AGENDA - cours, examens · TRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE Champs clair (échantillons non colorés) Faisant passé la lumière directement à travers l’échantillon,

AGENDA

• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:

• A ) Techniques de contraste en observation microscopique & préparation d’échantillon ,

B ) colorations,

, l’échantillon : fixation, inclusion, coupe, étalement, coloration.

• II / TECHNIQUES IMMUNOHISTOCHIMIQUE

Histo Cytochimie, immuno-histochimie, histo-enzymologie, autoradiographie,

Revue

Rappel :

La microscopie est un ensemble de techniques d’imagerie qui permet d’obtenir une image agrandie

de bonne qualité d’objets de petites dimensions.

On distingue principalement deux types de microscopies :

Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE

Les microscopes dits à transmission nécessitent d’avoir des échantillons de très faible épaisseur.

Le matériel biologique devra donc être traité pour pouvoir être analysé.

Les techniques histologiques et cytologiques décrites plus loin dans le cour répondent à ce besoin

la microscopie optique (ou photonique)

et la microscopie électronique.

http://www.inserm.fr/thematiques/technologies-pour-la-sante/enjeux


Introduction :

• De nombreux objets microscopiques d'intérêt biologique sont intrinsèquement transparents ou de

réflectivité similaire à leur entourage et donnent donc en observation simple au travers d'un

microscope une image quasi-uniforme inexploitable.


Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement à traversl’échantillon, sauf si la cellule est naturellement pigmenté ,l’image obtenue et très peu contrastée,

De plus, les cellules vivantes non pigmentées ne sont pas clairement

visibles au microscope à fond claire à cause de la faible différence de

contraste entre les cellules et l’eau.

D’où la nécessité d’utiliser des colorants spécifiques pour une

observation correcte



Introduction :


Des techniques de coloration ou de révélation “chimiques” peuvent éventuellement être

utilisées mais leur emploi est restreint par des difficultés de mise en œuvre ou par les

modifications de l'objet étudié qu'elles entraînent inéluctablement (altération du

métabolisme des cellules vivantes, attaque irréversible des surfaces...)

Cependant ces “imperceptibles” objets bruts, s'ils modifient peu l'intensité de la lumière

d'éclairage qu'ils transmettent ou réfléchissent, changent usuellement de manière

tangible d'autres propriétés de celle-ci, comme la phase ou la polarisation.



L’optique/ principe

Structure du microscope optique

Laser

Lampe UV

…

Absorbants

Diffusants

Dépolarisants

Fluorescents

…

Objectifs

Lentilles

…

Caméras

Photodiodes

…

Cours de Cytologie

Agents de contraste

• Les techniques de contraste sont couramment utilisées pour de nombreux types d'observation.

• Elles sont même indispensables dans de nombreux domaines scientifiques, techniques allant de

l'analyse médicale de routine au contrôle de matériaux de pointe.

Il est donc important de connaître ces techniques et de comprendre les méthodes optiques sous-

jacentes très diverses et intéressantes qu'elles mettent en œuvre.

Cette partie « Techniques de contraste en observation microscopique » du chapitre « Microscopie » a pour

objet de présenter les principaux éléments de ce domaine. Il fait suite au partie « Principes et notions de

base du microscope » du même chapitre, sur lequel il s'appuie pour les définitions et concepts de base de

microscopie qui ne seront pas repris ici.


http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/optique/M11G1_JSurrelHSauer/co/M11G1_web.html



Techniques de préparation des échantillons

L'examen vital (l'examen de cellules ou tissus vivantes):

Le nombre de tissus de Vertébrés qui se prête à l'examen vital est assez réduit.

Le matériel idéal pour ce type d'étude:

- cellules habituellement isolées dans un milieu liquide. Ex: cellules sanguines et protistes

- des petits métazoaires transparents. Ex: Rotifères, petits Vers, larves d'Arthropodes, de

Mollusques ou d'Echinodermes.

- des fragments de métazoaires facilement isolables. Ex: gonades d'Invertébrés, fragments

d'épithélium

- des organes entiers. Ex: poumon de Grenouille, pancréas de Rongeur

L'identification certaine d'une structure dans des cellules vivantes ne peut découler que de

colorations et réactions cytochimiques




L'examen vital (l'examen de cellules ou tissus vivantes):

Etalement des cellules sur des lames de verre :

l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis,

écouvillonage, brossages ou appositions ; ce geste simple doit être bien maîtrisé pour

éviter un écrasement des cellules ou des amas en plusieurs couches peu interprétables.




Colorations vitales

Il s'agit de coloration sur des tissus qui resteront vivants durant l'étude.

Cette méthode représente souvent une meilleure mise en évidence des structures puisqu'elle

ne comporte que peu de traitements sur les tissus.

note: Cela implique de prendre en compte la compléxité de la matière vivante et chaque coloration vitale

devient, en fait, une expérience de physiologie cellulaire, impliquant une critique du résultat brut. En effet, les

colorations vitales mettent en jeu des composés chimiques dont l'innocuité, loin d'être évidente, doit être

démontrée dans chaque cas




Technique cytologique/ histologiques

Pour une observation au microscope photonique, l’échantillon doit être de faible épaisseur

(2 à 10 m) afin de permettre le passage de la lumière.

Ainsi, lorsque le matériel biologique est massif (tissus animaux ou végétaux : foie, cerveau,

muscle, etc. ou tige, feuille, etc.), il faut préalablement le débiter en tranches fines et

régulières, que l’on appelle coupes histologiques




Techniques de contraste en

observation microscopique

Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions très

strictes :

il faut que l'objet à examiner soit transparent à la lumière. Les objets biologiques ne le sont que

rarement, à l’exception des objets naturellement très minces :

suspensions (sang, ..) ou cultures cellulaires.




Différents type de microscope optique: Une comparaison

Type de microscope Type de microscope

Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,

Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction

Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées

Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,

Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules

Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.

Les colorants pour préparation microscopique

La plupart des objets biologiques ne sont pas colorés ou sont faiblement colorés. D'où la

nécessité de colorer la plupart des échantillons. Voici les principaux colorants, il en

existe d’autres.

Coloration des structures cellulaires

Bleu de méthylène Ce colorant est utilisé essentiellement pour colorer les noyaux et autres structures

oxydantes

Bleu de méthylène phéniqué Ce colorant est utilisé en bactériologie (coloration simple pour bactéries).

Liquide de Lugol Ce colorant s'utilise comme colorant des noyaux des cellules végétales et des

membranes.

Il permet la mise en évidence des grains d’amidon (amyloplastes) contenus dans les

cellules végétales : par exemple dans le tubercule de pomme de terre, dans les

grains de blé…




Techniques d’observation des formes et des surfaces

La technique histologique en microscopie électronique

1. Fixation

Les fixateurs classiques ne suffisent pas car ils tendent à coaguler les protéines et à détruire les structures

fines. Il faut utiliser ici des agents chimiques qui réalisent des pontages entre les molécules voisines, plus

qu’ils ne les dénaturent ; cette fixation « en douceur » stabilise les structures auxquelles elles

appartiennent :

– le permanganate de potassium assure une excellente conservation des membranes lipoprotéiques,

mais les structures cellulaires contenant des acides nucléiques sont très mal fixées ;

– le tétroxyde d’osmium se comporte comme le précédent, mais il pénètre mal dans les cellules ;

– le glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules, fixe efficacement de nombreuses structures, sauf les

membranes.

De fait, on combine les avantages des différents fixateurs en réalisant une double fixation : un

traitement au glutaraldéhyde suivi d’un traitement au tétroxyde d’osmium.

MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE

MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE


La technique histologique en microscopie électronique

2. Inclusion en résine

Le principe est le même que pour l’histologie classique, à la différence près que la déshydratation

préalable doit se terminer dans un solvant de la résine utilisée pour l’inclusion. Les milieux d’inclusion

utilisés sont souvent des résines de la famille des araldites, qui polymérisent à chaud en présence d’un

catalyseur. On obtient des petits blocs solides et très durs, incluant et imprégnant l’échantillon à analyser

; la dureté de ce matériel permet d’obtenir des coupes extrêmement fines et régulières.

On utilise aussi des résines hydrosolubles pouvant être éliminées des coupes, ce qui autorise des

expériences d’immunocytochimie en microscopie électronique.




3. Coupe : ultramicrotomie

Les coupes ultrafines sont réalisées grâce à des couteaux de verre ou de diamant très affutés. Le

problème technique de l’avance régulière et surtout très progressive du porte-objet devant le couteau

est résolu par la mise au point de systèmes basés, par exemple, sur la dilatation d’un axe métallique

(avance thermique).

Les coupes, de très faible taille (moins de 0,5 mm de côté) et très fines, sont invisibles à l’oeil nu et

difficilement manipulables sans l’aide d’une loupe.

Le couteau est en fait muni d’une petite cuvette contenant de l’eau à la surface de laquelle les coupes

flottent.

Celles-ci sont récupérées sur des grilles de 3 à 4 mm de diamètre, à mailles très fines, qui servent en fait

de porte-objet et seront introduites dans la colonne du microscope.




4. « Coloration »

Cette étape consiste en un simple renforcement des contrastes : on parle de «coloration positive».

Certains atomes de métaux lourds se fixent sélectivement sur diverses structures cellulaires, fixation qui

arrête efficacement les électrons à leur niveau.

Le résultat est un meilleur contraste des images.

On utilise pour cela des solutions d’acétate d’uranyle ou de citrate de plomb et on fait flotter quelque

temps les grilles portant les coupes sur des gouttes de ces substances.



Préparations pour

microscopie électronique

Comment avoir une coupe ultrafine de 60-100 nm d'épaisseur ?



On peut observer les organites qui doivent être fixé très rapidement, sinon ils seront détruit.

➢ Fixation au Glutaraldéhyde, qui fixe les protéines très rapidement

➢ Post fixation à l'Acide Osmique qui fixe les lipides.

➢Déshydratation en passant par un solvant

➢ Le bloc doit être très rigide pour pouvoir être coupé finement, il y a donc une inclusion en

résine: Epon ou Araldite semi-liquide à froid.

➢ La résine est chauffé à 60°C environ où elle polymérise

➢ L'échantillon enrobé sera de l'ordre du millimètre cube

➢On découpe l'échantillon avec un Ultra-microtome plus sensible (avec un pas de 50nm).

Le couteau est fait de diamant et dont le fil fait 3mm.

➢ La coupe est maintenant ultra-fine avec une épaisseur de 100nm.

➢ Les coupes sont regroupées sur des grilles à maillage adapté.

La coupe flotte à la surface d'une cuve d'eau où elle sera récuperée

A mouse macrophage eating Staphylococcus aureus (12000 x) Courtesy of FIDEL MADRAZO

Comment augmenter la visibilité ?

a. Coloration négative

La fixation et les réactions ultérieures peuvent modifier notablement la structure de l'objet biologique.

Le contraste négatif permet d'assombrir le fond sans colorer l'objet lui-même et donc de le rendre visible sans le

modifier, par simple contraste.

Principe général : au lieu de colorer l'objet (coloration positive), celui-ci est enrobé d'un colorant qui mettra en évidence son contour.

Au début de la microscopie et en particulier de la microscopie électronique à transmission,

un objet ne pouvait être visible que si, après fixation, il était imprégné de substances, plus ou

moins spécifiques, contenant des atomes de métaux lourds opaques aux électrons.




a. Coloration négative

Coloration de petits objets isolés et déposés sur une grille recouverte d'un filtre.

Le produit de contraste vient se mouler autour des objets, le MeT affichera alors une image en négatif (en marquant les

contours).

mise en évidence des feuillets d’un liposomes

Adénovirus

Virus de la mosaïque du tabac (VMT)




b. Ombrage métalliqueIl met en évidence de petits éléments dans une cellule (ex: molécules protéique de la membrane

cellulaire). Le métal chauffé se dépose sur un coté de la structure.

Une fois déposé, il faudra solidariser la structure en appliquant un filtre

transparent. L'échantillon pourra ensuite être détruit, et on ne gardera

que la réplique qu'on passera au MET. On aura alors une image en

contraste avec impression de relief.

L'ombrage métallique est souvent associé aux techniques suivante:

1. La cryofracture

2. Le cryodécapage

Charpente cellulosique de la paroi végétale



Définition:

• Transformation d'un élément transparent en un élément opaque pour l'observation au microscope

But:

• Faire ressortir tous les détails superficiels de la cellule

Méthode:

• 1ère vaporisation verticale d’une mince couche de carbone, c’est la réplique carbonée ; cette dernière est ombrée par 2ème vaporisation oblique de platine

b. Ombrage métallique


b. Ombrage métallique

1. La cryofracture 2. Le cryodécapage

Ces techniques, cryofracture et cryodécapage, permettent une visualisation tridimensionnelle d'organites

intracellulaires ou de réseaux dans des gels hydratés.



1. La cryofracture

La technique de cryofracture permet d'obtenir une empreinte, appelée

réplique, de la surface fracturée sous vide d'un échantillon cryofixé.

technique de congélation qui permet d'observer la structure

d'échantillons fluides à l'échelle du nanomètre.



2. Le cryodécapage : « technique des répliques »

Technique moderne de cytologie

Etude des membranes cellulaires

l'observation avec un(MET)




• congélation ou utilisation de froidCryo

• élimination de la partie superficielle d’un objetDécapage

Enlever la partie superficielle d’un objet par congélation




Appareil de Golgie observer au MET après cryodécapage

Cellule végétale (Euglena gracilis ) observer au MET après cryodécapage



La coupe

Le microscope photonique en transmission ne peut fournir d'images que si la préparation à examiner

est suffisamment fine pour se laisser traverser partiellement par la lumière.

Dans le cas d'objets épais comme par exemple des tissus animaux ou végétaux, il est nécessaire de

pratiquer des coupes en leur sein pour les rendre suffisamment transparents. L'épaisseur de ces

coupes se situe aux alentours de 4 µ .




La coupe

A cette épaisseur, la résistance des tissus à la pression de l'arête de l'instrument coupant

n'est pas suffisante et entraîne des détériorations qui rendent inexploitables les

observations qui en résultent.

C'est pourquoi on a l'habitude de pratiquer une inclusion du tissus préalablement à la

coupe.

Le médium utilisé va se substituer à l'eau tissulaire pour augmenter la tenue du bloc à

couper.

Ruban de coupes sur le Microtome




Coupe

Microtome




Fixation

Fixer, c'est immobiliser les structures organiques dans un état aussi proche que possible de l'état vivant.

La fixation provoque l'insolubilisation des constituants intracellulaires et l'augmentation de l'indice de

réfraction.

Il existe des fixateurs simples et des mélanges fixateurs.

La fixation d'une coupe dans un tissu permet de mieux le colorer en favorisant la pénétration du

colorant.

En outre, elle facilite l'observation des pigments.

La fixation des cellules étalées sur lames est fait :

- par séchage à l'air (comme en technique hématologique),

- par vaporisation d'un spray,

- par immersion dans un fixateur liquide (alcool + éther).




Fixation

• Le formaldéhyde: gaz en solution aqueuse à 40%, vendue dans le commerce sous la dénomination

de « formol. » La solution à utiliser doit être encore diluée à 10% : on obtient un formol à 5%. Ce

produit est très toxique.

• Bouin : formol + acide picrique

FIXATEURS CHIMIQUES SIMPLES

. Ethanol ou alcool éthylique : fixe bien les glucides, mais il a l'inconvénient de durcir les tissus et est un

solvant des graisses. Il est utilisé à la concentration de 70 à 100 %. Il entre également dans la

composition de nombreux mélanges fixateurs.

N.B.

: il existe un polymère du formol (ParaFormAldéhyde P.F.A.) qui permet une fixation plus fine des structures et ne contient pas de méthanol

MAIS a l’inconvénient de déshydrater les tissus et la morphologie est moins bien préservée.




Étalement

Etalement des cellules sur des lames de verre :

l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis, écouvillonage, brossages ou

appositions ; ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules ou des amas en plusieurs

couches peu interprétables.

La fixation des étalements se fait soit par simple séchage à l'air pour la coloration de May-Grunwald-Giemsa soit

par immersion dans l'alcool-ether ou par application d'un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-

Schorr ou de Papanicolaou (frottis cervico-utérins notamment).

À gauche : projection du produit de ponction à l’aiguille sur une lame. Au centre : la goutte est étalée,

tirée à l’aide d’une autre lame. À droite : lame d’un étalement cytologique après coloration.




Étalement

Liquides frais : LCR, épanchement pleural ou péritonéal, ponction de collection liquidienne

Il est recommandé un acheminement rapide à 4°. Au laboratoire, ces prélèvements sont pris en charge par technique

de cytocentrifugation. Les préparations sont colorées par MGG.

Ces examens sont souvent complétés par un examen du culot de centrifugation traité par inclusion en paraffine.

Etalement des cellules en monocouche sur cellules fixées

Cette technique s’applique essentiellement à la cytologie urinaire et à la cytologie cervico utérine (en alternative au

frottis dit conventionnel). Les cellules sont recueillies dans un liquide conservateur, fixateur spécifique ou alcool à 50°.

Les cellules présentes dans le flacon de fixateur sont traitées par un processus de concentration (par filtration et/ou

cyto centrifugation). Enfin, les cellules sont transférées en couche mince sur une lame.

Les lames sont colorées par Papanicolaou.

Ces milieux sont également utilisé pour la conservation des cellules en vu d’un examen en biologie moléculaire

comme le typage viral HPV dans les FCU.




La coloration au May Grümwald Giemsa (MGG)

Habituelle en hématopathologie, elle est exclusive (en dehors des

frottis) dans certains laboratoires. Les lames sont séchées à température

ambiante.

Produit de cytoponction d’un ganglion lymphatique de lymphome de Hodgkin ;

étalement coloré au May-Grünwald-Giemsa




Test de Papanicolaou

méthode standard de diagnostic du cancer et des cycles hormonaux.

La cytologie s'est imposée comme méthode de diagnostic de malignité

concernant différents organes, notamment le tractus respiratoire, urinaire ou

gynécologique.

Elle impose une fixation préalable (Alcool éther, SEDFIX, laque).

Frottis cervico-utérin : étalement coloré au Papanicolaou




Coloration


Des colorants sont utilisés en microscopie à chaque fois que des cellules et des tissus animaux dans les

composants et le matériel végétal doivent être visualisés.

Souvent, ces techniques de visualisation optiques sont les seules

méthodes d'identification et de différenciation des tissus.



Utilisation en microscope optique


Les colorants en microscopie sont employés principalement en histologie, cytologie et

microbiologie mais également pour l'analyse des fibres de textile, le papier et d'autres produits

techniques.



Définitions:

Colorant: produit susceptible de teindre une ou plusieurs strucutres de façon durable.

Colorations structurales: elles mettent en évidence les composants de certaines structures tissulaires

indépendamment du tissu lui-même:

fibres élastiques,

phloème lignifié, (végétaux)

structures kératinisées, chitinisées, etc…

Colorations vitales: Coloration s'opérant sur des tissus qui resteront vivants durant l'étude.

(opposées aux colorations non-vitales).

Coloration létale (non-vitale) : la plupart des colorants agissent sur des cellules mortes, tout

simplement parce qu’ils nécessitent une fixation préalable.




Définitions:

Colorations histologiques: ce sont celles qui différencient finement tous les éléments d'un

tissu.

Cette coloration devient histochimique si elle est spécifique de tel ou tel composé défini.

Colorations cytologiques: ce sont celles qui permettent d'analyser les détails internes des

cellules.

De telles colorations peuvent être cytochimiques si elles mettent en évidence des fonctions

chimiques déterminées.




Classification des colorants en fonction de leurs propriétés chimiques

Colorants acides: il s'agit de colorants anioniques (C'est un anion qui est colorant).

Ex: Eosinate de K+

Colorants basiques: c'est un cation qui est colorant.

Ex: sel de Cl-, bleu de méthylène = Chlorohydrate de tétramethylthionine (où la fonction

methyl modifie la couleur violette en bleu)

Colorants neutres: cations et anions sont colorants.

Les groupements acides ou basiques se fixent:

Ou

aux structures basophiles (colorants cationiques, riches en groupements acides)

aux structures acidophiles (colorants anioniques, riches en groupements basiques).




Colorants selon l’origine

• Naturels

– Vert de Malachite

– Noir Soudan

– Safran

– Orcéine

– Éosine

– Aniline

– Hematoxyline


• Synthétique

– Giemsa

– …/...



Type de coloration

1. On parlera de COLORATION INDIRECTE lorsque celle-ci ne peut se produire sans l’intervention d’un

agent mordant ; avant la coloration, il est impératif de « mordancer », c'est-à-dire pratiquer le

mordançage (faire agir une autre substance qui va « préparer le terrain » au colorant et lui permettre

de se fixer sur les éléments à colorer.

2. On parlera de COLORATION DIRECTE lorsque celle-ci se produit par simple

immersion dans un bain de colorant, qui agit directement sur les composants

cellulaires.

Sans l’agent de mordançage, la coloration est impossible, ou difficile à réaliser.




Coloration : les AUTOMATES

Automate d'inclusion - Leica TP 1040 Automate de coloration - Leica AUTOSTAINER XL




Une coloration est une expérience de physiologie cellulaire

l'opérateur travaille dans l'infinie complexité de la matière vivante et doit particulièrement surveiller ses

conditions opératoires pour pouvoir tirer de bons enseignements de ses résultats.

Les colorations sont utilisées pour mettre en évidence des structures morphologiques intra-cellulaires, mais aussi

pour étudier la perméabilité de certaines interfaces, la réaction cellulaire à l'introduction d'un colorant, etc.

Notons cependant que les colorants que nous utilisons, opèrent tous, à concentration normale, une action létale sur

les éléments étudiés, même sans fixation préalable ; les colorants vitaux (qui laissent les cellules en vie) sont rares ;

le moins nocif est le rouge neutre, utilisé à 1/1.000 ; citons également le bleu de méthylène, le bleu de crésyl, le vert

Janus, employés à des dilutions de l’ordre de 1/10.000 à 1/30.000, voire 1/100.000.




Congo red

Coloration de rouge Congo d’une amylose

glomérulaire (lumière non polarisée).

Coloration de rouge Congo d’une amylose

glomérulaire : aspect dichroïque vert-jaune des dépôts

amyloïdes en lumière polarisée.




Inclusion

Inclusion en paraffine des prélèvements effectués sur la lésion.

La paraffine, liquide est chauffée, et refroidie sur une plaque réfrigérée.

en paraffine nécessite une étape d'enrobage préalable par passage de chaque prélèvement dans une série de

solvants organiques qui le déshydratent (et dissolvent les graisses figurées intra-tissulaires) et permettent

l'imprégnation de la paraffine dans le tissu.

Elle consiste à confectionner un bloc de paraffine pour chaque prélèvement en orientant convenablement le

fragment dans le sens de la coupe.

tissu inclus en paraffine dans le

bloc correspondant.


• Paraffine

• Celloïdine



Techniques particulièresExamen histologique extemporané

Cours de Cytologie

BASES DE LA MICROSCOPIE

Il s’agit d’un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une

intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement

de l’acte chirurgical.

Les motifs les plus fréquents de demandes d’examens histologiques extemporanés sont :

• déterminer la nature inflammatoire ou tumorale d’une lésion et, en cas de tumeur, sa nature bénigne ou cancéreuse

pour déterminer l’importance du geste d’exérèse chirurgical ;

• s’assurer qu’une biopsie chirurgicale a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie ;

• s’assurer que des limites de résection sont saines.

Étude macroscopique du prélèvement frais.

Un fragment est prélevé et fixé sur un portoir.

3 Le fragment congelé est coupé dans un cryostat.

4. Coupe de tissu congelé colorée au bleu de toluidine.

Examen histologique

extemporané



L’observation de cellules vivantes est possible si on utilise des colorants vitaux ou des

dispositifs physiques appropriés ajoutés au microscope photonique.

De façon générale, le matériel biologique doit être traité pour pouvoir être débité en

coupes fines et transparentes, qui sont ensuite colorées.

Des protocoles spécifiques existent pour l’histologie classique ou électronique.

L’observation des formes et des surfaces à l’échelle des ultrastructures ou des

molécules est possible grâce à la réalisation de répliques (cryofracture) ou à la

microscopie à balayage.

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