, 2, 4, 8 et 20 h. La figure 28 montre les résultats obtenus

par immunoempreinte avec l’anticorps monoclonal anti p-ERK (E-4): sc7383 qui reconnait

la Tyr 204-phosphorylée. La phosphorylation de p42/44MAPK induite par les lymphocytes

est déjà maximale après 1 h de coincubation et reste maintenue pendant 4 h déclinant à la

valeur basale après 8 h de coincubation.

Figure 28. Mise en évidence de la phosphorylation de p42/p44MAPK par

immunoempreinte. Immunoempreinte de p42/p44MAPK ( A) et phospho p42/p44MAPK (B)

des HUVEC coincubées avec des lymphocytes. Les HUVEC sont incubées en absence (basal) ou

en présence de lymphocytes (L/HUVEC 9:1) pendant les périodes de temps indiquées. Les

monocouches sont lavées pour enlevées les lymphocytes, les cellules sont lysées et les protéines

(20 µg protéine/puits) sont déposées dans le gel d’électrophorèse (10% SDS-polyacrylamide). La

figure montre les résultats d’une expérience représentative de 3 expériences indépendantes donnant

les mêmes résultats.

2.2 CONCLUSIONS ET DISCUSSION

Il est connu que l’activation de la cPLA2 est mediée par un certain nombre

d’agonistes différents et des signaux intracellulaires spécifiques impliquant les protéines G,

l’augmentation de la concentration de Ca2+ intracellulaire, l’activation de kinases telles que

140

la kinase régulée par des signaux extracellulaires (ERK ou MAPK) et la protéine kinase C

(PKC) (Leslie, 1997; Hirabayashi et Shimizu., 2000). Des données récentes indiquent

qu’en plus de la translocation induite par le Ca2+, la phosphorylation de sites spécifiques de

l’enzyme est essentielle pour l’activation de la cPLA2. Un de sites de phosphorylation le

mieux caractérisé est la Ser505 localisée dans le site consensus de phosphorylation par

MAPK (Hirabayashi et Shimizu., 2000). La phosphorylation de la Ser505 par

p42/p44MAPK augmente l’activité de la cPLA2 in vitro et in vivo (Hirabayashi et

Shimizu., 2000). La phosphorylation et l’activation de la cPLA2 sont corrélées à

l’activation des p42/p44MAPK dans plusieurs models cellulaires incluant les cellules

endothéliales (Clark et al., 1995; Sa et al., 1995; Kan et al., 1996;. Wheeler-Jones et al.,

1997). Il est connu que les MAP kinases s’organisent en modules, chacun contentant au

moins trois protéines kinases qui travaillent en série (English et al., 1999). Dans le module

p42/p44MAPK, la protéine Raf-1 est la première kinase qui phosphoryle les MAPK/ERK

kinases (MEK) sur le résidu serine ou thréonine. MEK activée phosphoryle et active à son

tour les MAPK p42/p44, ses cibles spécifiques. En amont de la cascade de la MAP kinase,

l’activité de Raf-1 est soumise à une régulation complexe qui implique de multiples

phosphorylations par la PKC, les tyrosine kinases et p21-kinases en plus de son interaction

avec Ras (Morrison et Cutler, 1997).

Des facteurs de croissance, des stimuli extracellulaires tels que le stress, les

hormones et les cytokines peuvent également conduire à l’activation des MAPKs.

Plusieurs de ces ligands transmettent leur signaux via des récepteurs hétérotrimeriques

couplés aux protéines G (GPCRs ). Même si les mécanismes d’activation de MAPKs par

les GPCR ne sont pas bien connus, des travaux récents indiquent que sous certaines

conditions la cascade MAPK peut être activée par la sous unité Gα, de différentes

protéines G (Gs, Gi, Go, Gq et G12) ainsi que par la sous-unite βγ. Il a été montré que des

ligands de récepteurs couplés à la sous-unité Gi, par exemple, activent les MAPKs

(Gutkind, 1998). La trans-activation des récepteurs tyrosine Kinases (RTKs), ainsi que

l’activation de tyrosine kinases de la famille Src, Ras, PKCζ et PI3K en conjonction avec

une réduction d’AMPc sont impliquées dans la voie Gi vers ERK/MAPK (Gutkind, 1998.,

Luttrell et al., 1999). Cependant, le mécanisme engagé a été attribué essentiellement aux

dimères βγ. La déplétion des sous-unités βγ endogènes par des peptides neutralisants

inhibe l’activation de p42/p44MAPK par des récepteurs couplés aux protéines Gi (Daaka

et al., 1997, Luttrell et al., 1996). La stimulation de p42/p44MAPK par des sous-unités

141

βγ est médiée par des protéines tyrosine kinases de la famille Src. L’activation de Src par

des protéines Gi n’est pas bien connue. Un des modèles propose que la sous-unité βγ

recrute l’isoforme γ de la PI3-Kinase à la membrane cellulaire induisant ainsi la production

de PIP3 (Lopez-Ilasaca et al., 1997). Etant donné que les domaines SH2 se lient au PIP3 in

vitro, PIP3 peut activer directement Src par son domaine SH2.

La PTX catalyse l’ADP ribosylation des sous-unités αi et αo de la protéine Gi/o et

inhibe la fonction de signalisation de Gi/o. Nos résultats montrent que la PTX n’inhibe pas

la production de PGI2 dans notre système de coincubation lymphocytes-HUVEC, ce qui

exclut la possibilité de participation de cette sous-unité dans le mécanisme de signalisation

induit par le contact des lymphocytes. Même s’il existe une sous-famille de Gi/o, (Gαz)

qui n’est pas sensible à la PTX, celle-ci est majoritairement exprimée dans les tissus

neuronaux. En revanche, comme il est montré dans la Figure 26, la génistéine et le PP1

inhibent totalement la production de PGI2 stimulée par le contact des lymphocytes. Ces

résultats suggèrent fortement la participation d’une tyrosine kinase de la famille Src dans la

voie de signalisation déclenchée durant la coincubation des cellules. Il a été montré que

l’activation de Src est impliquée dans différentes fonctions cellulaires induites par des

facteurs de croissances comme la mitogenèse induite par l’EGF (Wilson et al, 1989) ou la

motilité cellulaire induite par le PDGF ou l’EGF (Parsons et Parsons, 1997). Récemment,

le rôle de Src dans la voie de signalisation qui conduit à la synthèse de NO et de PGI2 a été

décrit dans des BAEC stimulées par le VEGF (He et al., 1999). La liaison du VEGF à son

récepteur déclenche une cascade de signalisation qui résulte en la phosphorylation de la

PLC γ1 sur un résidu tyrosine menant à l’augmentation de 1,4,5 IP3 et de Ca2+

intracellulaire. Cette activation cellulaire induit la synthèse de NO et de PGI2. La voie de

signalisation de VEGF requiert l’activation de tyrosine kinase Src car le pré-traitement des

cellules avec la génistéine (20µg/mL) ou le PP2 (1µmoles/L), un autre inhibiteur

spécifique des Src kinases, avant la stimulation par VEGF (10 ng/mL) bloque la synthèse

des deux autacoïdes, NO et PGI2. Cependant la voie de signalisation induite par le VEGF

diverge avant l’activation de NOS/guanyl cylase et de la cascade des MAPK puisque le

pré-traitement des cellules avec l’inhibiteur spécifique de MEK, PD98059 n’a pas d’effet

sur la production de NO alors qu’il bloque complètement la production de PGI2. D’autre

part, comme attendu, la production de NO est totalement bloquée par l’inhibiteur de NOS,

L-NAME tandis que ce dernier n’a pas d’effet sur la synthèse de PGI2.

142

Nous avons montré (Merhi-Soussi et al., 2000) que la libération de l’AA et la

production de PGI2 induites par le contact des lymphocytes dépend de l’activation de la

cPLA2 car l’inhibition irréversible de cette enzyme dans des HUVEC par le MAFP avant la

coincubation lymphocytes-HUVEC bloque (-80%) la production de PGI2. Les résultats

décrits ici, montrent un rôle essentiel de Src et des MAPK dans la voie de signalisation qui

conduit à la stimulation de la production de PGI2 par les lymphocytes. De plus, la

phosphorylation de p42/p44 MAPK est manifeste dès la première heure et jusqu’à 4 h de

coincubation, période de temps correspondant au plateau de la production de PGI2, comme

montré par l’étude cinétique présentée dans la première partie de ce travail.

L’activation de la cPLA2 par la p42/p44 MAPK a été décrite dans des cellules

endothéliales (Wheeler-Jones, 1997). D’après nos résultats nous proposons que le contact

des lymphocytes aux HUVEC induit une voie de signalisation impliquant l’activation

séquentielle de: Src ™ p42/p44 MAPK ™ cPLA2. L’activation de la cPLA2 conduirait à la

libération de l’AA et à la synthèse ultérieure de PGI2.

143

Chapitre 3. LES ACIDES GRAS ω−3 ET LA FONCTION

CELLULAIRE

De nombreuses études montrent qu’un régime supplémenté en EPA et DHA ou en

huiles de poisson inhibe le développement de l’athérosclérose chez l’animal par des

mécanismes indépendants de la concentration plasmatique de LDL-cholestérol ou des

modifications oxydatives de la particule de LDL (Davis et al, 1987; Leaf et Weber, 1988;

Wiener et al., 1986; Shimokawa et Vanhoutte, 1988; Parks et al, 1990). La capacité de

l’EPA et du DHA d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses induite par des

mitogènes (Pakala et al., 1999) peut s’ajouter aux effets positifs des acides gras ω−3

décrits dans la littérature. Il est généralement admis que les acides gras EPA et DHA

opèrent par des mécanismes différents affectant ainsi des fonctions cellulaires distinctes.

L’effet antithrombotique résultant d’une diminution du rapport TXA2/TXA3 plaquettaire

est spécifique de l’EPA. Le DHA par exemple, protège contre le stress oxydant induit par

l’H2O2 in vitro (Bechoua et al., 1999), diminue l’expression des ECAMs (Weber et al.,

1995; De Caterina et al., 1995; Collie-Duguid et Wahle, 1996). Cet effet qui semblait être

spécifique du DHA a été aussi décrit pour l’EPA (Khalfoun et al., 1997).

Les changements de la composition lipidique des phospholipides cellulaires induits

par l’enrichissement du microenvironnement en acides gras ω−3 à longues chaînes peuvent

induire des altérations de certaines protéines et conduire à une altération de la transduction

de signaux. Il a été montré dans des thymocytes isolés à partir de rats soumis à un régime

riche en huile de poisson et activés par la Con-A, une altération des premières étapes

d’activation induite par le mitogène telles que l’induction rapide de l’ornithine

décarboxylase et de la phosphodiestérase des nucleotides cycliques (Valette et al., 1991).

Une absence d’inhibition des activités AMPc et GMPc phosphodiestérases en réponse à

H2O2 dans des cellules mononucléées de sang périphérique humain pré-traitees avec 5

µmoles/L DHA pendant 1h a été également décrite (Bechoua et al., 1999). D’autre part,

une augmentation de l’activité tyrosine kinase du récepteur à l’EGF et de la PLC-PI

spécifique, a été démontrée dans des cellules de carcinome mammaire traitées avec 52

µmoles/L d’un extrait d’huile de poisson (Estes et al., 1997). Les changements induits par

les acides gras ω−3 peuvent affecter la thromborésitance dépendante de l’endothélium et

en particulier, la production de PGI2. Les résultats de la littérature concernant la production

de PGI2 dans des cellules enrichies en des acides ω−3 sont contradictoires. Cette

144

contradiction peut être essentiellement due aux différents modèles expérimentaux ainsi

qu’aux différents acides gras ω−3 employés.

Afin de déterminer l’effet de l’enrichissement des cellules en acides gras ω−3 à

longues chaînes sur la réponse endothéliale induite par les lymphocytes dans notre

système, nous avons étudié en parallèle l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC et la

production de PGI2 après 4 h de coincubation des deux types cellulaires. Les cellules sont

préalablement maintenues pendant 3 jours dans un milieu enrichi en EPA ou DHA. Des

cellules enrichies en acide oléique ont été utilisées comme témoins de la production de

PGI2. Nous avons vérifié l’enrichissement des cellules par l’analyse en CPV des acides

gras des phospholipides totaux, selon le protocole décrit dans la partie II (Méthodes

paragraphe 2.8.3, p 111).

3.1 INCORPORATION DES ACIDES GRAS ω−3 DANS LES PHOSPHOLIPIDES

CELLULAIRES.

Les phospholipides (PL) membranaires représentent le réservoir cellulaire de

précurseurs pour la biosynthèse des eicosanoïdes dont la prostacycline. La composition

lipidique de ce compartiment cellulaire détermine donc la nature des eicosanoïdes qui

seront préférentiellement synthétisés par les cellules. Les HUVEC ont un contenu

relativement élevé en acide arachidonique (AA), acide gras précurseur de la PGI2. Après 3

jours de culture dans un milieu contenant 60 µmoles/L d’EPA, DHA ou acide oléique, le

contenu des PL totaux en ces acide gras d’intérêt est significativement augmenté. (Tableau

II). La proportion d’AA, n‘est pas modifiée par l’enrichissement en acide oléique. Par

contre, l’enrichissement en EPA ou DHA diminue significativement la proportion d’AA (-

62 et –34%, respectivement). La diminution plus importante obtenue avec l’EPA reflète sa

plus forte capacité à remplacer l’AA dans les PL cellulaires par rapport au DHA.

Comme cela a été montré dans les cellules endothéliales d’aorte bovine (BAEC)

(Achard et al., 1995; Kanayasu-Toyoda et al., 1996), l’acide docosapentaénoïque (DPA),

22:5 ω−3 est le principal produit d’élongation de l’EPA dans les HUVEC. Par contre, la

rétroconversion du DHA est beaucoup plus faible dans les HUVEC que dans les BAEC

(Achard et al., 1995). D’autre part, on remarque que la proportion d’acide linoleique (18:2

ω−6) n’est pas modifiée par l’enrichissement.

Le tableau III montre la composition en acides gras des PL totaux de lymphocytes

maintenus pendant 3 j dans les milieux contrôle ou enrichi (30 µmoles/L d’EPA, DHA ou

145

acide oléique). Comme il a été observé dans les HUVEC, la culture des lymphocytes dans

un milieu enrichi augmente significativement le contenu des PL totaux en l’acide gras

considéré. L’enrichissement est particulièrement important avec l’EPA (10 fois vs

contrôle). L’enrichissement des lymphocytes en DHA augmente leur contenu en EPA (7

fois vs contrôle), ce qui peut indiquer une activité peroxisomale normale. On note que la

rétroconversion du DHA en EPA semble être plus efficace dans les lymphocytes que dans

les HUVEC comme l’indique le pourcentage élevé (21%) de DHA rétroconverti.

Les HUVEC sont cultivées dans un milieu contrôle ou dans un milieu enrichi en acide oléique,

EPA ou DHA 60 µmoles/L (concentration finale). Après 3 jours de culture dans des boîtes (T250

mm2) les cellules sont récoltées et les PL totaux séparés comme décrit dans la Partie II méthodes,

paragraphe 2.8.3, p 111. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM du nombre de

déterminations indiqué entre parenthèses. Les moyennes sont comparées par le test de Bonferroni,

* (P <0,05), † (P <0,01) et ‡ (P <0,001), N.D= non détectée.

Tableau II. Composition en acides gras des phospholipides totaux (% molaire) dans des HUVEC après 3 j de culture dans un milieu enrichi en acides gras.

Acides Gras Cellules EnrichiesSaturés Témoin (n=6) Oléique (n=3) EPA (n=5) DHA (n=4)

16:0 20,3 ± 0,85 21,5 ± 1,2 19,8 ± 0,86 21,5 ± 1,218:0 20,4 ± 1,23 15,6 ± 0,63 13,9 ± 1,32* 18,2 ± 0,7420:0 0,1 ± 0,05 0,2 ± 0,05 0,2 ± 0,03 0,1 ± 0,0522:0 0,7 ± 0,19 1,2 ± 0,54 0,2 ± 0,06 0,6 ± 0,224:0 1,1 ± 0,29 0,1 ± 0,09* 0,4 ± 0,10* 0,6 ± 0,17

Monoinsaturés 16:1 ω−9 0,9 ± 0,18 1,2 ± 0,23 1,1 ± 0,06 1,2 ± 0,1916:1 ω−7 1,1 ± 0,21 1,3 ± 0,17 1,5 ± 0,26 1,6 ± 0,2418:1 ω−9 21,2 ± 0,86 29 ± 2,64* 23,9 ± 0,76 18,5 ± 0,718:1 ω−7 3,7 ± 0,2 3,8 ± 0,42 2,9 ± 0,07* 3,8 ± 0,3220:1 ω−9 0,3 ± 0,15 0,5 ± 0,04 0,2 ± 0,05 0,2 ± 0,08

Polyinsaturés18:2 ω−6 5,5 ± 0,84 3,8 ± 0,33 4,2 ± 0,15 3,9 ± 0,3720:3 ω−6 1,1 ± 0,49 1,2 ± 0,1 1 ± 0,09 2,1 ± 0,520:4 ω−6 11,5 ± 0,69 9,1 ± 0,43 4,4 ± 0,36‡ 7,6 ± 0,07† 20:5 ω−3 0,2 ± 0,06 0,4 ± 0,15 7,5 ± 0,42‡ 1 ± 0,3822:4 ω−6 3,6 ± 0,86 N.D N.D N.D22:5 ω−6 0,2 ± 0,08 0,1 ± 0,06 N.D ± N.D 0,02 ± 0,0122:5 ω−3 2,7 ± 0,21 1,6 ± 0,18 8,4 ± 0,49* 0,7 ± 0,25*22:6 ω−3 1,9 ± 0,23 0,9 ± 0,20* 0,4 ± 0,04* 9,7 ± 0,49‡

146

Un autre effet du DHA observé sur les lymphocytes et pas sur les HUVEC est la

diminution de l’acide palmitique (16:0). En revanche, l’élongation de l’EPA en DPA, 22:5

ω−3 est plus efficace dans les HUVEC que dans les lymphocytes (76 et 7%

respectivement). Le contenu en AA des PL totaux de lymphocytes témoins est très

supérieur à celui des HUVEC témoins (20 vs 11%, respectivement). Ce pourcentage est

diminué significativement (-33%) seulement dans les lymphocytes enrichis en EPA. De

plus, dans tout les cas, la supplémentation en acide gras diminue le contenu en 18:2 ω−6.

Les lymphocytes sont cultivées dans un milieu control ou dans un milieu enrichi en acide oléique,

EPA ou DHA 30 µmoles/L (concentration finale). Après 3 jours de culture dans des boîtes (T250

mm2) les cellules sont récoltées et les PL totaux séparés comme décrit dans la Partie II méthodes,

paragraphe 2.8.3, p 111. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM du nombre de

déterminations indiqué entre parenthèses. Les moyennes sont comparées par le test de Bonferroni,

* (P <0,05), † (P <0,01) et ‡ (P <0,001), N.D= non détectée.

Tableau III. Composition en acides gras des phospholipides totaux (% molaire) dans des lymphocytes après 3 j de culture dans un milieu enrichi en acides gras.

Acides Gras Cellules EnrichiesSaturés Témoin (n=6) Oléique (n=3) EPA (n=5) DHA (n=4)

16:0 21,2 ± 1,0 18,7 ± 0,2 23,4 ± 0,4 16,4 ± 0,6*18:0 21,3 ± 1,1 16,9 ± 0,2 25,5 ± 0,1 23,7 ± 0,720:0 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 N.D22:0 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,2* 1,2 ± 0,7 0,5 ± 0,224:0 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,04* 0,1 ± 0,1 0,4 ± 0,1

Monoinsaturés 16:1 ω−9 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,04 0,6 ± 0,116:1 ω−7 0,5 ± 0,3 0,3 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,4 ± 0,118:1 ω−9 8,0 ± 0,5 11,4 ± 0,5* 6,1 ± 0,4 8,4 ± 0,618:1 ω−7 3,2 ± 0,1 2,7 ± 0,4 3,1 ± 0,1 3,0 ± 0,320:1ω−9 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,03 N.D 0,2 ± 0,03

Polyinsaturé18:2 ω−6 5,7 ± 0,3 3,4 ± 0,4† 4,1 ± 0,5* 3,8 ± 0,4† 20:3 ω−6 2,4 ± 0,2 1,3 ± 0,3 1,02 ± 0,9 1,5 ± 0,120:4 ω−6 20 ± 0,4 16,7 ± 0,7 13,4 ± 1,6* 17,5 ± 0,720:5 ω−3 0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,1 7,6 ± 0,4‡ 4,6 ± 0,4‡22:4 ω−6 2,4 ± 0,3 1,0 ± 0,2 2,7 ± 0,5 2,0 ± 0,522:5 ω−6 0,1 ± 0,1 N.D 0,1 ± 0,1 N.D22:5 ω−3 2,7 ± 0,2 1,6 ± 0,1* 3,2 ± 0,2 1,5 ± 0,2† 22:6 ω−3 3,0 ± 0,2 2,1 ± 0,1 1,9 ± 0,1 13,2 ± 0,4‡

147

3.2 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHÉSION

DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM

Il est admis que les acides gras, particulièrement le DHA diminuent la capacité

adhésive des cellules endothéliales activées par des cytokines ou par le LPS. (De Caterina

et al., 1995; Weber et al, 1995; Khalfoun et al, 1996; Sanderson et Calder, 1998). Nous

avons donc mesuré l’adhésion des lymphocytes enrichis en acides gras ω−3 puis marqués

au 51Cr, à des HUVEC également enrichies (voir partie II, méthodes; paragraphe 2.6, p

107). Les résultats présentés dans la figure 29 montrent que l’adhésion de lymphocytes

enrichis en EPA et DHA sur des HUVEC enrichies ne représente que 80 et 60%,

respectivement de celle observée avec des cellules non enrichies.

Figure 29. Effet de l’enrichissement en acide gras ω−3 sur l’adhésion des lymphocytes

à l’endothélium. Les HUVEC et les lymphocytes sont cultivés séparément pendant 3 j avec un

milieu contrôle ou enrichi en l'acide gras indiqué. Les lymphocytes sont marqués pendant 1h avec

925 KBq de Na251CrO4/106 cellules à 37°C. Après 3 lavages, 200 µL de la suspension de

lymphocytes resuspendus à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ensuite ajoutés (rapport

L/HUVEC 9:1) aux HUVEC. Après 4 h de coincubation dans des conditions statiques, les puits

sont lavés trois fois avec du PBS pour éliminer les lymphocytes non adhérents. Les lymphocytes

adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et la radioactivité est comptée. L’adhésion est

exprimée en pourcentage par rapport à l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC témoins

considérée égale à 100. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 6 expériences

indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par un test

de t de Fisher. *P<0,05 ou †P<0,001 vs la valeur correspondant au témoin.

0

60

120

Témoin O le ique EP A D HA

Adh

ésio

n (%

du

cont

röle

)

*

†

148

L’enrichissement des cellules en acide oléique ne modifie pas l’adhésion. Nos résultats sont en bon

accord avec ceux décrit par Khalfoun et al. (1996) montrant une diminution de l’adhésion de

lymphocytes au repos à des HUVEC au repos après pré-traitement de ces deux types cellulaires

avec de l’EPA et du DHA.

3.3 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA

PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE INDUITE PAR LES

LYMPHOCYTES.

Parallèlement à l’adhésion, nous avons mesuré la PGI2 dans les surnageants des

cellules enrichies en acides gras ω−3 ou non enrichies après 4 h de coincubation. La

production basale de PGI2 diminue significativement dans les HUVEC enrichis en acides

gras ω−3 par rapport aux HUVEC témoins (Figure 30). De même que d’autres auteurs

(Spector et al., 1983;. Achard et al., 1997) nous avons trouvé 50% de diminution de la

production de PGI2 dans les HUVEC enrichies en EPA ou DHA. Cette diminution peut

être attribuée à la diminution de la disponibilité du précurseur, l’AA, car il a été remplacé

dans les PL cellulaires (Tableau II), ou à la régulation négative de la PGHS-1 par les

acides gras ω−3, comme cela a été préalablement montré dans notre laboratoire (Achard et

al., 1997).

Figure 30. Effet de l’enrichissement en acide gras ω−3 sur la production de PGI2. Les

HUVEC et les lymphocytes sont cultivés séparément pendant 3 j dans un milieu contrôle ou enrichi

en l'acide gras indiqué (voir Matériels et Méthodes). Les HUVEC sont coincubées avec les

lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1). Après 4 h de coincubation les surnageants sont collectés

pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par rapport à la production basale de

2 .3

2 .7

2 .6

2 .6

0

1

2

3

4

5

Té m oin O LEIQ UE EP A D HA

6-ox

o-PG

F 1α

Co in c u b a t io n

Ba s a l

* *

149

PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 10 expériences

indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont comparées par un

test de t de Fisher. Les barres solides représentent la production basale, les barres vides montrent la

synthèse induite par les lymphocytes. Les chiffres à l'intérieur des barres indiquent l'augmentation

relative à la production basale pour chaque traitement.

Par contre, la production de PGI2 ne varie pas par rapport au témoin dans des

HUVEC enrichies en acide oléique. Ce résultat montre un effet spécifique des acides gras

ω−3 sur la production basale de PGI2. Bien que l’enrichissement en EPA ou DHA ait

diminué la production basale de PGI2, l’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse

de PGI2 n’est pas modifié après l’enrichissement de ces deux types cellulaires. En fait, la

coincubation lymphocytes-HUVEC enrichies augmente significativement la synthèse de

PGI2. L’amplitude de cette réponse qui représente 2,6 et 2,3 fois la production basale des

HUVEC enrichies en EPA ou DHA, respectivement, est égale à celle obtenue lors de la

coincubation de cellules témoins non enrichies ou de cellules enrichies en acide oléique.

3.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS

L’utilisation de cellules en culture donne la possibilité de modifier rapidement, en

terme d’heures, la composition en acides gras des phospholipides cellulaires (Spector et

al., 1981; Spector, 1969). Dans nos conditions d’enrichissement, suite à 3 jours de culture

dans un milieu enrichi en EPA ou DHA, la composition en acides gras des PL cellulaires

est fortement modifiée. Les PL sont nettement enrichis en EPA ou en DHA,

respectivement. De plus, nous avons observé une forte élongation de l’EPA en DPA, la

proportion de DHA restant basse dans les PL des cellules enrichies en EPA. Ces résultats

sont en accord avec des travaux antérieurs (Hadjiagapiou et al., 1986), montrant que

l’apport d’EPA aux cellules endothéliales n’entraîne pas d’augmentation de la proportion

de DHA dans les PL. En revanche, l’enrichissement en DHA se traduit par une

augmentation de la proportion en EPA, qui est beaucoup plus évidente dans les

lymphocytes que dans les HUVEC, et qui n’entraîne pas d’accumulation de DPA dans les

PL cellulaires. Les phénomènes de conversion de l’EPA et du DHA ont été mis en

évidence in vivo dans le cerveau et le foie (Bourre et al., 1990; Voss et al., 1992), et in

vitro, dans des BAEC (Hadjiagapiou et al., 1986; Hadjiagapiou et Spector, 1987).

150

Contrairement aux BAEC (Hadjiagapiou et al., 1986; Hadjiagapiou et Spector,

1987) où la réduction de la proportion d’AA est spécifique de l’EPA, nous observons dans

les HUVEC une diminution de l’AA induite par le DHA. Il est possible que ces résultats

contradictoires soit liés aux différences de conditions expérimentales. Tout d’abord, ces

auteurs ont travaillé avec un autre type de cellules endothéliales, (BAEC). Ces cellules ont

été incubées pendant 24 h avec des concentrations de DHA plus faibles, (40 µmoles/L).

Nous avons cultivé des HUVEC pendant 3 jours dans un milieu contenant 60 µmoles/L de

DHA. De plus, une certaine quantité de DHA a été rétroconvertie en EPA. Néanmoins, le

pourcentage de diminution de l’AA après enrichissement en DHA représente environ la

moitié de celui observé avec l’EPA (Tableau II ). Ceci met en évidence la plus forte

capacité de l’EPA pour déplacer l’AA, ce qui pourrait s’expliquer par sa structure

chimique. L’EPA et l’AA sont des acides gras à 20 atomes de carbone présents dans les

mêmes compartiments phospholipidiques, à savoir les PC et dans une moindre proportion

les PE (Takayama et al, 1987, 1989). Ils sont donc en compétition pour leur estérification

dans les PL. Par contre, les acides gras à 22 atomes de carbones comme le DHA étant

plutôt présents dans les PE (Hadjiagapiou et Spector, 1987; Weiner et Sprecher, 1985), leur

compétition vis à vis de l’AA est moindre.

Quand les HUVEC sont préalablement enrichies en acides gras ω−3 la production

basale de PGI2 (HUVEC seules) est réduite de 50 % par rapport aux cellules témoins.

Comme déjà mentionné auparavant des résultats contradictoires concernant l’effet des

acides gras ω−3 sur la production de PGI2 ont été rapportés. Saito et al. (1997) ont montré

une augmentation de la PGI2 basale dans les SVCM après 13 h d’incubation avec 160

µmoles/L d’EPA apporté sous forme de triacylglycerol. D’autres auteurs en accord avec

nos résultats ont décrit dans des HUVEC (Spector et al., 1983; Hadjiagapiou et Spector,

1987) et dans d’autres cellules endothéliales (Achard et al., 1997; Hadjiagapiou et Spector,

1987; Yerram et al, 1989) une réduction d’environ 50 % de la production de PGI2 basale

après traitement des cellules avec des acides gras ω−3. Ces auteurs proposent que l’effet

soit dû à une inhibition de la PGHS plutôt qu’à la diminution de la disponibilité de l’AA.

Dans des BAEC, l’incubation (24 h) avec 10 µmol/L d’EPA ou DHA induit la diminution

de la production basale de PGI2, alors que celle-ci augmente lorsque les cellules sont

cultivées pendant 5 j dans un milieu supplementé avec 10 µM EPA ou DHA (Hishinuma et

al., 1999). Des réductions similaires sont observées lorsque la synthèse de PGI2 est

stimulée par l’AA; la production de PGI2 diminue par rapport aux témoins dans des BAEC

151

(Achard et al., 1997) ainsi que des HUVEC (Spector et al., 1983) après exposition (<22 h)

aux acides gras ω−3 liés à l’albumine. De plus, sous l’action d’agonistes qui mobilisant

l’AA endogène tels que la thrombine (Spector et al., 1983), la bradykinine (Achard et al.,

1997) ou l’ionophore de calcium (Spector et al., 1983; Achard et al., 1997; Yerram et al.,

1989) la quantité de PGI2 issue des cellules traitée avec EPA ou DHA est toujours égale à

50 % de celle des cellules témoins. L’altération de la synthèse de PGI2 peut être liée à une

diminution de la PGHS-1 ou de son expression comme cela a été montré par Achard et al.,

(1997) dans des BAEC traitées avec EPA ou DHA. Ces résultats indiquent que l’EPA et le

DHA ont la capacité de moduler l’expression de la PGHS-1 car la quantité de l’enzyme

ainsi que celle des ARNm correspondants sont diminuées dans les cellules incubées

pendant 22 h avec 25µmoles/L d’EPA ou DHA.

D’autre part, les résultats des études nutritionnelles chez l’Homme montrent que la

production de PGI2 n’est pas modifiée après 40 semaines de régime avec un supplément en

huile de foies de morue (von Schacky et a.l, 1985). De plus, De Caterina et al. (1990) ont

montré une augmentation de la PGI2 basale dans les vaisseaux et le tissu atrial chez des

patients soumis à un pontage coronarien, après un régime riche en acides gras ω−3 pendant

28 jours.

Nos résultats montrent que malgré les 50 % de réduction de la production basale de

PGI2 observée dans les HUVEC après l’enrichissement en acides gras ω−3, la capacité

inductive des lymphocytes sur la production de PGI2 est préservée après l’enrichissement

des deux types cellulaires (Figure 30, p 148). Bien que l’activité de la PGHS-1 puisse être

régulée négativement par les acides gras ω−3, il semblerait que l’activité soit maintenue à

un niveau suffisant pour assurer la synthèse de PGI2 après libération de l’AA par une

cPLA2. En effet, lors de la coincubation, les HUVEC enrichies en acides gras ω−3 se

comportent comme les témoins (augmentation de la production de PGI2 d’un facteur 2,5)

malgré leur faible contenu en AA, particulièrement les cellules enrichies en EPA. Ceci

indique que la voie de signalisation induite par les lymphocytes n’est pas modifiée par les

changements dans la composition en acides gras des PL ni par des changements de fluidité

de la membrane cellulaire. D’autre part, bien que l’EPA ne soit pas le principal substrat, il

est quand même transformé par la PGHS en PGH3 (Willis, 1981; Whitaker et al., 1979;

Mai et al.,1981) qui peut être métabolisée en PGI3 (Hishinuma et al., 1999). Ce qui n’altère

pas la capacité antithrombogénique de l’endothélium.

152

D’après nos résultats il est clair que le mécanisme d’induction de la synthèse de

PGI2 ne requiert pas une adhésion forte de deux types cellulaires. Deux arguments sont en

faveur de cette idée: le blocage des ECAMs particulièrement ICAM-1 ne modifie pas la

réponse endothéliale induite par le contact avec les lymphocytes et l’amplitude de cette

réponse dans les cultures enrichies en EPA ou DHA est comparable aux témoins bien que

l’adhésion soit diminuée, notamment dans les cellules enrichies en DHA.

En conclusion, nos résultats indiquent que l’endothélium enrichi en acides gras ω−3

à longue chaîne répond efficacement au contact des lymphocytes par une augmentation de

la synthèse de PGI2. Quel que soit le mécanisme d’action, l’existence de cet effet in vivo

peut contribuer à expliquer la protection contre les maladies cardio-vasculaires attribuées

aux acides gras de la famille ω−3.

153

CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSIIIOOONNN GGGÉÉÉNNNÉÉÉRRRAAALLLEEE EEETTT

PPPEEERRRSSSPPPEEECCCTTTIIIVVVEEESSS

154

PARTIE IV. CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES

Notre travail avait pour objectif principal d’étudier l’influence des lymphocytes du

sang périphérique sur le pouvoir vasodilatateur et anti-agrégeant de l’endothélium. Trois

aspects principaux ont été développés:

La spécificité du contact des lymphocytes sur la production de la PGI2 endothéliale

Les voies de signalisation impliquées dans la synthèse de la PGI2 lors de la

coincubation lymphocytes-HUVEC et

L’effet d’un changement majeur de la composition en acides gras des phospholipides

cellulaires sur la réponse endothéliale induite par les lymphocytes.

Des résultats précédents (Merhi-Soussi et al., 2000) avaient montré que les

lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de prostacycline (PGI2) par les

cellules endothéliales de veine de cordon ombilical humain. Cette réponse observée, in

vitro, lors de la coincubation des deux types cellulaires en conditions statiques est fonction

du nombre de lymphocytes ajoutés mais ne dépend pas de leur condition métabolique. En

effet, aucune différence significative de production de PGI2 n’a été observée lors de la

coincubation des HUVEC avec des lymphocytes non activés ou des lymphocytes pré-

activés pendant 72 h par la PHA avant la coincubation. Toutefois, le contact entre les deux

types cellulaires est obligatoire car l’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse de

PGI2 disparaît lorsque les lymphocytes sont coincubés à distance des cellules endothéliales.

Le présent travail a permis de montrer que l’effet stimulateur sur la synthèse de

PGI2 dépend des interactions spécifiques entre les lymphocytes et les HUVEC. Aucune

augmentation significative de PGI2 n’a été observée lorsque les HUVEC ont été

coincubées avec des plaquettes, des PMN ou des billes de latex. Ce résultat montre que le

contact physique per se n’est pas un stimulus efficace. La coincubation lymphocytes-

HUVEC dans des conditions statiques induit des interactions spécifiques entre les deux

types cellulaires et conduit à l’activation de l’endothélium, en particulier à l’augmentation

de l’expression des molécules d’adhésion endothéliales (ECAMs): sélectine-E, VCAM-1 et

ICAM-1.

L’étude cinétique de la production de PGI2 induite par les lymphocytes montre que

l’augmentation de la synthèse de PGI2 est déjà significative après 20-30 minutes de

155

coincubation. La rapidité du processus ainsi que la nécessité d’un contact direct entre les

deux types cellulaires sont deux arguments qui permettent d’exclure la participation de

médiateurs soluble comme les cytokines dans le mécanisme d’augmentation de la synthèse

de prostacycline. Cependant, même si les ECAMs sont régulées positivement par le contact

des lymphocytes nos résultats montrent clairement que la sélectine-E, VCAM-1 ou ICAM-

1, ne sont pas impliquées dans la voie de signalisation menant à la synthèse de PGI2 induite

par les lymphocytes (Dominguez et al., 2001).

Les résultats obtenus à l’aide des inhibiteurs génistéine et PP1 montrent que des

protéines tyrosine kinases, en particulier celle de la famille Src sont impliquées dans la

cascade de signalisation induite par le contact lymphocyte-HUVEC. D'ailleurs, nous avons

mis en évidence la phosphorylation de p42/p44 MAPK. De plus, il a été montré dans notre

système (Merhi-Soussi et al., 2000) que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes

dépend de l’activité d’une cPLA2 calcium-dépendante et de l’activité constitutive de la

PGHS-1. Donc, nous pouvons postuler que la voie en amont de la libération de l’AA est

probablement dépendante de l’activation de PTK de la famille Src qui vont en suite

phosphoryler p42/p44MAPK conduisant à l’activation de la cPLA2 et à la synthèse

ultérieure de PGI2 par la PGHS-1.

Enfin, nous avons montré que le remplacement des acides gras du

microenvironnement cellulaire par des acides gras à longues chaînes de la famille ω−3 ne

modifie pas la synthèse de PGI2 induite par le contact des lymphocytes indiquant que

l’activité de la PGHS-1 est suffisamment maintenue dans ces conditions d’enrichissement

en EPA ou DHA pour assurer la synthèse de cet eicosanoïde à partir d’un pool d’AA

généré par la cPLA2.

Etant donné que le contact spécifique des lymphocytes aux cellules endothéliales

est essentiel pour déclencher la synthèse de PGI2, il serait important d’étudier l’implication

d’autres molécules exprimées sélectivement par les lymphocytes et non par les PMN ou les

plaquettes non-activées, susceptibles de jouer un rôle dans l’initiation de la voie de

signalisation dans les HUVEC qui mène à la synthèse ultérieure de la PGI2. Les molécules

de classe-I et II du complexe majeur d’histocompatibilité exprimées sur les cellules

endothéliales et leurs contre-récepteurs correspondants, les molécules CD8 et CD4

exprimées sur les lymphocytes pourraient être de bons candidats. Les HUVEC au repos

expriment de façon constitutive les antigènes de classe-I (Lidington et al., 1999). Nos

résultats montrent que le contact lymphocytes-HUVEC induit significativement

l’expression des ECAMs après 4 h de coincubation. Il est très possible que l’expression des

156

molécules CMH classe-II soit aussi régulée positivement. En effet, Doukas et Pober (1990)

ont montré l’induction de l’expression des molécules du CMH classe II et I ainsi que

d’ICAM-1 dans des HUVEC cocultivées pendant 72 h avec des lymphocytes du sang

périphérique avec un rapport lymphocyte/HUVEC 10:1, comparable au nôtre. En plus, il a

été montré que les molécules CMH classe I et II sont capables de délivrer des signaux

d’activation aux lymphocytes CD8 et CD4 et que cette activation est dépendante du

contact entre cellules (Adams et al., 1994; Page et al., 1994, Denton et al., 1999). Donc, on

peut spéculer que lors du contact entre cellules, les lymphocytes CD4 et CD8 pourraient

activer les cellules endothéliales pour produire de la PGI2.

Même si l’induction de la PGI2 par les lymphocytes est indépendante des cytokines

solubles, des cytokines fortement liées aux membranes cellulaires pourraient être

impliquées. Il serait intéressant d’étudier l’implication éventuelle du TNFα membranaire

lymphocytaire et de ses récepteurs endothéliaux dans l’activation de la cPLA2 et la

synthèse de prostacycline dans notre système d’interaction cellulaire. En effet, il a été

montré dans des conditions proches des nôtres, que les lymphocytes humains au repos

induisent l’expression du facteur tissulaire (FT) dans des HUVEC au repos via des

interactions entre le TNFα membranaire, exprimé sur les lymphocytes, et son récepteur de

masse moléculaire 75 kDa, exprimé sur les cellules endothéliales (Reverdiau-Moalic et al.,

1998). La synthèse de FT est dépendante du contact entre les deux types cellulaires et

montre une cinétique dont le maximum se situe à 4 h de coincubation. Le TNF-α a été

décrit comme activateur de la cPLA2 dans plusieurs types cellulaires tels que les cellules

endothéliales vasculaires humaines (Terry et al., 1999), les cellules endothéliales bovines

(Clark et al., 1988) et les cellules épithéliales humaines (Hansen et al., 1999). De plus,

Luschen et al., (2000) ont montré que la production d’eicosanoïdes en réponse au TNF

dans les fibroblastes implique une activation de ERK-1/2 et de cPLA2, cette activation

étant initiée à partir du récepteur du TNF de 55 kDa. De même, il a été montré que le TNF-

α active la voie de la MAPK menant à une activation de la PLA2 et à la synthèse de PGF2α

dans les cellules lutéales bovines (Sakumoto et al., 2000). La contribution des récepteurs

du TNFα membranaire à la production de PGI2 pourrait être vérifiée en préincubant les

HUVEC avec des anticorps bloquants anti-récepteurs TNFα avant leur coincubation avec

les lymphocytes.

D’autres molécules telles que PECAM-1 Platelet-endothelial cell adhesion

molecule-1, membre de la superfamille des immunoglobulines, ou CD44, glycoprotéine

157

transmembranaire, exprimées à la surface des lymphocytes et des cellules endothéliales,

seraient intéressantes à étudier même si elles ne sont pas uniquement exprimées sur les

lymphocytes. En effet, Gurubhagavatula et al. (1998) ont montré que des anticorps anti-

PECAM-1 augmentent la concentration en calcium intracellulaire des HUVEC ainsi que la

synthèse de PGI2. Des résultats suggérant la participation de PECAM-1 et de la famille des

tyrosine kinases Src dans la captation et la transduction du signal induit par les stimuli

mécaniques ont été publiés (Osawa et al., 1997); ce travail montre dans des cellules

endothéliales bovines et humaines la phosphorylation de PECAM-1 induite par le flux,

ainsi que la co-immunoprécitpitation de c-Src et d’une protéine de fusion contenant le

domaine cytoplasmique de PECAM-1. Nos résultats de coincubation dans la condition de

rotation continue montrent que le stimulus mécanique est synergique de l’effet inducteur

des lymphocytes sur la production de PGI2. Par ailleurs, l’engagement de PECAM-1 sur

des lymphocytes T, CD45RA conduit à la prolifération, la sécrétion de cytokines et la

régulation positive du récepteur de l’IL-2. Dans d’autres types cellulaires comme les

monocytes, la liaison de PECAM-1 avec des anticorps monoclonaux stimulants de la

fonction, entraîne la sécrétion de TNF-α alors que dans le PMN l’activation de PECAM-1

mène à la régulation négative de sélectine-L et à la régulation positive de Mac-1 et de

l’explosion respiratoire (Elias et al., 1998). Cependant, PECAM-1 contient un motif ITIM

dans son domaine cytoplasmique qui pourrait inhiber la signalisation. Par exemple,

l’inhibition de la signalisation du TCR médiée par PECAM-1 a été attribuée au moins en

partie à l’inhibition de la libération de Ca 2++ depuis les réserves intracellulaires (Newton-

Nash et Newman, 1999). Dans notre système, des interactions homophiliques entre les

PECAMs des HUVEC et des lymphocytes peuvent être possibles. L’utilisation d’un

anticorps bloquant anti-PECAM permettrait de vérifier cette hypothèse.

D’autre part, la stimulation du CD44 active des protéines tyrosine kinases (PTK)

intracellulaires et notamment les PTK de la famille Src qui sont couplées au CD44

(Ilangumaran et al., 1999). La préincubation des HUVECs et/ou des lymphocytes avec un

anticorps anti-CD44 avant leur coincubation permettrait d’étudier l’implication du CD44

en amont de l’activation des PTK de la famille Src dans la voie de signalisation déclenchée

dans les HUVEC par le contact des lymphocytes.

Egalement, pour compléter cette étude, la cascade de signalisation activée par le

contact lymphocytes-HUVEC pourrait être éclaircie. Nos résultats sont en faveur d’un voie

de signalissation dans laquelle une tyrosine kinase de la famille Src est activée et initie à

son tour une cascade de signalisation menant à l’activation de la p42/p44 MAPK et par la

158

suite à l’activation de la cPLA2. Premièrement, il serait nécessaire d’identifier le type de

PTK Src impliquée, à l’aide d’anticorps reconnaissant les différents membres de la famille

PTK Src, qui comprend au mois huit protéines: Scr, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck et Blk,

parmi lesquelles Src, Fyn, Lyn, sont exprimées dans les HUVEC. La mise en évidence des

formes phosphorylées de ces protéines, permettrait de caractériser complètement le chemin

de signalisation à partir du récepteur d’interaction lymphocytes-HUVEC dans notre

système.

Comme approche de la situation in vivo, nous avons utilisé un système de coculture

lymphocytes-HUVEC mimant une concentration locale de lymphocytes sur l’endothélium.

Ce travail confirme nos résultats précédents montrant la capacité des lymphocytes à

augmenter la production de prostacycline par les HUVEC et démontre que

l’enrichissement en EPA ou DHA n'altère pas la réponse, même si l’adhésion des

lymphocytes est substantiellement réduite par ces acides gras.

Compte tenu de l’absence d’induction de PGHS-2 et/ou de régulation de

l’expression de la PGHS-1 (Merhi-Sossi et al., 2000), nous avons émis l’hypothèse que le

contact direct lymphocytes/cellules endothéliales augmente la libération de l’acide

arachidonique indépendamment de la composition en acides gras des phospholipides

cellulaires

Les changements de composition en acides gras de la membrane peuvent induire

des altérations de la fonction de certaines protéines ( Stubbs et Smith‚ 1984; Keelan et al.,

1994; Bidard et al., 1984) et modifier la transduction du signal. L’enrichissement des

HUVEC en acides gras ω−3 préserve la capacité anti-thrombogénique de l’endothélium

puisque sa capacité de production de PGI2 est maintenue. Ceci doit être une fonction

essentielle durant les évènements qui précèdent le recrutement des monocytes et des

lymphocytes.

De plus, si on considère la supplémentation in vivo, la conversion d’EPA en PGH3

et la diminution de TXA2 en faveur de TXA3 dans les plaquettes est sans doute

d’importance majeure. Contrairement à la PGH2 et au TXA2, la PGH3 et le TXA3 sont de

très faibles inducteurs de l’activation et de l’agrégation plaquettaires. L’enrichissement des

plaquettes en EPA doit donc diminuer la réponse plaquettaire aux agonistes pro-agrégants

car le rapport AA/EPA est diminué. Ainsi, l’effet global de la substitution de l’AA par

l’EPA ou le DHA devrait se traduire par une réduction de l’agrégation plaquettaire car la

balance est en faveur de la production de médiateurs moins actifs. L’EPA dans la cellule

endothéliale, produit à partir de la PGH3 de la PGI3 qui a des effets inhibiteurs similaires à

159

ceux de la PGI2 (Needleman et al.‚ 1979; Moncada et Vane, 1979). Ainsi, l’effet de la

supplementation du régime alimentaire en acide gras ω−3 serait en faveur de

l’antiagrégation sans altération de la capacité vasodilatatrice et de production de PGI2

vasculaire (von Schacky et al., 1985). Ceci pourrait contribuer à expliquer la protection

contre les maladies cardio-vasculaires attribuée aux acides gras ω−3 (Leaf et Weber, 1988;

McLennan et al., 1995).

Ainsi le mécanisme par lequel les lymphocytes induisent la synthèse de PGI2 n’est

pas modifié par un microenvironnement enrichi en acides gras ω−3. Ce mécanisme

inducteur de la synthèse de PGI2 qui dépend du contact des lymphocytes peut constituer un

nouveau rôle régulateur des lymphocytes dans les cellules vasculaires. Ceci s’ajoute aux

autres effets connus des lymphocytes comme l’inhibition de la prolifération des cellules

musculaires lisses (Hansson et al., 1989., Hansson et al., 1991), et l’induction de la

synthèse de monoxyde d’azote (Shuler et al., 1995). Ces effets peuvent avoir un rôle

physiopathologique important dans les phases précoces de l’athérosclérose. Ces effets

positifs du lymphocyte pourraient contrebalancer son effet procoagulant (Schmid et al.,

1995, Reverdiau-Moalic et al., 1998) et jouer un rôle décisif dans les étapes précoces de

l’athérogenèse.

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RRRÉÉÉSSSUUUMMMEEE EEENNN AAANNNGGGLLLAAAIIISSS

200

TITRE DE LA THÈSE EN ANGLAIS:

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Prostacyclin (PGI2), regulates haemostasis, vascular tone, as well as the

proliferation of smooth muscle cells. We have previously reported that human peripheral

blood lymphocyte (L) contact to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)

enhances PGI2 output involving a cPLA2 pathway. Here, we demonstrate the specificity of

lymphocytes in switching-on this response. PGI2 synthesis during coincubation of

L/HUVEC was maximal at 4 h, reaching a plateau thereafter for up to 20 h. L/HUVEC

coincubated in serum-free medium, at a ratio of 9:1, under static or dynamic conditions,

enhanced the basal (HUVEC alone) PGI2 output by 2.5-fold. Preactivation of either cell is

not required but the mechanism depends on a specific contact with lymphocytes shown by

the absence of effect when HUVEC were coincubated with resting neutrophils, platelets or

latex beads at a ratio of 9:1. Blocking endothelial cell adhesion molecules (ECAM) E-

selectin, VCAM-1 or ICAM-1 did not modify the L/HUVEC effect. However, 51Cr-labeled

L adhesion was significantly decreased with anti-ICAM-1. Contrariwise, tyrosine proteins

kinases of the Scr family show to be essential. Moreover, phosphorylation of

p42/p44MAPK evidenced by western-blot occurred as early as 1 h of coincubation

remaining up to 4 h. Furthermore, the lymphocyte-induced PGI2-output was totally

abolished when inhibiting MAPKK by using PD98059, 25 µmoles/L, a concentration well

known to restrain p42/p44MAPK phosphorylation. Changes in fatty acid composition of

membrane phospholipids (PL) induced by incubation for 3 days with eicosapentaenoic or

docosahexaenoic acids resulted in less basal PGI2 output and adhesion of 51Cr- labeled

lymphocytes whilst the lymphocyte-induced PGI2 output was not modified.

This lymphocyte-induced PGI2 synthesis which does not primarily involves ECAM

pathway is independent of PL fatty acid composition and signals through the

p42/p44MAPK cascade. This physiological response might serve as a switch-on step for

operation of host defense against atherogenesis.

Keywords: prostacyclin, lymphocytes, HUVEC, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, Src,

MAP-Kinase, EPA, DHA, atherogenesis.

FOLIO ADMINISTRATIF

THÈSE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES DE LYON

NOM : DOMINGUEZ DELGADO DATE DE SOUTENANCE : 25 Juin 2001

PRÉNOM : Zury Ana

TITRE : ADHÉSION DES LYMPHOCYTES À L'ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE. MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE

NATURE : DOCTORAT NUMÉRO D'ORDRE : 01 ISAL 0023 FORMATION DOCTORALE : BIOCHIMIE

COTE B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE :

RÉSUME

Le but de cette étude était de déterminer les mécanismes impliqués dans l’induction de la synthèse de prostacyline

(PGI2) endothéliale par le contact avec des lymphocytes (L) humains in vitro. La coincubation des cellules endothéliales de

veine de cordon ombilical (HUVEC) avec des lymphocytes augmente de 2,5 fois la production basale de PGI2 dans des

HUVEC incubées seules. Cette augmentation est observée lors de la coincubation des cellules dans un milieu dépourvu en

sérum avec un rapport L/HUVEC de 9:1. La synthèse de PGI2 est maximale après 4 h. de coincubation. Cet effet est spécifique

des lymphocytes car la réponse n’est pas observée lorsque les HUVEC sont coincubées avec d'autres cellules sanguines ou

avec des billes de latex. Le contact des lymphocytes aux HUVEC est capable d’activer ces dernières et d'induire l’expression

des molécules d’adhésion endothéliales (ECAMs), telles que la sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1.

L’effet des lymphocytes sur la production de PGI2 par des HUVEC préalablement incubées avec des anticorps anti-

ECAMs n’est pas modifié, indiquant que ces ECAMs ne sont pas impliquées dans le mécanisme. En revanche, l’inhibition de

tyrosines kinases du type Src bloque totalement l’effet inducteur des lymphocytes. La participation de p42/p44MAPK dans la

cascade de signalisation est fortement suggérée par la présence de sa forme phosphorylée dès la première heure de

coincubation. L’enrichissement des phospholipides cellulaires en acides gras ω−3, assuré par la culture des cellules dans un

milieu contenant EPA ou DHA avant la coincubation, est sans effet sur l’induction de PGI2. Néanmoins, l’effet inhibiteur de

ces acides gras sur l’adhésion lymphocytaire à l’endothélium est constaté par la moindre adhésion de lymphocytes marqués au 51Cr préalablement enrichis à des HUVEC également enrichies en EPA ou DHA.

Ces résultats suggèrent que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes pourrait constituer un mécanisme de

défense contre l'accumulation excessive de leucocytes sur la paroi vasculaire, situation physiopathologique qui survient durant

l’atherogenèse.

MOTS-CLEFS : Prostacycline, Lymphocytes, HUVEC, Sélectine-E, VCAM-1, ICAM-1, Src, MAP-Kinase, EPA, DHA, Atherogènese.

LABORATOIRE DE RECHERCHE : Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie, INSERM-U352 INSA de Lyon, Bât. Louis Pasteur, 11 avenue Jean Capelle, 69620 Villeurbanne Cedex.

DIRECTEUR DE THÈSE : Annie France PRIGENT et Michel LAGARDE.

PRÉSIDENT DU JURY : Michel LAGARDE. COMPOSITION DU JURY : Yvon LEBRANCHU (rapporteur), Philip CALDER (rapporteur), Olga MACOVSCHI, Michel LAGARDE, et Annie France PRIGENT.