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Aide au diagnostic des pathologiesneurologiques par traitement d’images couleurde fibres de myéline
Julio Rojas Varela*, Alain Clément*, Sié Outtara*, Eva Vonasek**, RodolfoVargas***, Jesús P. Rodriguez****
* Laboratoire d’Ingénierie de Systèmes automatisés UPRES EA 4094Institut Universitaire de Technologie, 4 Bd. Lavoisier, B.P. 42018 - 49016 Angers – France** Departamento de Biología Estructural, Laboratorio de Estructura Molecular, InstitutoVenezolano de Investigaciones Científicas Apartado Postal 21827, Caracas 1020 A, Venezuela*** Fundación Instituto de Estudios AvanzadosCarretera Hoyo de la Puerta-Baruta. Venezuela.**** CEBIV-IDECYT. Universidad Simón Rodriguez Apartado postal. 47.947, Caracas 1020 A – Venezuela
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Sections de rattachement : 61, 63Secteur : Secondaire
RÉSUMÉ. L’analyse par diffraction des rayons X sur des échantillons de biopsie du nerf sural fournitune aide au diagnostic des neuropathologies. Ce procédé coûteux en personnels et en moyensmatériels ne donne cependant que des mesures globales des composantes de la fibre nerveuse. Afind’obtenir des mesures plus précises de la distribution des surfaces et des constituants des fibres, nousproposons une méthode automatisée par analyse d’images numériques couleur en microscopieoptique. Notre méthode repose sur une classification couleur non supervisée qui nous permet desegmenter les images des fascicules nerveux en différentes régions correspondant aux structureshistologiques à mesurer. Nos résultats montrent la faisabilité de la méthode proposée et fournissentune mesure rapide et précise pour l’aide au diagnostic des neuropathologies.
MOTS-CLÉS : Histologie, diagnostic, myéline, neuropathologies, classification, segmentation, imagescouleur.
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1. Introduction
La myéline est une membrane biologique naturellement ordonnée et enroulée autour desaxones des nerfs. Cette caractéristique permet d’étudier sa structure au moyen destechniques de cristallographie (diffraction par rayons X). L’examen des diagrammes dediffraction fournit une mesure quantitative globale et donne des indications aux praticiensen vue du diagnostic des neuropathies des systèmes nerveux périphérique et central. Enalternative à cette méthode coûteuse et relativement imprécise, nous proposons une mesureautomatisée de la quantité de myéline contenue dans les fibres des nerfs par traitement desimages numériques issues d’un microscope optique. La préparation des échantillons estdécrite à la section 2. Le système d’acquisition des images est décrit à la section 3. Lasection 4 décrit la méthode d'acquisition des diagrammes des rayons X. Le traitement desimages par segmentation couleur est détaillé à la section 5. Les résultats, donnés à la section6, montrent la faisabilité de la méthode proposée et fournissent une méthode rapide etprécise pour l’aide au diagnostic des neuropathologies.
2. Préparation des échantillons
La méthode d’imprégnation utilisant la paraffine produit une rétractation des tissus etl’extraction des lipides des composants de la myéline. L’utilisation de résine plastique(Epon 812) au lieu de paraffine permet de réduire le temps des processus de fixation etd’inclusion. Certains artefacts sont éliminés et les coupes des nerfs présentent un meilleurcontraste. Nous utilisons la méthode de saturation argentique, en modifiant la méthode deréduction de nitrate d’argent de Cajal (Lisson, 1960) ainsi que celle de d’imprégnationargentique (Rodriguez et al., 2005). Cette procédure permet la conservation cellulaire de larelation individuelle des structures anatomiques d’origine.
3. Acquisition des images
Les images telles que celle présentée à la figure 1 sont obtenues au moyen des coupeshistologiques des nerfs avec imprégnation de chlorure d’argent à l’aide d’une caméracouleur tri-CCD Pixera Professionnel (1,2 Mpixels, 3 x 256 en RGB) associée aumicroscope LEICA DMLBV (Rodriguez et al. 2006). Nous avons utilisé une méthode demicrotomie qui facilite le traitement des fibres nerveuses et permet la conservation descomposantes cellulaires de la fibre.
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Figure 1 . Coupe histologique du nerf sural, image RGB, 2,5 pixels/µm.
4. Diffraction par rayons X
Les diagrammes de diffraction par rayons X des nerfs de myéline (figure 2) sont obtenusau moyen du générateur de rayons X Elliot GX6 à anode rotative sous 30kV-30mA. Lefaisceau est focalisé à l’aide d’un miroir enduit au nickel. Le diagramme est enregistré enutilisant la position du détecteur à 80 mm de longueur avec 10 mm d’ouverture.
Figure 2 . A. Diagramme de diffraction par rayons X du nerf sural 156 avec 12 réflexionsindiquant l’ordre de la structure. B. Densité électronique relative utilisant la réflexion laplus importante (5) avec les valeurs cytoplasmiques, bilayer et espace intercellulaire pourcette résolution.
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Le diagramme A de la figure 2 permet d’évaluer la fréquence de répétition (D) et sadistribution cytoplasmique (Dcyt), Bilayer (Dbil) et l’espace intercellulaire (Dext).Diagramme B de la figure 2. Temps d’acquisition 3600 s. température 22 °C (RT).Échantillons: biopsie de nerf sural humain. Perfusion : solution Ringer Mammalian.(Luzzati et al., 1990 ; Vonasek et al. 2001). L’inconvénient majeur de cette méthode estqu’elle ne fournit qu’une information globale qui ne permet pas la mesure individuelle desfibres.
5. Segmentation des images
Une méthode de classification hiérarchique non supervisée obtenue à partir de (Clémentet al., 2003) et étendue aux histogrammes tridimensionnels caractéristiques des imagescouleur (Ouattara et al., 2007) a été mise en oeuvre. Celle-ci a permis de segmenter lesimages d’un fascicule de nerf en trois régions correspondant respectivement aux structuresbiologiques que sont la myéline, l’endoneurium et périneurium. Dans la figure 3, nousprésentons la localisation de ces trois structures sur l’image segmentée (3a) ainsi que leurpositions respectives dans l’histogramme RGB à partir duquel la classification a étéeffectuée (3b).
(a) (b)
Figure 3 . Image segmentée (a) avec les régions myéline, endoneurium and périneurium etleur correspondance dans l’histogramme RGB (b)
Pour chacune des trois régions, les valeurs des classes associées sont précisées dans letableau 1. On notera que le périneurium et une partie de l’endoneurium appartiennent à unemême classe. Ces structures sont néanmoins clairement distinguées des fibres de myélineque nous cherchons à mesurer.
Myéline
Périneurium
Endoneurium
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Noyau GP Classes GC % total Couleur
[98 33 69] [106 36 76] 37,7764 [255 0 0]
[199 96 176] [192 97 168] 44,8726 [0 255 0]
[245 206 240] [230 186 227] 17,3511 [0 0 255]
Tableau 1 . Distribution des pourcentages des trois classes en rapport avec leurs centresde gravité GC.
La colonne « Noyau GP » indique le centre de gravité des pics des histogrammes. Lepourcentage des classes correspond à « % total ». La colonne « Couleur » indique lescouleurs associées aux classes dans l’image segmentée.
6. Résultats
Le traitement morphologique des images permet de séparer les fibres afin de lesquantifier. Tout d’abord, on extrait l’objet myéline (image Im) à partir de l’image de lafigure 3a en effectuant un seuillage sur le plan rouge. Puis, sur l’image binaire Im on sépareles fibres myélinisées des non-myélinisées, c’est-à-dire, celles qui possèdent ou non desaxones par extraction des objets ayant ou non des trous (images : Im1 et Im2). Les imagesIm1 et Im2 seront traitées séparément. En troisième lieu, on extrait les objets axones (imageIm1ax) de l’image Im1 au moyen d’opérateurs morphologiques d’extraction des trous desobjets.
Le détourage des fibres est obtenu au moyen d’un traitement original qui consiste àeffectuer un « et » logique entre le squelette géodésique par zones d’influence (SKIZ) del’image Im1ax et l’image Im. Le SKIZ est obtenu par une squelettisation du complémentairede l’image Im1ax (exo-squelette) suivi d’un ébarbulage (figure 4). Finalement, l’imagerésultante (figure 5) est constituée en superposant les images Im1 et celle issue du traitementmorphologique décrit ci-dessus.
Afin d’évaluer le résultat de la segmentation et du traitement morphologique, oncompare l’image résultante (figure 5) à la segmentation effectuée manuellement par unexpert en utilisant trois critères : la sensitivité, la spécificité et l’erreur globale (Littmann etal. 1997). La spécificité représente le pourcentage de pixels confirmés par l’expert parmiceux trouvés par le programme. La sensitivité représente le pourcentage de pixels trouvéspar le programme parmi ceux trouvés par l'expert. L'erreur globale représente le pourcentagede pixels mal classés par rapport à l’expert. Ces résultats sont donnés dans le tableau 2.
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Spécificité Sensitivité Erreur globale 92,63% 99,12% 4,82%
Tableau 2 . Évaluation experte de la segmentation
Figure 4 . Squelette géodésique par zone d’influence (SKIZ) des objets axones.
Figure 5 . Résultat de la séparation des fibres après traitement morphologique.
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Grâce au traitement morphologique des fibres de myéline, nous pouvons classer lesobjets binaires par taille et comparer ces mesures par rapport à une fibre de référence (Dycket al., 1984). Cette comparaison (tableaux 3 et 4) donne au praticien des indications précisespour le diagnostic des maladies neurologiques.
Fibre analysée Fibre de référenceDiamètres des
fibres (µm) % % cumulé % % cumulé<1,5 13,03 13,03 0 0
1,5-3,0 20,50 33,51 8,15 8,153,1-6,0 27,46 60,97 60,83 68,986,1-9,0 29,83 90,80 11,98 80,969,1-12 8,54 99,34 16,81 97,77
12,1-15,0 0,66 100 2,23 100
Tableau 3 . Classification des fibres de la figure 5.
Nombre defibres
% de fibresmyélinisées
% de fibres nonmyélinisées
Diamètremaximal (µm)
Diamètreminimal (µm)
761 54,73 45,73 13,85 0,78
Tableau 4 . Mesures des fibres de la figure 5.
7. Conclusion et perspectives
L’algorithme de classification non supervisée fondé sur l’analyse hiérarchique deshistogrammes couleur constitue un outil efficace pour segmenter les images en trois régionscorrespondant à la myéline, l’endoneurium et le périneurium. Afin de mesurer la quantité demyéline des fibres nerveuses, une séparation des fibres a été obtenue au moyen d’uneméthode morphologique originale qui consiste à utiliser le squelette géodésique par zonesd’influence des axones. Les résultats quantitatifs ont été présentés en donnant les tailles desfibres par rapport à une fibre de référence. Notre travail montre ainsi la faisabilité d’uneméthode de mesure rapide et précise permettant une aide au diagnostic des maladiesneurologiques. Une plus large validation reste néanmoins nécessaire avec la mise en routinede la méthode proposée sur différentes séries de coupes histologiques.
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Bibliographie
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Dyck P.J., Thomas P.K., Lambert E.H.,. Bunge R., eds. Peripheral Neuropathy. Philadelphia ,1984.
Littman E., Ritter H., Adaptive Color Segmentation – A comparison of Neural and StatisticalMethods. IEEE Transactions on Neural Networks, vol. 8, n° 1, 1997, p. 175-185.
Lisson L. Histochimie, Ed. Sciences et technologie, Asunción, Paraguay 1960.
Luzzati V., Mateu L., Order-Disorder Phenomena in Myelinated Nerve Sheaths, I. A. Physical Modeland Its Parameterization: Exact and Approximate Determination of the Parameters, JournalMolecular Biology, 1990, p. 215, 373-384.
Outtara S., Clément A., Etiquetage d’histogramme multidimentionnels compacts pour l’analysed’images multicomposantes, Actes du 21ième Colloque GRETSI sur le traitement d’image, Troyes,France, 11-14 septembre, CDROM, 2007.
Rodriguez J.P. , Parthé V., Vargas R., Mateu L., Vonasek E., Rojas Varela J., Cavaro-Menard C.,Chapeau-Blondeau F., Argentic impregnation method derived from silver nitrate process applied to thenervous tissue, 8th Inter American Congress on Electron Microscopy, Cuba, 25-30 septembre 2005.
Vonasek E., Mateu L., Luzzati V., Marquez G., Vargas R., Céspedes G., Cotúa M., Borges J.,AReversible Abnormal Form of Myelin: An X-ray Scattering Study of human Sural and Rat SciaticNerves, Eur. Biophys. J., 2001, Vol 30, p. 11-16.
Remerciements
Ce travail a été financé partiellement par FONACIT G (97000379) selon le programme ECOS-NORDN.200000866 (V00S02) Caracas - Venezuela. Les images proviennent de l’Hôpital Universitaire deCaracas.
