ale d’intérêt agronomique « CAVALBIO » Rapport Intermédiaire d’ 01.01.2016 … · 2019-11-19 · RIE 2016 - Projet PO AVALIO pour l’innovation variétale Page 1 Résumé

RIE 2016 - Projet PO CAVALBIO pour l’innovation variétale Page 1

Résumé

L’agriculture est un secteur d’activités important pour la Guadeloupe dans un contexte caractérisé par un tissu socio-

économique fragile, une dépendance importante aux importations et des enjeux de santé publique liés à une consommation

insuffisante de produits frais. Les productions agricoles guadeloupéennes sont fragilisées par (i) de multiples contraintes

biotiques et abiotiques, (ii) le recours encore trop important à la lutte chimique et (iii) une faible diversité variétale aggravant

l’impact des maladies émergentes et réduisant pour certaines espèces les périodes d’alimentation du marché du fruit frais.

La sélection variétale est une composante essentielle du développement d’une agriculture durable et performante. En sus

des objectifs d’adaptation et de résistance aux maladies, d’insertion dans des systèmes agro écologiques, elle doit répondre

aux attentes des consommateurs en termes de qualité et d’étalement des productions. L’objectif principal du projet Cavalbio

est de contribuer au développement de filières ignames et agrumes durables en Guadeloupe, et plus largement dans les

Antilles Françaises, en appuyant par des recherches cognitives et méthodologiques l’émergence de solutions variétales

adaptées aux enjeux régionaux. Les stratégies d’amélioration retenues reposent sur la mobilisation de la biodiversité des

complexes d’espèces à partir desquelles ont été domestiquées les variétés modernes grâce (i) au développement de

nouvelles ressources biologiques et moléculaires, (ii) à une meilleure compréhension de l’hérédité et de la recombinaison

sexuée chez les géniteurs d’origines inter(sub)spécifiques et souvent polyploïdes et (iii) à l’acquisition de connaissances fines

sur les déterminants physiologiques, biochimiques, et moléculaires de la variabilité des caractères utiles. L’analyse de

l’acceptation des innovations variétales ou techniques par les producteurs complète le projet. Cavalbio fédère les

compétences scientifiques du CIRAD, de l’INRA et de l’Université dans le domaine des Sciences du Végétal et est conduit en

lien étroit avec les acteurs du développement. Il se situe en amont direct des plateformes de sélection de nouvelles variétés

soutenues par le PDR permettant un transfert rapide des innovations variétales aux agriculteurs via les RITA. Le présent

Rapport Intermédiaire d’Exécution fait le bilan des travaux conduits par le Cirad lors de l’année 2016. Un tableau annexé

(annexe 1) met en relation les jalons/livrables programmés et l’avancement des travaux avec une estimation du pourcentage

de réalisation de chaque action.

Projet de recherche présenté au

Programme Opérationnel Guadeloupe 2014 – 2020

Tranche 1 : 01.01.2015 au

31.12.2017

Caractérisation et valorisation de la biodiversité végétale tropicale d’intérêt agronomique

« CAVALBIO » Rapport Intermédiaire d’Exécution (RIE)

01.01.2016 – 31.12.2016 Bilan des travaux en cours


Sommaire

Activités 4 WP 1- Développement de ressources moléculaires et dynamique de la diversité 4 WP 1.1 Développement de marqueurs moléculaires SNPs et caractérisation des collections 4 1.1.1 SNP mining chez l’igname 4 1.1.2 SNP mining chez les agrumes 6 1.1.3 Implémentation de set de marqueurs SNPs Kaspar pour agrumes et ignames 7 1.1.4 Caractérisation des collections d’ignames 8 WP 1.2 Etablissement d’une carte génétique de référence de l’igname 8 WP 1.3 Fonctionnement méiotique des génomes complexes 10 1.3.1 Méiose et structure des gamètes des géniteurs tétraploides interspécifiques et intergénériques d’agrumes 10 1.3.2 Impact de l’interspecificité sur les écarts au mendélisme 13 WP 2 - Création de ressources biologiques innovantes 16 WP 2.1 Ressources biologiques innovantes d’ignames 16 2.1.1 Diploïdes doublés de géniteurs élites de D. alata 16 2.1.2 Populations diploïdes pour la cartographie génétique et les analyses QTLs 16 2.1.3 Hybrides tetraploïdes issus d’hybridation interploïde 2x x 4x 16 WP 2.2 Ressources biologiques innovantes d’agrumes 17 2.2.1 Porte-greffes tétraploïdes d’agrumes 17 2.2.2 Limettiers triploïdes 18 WP 3 - Déterminants du développement, de l’adaptation et de la qualité 19 WP 3.1 Développement et adaptation des ignames 19 3.1.1 Mise au point d’outils de phénotypage adaptés à la culture d’ignames et application à la collection de référence 19 3.1.2 Mise au point d’un modèle de culture générique pour la sélection de variétés adaptées aux systèmes à bas intrants 26 3.1.3 Implication de la tétraploïdie sur le phénotype des ignames 28 WP 3.2 Qualité physico-chimique des ignames 33 WP 3.3 Polyploïdie et adaptation des porte-greffes d’agrumes aux contraintes abiotiques 34 3.3.1 Adaptation de couples de porte-greffes 2x et 4x aux sols calcaires 34 3.3.2 Etude de couples de porte-greffes 2x et 4x francs de pied ou greffés sous contrainte hydrique 35 3.3.3 Impact de la ploïdie sur le développement du porte-greffe dans le cadre de la mise en place d’un parc semencier 37 WP 3.4 Impact de la polyploïdie et de l’environnement sur l’apomixie des porte-greffes 37 3.4.1 : comparaison de couples diploïdes/diploïdes doublés pour l’apomixie 37 3.4.2 : influence de l’environnement sur l’apomixie 39 WP 4 - Déterminant de la tolérance aux maladies 40 WP 4.1 Marquage et utilisation de gènes de résistances à l’anthracnose des ignames 40 4.1.1 Génotypage des populations de l’INRA 40 4.1.2 Phénotypage de l’ensemble des populations. 40 4.1.3 Méta-analyse de QTLs de résistance à l'anthracnose 41 WP 4.2 Plasticité phénotypique et adaptation au Huanglongbing (HLB) chez les polyploïdes 41 4.2.1 Caractérisation écophysiologique sous contrainte HLB d’orangers sur 4 couples de porte-greffes 2x/4x 42 4.2.2 Caractérisation anatomique et physiologique de limes 2x et 3x greffées sur porte-greffes 2x et 4x 43 WP 5- Caractérisation de séquences virales endogènes 47 WP 5.1 Criblage des banques BAC 47 WP 5.2 Analyse structurale des EVEs présents dans les trois espèces principales de l’igname 47 WP 5.3 Reséquençage de 10 accessions Dioscorea pour évaluer la diversité des EVE 48 WP 5.4 Criblage des ressources génétiques Dioscorea du CRB-PT 48 WP 5.5 Suivi du potentiel d’activation des EVE présents chez l’igname 48


WP 6- Valorisations économiques des innovations variétales 49 WP 6.1 Modélisation ex-ante des attentes et préférences des agriculteurs 49 WP 6.2 Impacts économiques des innovations pour le territoire 49 Indicateurs qualitatifs et quantitatifs (année 2016) 50 Annexes 53 Annexe1: Etat d’avancement au 31 décembre 2016 par rapport aux livrables 53 Annexe 2: SNPs sélectionnés pour le développement de marqueurs KASPar chez l’igname 68 Annexe 3: Posters présentés à l’ « International Citrus Congress »; 18-09-2016 au 23-09-2016, Foz do Iguaçu ; Brésil 76 Annexe 4: Fiche innovation à destination des partenaires du RITA "L’amplification « LAMP» pour détecter le HLB 80 Annexe 5: Posters en liens avec Cavalbio présentés à l’ occasion du joli mois de mai de l’Europe 83


Activités

WP 1- Développement de ressources moléculaires ; caractérisation et dynamique de la biodiversité Partenaires : CIRAD1, INRA2 Responsable WP : P. Ollitrault1 Le WP1 répond aux objectifs O1, O2 et O3. Il vise (i) à développer des ressources moléculaires en appui aux projets de recherche en génétique et amélioration variétale et à la gestion des ressources biologiques au sein du CRB-PT et (ii) à comprendre la dynamique, via la reproduction sexuée, de cette biodiversité sous-tendue par des génomes aux structures complexes. Les nouvelles technologies de génotypage par séquençage (GBS) seront utilisées pour identifier un polymorphisme moléculaire abondant régulièrement reparti sur le génome. Des panels de marqueurs moléculaires co-dominants (SNP) de type Kaspar seront développés et validés pour l’igname et pour les agrumes (marqueurs diagnostiques du genre Poncirus). Ils serviront à la caractérisation des collections d’ignames gérées par le CRB-PT et le CIRAD d’ici 2017 et seront utilisés en routine durant la totalité du Feder (2015-2020) pour différentes actions de recherches. La carte génétique de référence de D. alata (établie par GBS), couplée à la séquence de référence du génome de D. alata, élaborée au plan international, constituera une ressource moléculaire très précieuse pour les futurs développements des travaux de génétique sur l’igname et en particulier : l’étude (i) de la résistance à l’anthracnose (WP4.1) ainsi que (ii) celle des déterminants de la qualité et (iii) de l’origine des 2n gamètes programmées dans la seconde phase du Feder (2018-2020). L’analyse de l’impact des génomes complexes (interspécificité, polyploïdie) sera réalisée sur agrumes durant la première tranche du feder et étendue aux ignames pour la phase 2018-2020.

WP 1.1 Développement de panels de marqueurs moléculaires SNPs et caractérisation des collections (CIRAD-INRA)

1.1.1 SNP mining chez l’igname (CIRAD) Participants : G. Arnau, P. Mournet, P. Ollitraut, D. Roques, H. Chaïr Activité/méthode programmées sur 2015-2017: GBS sur 48 accessions (géniteurs et germplasm D. alata). Résultats obtenus Dans un premier temps, afin de sélectionner les enzymes de digestion un panel de sept accessions de Dioscorea alata représentatif des différents pays a été choisi auquel a été ajoutée une accession de D. nummularia. Trois banques ont été préparées à partir de 3 réductions génomiques : PstI, PstI/MseI, ApeKI sur les huit accessions et séquencées sur MiSeq. La double digestion avec Pst1-Mse1 est celle qui a produit le meilleur compromis en termes de nombre de marqueurs, de profondeur de lecture et de pourcentage de données manquantes. Cette double digestion a été retenue pour la suite des expérimentations. Un panel de 48 accessions a été sélectionné au sein des collections INRA et CIRAD pour la mise au point des marqueurs KASPAR. Il est représentatif de la diversité, des différents niveaux de ploïdie (vérifié par cytométrie en flux et/ou comptage chromosomique) et contient les parents utilisés dans les programmes de sélection du Cirad et de l’INRA (Tableau 1.1).


Tableau 1.1 : Liste des accessions génotypées par séquençage afin de déterminer un set de marqueurs KASPAR. L’individu appartenant à l’espèce D. rotundatal a été éliminé de la suite des analyses.

Code

Institut

Origine géographique

Nom vernaculaire Nom Niveau de

ploïdie

CRB16

Nlle Caledonie

CRB22 Puerto Rico 2

CRB27 Guadeloupe 2

CRB38 Guyane Française 3

CRB47 Haïti 2

CRB51 Puerto Rico 2

CRB65 Puerto Rico 2

CRB72 Nlle Calédonie 2

CRB96 Puerto Rico 2

CRB97 Haïti 3

CRB403 Guadeloupe 2

CRB751 Roujol Cirad 4x-241 4

CRB752 INRA C 143

CRB753 INRA AL 56

CRB755 INRA AL 18

CRB757 Guadeloupe INRA X 154


CRB759 Dou Cirad 4x-431 4


CRB761 Ciradienne Cirad 4x-438 4

CRB762 TiViolet Cirad 4x-105 4

CRB763 Vanuatu Malalagi VU 639 2

CRB764 Coco (D. rotundata) Cirad 47M

CRB767 Vanuatu Manlankon VU 423 2

CRB768 Vanuatu Nureangdan VU 760 3

CRB391 Guadeloupe HYB 30

Roujol1 Vanuatu Tépuva Vu 024a 2

Roujol3 Vanuatu Tagabé Vu 231a 4

Roujol4 Vanuatu n.a Vu 247a 2

Roujol5 Vanuatu Basa Vu 401a 2

Roujol9 Vanuatu Tépuna Vu 472a 4

Roujol11 Tacharamivar Vu 528a 2

Roujol12 Naharto Vu 534a 4

Roujol15 Vanuatu Mendrovar Vu 564a 2

Roujol16 Vanuatu Homb Vu 567a 2

Roujol20 Vanuatu Malalaghi Vu 639a 2

Roujol27 Vanuatu Wanora.wo Vu 750a 4

Roujol29 Vanuatu Intejegan Vu 754a 4

Roujol32 Madagascar Ovy taty(Ambala Kindresy-Ambohimasoa) Madagascar 1

Roujol35 Bénin Florido Benin 33 2

Roujol44 kabusah lamentin 2

Roujol49 74F génitrice 2x 2



Roujol53 14M géniteur 2x 2

Roujol62 Dou genitrice 4x-431 4

Roujol64 génitrice 4x-200 4

Roujol65 TiViolet génitrice 4x-105 4

L’ADN des plantes a été extrait selon la procédure décrite dans (Risterucci, et al. 2000). La qualité de l’ADN génomique a été vérifiée sur gel d’agarose et la quantité estimée en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop ND-1000(Thermo Scientific, Wilmington, USA). Une banque génomique (48 individus + compris un témoin négatif), a été préparée en utilisant la double digestion enzymatique PstI-MseI selon la procédure publiée dans (Elshire, et al. 2011) . Le séquençage single-end a été réalisé sur un séquenceur type Illumina HiSeq3000 (à la Plateforme GeT-PlaGe, Toulouse, France). Par la suite l’appel des SNPs et des indels à partir des séquences brutes a été effectué avec le pipeline Tassel 5.2


(Glaubitz, et al. 2014). En l’absence de génome de référence sur l’igname, nous avons aligné les séquences tags produites sur des contigs d’igname Dioscorea alata) publiés par the Genome Analysis Center (UK) en utilisant Bowtie2 v2.2.6. Nous avons ainsi produit 465052 unpaired reads dont 171583 (36.90%) ont été alignés exactement 1 fois sur les contigs de D. alata. L’appel des SNP a été réalisé à partir de ces 171583 reads et a révélé 158695 sites polymorphes. Nous avons par la suite procédé à des étapes de filtres pour éliminer les individus présentant trop de données manquantes (fréquence de l’allèle mineur > 0.01, profondeur minimum de 8X et 20% maximum de données manquantes). Ces filtres ont conduit à garder 40 individus et 7910 SNPs. Un nettoyage des SNP a été effectué par la suite conduisant à 7836 SNP finaux.

1.1.2 SNP mining chez les agrumes (CIRAD) Participants : P. Ollitrault, R. Morillon, D. Roques Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : Mining in silico de SNPs à partir de séquence Sanger d'amplicons de divers Citrus et Poncirus (données de séquences pré-existantes) ; sélection de SNPs utiles pour l’étude des hybrides intergénériques Citrus x Poncirus utilisés dans Cavalbio pour l’amélioration des porte-greffes. Résultats obtenus Cette action avait été conduite avec succès en 2015 pour la recherche de marqueurs diagnostiques du genre Poncirus. L’année 2015 avait également permis de valider l’approche GBS pour l’obtention de nombreux marqueurs hétérozygotes permettant de suivre les ségrégations des parents citronniers et limettiers utilisés pour créer la population d’hybrides triploïdes WP1.3 et WP2.2.2). Afin de pouvoir analyser finement la structure phylogénomique des hybrides créés dans le projet Cavalbio, la recherche de marqueurs diagnostiques des taxons ancestraux des agrumes cultivés a été approfondie à l’aide d’un panel élargi (29 accessions contre 9 en 2015) des représentants des taxons ancestraux auxquel était joint un panel de 26 représentants des principales espèces secondaires (données GBS Apek1 acquise en dehors du projet Cavalbio). 43598 SNPs ont été sélectionnés sur ce panel de 55 accessions. Figure 1.1 : AFTD (distance de Manhattan) à partir des 43598 SNPs sélectionnés issus de GBS. L’organisation de la diversité révélée par ces 43598 SNPs a été analysée à l’aide d’une analyse factorielle sur Tableau de distance (AFTD ; indice de Manhattan) à l’aide du logiciel Darwin 6.0. La diversité apparaît très structurée (Figure 1.1) avec 84% de la diversité totale portée par les trois premiers axes et une organisation autour des quatre taxons ancestraux (C. maxima, C. reticulata, C.


medica et papeda). Les variétés des espèces secondaires se répartissent entre ces quatre pôles en parfaite cohérence avec les études réalisées avec des marqueurs SSRs et Indels et SNPs. L’approche GBS pour des analyses phylogénomiques apparaît donc globalement validée. 14926 marqueurs diagnostiques des taxons ancestraux (DSNPs) ont finalement été sélectionnés sur la base de ce panel. Ils ont permis de décrypter les structures phylogénomiques des 55 variétés analysées et serviront de référence pour analyser celles des hybrides triploïdes de citronnier x lime. Des marqueurs KASPar utilisable en routine en Guadeloupe pourront aisément être développés à partir de ces DSNPs. Ces résultats feront l’objet d’un article soumis en 2017.

1.1.3 Implémentation de set de marqueurs SNPs Kaspar pour agrumes et ignames (CIRAD, INRA) Participants : P. Ollitrault, S. Bruyère, F. Cormier, G. Arnau, H. Chair Activité/méthode : sélection de SNPs régulièrement répartis le long du génome et permettant de répondre aux questions de recherche et besoin de contrôle génétique dans le cadre du projet Cavalbio, définition d’amorces et validation sur un panel d’individus représentatif de la diversité de chaque espèce. Résultats obtenus A. Marqueurs KASPar agrumes diagnostiques du genre Poncirus. Participants : P. Ollitrault, S. bruyère Le développement des marqueurs était terminé fin 2015. Une communication a été réalisée lors de l’ « International citrus congress» tenu à Foz de Iguazu (Bresil) en septembre 2016. Ces travaux feront l’objet d’une publication en 2017. Bruyère S, Luro F, Froelicher Y, Morillon R & Ollitrault P. 2016. Poncirus phylogenetic diagnotic snps markers are useful to analyse zygotic rates in diploid and tetraploid citrus x poncirus rootstock seedlings. International Citrus Congress 2016. Foz de Iguaçu, Brazil, Sept. 18 - 23, 2016.

B. Marqueurs SNP KASPar de l’Igname Participants : F. Cormier, G. Arnau, P. Ollitrault, H. Chair

Les données de génotypage (GB) de 7836 SNPs pour 40 accessions ont été utilisées pour sélectionner

192 SNPs destinés au développement de marqueurs KASPar. Nous avons tout d’abord évalué le

polymorphisme des marqueurs en calculant le PIC suivant la formule (Anderson, et al. 1993) :

𝑃𝐼𝐶 = 1 −∑𝑝𝑖²

𝑛

𝑖−1

Où ‘n’est le nombre total d’allèles et ‘p’ la fréquence de l’allèle ‘i’ au locus chez différents génotypes.

Les SNPs présentant une valeur de PIC (Polymorphism Information Content) supérieure à 50% ont été

retenus pour la suite des analyses, soit 3665 SNPs. Par la suite, nous avons procédé à la sélection des

192 SNPs représentatifs des marqueurs sélectionnés. Nous avons utilisé tout d’abord le package R

LDcorSV (Mangin, et al. 2012) pour calculer le déséquilibre de liaison (LD) entre marqueurs en prenant

en compte l’apparentement estimé par la distance de Manhattan sur la matrice de génotypage (dosage

allélique 0, 1, 2). Un partitionnement des 3665 marqueurs en 192 clusters a été réalisé (K-mean cluster

analysis) en se basant sur la matrice LD. Les 192 SNPs les plus proches des centroïdes (distance

Euclidienne) de chaque cluster ont ainsi été sélectionnés pour développer des marqueurs KASPars


(Tableau annexe 2). Ces 192 marqueurs permettent de maintenir la structure de la diversité obtenue

sur nos échantillons (Figure 1.2).

a

b

Figure 1.2: Comparaison des dendogrammes des distances génétiques entre les accessions génotypées par séquençage. a- avec les 3665 SNP présentant des valeurs de PIC>0.5 et b- après sélection des 192 SNP parmi les 3665. Ces marqueurs SNPs KASPar pour l’igname seront validés début 2017.

1.1.4 Caractérisation des collections d’igname (INRA, CIRAD) Participants : C. Pavis2, D. Roques1, G. Arnau1, M. Umber2, L. Toubi1, N. Paulo de la Riberdière1, P. Ollitrault1, D. Petro2

Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : Génotypage de 600 accessions pour 40 marqueurs

SNPs (méthode Kaspar).

Il n’y a pas eu d’activité en 2016. Les collections d’Ignames seront caractérisées en 2017 avec les SNPs KASPar définis au 1.1.3.

WP 1.2 Etablissement d’une carte génétique de référence de l’igname (CIRAD) Cette carte génétique de référence de l’igname élaborée par une approche GBS sera produite grâce à la conjonction du projet Cavalbio et du projet « Africa Yam » (fondation Gates) qui financeront chacun le génotypage de 120 hybrides. La population globale de 240 hybrides permettra d’établir une carte de référence avec une précision élevée et couvrant densément le génome de D. alata. Participants : G. Arnau, P. Ollitrault, E. Nudol, E. Maledon, H. Chair et équipe technique station de Roujol Activité/méthode programmées pour 2016-2017: GBS sur 120 individus et génotypage après mappage sur la séquence de référence de D. alata. Etablissement des cartes génétiques (parents et consensus) à partir des données sur 240 hybrides. Résultats obtenus


Des échantillons foliaires ont été prélevés sur l’ensemble des hybrides et sur les parents. Ceux-ci ont été conditionnés par la méthode de dessiccation au silicagel, sélectionnée lors du test préliminaire, et envoyés à LGC Genomics en Angleterre, qui a réalisé les extractions d’ADN. La technologie SBEADEX (des billes magnétiques) a été sélectionnée car elle permet d’obtenir des ADNs de très bonne qualité pour les analyses GBS. Lorsque nous avons reçus nos ADNs, nous avons vérifié les concentrations au spectrophotomètre, et nous les avons envoyés à la Plateforme de Genotypage de Montpellier (GPTR Génotypage) pour la préparation des banques GBS. Une aliquote des ADNs (3 ul) a été déposée par la Plateforme, sur un gel d’agarose, pour permettre de vérifier la qualité des ADNs et d’estimer leurs concentrations avec précision. Cette analyse a permis de confirmer que nos ADNs étaient de bonne qualité (pas de dégradation, Figure 1.3). Ce gel a mis en évidence également que les concentrations d’ADN d’un certain nombre d’échantillons (environ 20 %) étaient inférieures au seuil minimum accepté pour la préparation des banques GBS (seuil de 20 ng/ul). Afin d’augmenter les concentrations de ces échantillons, la Plateforme a opté par une précipitation et ré- concentration de l’ensemble des ADNs. Malheureusement cette opération n’a pas fonctionné et la plupart de nos échantillons ont été perdus. Nous allons donc devoir renvoyer les échantillons, ce qui va entrainer un retard des travaux de séquençage GBS et de SNP Calling, prévus initialement pour novembre 2016 et février 2017. Malgré ce contretemps, nous devrions pouvoir établir la carte de référence en 2017 comme programmé.

Figure 1.3 : contrôle de la qualité des ADNs de la population en ségrégation


WP 1.3 Fonctionnement méiotique des génomes complexes (CIRAD) Cette action répond à l’objectif O3 du projet. Le fonctionnement méiotique et la structure de populations de gamètes de géniteurs d’agrumes tétraploïdes ou diploïdes d’origine interspécifique et intergénérique (Citrus/Poncirus) seront analysés par marquage GBS qui permettra un suivi très fin des ségrégations/recombinaisons. Deux types de populations créées dans le cadre du WP2 sont concernées : (i) une population triploïde issue d’hybridation entre un citronnier diploïde et un limettier tétraploïde destinée à l’amélioration des limettiers à gros fruits type Tahiti ; (ii) des populations tétraploïdes issues d’hybridations entre géniteurs tétraploïdes interspécifiques et intergénériques destinées à l’amélioration des porte-greffes. Ces populations et le génotypage GBS serviront de support à des études de génétique d’association durant la deuxième phase du projet (2018-2020 ; phénotypage pour des caractères de qualité et d’adaptation aux stress biotiques et abiotiques). Participants : P. Ollitrault, D. Ahmed, S. Bruyère, Y. Froelicher

1.3.1 Méiose et structure des gamètes des géniteurs tétraploides interspécifiques et intergénériques d’agrumes Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : (i) validation de l’approche GBS (enzyme APEK1 et base de sélection) pour les géniteurs concernés, par l’analyse de données de GBS pré-existantes au projet Cavalbio ; (ii) analyse fine de l’hérédité des fragments chromosomiques et de la recombinaison par GBS à partir des populations tétraploïdes et triploïdes créées dans le WP2. Résultats obtenus A : parents des populations d’hybrides tétraploïdes pour l’amélioration des porte-greffes En 2015 le fonctionnement méiotique du Volkameriana tétraploïde avait été analysé à l’aide de marqueurs Kaspar répartis sur les différents chromosomes. Ce résultat a contribué à une communication au congrès ISC 2016 : Ollitrault P, Curk F, Ollitrault F, Garcia-Lor A, Navarro L & Morillon R. 2016. Usefulness of phylogentic diagnostic snp markers of citrus ancestral taxa for genetics and breeding. International Citrus Congress 2016. Foz de Iguaçu, Brazil, Sept. 18 - 23, 2016. En 2016 une étude équivalente a été réalisée pour le Citrumello 4475 tétraploïde. Vingt marqueurs diagnostiques Poncirus KASPar (développés dans le WP1.1) couvrant les 9 chromosomes ont servi à génotyper 83 hybrides tétrazyg Volkameriana x Citrumello 4475 conjointement à des échantillons témoins (poncirus 2x ; 1 poncirus 4x ; pomelo 2x ; 1 pomelo 4 x ; citrumelo 2x; 2 citrumelo1 4x et Volkameriana 2x et 4x. Le pourcentage de restitution de l’hétérozygotie parentale (RHP) a été étudié pour les 20 marqueurs et les valeurs moyennes par chromosome estimée (Tableau 1.2). Tableau 1.2: pourcentage de restitution de l’hétérozygotie parentale du citrumello par les gamètes diploïdes

Chr1 Chr2 Chr3 Chr4 Chr5 Chr6 Chr7 Chr8 Chr9 Total nb

marqueurs 4 1 4 1 4 2 2 1 1 20

RHP 82.7% 83.1% 83.1% 88.9% 81.4% 95.1% 85.5% 88.8% 87.5% 84.9%


RHP varie entre 81.4% et 95% suivant les chromosomes. Ces pourcentages sont supérieurs à ceux mesurés en 2015 pour le Volkameriana. Ils correspondent à une ségrégation intermédiaire (entre tétrasomique et disomique) à préférence disomique. Une très grande partie du génome du citrumelo diploïde (parent du tétraploïde) est transmise à chaque hybride. C’est une situation favorable pour la transmission des caractères de résistance du citrumello (virus de la Tristeza, phytophthora, nématodes…) aux hybrides. La diversité des gamètes est en revanche et logiquement relativement réduite (Figure 1.4) comparativement à la distance génétique entre les deux parents du citrumello (Pomelo et Poncirus).

Figure 1.4 : distribution des gamètes diploïdes produits par le citrumello 4475 tétraploïde L’année 2015 avait permis de valider l’approche GBS pour suivre finement les ségrégations chez le Volkameriana tétraploïde et le citrumello 4475 tétraploïde. Cette expérimentation GBS sera réalisée en 2017 sur une centaine d’hybrides après validation par marquage Kaspar des nouveaux hybrides obtenus en 2016 dans le cadre du WP2. B : parent tétraploïde de la population de limes triploïdes En 2016 l’expérimentation GBS a été réalisée avec les hybrides existants et les différents parents. Comme précédemment les banques GBS ont été préparées avec l’enzyme de restriction APEK1 et une base de sélection (A) a été ajoutée lors de l’étape de PCR pour limiter le nombre de cibles à séquencer. Afin d’obtenir une profondeur de lecture suffisante le multiplexage a également été limité à 40 individus. Ainsi 3 banques GBS de 40 individus ont été séquencées sur la plate-forme Illumina Hiseq3000. Les données de séquence brutes ont été « mappées » sur la séquence de référence du génome de clémentinier (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Cclementina) et l’appel de génotypes réalisé avec le programme Tassel (Glaubitz et al., 2014). Une analyse préliminaire de la structuration de la population de triploïdes a été réalisée par AFTD par rapport au référentiel des taxons ancestraux (Figure 1.5a) ou uniquement des parents et de l’idéotype lime Tahiti (Figure1.5b). Il apparait que quelques accessions supposées hybrides sortent en extrême proximité avec le parent citronnier. La ploïdie de ces accessions sera vérifiée. Si elles sont diploïdes elles résultent probablement d’embryons nucellaires (apomixie), si elles sont bien triploïdes elles pourraient être issues d’autofécondation. Quelques accessions supposées hybrides triploïdes sortent entre les ancêtres C. reticulata et C. maxima il est possible que lors du prélèvement, ce soit des feuilles du porte greffe et non de l’hybride triploïde qui ait été prélevée. Le statut de ces échantillons sera

https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Cclementina


analysé au cas par cas avant d’engager les études de cartographie et plus tard d’association génotype/phénotype. Figure 1.5 : AFTD à partir des données GBS (50368 SNPs) a: situation par rapport aux taxon ancestraux b: situation par rapport au parents et à l’idéotype limettier Tahiti Un des éléments clefs de l’étude du fonctionnement méiotique est l’analyse de la restitution de l’hétérozygotie parentale par les gamètes diploïdes. L’inférence de la structure génétique des gamètes diploïdes implique de pouvoir réaliser un dosage allélique chez les individus triploïdes hétérozygotes (XYY ou XXY). Il est apparu que ce dosage ne pouvait pas être déduit directement des proportions de lecture de chacun des allèles pendant le séquençage. Diverses approches analytiques sont actuellement étudiées pour tenter d’estimer ce dosage. Un génotypage complémentaire avec des marqueurs DSNPs Kaspar (identifiés dans le WP1) est également envisagé. Compte tenu de cette difficulté et dans le cadre de notre partenariat avec l’IVIA (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Espagne) nous avons accueilli en Guadeloupe d’octobre à décembre 2016 Mr Houssem Rouiss doctorant (co direction P. Ollitrault et P. Aleza) pour analyser des données de ségrégation d’un limettier tétraploïde (population de l’IVIA et génotypage réalisé précédemment à l’IVIA). Quatre-vingt-cinq hybrides triploïdes issus d’hybridations entre clémentinier et limettier tetraploïdes étaient génotypés pour 33 marqueurs codominants (SSRs, Indels et SNPs) répartis sur les 9 chromosomes. Tableau 1.3: restitution de l’hétérozygotie parentale (RHP) par les gamètes diploïde du limettier mexicain 4x

Chr1 Chr2 Chr3 Chr4 Chr5 Chr6 Chr7 Chr8 Chr9 Total nb

marqueurs 4 3 3 4 3 5 3 4 5 20

RHP 90.3% 95.3% 88.6% 89.7% 82.7% 88.0% 92.9% 95.6% 92.0% 90.6% Les taux RHP moyens par chromosome varient entre 82.7% et 95.6% avec une moyenne de 90.6% (Tableau 1.3). Ces taux très élevés témoignent d’un fort apparentement préférentiel des chromosomes lors de la méiose et conduisent à la production de gamètes peu variables (Figure 1.5) centré autour de la lime Mexicaine diploïde.


Figure 1.5 : distribution des gamètes diploïdes produits par le limettier mexicain tétraploïde Ces résultats seront utiles pour mettre en place (si elle est possible) l’analyse des dosages alléliques à partir des données GBS. Ils seront par ailleurs valorisés par un article dans une revue internationale (en cour d’écriture).

1.3.2 Impact de l’interspécificité sur les écarts au mendélisme (distortions de ségrégation, recombinaison). Activité/méthode programmées sur 2015-2017: l’étude concerne le citronnier qui a une structure complexe impliquant trois espèces ancestrales du genre Citrus et qui est utilisé comme géniteur femelle dans le programme d’amélioration des limettiers à gros fruits. (i) validation pour le citronnier de l’approche GBS (enzyme APEK1 et base de sélection) par l’analyse de données de GBS pré-existantes au projet Cavalbio ; (ii) analyse fine de l’hérédité des fragments chromosomiques et de la recombinaison par GBS à partir de la population triploïde créée dans le WP2. Résultats obtenus Les résultats concernant l’évaluation de l’approche GBS pour l’étude de la méiose du citronnier en 2015 et la méthode de l’expérimentation GBS réalisée en 2016 ont été présentés avec ceux du limettier tétraploïde au point 1.3.1. 50368 positions polymorphes (dont 49688 localisées sur les 9 chromosomes de la séquence de référence) ont été identifiées après traitement des données de séquence avec le programme Tassel. Les données pour lesquelles moins de 10 lectures étaient disponibles ont été considérées manquantes. Les positions hétérozygotes pour l’ensemble des parents citronniers et homozygotes pour le limettier Giant Key ont été retenues pour l’analyse de la méiose du citronnier.


Leur position dans les séquences géniques ou inter géniques ont été étudiées sur la base de l’annotation du génome de clémentinier ((https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Cclementina) et le nombre total de gènes marqués a été calculé pour chaque chromosome (Tableau 1.4). Au total 4376 gènes sont marqués. Pour chaque gène le marqueur présentant le moins de données manquantes a été sélectionné. Au final 3471 marqueurs localisés dans des gènes différents et 2276 non localisés dans des gènes (avec moins de 5% de données manquantes pour les deux types) ont été retenus pour réaliser en 2017 la carte génétique de référence du citronnier avec le programme JoinMap. Tableau 1.4: polymorphismes totaux et utiles pour l’analyse de la ségrégation des citronniers (données GBS sur la population en ségrégation citronnier x limettier 4x

Une approche phylogénomique de recherche des points de recombinaison dans les gamètes de citronnier a été développée. Elle repose sur les 14926 SNPs diagnostiques (DSNPs) des quatre taxons ancestraux identifiés dans l’étude GBS réalisée sur un panel de diversité (1.1.2). La possibilité de décrire les structures phylogénomiques des hybrides triploïdes citronnier x limettier à partir de ce panel de DSNPs a été validée pour le chromosome 1. Pour ce chromosome, respectivement 356, 269, 58 et 46 DSNPs (total 1629) des espèces C. reticulata, C. maxima, C. medica et C. micrantha sont en ségrégation. Ces DSNPs permettent d’inférer l’hétérozygotie et l’homozygotie des DSNPs des 4 taxons tout au long du chromosome 1. Dans les régions chromosomiques ou l’hybride triploïde a hérité des fragments génomiques C. reticulata ou C. maxima du citronnier (Figure 1.6a), le caryotype phylogénomique complet de l’hybride et des gamètes l’ayant généré peut être inféré. En revanche dans les régions chromosomiques en hétérozygotie C. medica / C. micrantha (exemple 1.6b) seule une évaluation des dosages alléliques pourra permettre cette inférence. Toutefois, les points de recombinaison entre le chromosome C. medica et le chromosome C. reticulata/C. maxima du citronnier peuvent être identifiés sur la base du traitement de données déjà réalisé (Figure 1.6a à 1.6c). Cette étude sera étendue à l’ensemble des chromosomes et des hybrides.

Nbre sites

polymorphes

Sites dialléliques

citron

Nb marqueurs dans gènes

Nb gènes marqués

Chr1 5005 1272 948 520

Chr2 6616 1527 1114 369

Chr3 8934 2079 1555 862

Chr4 5121 1131 831 488

Chr5 6400 1342 860 487

Chr6 4386 1050 712 396

Chr7 4199 1072 783 415

Chr8 4109 1016 728 388

Chr9 4918 1223 881 451

UN 680 74

Total 50368 11786 8412 4376

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Figure 1.6 : « Caryotype phylogénomique » d’hybrides triploïdes pour le chromosome 1 A) exemple d’un hybride triploïde ayant hérité d’un gamète C. reticulata / C. maxima du parent citronnier sans recombinaison (hybride Clb107FM) B) exemple d’un hybride triploïde ayant hérité d’un gamète C. medica du parent citronnier (hybride Clb087FM) ; C) identification de deux points de recombinaison interspécifiques (flèches) dans un gamète de citronnier (hybride Clb110FM) Rouge : fréquence DSNPs C. reticulata ; Jaune fréquence DSNPs C. medica ; Vert : fréquence DSNPs C. micrantha ; bleu : fréquence DSNPs C. maxima GC gamète du citronnier, GL gamète diploïde de la lime

A

B

C


WP 2 - Création de ressources biologiques innovantes Partenaires : CIRAD Responsable WP : G. Arnau Le WP2 répond à l’objectif O4 du projet. Il vise à produire du matériel végétal innovant pour l’igname (WP2.1.) et les agrumes (WP2.2.) afin d’alimenter les projets d’amélioration variétale (géniteurs et populations pour sélection) et les actions de recherches cognitives de Cavalbio (WP1, WP3, WP4) sur la période 2015-2020. Il s’appuie sur des méthodologies éprouvées pour la création d’hybrides interspécifiques voire inter-génériques entre parents pouvant appartenir à des compartiments de différentes ploïdies.

WP 2.1 Ressources biologiques innovantes d’igname (CIRAD) Les populations créées alimenteront le programme d’amélioration de l’igname; la population diploïde 2.1.2 servira de support à la carte génétique de référence et les populations 2.1.3 serviront de support à l’étude des mécanismes de formation des 2n gamètes durant la période 2018-2020. Elles seront également le support d’étude d’association entre diversité phénotypique et moléculaire (qualité, résistance à l’anthrachnose)

2.1.1 Diploïdes doublés de géniteurs élites de D. alata (CIRAD) Participants : G. Arnau, E. Nudol, E. Maledon Activité/Méthode programmées sur 2015-2017: les diploïdes doublés de D. alata seront cherchés par traitement à la colchicine in vitro. La ploïdie et l’existence d’éventuelles chimères de ploïdie seront analysées par cytométrie en flux. Résultats obtenus : Il n’y a pas eu d’activité sur ce volet en 2016. Ce travail sera réalisé en 2017.

2.1.2 Populations pour la cartographie du génome et les analyses QTLs Participants : G. Arnau, E. Nudol, E. Maledon Activité/Méthode programmées sur 2015-2017: Production d’une population de 250 hybrides entre deux géniteurs diploïdes D. alata non apparentés. Vérification de la conformité du croisement par marquage moléculaire. Résultats obtenus : cette activité avait été réalisée totalement en 2015.

2.1.3 Hybrides tétraploïdes issus d’hybridation interploïde 2x x 4x (CIRAD) Participants : G. Arnau, E. Nudol, E. Maledon Activité/Méthode programmées sur 2015-2017: Les semences seront gérées par des techniques standardisées de pépinière. Les tétraploïdes seront sélectionnés par cytométrie en flux. Résultats obtenus


Un essai a été mis en place au champ en 2016, pour pouvoir générer la population tétraploïde qui servira de support à l’étude des mécanismes de formation des 2n gamètes (durant la période 2018-2020), par croisement entre une génitrice diploïde (61F) et un male tétraploïde (cultivar VU472 Toufi Tetea). Cette femelle produit des diplogamètes à un taux relativement élevé (12%). Mille soixante-seize pollinisations manuelles ont été réalisées pendant la période des croisements (Octobre-Novembre) et un total de 122 graines viables (non fripées) a été obtenu. Celles-ci seront semées et le niveau de ploïdie des plantes sera analysé par cytometrie en flux en 2017.

WP 2.2 Ressources biologiques innovantes d’agrumes (CIRAD) Les populations créées seront destinées à des projets d’amélioration des porte-greffes (2.3.1) et de diversification du limettier (2.3.2) elles seront également support d’étude de biologie de la reproduction (WP1) et sur la période 2018-2020 d’analyse des déterminants génétiques de caractères de qualité et d’adaptation aux stress biotiques et abiotiques. La création des populations triploïdes et tétraploïdes (hybridations sexuées) sera réalisée en Corse sous la responsabilité de Y Froelicher du Cirad ; les géniteurs ne sont en effet pas présents à l’état adulte en Guadeloupe.

2.2.1 Porte-greffes tétraploïdes d’agrumes Participants : P. Ollitrault, S. Bruyère, R. Morillon, Equipe plateau Roujol, Y. Froelicher, Activité/Méthode programmé sur 2015-2017: le Volkameriana tétraploïde sera hybridé en Corse avec trois autres géniteurs tétraploïdes : Citrumello4475, Citrandarin et Poncirus. Les semences tétraploïdes seront gérées suivant des techniques classiques de pépinière et la nature hybride testée par marquage moléculaire (SNP Kaspar). Résultats obtenus Respectivement 112 et 99 graines issues de croisements (réalisés en 2015 sur la station de San Giuliano en Corse-UMR AGAP) entre le Volkameriana tétraploïde et le citrumello 4475 tétraploïde (VxC) d’une part et Volkameriana tétraploïde et le citrandarin Poncirus x Cléopatre tétraploïde (VxPC) ont été introduites en Guadeloupe (Tableau 2.1). 40 et 27 graines respectivement de VxC et VxPC ont été semées directement en serre. Elles ont permis d’obtenir respectivement 27 et 22 plantes. Parallèlement 72 graines de chaque croisement ont été semées in vitro. Respectivement 60 et 57 graines ont germé pour VxC et VxPC. Certaines graines ont produit plusieurs plantules et le nombre de plantules obtenues a été respectivement de 87 et 93. Elles ont été sevrées par mini-greffage). Au total 231 plantes issues d’hybridations tetrazygs ont été obtenues. La caractérisation moléculaire à l’aide de marqueurs SNPs afin d’identifier les plantes d’origine hybride et le contrôle du niveau de ploïdie par cytometrie en flux seront réalisés mi 2017. Tableau 2.1: Obtention de plantes à partir des croisements tétrazygs VxC : Volkameriana tétraploïde X citrumello 4475 tétraploïde VxPC : Volkameriana tétraploïde X citrandarin Poncirus x Cléopatre tétraploïde

Nb

semences introduites

Semis direct en Serre Semis in vitro Total

Nb graines semées

Nb plantes obtenues

Nb graines semées

Nb graines germées

Nb plantes obtenues

Nb graines germées

Nb plantes obtenues

V x C 112 40 29 72 60 87 89 116

V x PC 99 27 22 72 57 93 79 115

Total 211 67 51 144 117 180 168 231


De nouvelles hybridations V xC et V x PC ont été réalisées en Corse au printemps 2016. Malheureusement, les tempêtes successives qui ont affecté la Corse durant l’hiver 2016 ont provoqué des chutes massives de fruits et n’ont pas permis de récolter de semences issues de ces hybridations. De nouveaux croisements seront réalisés au printemps 2017.

2.2.2 Limettiers triploïdes Participants : P. Ollitrault, S. Bruyère, R. Morillon, Equipe plateau Roujol, Y. Froelicher, Activité/Méthode programées sur 2015-2017: différents citronniers diploïdes seront hybridés en Corse avec une lime mexicaine tetraploïde. Les embryons seront sauvés in vitro. La ploïdie des plantes obtenues sera testée par cytométrie en flux et la validité de la nature hybride par marquage moléculaire SNPs Kaspar. Résultats obtenus Parmi les 20 hybrides triploïdes obtenus en 2015 trois présentaient une très faible vigueur et ont été perdus. Deux cents graines issues de croisements (réalisés en 2015 sur la station de San Giuliano en Corse-UMR AGAP) entre différents citronniers diploïdes (Lisbonne ; Feminello ; Limonera ; Santa tereza) et la lime tétraploïde « Giant Key » ont été introduites. Cent soixante-dix-huit ont produit des plantes dont la ploïdie a été analysée par cryométrie en flux. Quatre-vingt-seize plantes se sont avérées triploïdes et ont été greffées pour conservation sur Citrumello 4475. Les 17 triploïdes obtenus en 2015 et les 96 de 2016 ont été regreffés sur le porte-greffe Poncirus Flying-Dragon pour être évalués à haute densité sur le domaine de Roujol (Cirad Petit Bourg) ; ces plants greffés sur Flying Dragon seront plantés début 2017. Une nouvelle série de croisement citronnier 2x X limettier 4x a été réalisée en Corse au printemps 2016. Les semences issues de ces hybridations seront introduites en Guadeloupe début 2017.


WP3 - Déterminants du développement, de l’adaptation et de la qualité Partenaires : CIRAD1, INRA2, Université Antilles, ECOFOG4 Responsable WP : R Morillon Le WP3 répond à l’objectif O5 pour les déterminants liés aux propriétés de développement, d’adaptation aux contraintes environnementales et de qualité. Ses objectifs spécifiques sont (i) mettre au point des outils et des modèles de phénotypage adaptés à la culture de l’igname et proposer un modèle de culture générique pour la sélection de variétés adaptées aux systèmes de culture à bas intrants, (ii) analyser la diversité et l’héritabilité de caractères de qualité physico-chimique des ignames, (iii) caractériser l’impact de la tétraploïdie sur l’adaptation aux contraintes abiotiques et le niveau d’apomixie des porte-greffes d’agrumes et sur le développement/physiologie de l’igname.

WP3.1 Développement et adaptation des ignames (CIRAD1, INRA2, Univ. Antilles, ECOFOG4)

3.1.1 Mise au point d’outils et de modèles de phénotypage adaptés à la culture d’ignames et application à la collection de référence (CIRAD, INRA) Participants : D. Cornet1, R. Morillon1, E. Malédon1, E. Nudol1, G. Arnau1, P. Chopin2, D. Lange2, E. Francius², R. Tournebize2, C. Pavis2, T. Bajazet2, M. Dulormne4 Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : Phénotypage d’une collection de travail sans et avec une pression des plantes adventices pour l’identification des traits d’intérêts. Mise au point de méthodes rapides et non-destructives de mesures de ces traits. Résultats obtenus Une collection de travail (Colziyanm) a été installée à l’INRA sur la station expérimentale de Godet en avril 2016 ( Une première récolte de la collection est en cours. Des fiches variétales seront réalisées. Nous prévoyons de replanter la collection sur deux sites en 2017 : Duclos et Godet. L’encadrement de stages de L3 ou M1 est aussi prévu en 2017 afin de commencer les travaux de phénotypage.


Tableau 3.1). L’objectif est de pouvoir disposer des variétés utiles aux programmes de recherche en s’assurant de la pureté variétale et de l’homogénéité physiologique des tubercules produits. Parallèlement, cette collection permet de fédérer les acteurs de la recherche autour de questions relatives au phénotypage des traits d’intérêt (qualité, physiologie, agronomie, pathologie…). C’est dans cette optique qu’un forum de discussion a été créé en septembre 2016 : http://www2.antilles.inra.fr/colziyanm/. Ce forum permet de discuter les protocoles, de partager les informations et les données. Il est ouvert à l’ensemble des chercheurs du projet sur simple demande. Une première récolte de la collection est en cours. Des fiches variétales seront réalisées. Nous prévoyons de replanter la collection sur deux sites en 2017 : Duclos et Godet. L’encadrement de stages de L3 ou M1 est aussi prévu en 2017 afin de commencer les travaux de phénotypage.

http://www2.antilles.inra.fr/colziyanm/


Tableau 3.1 : Liste des variétés de la collection de travail. Espèce Code CRB Nom alata 476 St Vincent alata 41 Florido alata 43 Goana alata 47 Plimbite alata 51 Pyramide alata 93 Oriental alata 95 Bélep alata 96 Kinabayo alata 390 Boutou (Hyb 4) alata 403 Pacala alata Récupération Dalila INRA-15 alata Récupération Gemma Toufi Tetea rotundata 147 Grosse caille 3 mois cayenensis 152 Igname jaune

Une expérimentation de terrain (PhenoComp) a été mise en place début 2016 avec pour objectif de tester le comportement de 4 variétés d’igname (Grosse-Caille, Kinabayo, Boutou et Belep) en fonction de la présence ou de l’absence de pression des mauvaises herbes. Plus spécifiquement, l’objectif est de mesurer différents traits (architecture, physiologie, agronomie) potentiellement impliqués dans la compétitivité et de relier ces mesures aux variations de performance avec et sans la présence de plantes adventices. Dans un premier temps, un suivi floristique des populations de plantes adventices a été réalisé en cours de saison afin de pouvoir calculer un indicateur de pression des mauvaises herbes au sein de chaque unité expérimentale. La Figure 3.1 montre l’évolution du recouvrement au sol des principales espèces de mauvaises herbes présentes sur la parcelle. Les chutes de recouvrement du sol correspondent aux sarclages manuels réalisés en cours de saison.

Figure 3.1 : Suivi du recouvrement des principales mauvaises herbes pour chaque variété d’igname en 2016.


L’observation des fréquences relatives et du recouvrement local (Figure 3.2) permet de montrer que

le genre Cyperus a dominé durant cette expérimentation. Cette Figure montre aussi que globalement

les espèces les plus fréquentes sont aussi celles qui présentent le plus fort recouvrement. L’absence

d’espèce rare mais ponctuellement importante permet d’affirmer que la parcelle cultivée est

homogène et donc que les comparaisons entre variétés sont pertinentes.

Figure 3.2 : Relation entre la fréquence relative et le recouvrement locale de chaque mauvaise herbe présente sur la parcelle en 2016.

Dans un deuxième temps, nous avons suivi des indicateurs de compétition subie, telle que la teneur en chlorophylle des feuilles, directement liée à la nutrition azotée de chaque variété. La Figure 3.3 montre ainsi que la présence de mauvaises herbes contraint la nutrition azotée des quatre variétés d’igname mais que cette contrainte est ressentie différemment par chaque variété. Ainsi Belep et Grosse-Caille ne semblent pas subir trop fortement la compétition pour l’azote alors que Kinabayo présente une forte diminution du niveau de chlorophylle dans les feuilles en présence des mauvaises herbes. Boutou offre un comportement intermédiaire.

Figure 3.3 : Influence de la pression des mauvaises herbes sur la nutrition azotée (valeur SPAD) de quatre variétés d’igname.


Ensuite, nous avons suivi la croissance et le développement des quatre variétés d’igname en cours de saison. De nombreux traits ont été suivis :

- Emergence : Les dynamiques d’émergence des quatre variétés montrent une distribution normale à long-normale avec un pic d’émergence début juin pour Belep et mi-juin pour Grosse-Caille, Boutou et Kinabayo (Figure 3.4). Le taux de germination maximum est atteint environs 50 jours après plantation pour toutes les variétés sauf Belep qui semble plus précoce (Figure 3.5). Le taux de germination maximum des trois variétés appartenant à l’espèce D. alata est supérieur à 90% alors que le taux de germination de Grosse Caille appartenant à l’espèce D. cayenensis n’atteint que 61%. Ce faible taux d’émergence est dû à une mauvaise conservation de cette variété en stockage et à une levée de dormance bien avant la date de plantation.

Figure 3.4 : Distribution des émergences de quatre variétés d’igname.

Figure 3.5 : Dynamiques d’émergence de quatre variétés d’igname.

- Architecture : Parmi les différents traits d’architecture observés, seules les tailles de feuilles et

d’entrenœuds sont influencées, négativement, par la pression des mauvaises herbes, et ce, quelle que soit la variété (Figure 3.6). Ainsi, la présence de mauvaises herbes provoque un raccourcissement des entrenœuds et une diminution de la taille des feuilles.


Figure 3.6 : Influence de la pression des mauvaises herbes sur l’architecture de 4 variétés d’igname.

- Recouvrement : Les dynamiques de recouvrement du sol par l’igname montrent un profil classique sigmoïde (Figure 3.7). Boutou semble être la variété la plus performante pour recouvrir le sol, suivie par Kinabayo et Belep. Enfin Grosse Caille recouvre moins de 50% de la parcelle, laissant beaucoup d’espace pour le développement des adventices. La vitesse de recouvrement de chaque variété doit encore être analysée.

-

Figure 3.7 : Dynamiques de recouvrement du sol par quatre variétés d’igname.

- Efficacité d’interception du rayonnement : Pour une surface foliaire donnée, Boutou semble

être la variété la plus efficace pour intercepter le rayonnement, suivie par Belep et Kinabayo


(Figure 3.8). Enfin, Grosse Caille semble peu efficace pour intercepter le rayonnement. Ces observations sont confirmées par le calcul du coefficient d’extinction, plus élevé pour Boutou et Kinabayo, montrant ainsi une surface foliaire, en moyenne, plus horizontale ou mieux répartie que Belep et Grosse Caille (Figure 3.9).

-

Figure 3.8 : Efficacité d’interception du rayonnement de quatre variétés d’igname.

Figure 3.9 : Influence de la pression des adventices sur le coefficient d’extinction du rayonnement de quatre variétés d’igname.

- Biomasse : Lors des récoltes intermédiaires (c’est-à-dire durant la phase végétative en cours

de saison), la pression des plantes adventices se traduit systématiquement par une baisse de la production quel que soit l’organe observé (Figure 3.10). Malgré une efficacité d’interception inférieure, Belep présente la plus forte production de biomasse avec ou sans pression des adventices. Cette performance peut être due à plusieurs facteurs. Tout d’abord, Belep présente la plus forte efficacité d’utilisation du rayonnement (Figure 3.11), c’est-à-dire la plus forte capacité à transformer le rayonnement intercepté en biomasse. De plus, Belep présente une dynamique d’émergence plus rapide que les autres variétés (Figure 3.5). De ce fait, au moment de la récolte intermédiaire, la biomasse produite était plus importante et le cycle de la variété plus avancé. Ainsi, Belep présente déjà un début de tubérisation alors que les trois autres variétés sont encore en phase végétative. Une analyse de la production de biomasse en


fonction du temps thermique écoulé depuis l’émergence devrait permettre de comparer les variétés avec une même échelle de temps. Enfin, Belep semble présenter une dynamique d’utilisation de l’azote différente des autres variétés (Figure 3.3), avec moins de chlorophylle dans les feuilles mais aussi moins d’effet de la pression des mauvaises herbes sur la nutrition azotée. Une analyse complète des autres traits foliaires mesurés (SLA, LDMC, taille des feuilles, rapport feuilles-tiges…) devrait permettre de mieux comprendre les différences de stratégies d’allocation des ressources de chaque variété.

Figure 3.10 : Influence de la pression des mauvaises herbes sur la biomasse sèche des différents organes de 4 variétés d’igname.

Figure 3.11 : Influence de la pression des mauvaises herbes sur l’efficacité d’utilisation du rayonnement.

L’observation des rendements montre que la pression des mauvaises herbes a fortement pénalisé la production de l’igname quelle que soit la variété (Figure 3.12). Au final, la variété Boutou présente les rendements les plus importants, devant Belep et Kinabayo et, loin derrière, Grosse Caille. Il semble donc que malgré la précocité et la meilleure efficacité d’utilisation du rayonnement de Belep, l’efficacité d’interception du rayonnement supérieure de Boutou lui confère un avantage. Les résultats sont toujours en cours d’analyse. Ainsi l’influence de la pression des adventices sur le calibre et la variabilité des poids de tubercule est encore à réaliser. De même, le lien entre performances et traits observés est encore à analyser. Une deuxième année d’expérimentation est prévue en 2017 pour confirmer ces résultats.


Figure 3.12 : Influence de la pression des plantes adventices sur le rendement de quatre variétés d’igname.

3.1.2 Mise au point d’un modèle de culture générique pour la sélection de variétés adaptées aux systèmes de culture à bas intrants (CIRAD, INRA) Participants : D. Cornet1, R. Morillon1, R. Sierra2, P. Chopin2, P. Marival2, R. Tournebize2, M. Publicol2 Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Simplification et traduction sous R de l’actuel modèle CropSyst VB Yam (Inra). Développement du modèle pour intégrer les traits variétaux d’intérêt. Validation du modèle par une expérimentation de terrain incluant la collection de travail. Résultats obtenus A l’heure actuelle, le modèle principal est codé en VisualBasic et donc inutilisable à notre niveau. De plus, sa complexité le rend difficilement accessible pour un informaticien. Le bon déroulement de cette activité repose donc sur un travail initial du postdoctorant ayant conçu le modèle original. Ce travail était prévu sous la forme d’une mission de 3 mois dans le cadre du projet CavalBio. Pour des raisons de santé, le postdoctorant n’est pas en état de se déplacer actuellement. Les activités sur la simplification et la traduction du modèle de culture sont donc à l’arrêt. Dans l’attente d’une solution réaliste (que nous espérons possible pour la 2ème phase de CavalBio), nous avons proposé à la Région d’avancer le travail de modélisation sur des modules essentiels du modèle mais que nous pouvons travailler séparément. Il s’agit d’un module compétition et d’un module nutrition azotée. Ces 2 modules sont en cohérence avec les activités (3.1.1 et 3.1.3) et répondent à des problématiques locales d’importance (lutte contre les mauvaises herbes et adaptation aux systèmes de culture à bas intrants). De plus, l’étude de la compétition nous permettra de répondre à des questions soulevées dans le cadre du RITA2 sur la plantation à haute densité. Afin de permettre une interaction entre les activités du Cirad et de l’INRA, certains jalons et livrables seront réalisés en 2018. Les livrables sont donc modifiés comme suit :


Ancien livrable Nouveaux livrables Echéance

Un modèle de culture générique est disponible

Un modèle de nutrition azotée de l’igname est développé Un modèle sur la compétition interplante est développé

Septembre 2018

Et les jalons seraient donc modifiés comme suit :

Ancien jalons Nouveaux jalons Echéance

Le modèle de culture en VB est simplifié et adapté

Le protocole de suivi de la nutrition azotée est rédigé et validé

Fév. 2017

Le modèle de culture est traduit en langage R

Le protocole d'évaluation et de suivi de la compétition au champ est rédigé et validé

Fév. 2016

Certains traits variétaux d'intérêt sont inclus dans le modèle

Mise en place du dispositif expérimental au champ permettant l'évaluation de la nutrition azotée

Avril 2017

Le modèle de culture en VB est simplifié et adapté

Mise en place du dispositif expérimental au champ permettant l'évaluation de la compétition

Avril 2016 et avril 2017

Le modèle de culture est traduit en langage R

Les dynamiques de nutrition azotée sont connues Sept. 2018

Les déterminants de la compétition sont connus et modélisés

Sept. 2018

Dans ce contexte, une expérimentation de terrain a été mise en place en 2016. Il s’agit de l’essai ACompLi dont l’objectif est une meilleure compréhension des mécanismes de compétition chez l’igname. Les analyses sont toujours en cours. Mais les premiers résultats montrent plusieurs points intéressants. Tout d’abord, même en triplant la densité traditionnelle, les phénomènes d’auto-réduction (self-thinning) ne semblent pas apparaître (Figure 3.13). Cette absence d’augmentation de la mortalité avec l’augmentation de la densité pourrait-être due tout d’abord au mode de croissance lianescent de l’igname et dans une moindre mesure à la taille du matériel de plantation qui permet à la jeune plantule de se développer indépendamment du milieu durant les premiers stades développement.

Figure 3.13 : Influence de la densité et de l’arrangement spatial sur le taux d’auto-éclaircie chez l’igname (I : plant isolé, TC : densité traditionnelle arrangée en quinconce, T : densité traditionnelle et HD : haute densité).

Enfin, l’augmentation de la densité n’a pas ou peu d’effet sur le rendement parcellaire (Figure 3.14). Il semble qu’à densité traditionnelle, le seuil de maximum de production soit déjà atteint. En revanche, la taille des tubercules récoltés en dépit d’une variabilité importante, est fortement influencée par la


compétition. Il semble donc, pour une variété donnée, possible d’ajuster la taille moyenne des tubercules produits en jouant sur la densité. Que ce soit pour le rendement global ou pour la taille moyenne des tubercules, le traitement avec pression des mauvaises herbes (C) présente les performances les moins bonnes. Il semble donc que la compétition exercée par les plantes adventices soit supérieure à celle exercée entre plants d’ignames lorsqu’on triple la densité traditionnelle. L’étude des déterminants de la compétition, en cours, devrait permettre d’aboutir à la modélisation de la production individuelle et donc d’ouvrir des pistes de gestion de la production et de sa variabilité. Une deuxième année d’expérimentation est prévue en 2017.

Figure 3.14 : Influence de la densité et de l’arrangement spatiale sur le rendement et le poids moyen des tubercules d’igname (I : plant isolé avec paillage, TC : densité traditionnelle arrangée en quinconce avec paillage, T : densité traditionnelle avec paillage, HD : haute densité avec paillage et C : densité traditionnelle sans paillage).

3.1.3 Implication de la tétraploïdie sur le phénotype des ignames (CIRAD, INRA) Participants : D. Cornet1, R. Boisne-Noc1, R. Morillon1, E. Malédon1, E. Nudol1, G. Arnau1, P. Chopin2, D. Lange2, E. Francius², R. Tournebize2, M. Dulormne4. Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Caractérisation physiologique de la différenciation phénotypique (anatomie, croissance, développement, rendement) entre génotypes 2x, 3x ou 4x cultivés en serre et au champ. Résultats obtenus Une première expérimentation de terrain a été mise en place en 2016, regroupant 7 génotypes d’ignames (Tableau 3.2). Les récoltes se sont terminées fin février 2017.


Tableau 3.2 : Liste des variétés identifiées pour l’étude de l’influence du niveau de ploïdie sur la physiologie et les performances des ignames (D. alata)

Au total, cinq stages ont été supervisés dans le cadre de cette expérimentation (Tableau 3.2). Chaque stage a fait l’objet d’une présentation aux instituts de recherche concernés (Cirad, INRA).

Tableau 3.3 : Stages encadrés sur l’activité 3.1.3 durant la saison 2016-2017. Stagiaire Niveau Université Durée Sujet

Marcel Borher

M1 Université de Strasbourg

du 13 juin au 22 juillet 2016

Influence du niveau de ploïdie sur la physiologie des ignames : mesure de la taille et de la densité stomatique ainsi que des surfaces d’ostiole.

Clementine Masson

M1 Montpellier SupAgro

du 1er août au 11 septembre 2016

Influence du niveau de ploïdie sur la physiologie des ignames : mesures du taux photosynthétique, de la transpiration et de la conductance stomatique.

Clementine Masson

césure Montpellier SupAgro

du 12 septembre 2016 au 29 janvier 2017

Influence du niveau de ploïdie sur la physiologie des ignames et de la banane : mesures du taux photosynthétique, de la transpiration, de la conductance stomatique et des caractéristiques stomatiques.

Dimitri Bernier

L3 Université des Antilles

du 30 janvier au 23 février 2017

Influence du niveau de ploïdie sur les composantes du rendement chez l’igname.

Lafie Reva M1 Université des Antilles

du janvier au 23 février 2017

Influence du niveau de ploïdie sur les caractéristiques stomatiques et la taille des grains d’amidon de deux espèces d’intérêt au Antilles : l’igname et la banane.

La Figure 3.15 présente l’influence du niveau de ploïdie sur la densité et la taille des stomates. Nous observons une différence très hautement significative entre les individus diploïdes (qui présentent une densité élevée), triploïdes (qui présentent une densité intermédiaire) et les individus tétraploïdes (qui présentent une faible densité). Il y a donc une corrélation négative significative entre la densité stomatique et le niveau de ploïdie. Concernant la taille des stomates, nous notons une différence très hautement significative entre les diploïdes, triploïdes et tétraploïdes. En effet, les diploïdes présentent des stomates plus petits (en terme de longueur, largeur et surface). Inversement, les tétraploïdes présentent des stomates plus gros. Quant aux triploïdes, ils ont des tailles intermédiaires.

Nureangdan alata 25 Polyp2015 triploid VU760 202

Toufi tetea alata 25 Polyp2015 allotétraploid VU472 148

Noulelcae alata 25 Polyp2015 allotétraploid VU754 198

Sinoua alata 25 Polyp2015 diploid doublé VU528 160DD

Kinabayo alata 25 Irep diploid 96

Boutou alata Polyphene diploid

Goana alata 25 Volnin triploid 43

Code

CRBEspèce

Code

SPYN

Code

GemmaNom PloidieEssai Origine

Besoins

(kg)

POLYP


Figure 3.15 : Analyse inférentielle des caractéristiques stomatiques en fonction de la ploïdie chez 6 variétés de Dioscorea alata. Différentes lettres indiquent des différences significatives entre traitements (test de Tukey sur les moyennes des moindres carrés, P>0.001).

Nous notons ainsi, suite à nos analyses une corrélation positive significative entre la taille des stomates et le niveau de ploïdie et une corrélation négative significative entre la densité stomatique et la ploïdie (Figure 3.16). Des auteurs comme Babil et al. (2010), ont aussi mis en évidence cette forte corrélation entre la densité importante des petits stomates et un faible niveau de ploïdie. Toyohara et al. (2002) a démontré que les tétraploïdes de Dioscorea alata ont des stomates plus gros que les diploïdes et que cela implique une meilleure performance en culture.

Figure 3.16 : Influence de la ploïdie sur la hauteur des stomates (μm) en fonction de la densité stomatique (mm-²) chez 6 variétés de Dioscorea alata (Igname).

Afin de vérifier l’avantage comparatif que peut présenter chacune de ces situations (peu de gros stomates pour les tétraploïdes et beaucoup de petits stomates pour les diploïdes), nous avons mesuré les surfaces d’ostioles et multiplié cette valeur par la densité stomatique pour obtenir une estimation de la surface d’échange par unité de surface de feuille. La Figure 3.17 montre que la surface d’échange par unité de surface de feuille augmente significativement avec le niveau de ploïdie.


Figure 3.17 : Estimation de la surface d’échange par unité de surface de feuille chez 6 variétés d’igname. Différentes lettres indiquent des différences significatives entre traitements (test de Tukey sur les moyennes des moindres carrés, P>0.001).

Figure 3.18 : Mesure des échanges gazeux chez 7 variétés d’ignames (Dioscorea alata). A : taux photosynthétique, gs : conductance stomatique, E : taux de transpiration et WUE : efficacité d’utilisation de l’eau.

Dans un deuxième temps, nous avons mesuré les échanges gazeux à l’échelle de la feuille (


Figure 3.18). Les résultats obtenus et leur importante variabilité ne permettent pas de mettre en évidence d’influence du niveau de ploïdie sur les échanges gazeux à l’échelle de la feuille en condition optimale. Dans la littérature, l’avantage des polyploïdes se marque principalement en terme d’adaptation. C’est pourquoi nous prévoyons en 2017 de poursuivre ces mesures en incluant différents stress (mesures à CO2 doublé ou en stress hydrique).

Puisque que la ploïdie se traduit par un gigantisme cellulaire, observé notamment sur les stomates,

nous avons cherché à étudier son influence sur la taille et l’architecture de l’appareil aérien de

l’igname. La Figure 3.19 montre que la longueur des entrenœuds et la masse linéique sont

influencées positivement par le niveau de ploïdie alors que la taille des feuilles a tendance à

diminuer.

Figure 3.19 : Influence du niveau de ploïdie sur la taille et l'architecture de l'appareil aérien chez 6 variétés d'igname (D. alata).

Enfin, nous avons étudié l’influence du niveau de ploïdie sur les composantes du rendement : la taille

et le nombre de tubercule. Si le nombre de tubercules ne semble pas influencé par le niveau de

ploïdie, la taille des tubercules augmente proportionnellement avec ce dernier (Figure 3.20). Cette

augmentation de la taille des tubercules se traduit au final par une augmentation du rendement

(Figure 3.21).


Figure 3.20 : Influence du niveau de ploïdie sur la taille moyenne des tubercules chez 6 variétés d’igname (D. alata).

Figure 3.21 : Influence du niveau de ploïdie sur les rendements de 6 variétés d’igname (D. alata).

Les analyses de cette expérimentation sont toujours en cours et devraient permettre, via l’analyse

des efficacités (d’interception et d’utilisation du rayonnement), de mieux comprendre les

mécanismes à l’œuvre qui aboutissent à une meilleure performance des polyploïdes. Une deuxième

année d’observation, nécessaire avant de pouvoir conclure, est prévue en 2017.

WP3.2 Qualité physico-chimique des ignames (CIRAD) Participants : G. Arnau, E. Nudol, E. Maledon Activité/Méthode programmée sur 2015-2017: 25 variétés de D. alata présentant des qualités contrastées seront phénotypées pour leurs caractéristiques physico-chimiques (teneurs en matière sèche, sucres, amidons, protéines, cellulose). L’héritabilité au sens large de ces caractères sera


estimée. Des modèles de calibration seront recherchés pour une estimation en SPIR de ces composés sur la base de la variabilité des 25 variétés. Résultats obtenus Un essai a été mis en place en avril 2016 pour permettre de mener à terme les travaux prévus. Un total de 23 variétés de D. alata (Tableau 3.4) qui présentent des qualités contrastées ont été plantées en 12 répétions (3 billons x 4 répétitions). Les tubercules seront récoltés à maturité et conditionnés pour réaliser à la fois des analyses physico-chimiques (5 répétions par variété) et la calibration du SPIR sur les mêmes farines.


Tableau 3.4: liste des accessions de D. alata étudiées

WP3.3 Polyploïdie et adaptation des porte-greffes d’agrumes aux contraintes abiotiques (CIRAD, Univ. Antilles, ECOFOG4)

3.3.1 Adaptation de couples de porte-greffes 2x et 4x aux sols calcaires (CIRAD) Participants : R. Morillon, S. Bruyère, R. Boisne-Noc, P. Ollitrault Activité/méthode programmé sur 2015-2017: application d’une carence en fer sur des couples de porte-greffes 2x et 4x. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, dosages d’ions et dosages d’enzymes impliquées dans la réduction du fer. Résultats obtenus A : Etablissement des protocoles de carence ferrique sur génotypes ayant des propriétés de tolérances contrastées Des essais en situation de carence ferrique ont été réalisés à l’automne 2016 afin de mettre au point les protocoles nécessaires à l’expérimentation. Nous avons utilisé le mode opératoire proposé par Martinez-Cuenca et al., (2013). Des plants 2x de porte-greffes Poncirus Rubidoux connus pour être

Code Origen Nom Type Ploidie Type Groupe étude

accession géographique accession accession 1

floraison diversité 2

VU024 Vanuatu Ptris C 2 Mâle 3

VU613 Vanuatu Peter C 2 Mâle 6

VU639 Vanuatu Malalaghi C 2 Mâle 3

CT256 Benin Florido C 2 Mâle 7

Plim-G Guadeloupe Plimbite C 2 Mâle _

kin-G Guadeloupe kinabayo C 2 Femelle 2

Pac-P Guadeloupe Pacala C 2 Femelle 8

Kab-L Guadeloupe kabusah C 2 Mâle 3

STVB Guadeloupe St vincent blanc C 2 Femelle 4

STVV Guadeloupe St vincent violet C 2 Femelle 4

Div-PB Guadeloupe Divin C 2 Mâle _

VU760 Vanuatu Nureangdan C 3 _ 14

VU754 Vanuatu Noulelcae C 4 Femelle 16

VU231 Vanuatu Tagabé C 4 Mâle 18

VU472 Vanuatu Toufi Tetea C 4 Mâle 18

VU528DD Guadeloupe Sinoua C 4 _ _

74F Inde Hyb 2x-74F BRL 2 Femelle _

14M Inde Hyb 2x-14M BRL 2 Mâle _

4x-431 Guadeloupe Dou BRL 4 Femelle _

4x-105 Guadeloupe TiViolet BRL 4 Femelle _

4x-172 Guadeloupe Hyb 4x-172 BRL 4 Femelle _

4x-274 Guadeloupe Hyb 4x-274 BRL 4 Mâle _1C, Cultivars; BRL, Ligneés d'amélioration2 Groupes identifiés dans Arnau et al. 2017 PloSONE 12(3) e0174150


sensible à la chlorose ferrique ont été utilisés comme témoins négatifs. Nous avons également utilisé des plants 2x de porte-greffes de mandariniers Cléopâtre connus pour leur tolérance à la chlorose ferrique. Les plants ont été cultivés sur un milieu inerte (perlite + fibre de coco). Les plants témoins ont été irrigués avec une solution nutritive supplémentée de Fe-EDDHA 20µM. Les plants stressés ont été cultivés avec la même solution nutritive ne contenant pas de Fe-EDDHA. Au bout de 8 semaines, les plants stressés de Poncirus Rubidoux présentaient des symptômes de chlorose ferriques. Les mandariniers Cléopâtre ne présentaient pas de symptômes. B: Evaluation de couples 2x/4x en situation de carence ferrique Des plants de deux couples de porte-greffes 2x et 4x (Poncirus Rubidoux et citrandarin Mandarinier Cléopâtre x Poncirus Pomeroy) et de FLHORAG1 ont été préparés. Le matériel sera évalué en condition témoin (Fe-EDDHA 20µM) et en l’absence de Fe-EDDHA. Pour chaque condition et génotypes, 6 à 8 plants seront étudiés. L’étude sera réalisée dans le cadre du stage de Thomas Moutou, stagiaire de M1 du 17 avril au 16 juin 2017.

3.3.2 Etude de couples de porte-greffes 2x et 4x francs de pied ou greffés sous contrainte hydrique (CIRAD, ECOFOG) Participants : R. Morillon1, M. Dulormne4, D. Cornet1, S. Bruyère1, R. Boisne-Noc1, P. Ollitrault1. 3.3.2.1 Plants francs de pieds Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : application d’un déficit hydrique sur des porte-greffes 2x et 4x francs de pied. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, mesures des potentiels hydriques des feuilles et du sol au cours du stress, étude de l’expression de gènes impliqués dans l’osmorégulation cellulaire. De même, il est proposé de mettre au point la méthodologie pour les mesures d’hydraulique sur différents couples de plants 2x et 4x francs de pied. Résultats obtenus A : Evaluation des couples 2x/4x francs de pied sous contrainte hydrique Les travaux que nous avons menés sur la tolérance au déficit hydrique de génotype 2x et 4x francs de pied de citrange Carrizo viennent d’être acceptés pour publication (de Oliveria et al, 2017). Un second article sur l’implication des mécanismes d’osmorégulation au cours d’un déficit chez des génotypes 2x et 4x francs de pied de limettier Rangpur est en cours d’écriture. B : Mesures de conductance hydraulique sur agrumes franc de pied Des mesures de conductance hydrauliques racinaires, des parties aériennes et foliaires de plants 2x et 4x (citrandarin Mandarinier Cléopâtre x Poncirus Pomeroy, Poncirus Pomeroy) et Mandarinier 4x propagés par micro-bouturage in vitro par la société Agromillora en Espagne ont été réalisées à l’UMR PIAF à Clermont-Ferrand (séjour du Dr. Raphaël Morillon du 4/7 au 22/7/2016) en collaboration avec les Dr. Têté Barigha de l’INRA et Dr. Aurélie Gousset de l’Université Blaise Pascal. Ce séjour à Clermont a permis au Dr. Morillon de se former à ces techniques. Les premiers résultats montrent qu’en l’absence de stress, les paramètres qui caractérisent l’architecture hydraulique (CERt, Specific conductance: Ktotal/leaf, Ktotal/cross sectional, Kshoot/leaf, Kroot/leaf) sont similaires entre génotypes 2x et 4x. Seuls les paramètres CERt entre 2x et 4x de Poncirus et Kroot/leaf entre 2x et 4x de citrandarin Mandarinier Cléopâtre x Poncirus étaient légèrement différents (Figure 3.22). Ces résultats suggèrent que la différenciation phénotypique existante entre 2x et 4x affecte peu l’hydraulique de la plante. Toutefois,


il serait nécessaire de vérifier dans quelle mesure le stress hydrique ne conduit pas à des changements d’architecture hydraulique particuliers entre 2x et 4x. Ces résultats ont fait l’objet d’une présentation sous forme de poster au congrès international agrumes au Brésil (Dutral et al, 2016).

Figure 3.22: Mesures de conductances spécifiques (Ktotal /leaf, Ktotal/cross sectional area, Kshoot/leaf, Kroot/leaf) and CERt sur différents couples de 2x et 4x de porte greffes les lettres différentes indiquent une différence statistique entre 2x and 4x du même génotype (t-test, P ≤ 0.05). 3.3.2.2 Plants greffés Activité/méthode : application d’un déficit hydrique sur des porte-greffes 2x et 4x greffés avec du limettier 3x. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, mesures de potentiel hydrique et potentiel osmotique foliaire, de conductance hydraulique mais également dosages de proline. Résultats obtenus A : Préparation du dispositif expérimental en pot (déficit hydrique) 2x/4x lime 3x En 2015, des plants de porte-greffes ont été préparés comme décrit dans l’action 3.4.1 (rapport 2015). En 2016, une partie des porte-greffes (citrumelo 2x et 4x, FLHORAG1) a été greffée avec du limettier Tahiti (3x) et Limettier Antillais (2x) et limettier Mexicain (2x). Les arbres vont être prochainement


rempotés en pot de 50L. Ils seront étudiés sous contrainte hydrique à l’automne 2017 selon les protocoles déjà établis par Allario et al., (2013) et Oliveira et al. (2017).

3.3.3 Impact de la ploïdie sur le développement du porte-greffe dans le cadre de la mise en place d’un parc semencier (CIRAD) Participants : R. Morillon, S. Bruyère, D. Roques, P. Ollitrault Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Préparation de 6 couples 2x et 4x de porte-greffes. Pour chaque génotype, des associations porte-greffe/greffon (2x/2x, 2x/4x, 4x/4x, 4x/2x) seront plantées au champ afin d’évaluer l’impact de la polyploïdie sur le développement et la croissance des arbres. In fine ce dispositif pourra servir de parc semencier dans le cadre du schéma de production de plants d’agrumes sains (RITA). Résultats obtenus En 2015, des plants de porte-greffes ont été préparés et analysés comme décrit dans l’action 3.4.1 pour contrôler leur conformité génétique (rapport 2015). En septembre 2016, les porte-greffes 2x et 4x (citrumelo, citrange Carrizo, Citrus Vokameriana, citrandarin Mandarinier Cléopâtre x Poncirus Pomeroy), et FLHORAG1 ont été greffés afin d’obtenir les différentes associations porte-greffe-greffons (2x/2x, 2x/4x, 4x/4x, 4x/2x) nécessaires. Les arbres seront plantés au champ sur une parcelle du site CIRAD de Roujol en février 2017. Un suivi de croissance et l’estimation de quelques paramètres physiologiques seront effectués en 2017.

WP3.4 Impact de la polyploïdie et de l’environnement sur l’apomixie des porte-greffes d’agrumes

3.4.1 : comparaison de couples diploïdes/diploïdes doublés pour l’apomixie Participants : R. Morillon, S. Bruyère, R. Boisne-Noc, P. Ollitrault Activité-Méthode programmées sur 2015-2017 : 4 couples diploïdes/diploïdes doublés seront analysés : Citrumello 4475, Citrange Carrizo, Citrandarin Cleopatre x Poncirus et Volkameriana. Une centaine de plants de semis de chaque porte-greffe sera génotypée avec un minimum de 10 marqueurs héterozygotes (SNPs, méthode Kaspar) pour chaque porte-greffe. Les plants génétiquement conformes alimenteront les différents dispositifs d’essai de Cavalbio et du RITA. La variabilité phénotypique des plants zygotiques sera analysée pour identifier des critères de tri dans les pépinières commerciales. Résultats obtenus Des semis de quatre couples de porte-greffes diploïdes/tétraploïdes (citrumelo 4475, citrange Carrizo, citrandarin mandarinier Cléopâtre × Poncirus Pomeroy, Citrus Volkameriana) ont été réalisés à l’automne 2015. Les semences provenaient de Corse. Pour chaque cultivar, près d’une centaine de plants ont été repiqués en décembre. Le contrôle de la ploïdie ainsi que l’évaluation des taux de plants zygotiques (génétiquement non conformes) des Volkameriana 2x et 4x avaient été réalisés fin 2015. En 2016, une caractérisation génétique des plants de semis de Citrumello 4475, Citrange Carrizo, Citrandarin Cleopatre x Poncirus Pomeroy 2x et 4x a été réalisée avec les marqueurs SNP Kaspar diagnostiques de Poncirus développés durant la première année du projet. Ces marqueurs hétérozygotes (respectivement XY et XXYY) pour les porte-greffes 2x et 4x considérés permettent de


tester si les plants proviennent des embryons nucellaires et sont donc identiques à l’arbre mère ou s’ils sont issus d’embryons zygotiques, produit d’une fécondation. Dans une situation d’autofécondation (la plus défavorable pour détecter des plants zygotiques) la probabilité de ne pas identifier un plant zygotique à l’aide d’un marqueur hétérozygote est de 0.5 elle tombe à 0.002 (0.59) lorsque 9 marqueurs indépendants (un par chromosome) sont analysés. Pour les tétraploïdes la situation est plus complexe et la puissance du marquage moléculaire pour l’identification des zygotiques est fonction du mode de ségrégation (tetrasomique/disomique). Figure 3.23: illustration des résultats obtenus pour la population de porte-greffes 4x Citrumello 4475 en utilisant le marqueur 5P14956622. Vingt-cinq DSNPs de Poncirus répartis sur les 9 chromosomes ont été utilisés (Figure 3.23). Le taux de plants zygotiques est relativement bas (<6% ; Tableau 3.5) pour l’ensemble des porte-greffes considérés et compatible avec une propagation par semis de ces porte-greffes en pépinière, à l’exception du Citrumello 4475 tétraploïde (29.8%). Si ce dernier porte-greffe s’avère intéressant pour répondre aux contraintes de l’agrumiculture Guadeloupéenne, il conviendra de mettre en place une procédure de multiplication par micro bouturage in vitro. Les plants zygotiques identifiés ont été écartés des essais conduits dans le cadre du projet Cavalbio et du Rita ParadeHlb. Il ne semble pas y avoir d’effet systématique de la ploïdie sur le taux de niveau d’apomixie. Tableau 3.5: taux de plants zygotiques (génétiquement non conformes) dans les semis de sept porte-greffes

Citrange Carrizo

Citrumelo 4475

Citrandarin CleoxPonc

Citrandarin FLHORAG1

2X 1.10% 0% 5.90% 4X 3.60% 29.80% 2.40% 5.90%


3.4.2 : influence de l’environnement sur l’apomixie Participants : R. Morillon, S. Bruyère, R. Boisne-Noc, P. Ollitrault Activité-Méthode programmées sur 2015-2017 : Les taux d’apomixie dans des semences de FLHORAG1 (hybride somatique allotétraploïde entre mandarinier Commun et Poncirus Pomeroy, prometteur pour les enjeux de la Guadeloupe) provenant de Corse et de Guadeloupe seront comparés. Une centaine de plants de semis de chaque provenance sera génotypée avec un minimum de 10 marqueurs héterozygotes (SNPs, méthode Kaspar). Les plants génétiquement conformes alimenteront les différents dispositifs d’essai de Cavalbio et du Rita. La variabilité phénotypique des plants zygotiques sera analysée pour identifier des critères de tri dans les pépinières commerciales. Résultats obtenus En 2015, le niveau de ploïdie d’une centaine de plants de FLHORAG1 issus de semis (semences originaire de Guadeloupe) a été analysé par cytométrie en flux (cf 3.4.1). L’ensemble des plants étaient tétraploïdes. L’identification des plants zygotiques, au sein de ce même semis été réalisée en 2016 par marquage Kaspar a à l’aide des DSNPs Poncirus développés dans le WP1.1. Le taux de plants zygotiques observé est de 5.9% pour les plants obtenus à partir de semences produites en Guadeloupe. Courant 2017, de nouvelles semences de FLHORAG1 seront introduites à partir de Corse. Les mêmes analyses de génotypage seront réalisées sur les plants de semis obtenus. Il sera ainsi possible de comparer au cours de l’année 2017 l’impact d’environnements tropicaux et tempérés sur la conformité des semences générées (impact sur le niveau de ploïdie et sur le taux d’apomixie). Publications citées : Allario T, Brumos J, Colmenero-Flores JM, Iglesias DJ, Pina JA, Navarro L, Talon M, Ollitrault P, Morillon R. (2013) Tetraploid Rangpur lime

rootstock increases drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant Cell Environ. 36: 856-68. Dutra J, Rodrigues V, Barigah T, Ollitrault P, Gesteira A, Morillon R. Whole genome expression in diploid and doubled diploid citrus seedlings

in intra and interspecific contexts. International Citrus Congress 2016. Foz de Iguaçu, Brazil, Sept. 18 - 23, 2016. Curk F, Ancillo G, Ollitrault F, Perrier X, Jacquemoud-Collet JP, Garcia-Lor A, Navarro L, Ollitrault P. 2015. Nuclear Species-Diagnostic SNP

Markers Mined from 454 Amplicon Sequencing Reveal Admixture Genomic Structure of Modern Citrus Varieties. Plos ONE, 10(5): e0125628

Martínez-Cuenca M-R, Forner-Giner MA, Iglesias DJ, Primo-Millo Eduardo, Legaz F (2013). Strategy I responses to Fe-deficiency of two Citrus rootstocks differing in their tolerance to iron chlorosis. Scientia Horticulturae 153: 56–63

Oliveira TM, ben Yahmed J, Dutra J, Maserti BE, Talon M, Navarro L, Ollitraut P, Gesteira A, Morillon M. (2017). Better tolerance to water deficit in doubled diploid 'Carrizo citrange' compared to diploid seedlings is associated with more limited water consumption. Acta Physiologia Plantarum. Sous presse.


WP4 - Déterminant de la tolérance aux maladies Partenaires : CIRAD1, INRA2, Univ. Antilles C3MG3, ECOFOG4 Responsable WP : D Petro2 Le WP4 répond à l’objectif O5 pour les déterminants de la résistance/tolérance aux maladies. Ses objectifs spécifiques sont (i) le marquage de gènes de résistance à l’anthracnose des ignames par approche metaQTL sur des fonds génétiques diversifiés et (ii) l’étude de la réponse des agrumes polyploïdes au citrus greening en lien avec leur plasticité phénotypique. Les QTLs identifiés pour les résistances à l’anthrachnose de l’igname permettront durant la 2e phase du projet de développer des marqueurs diagnostics utilisables en sélection assistée par marqueurs (SAM) pour la construction de nouveaux hybrides porteurs d’une résistance durable fondée sur le cumul de divers gènes complémentaires (Hollomon and Brent, 2009, Brun et al., 2010). Durant cette même période, l’annotation des régions génomiques concernées permettra d’identifier des gènes candidats. Afin d’exploiter efficacement l’avantage suspecté de la polyploïdie sur la réponse des agrumes au HLB, en lien avec leur anatomie et une plus grande plasticité phénotypique (adaptation, résilience), les composantes anatomiques, physiologiques, biochimiques et moléculaires de la différenciation entre génotypes diploïdes et polyploïdes et la réponse physiologique au HLB de variété diploïdes/triploïdes et de porte-greffes diploïdes/tétraploïdes seront étudiées.

WP4.1 Marquage et utilisation de gènes de résistances à l’anthracnose des ignames (INRA2, CIRAD1). Trois populations biparentales de l’INRA et une population du CIRAD seront analysées pour diversifier les fonds génétiques et potentiellement les sources de résistance à l’anthracnose.

4.1.1 Génotypage des populations de l’INRA (INRA) Participants : D. Petro, W. Drack et P. Renac Activité-Méthode programmées sur 2015-2017 : un génotypage pangénomique (GBS) sera complété par des marqueurs SSRs afin d’améliorer l’ancrage des différentes cartes. Le génotypage de la population du Cirad est réalisé dans le cadre de l’action WP1.3 avec la même approche GBS.

4.1.2 Phénotypage de l’ensemble des populations (INRA2, CIRAD1). Participants : D. Petro, W. Drack, P. Renac, G. Arnau, E. Malédon Activité-Méthode programmées sur 2015-2017 : les populations seront introduites in vitro à partir de graines immatures pour permettre leur multiplication rapide par micropropagation. Le phénotypage sera réalisé à l’aide du test en conditions contrôlées développé à l’Inra (Onyeka et al. 2006b) Résultats obtenus Les expérimentations à conduire avec l’INRA n’ont pas pu débuter en 2016 en raison du retard dans le déblocage du financement attribué à l’INRA. Le phénotypage de la population du Cirad, à l’aide du test en conditions contrôlées développé par l’INRA, sera réalisé en 2017.


4.1.3 Méta-analyse de QTLs de résistance à l'anthracnose Participants : D. Petro, G. Arnau, W. Drack, P. Renac, E. Malédon Activité-Méthode : les populations seront analysées individuellement puis feront l’objet d’analyses metaQTLs. Résultats obtenus : Cette activité portée par l’Inra n’a pas débuté conformément au chronogramme.

WP4.2 Plasticité phénotypique et adaptation au Huanglongbing (HLB) chez les polyploïdes d’agrumes (CIRAD1, Univ. Antilles C3MAG3, ECOFOG4)

4.2.1 Caractérisation écophysiologique d’orangers sur 4 couples de porte-greffes 2x/4x dans différents contextes pédoclimatiques de Guadeloupe sous contrainte HLB (CIRAD) Participants : R. Morillon, R. Boisne-Noc, S. Bruyère, P. Ollitrault Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Etudes physiologiques sur vergers de 4 couples de porte-greffes 2x et 4x greffés avec de l’oranger (dispositif RITA ; partenariat ASSOFWI et INRA). Quantification par PCR de l’infection des plants par le HLB. Caractérisation physiologique (mesures de croissance, conductance stomatique, photosynthèse, Fv/Fm, indice SPAD, dosage d’amidon dans les feuilles). Résultats obtenus En 2015, les porte-greffes nécessaire aux essais ont été préparés et leur conformité génétique analysée dans le cadre de l’action 3.4.1 (rapport 2015). Le matériel végétal a été greffé avec de l’oranger en septembre 2016 et sera planté au champ en janvier 2017 sur une parcelle du site CIRAD de Neufchâteau. Compte tenu des retards dans la signature des conventions RITA, la plantation de la parcelle à Vieux Habitants (Assofwi) a été repoussée. La quantification de l’infection des plants par le HLB et leur caractérisation physiologique sera réalisée en 2017 pour la parcelle de Neufchâteau.

4.2.2 Caractérisation anatomique et physiologique de limes 2x et 3x greffées sur porte-greffes 2x et 4x (CIRAD, Univ. Antilles C3MAG, ECOFOG) Participants : R. Morillon1, S. Bruyère1, R. Boisne-Noc1, P. Ollitrault1, M. Dulormne4, O. Gros3, JL Mansot3 Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : Caractérisation physiologique (mesures de croissance, conductance stomatique, photosynthèse, Fv/Fm, indice SPAD et de conductance hydraulique) de différentes associations porte-greffe/greffon: 2x/2x, 2x/3x, 4x/2x, 4x/3x ayant poussées en serre ou au champ sous contrainte HLB. Quantification par PCR de l’infection des plants au champ par le HLB. Caractérisation par microscopie à balayage de l’ultrastructure des vaisseaux du phloème entre 2x, 3x et 4x de plants témoins et de plants infectés par le HLB. Etude d’expression (PCR quantitative) pour des gènes candidats impliqués dans la détoxication cellulaire et les mécanismes de résistance systémique induite.


Résultats obtenus A : Evaluation au champ de l'impact de la ploïdie du porte-greffe sur la tolérance au HLB: En 2015, des plants de porte-greffes de citrumelo 2x et 4x et de FLHORAG1 ont été greffés avec deux cultivars de limettiers 2x (Antillais et Mexicain) et 3x (Tahiti). Ils ont été plantés sur une parcelle du site CIRAD de Neufchâteau en décembre 2015. En 2017, le statut sanitaire du matériel végétal sera évalué à l‘aide de kits de détection du HLB. Une fois que les arbres infectés par les psylles auront été identifiés, il sera possible d’évaluer l’impact de la ploïdie du greffon mais également du porte-greffe sur la tolérance à la maladie. B : Etablissement des protocoles de biologie moléculaire pour mettre en évidence l'infection des plants par le HLB : En 2015, des observations réalisées sur des parcelles commerciales ont montré que le cultivar de limettier 3x (Tahiti) est beaucoup moins affecté par la maladie que les 2x respectifs. En 2016, nous avons évalué la sensibilité des kits moléculaires de détection du HLB. L’amplification LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) est décrite comme étant une méthode quantitative. Nous avons donc réalisé différents tests (notamment dilutions avec différents échantillons) afin de vérifier la fiabilité des kits et de la machine utilisée (Figure 4.1).

Figure 4.1 : Exemples d’amplifications obtenus par la méthode LAMP. Différents niveaux d’amplification sont mis en évidence suggérant différents niveaux de présence de la bactérie. Les analyses réalisées montrent que les kits et la machine permettent d’identifier rapidement et simplement la présence de la bactérie dans un échantillon. Toutefois, les différents tests réalisés montrent que la méthode ne permet pas une reproductibilité quantitative fine des analyses. Une fiche innovation à destination des partenaires du RITA PARADE-HLB (FREDON, ASSOFWI, IT2) a été réalisée afin d’expliquer la méthode et son intérêt pour le suivi sanitaire des parcelles.


C : Etablissement des protocoles pour préparation des échantillons à analyser par microscopie à balayage En 2015 nous avons réalisé des essais préliminaires au laboratoire C3MAG (contact : Prof. O. Gros) de l’Université des Antilles afin d’identifier les paramètres importants pour la préparation des échantillons d’agrumes que nous souhaitons analyser par microscopie à balayage. En 2016, les analyses en microscopie ont été poursuivies dans le cadre du stage de Master II de Cécile Lony. L’ensemble des protocoles pour les analyses microscopie à balayage sur échantillon d’agrumes est opérationnel. C. Lony a également été impliquée dans les analyses physiologiques, écophysiologiques et biochimiques du matériel polyploïde sous contrainte HLB. D : Analyse physiologique et écophysiologique du comportement de limettiers 2x et 3x En 2016, deux cultivars de limetiers 2x (limettier Mexicain) et limettiers 3x (limettier Tahiti) greffés sur des porte-greffes de citrumelo 2x et 4x ont été évalués au niveau physiologique, en l’absence de stress et ont permis une analyse de la différenciation phénotypique entre les deux génotypes (données non présentées). Dans un second temps, les deux cultivars de limettiers greffés ont été évalués sous contrainte HLB. En condition de stress HLB, nous avons pu mettre en évidence que les arbres de limettier Tahiti 3x présentaient généralement beaucoup moins de symptômes de chlorose / marbrure que le limettier Mexicain 2x (Figure 4.2)

Figure 4.2 : Illustration des chloroses induites par la maladie du HLB sur une feuille de limettier Tahiti

(A) et limettier Mexicain (B).

Des mesures de conductance stomatique (gs), de photosynthèse (A) et de transpiration (E) ont été réalisées sur des plants infectés (Figure 4.3). Les valeurs mesurées chez les limettiers Mexicains (2x) se sont révélées être systématiquement inférieures à celles des limettiers Tahiti (3x) suggérant que ces derniers étaient moins affectés par la maladie (en condition contrôle les profils des deux génotypes étaient non significativement différents).

A B


Pho

tosy

nthè

se, A

(µm

ol m

-2 s

-1)

3

4

5

6

7

Con

duct

ance

sto

mat

ique

, gs

(m

mol

m-2

s-1

)

100

120

140

160

180

200

220

240

PAR (mmol m-2 s-1)

200 400 600 800 100012001400160018002000

Tra

nspi

rati

on,

E

(mm

ol m

-2 s

-1)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Lim ettier Mexicain Lim ettier Tahiti

a a

aa

a

a

b ba

bb

a

a

a a

b

b

b b

aa

a

a

bb

bb

b

Figure 4.3 : Mesures de conductance stomatique (gs), de photosynthèse (A), de transpiration (E), réalisées sur des feuilles infectées des deux cultivars de limettiers Mexicain (2x) et Tahiti (3x), en fonction de l'intensité lumineuse imposée.

E : Analyse par microscopie à balayage du phloème de tissus de pétiole de feuilles 2x et 3x (plants issus de serre –témoins non infectés- et provenant d’arbres infectés du terrain) Les analyses par microscopie à balayage (Figure 4.5) montrent que la taille des cellules des vaisseaux du phloème des limettiers Tahiti (3x) est plus grande que celles des limettiers mexicains (2x). Il en est de même pour la taille des cribles au travers des parois. L’analyse des vaisseaux d’échantillons infectés par le HLB montre la présence de dépôt de callose au niveau des cribles des deux génotypes. Toutefois ceux-ci paraissent moins obstrués chez les limettiers Tahiti (3x) que chez les limettiers Mexicain (2x).


Figure 4.5 : Coupes transversales de pétiole de limettier Mexicain (2x) et Tahiti (3x), témoins et infectés par le HLB, observées au microscope à balayage. Les flèches illustrent la présence des cribles dans les parois des cellules permettant leur mise en relation. F : Analyse biochimique d’échantillons de feuilles 2x et 3x (plants issus de serre –témoins non infectés- et plants infectés du terrain) En 2016, des analyses de biochimie ont été réalisées avec le laboratoire de biochimie du CIRAD de Neufchâteau dirigé par le Dr. P Brat. Les dosages d’amidon ont permis de montrer que le HLB induit une synthèse accrue (x10 environ) dans les échantillons infectés. Toutefois, il n’a pas été mis en évidence de différence significative entre le limettier Tahiti (3x) et le limettier Mexicain (2x) ; (Tableau 4.1). Tableau 4.1 : Mesures de la concentration d’amidon en mg/g de matière fraiche dans des feuilles témoins et infectées de limettiers Mexicain et Tahiti.

Limettier Mexicain Limettier Tahiti

TEMOIN 0.63 0.21 a 1.30 0.24 a HLB + 9.24 0.10 b 10.85 0.35 b

Enfin des mesures des contenus en H2O2, qui est un marqueur de stress oxydatif, ont été réalisées. Le travail a été complété par des mesures de l’activité enzymatique d’enzymes impliqués dans les processus de détoxication cellulaire tel que la Catalase. Les analyses ont été réalisées sur des échantillons de feuilles de limettiers Mexicain (2x) et Tahiti (3x) témoins et infectés. Un stress oxydatif a été induit par le HLB chez les deux génotypes, la concentration en H2O2 induite par le stress étant supérieure chez le limettier Tahiti (3x) à celle du limettier Mexicain (2x). Il est à noter toutefois qu’en situation témoin les quantités de H2O2 étaient également supérieures chez le 3x. Enfin les analyses des activités enzymatiques de la CAT ont montré une plus forte induction chez le limettier Tahiti (3x) suggérant l’induction de mécanismes de détoxication plus efficace chez ce génotype (Tableau 4.2).

Limettier Mexicain témoin Limettier Tahiti témoin

50 µm

50 µm

Limettier Mexicain HLB + Limettier Tahiti HLB +

50 µm

50 µm


Tableau 4.2 : Dosage d’indicateur du stress oxydatif (concentrations en peroxyde d’hydrogène (H2O2), et activités enzymatiques de la Catalase (CAT) sur des feuilles témoins et infectés de limettiers Mexicain et Tahiti.

L. Mexicain L. Tahiti

[H2O2] en nmol / g de MF

TEMOIN 8.384 0.002 a 12.045 0.007 b

HLB + 13.090 0.004 c 20.837 0.007 d

[Cat] en mol / g de MF

TEMOIN 1.2 0.00 a 1.6 0.00 b

HLB + 2.4 0.00 c 5.1 0.00 d

En conclusion, ces différents résultats montrent que le métabolisme du limettier Tahiti (3x) est moins affecté par le HLB que le limettier Mexicain (2x). Des cribles de plus grande taille et une détoxication plus efficace chez le limettier Tahiti (3x) pourraient contribuer, au moins pour partie, à la meilleure tolérance de ce génotype. Rapport de stage & Fiche innovation cités : -Stage de Cécile Lony : « Caractérisation de l’impact de la polyploïdie chez les agrumes sur la tolérance au Huanglongbing ». (2016). Stage de Master II, SV-ECOBIOVALO : Sciences Végétales– ECOproduction et BIOVALOrisation Université 45p. - Fiche innovation à destination des partenaires du RITA: L’amplification « LAMP », une méthode simple et rapide pour caractériser le statut sanitaire de plants d’agrumes et des psylles vis-à-vis du Huanglongbing (HLB).


WP 5- Caractérisation de séquences virales endogènes Partenaires INRA2, CIRAD1, Responsable WP : M. Umber2 et Pierre-Yves Teycheney1 Participants : M. Umber, P. -Y. Teycheney, C. Pavis, D. Filloux et équipes techniques. Le WP5 répond à l’objectif O6. Il vise à caractériser au plan moléculaire les séquences virales endogènes (EVE) présentes dans les génomes des ignames en utilisant les ressources génétiques du CRB-PT et à évaluer le risque infectieux lié à la présence d’EVE chez les ignames. L’élucidation de la structure des EVE se base à la fois sur l’analyse de banques BAC et sur le séquençage de clones BAC positifs après hybridation moléculaire à l’aide de sondes virales. Cette action est structurée en 5 sous actions qui s’organisent de manière successive afin de caractériser les EVE des ignames, dont la connaissance est bien moins avancée que celle des EVE de bananiers. Les deux premières sous actions (5.1 et 5.2) sont conduites en interaction avec l’INRA de Toulouse et l’UMR BGPI (CIRAD Montpellier) pour le criblage des banques BAC et l’analyse des séquences obtenues, les trois suivantes (5.3, 5.4 et 5.5) en partenariat avec le CRB-PT pour l’évaluation des ressources génétiques Dioscorea du CRB-PT et la mise en place des populations nécessaires au suivi du potentiel d’activation de ces insertions.

5.1 Criblage des banques BAC (INRA/CIRAD) Participants : M. Umber, P.-Y. Teycheney, D. Filloux, R.-M. Gomez Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Evaluation de la diversité des EVE présents dans le génome d’hybrides de D. alata, D. cayenensis-rotundata et D. trifida. Criblage des banques correspondantes avec cette diversité et séquençage des clones BAC positifs. Résultats obtenus Les banques BAC D. alata (accession Oriental) et D. trifida (accession Lac Bleu) ont été criblées respectivement à l’aide de 5 sondes et 2 sondes virales correspondant à des espèces virales (non Badnavirus) de la famille Caulimoviridae appartenant à deux clades différents. Au total, une soixantaine de clones se sont avérés positifs en hybridation. Des PCR de vérification ont été réalisées sur ces clones à l’aide des amorces ayant servi à synthétiser les sondes utilisées pour les hybridations moléculaires : 3 clones BAC D. alata et 3 clones BAC D. trifida négatifs en PCR ont été écartés de la suite des expérimentations. Parmi les clones restant, 10 clones D. alata et 6 clones D. trifida ont été sélectionnés pour séquençage complet. Ce dernier est en cours au Centre National de Ressources Génomiques Végétales (CNRGV) de l’INRA de Toulouse.

5.2 Analyse structurale des EVEs présents dans les trois espèces principales de l’igname (INRA/CIRAD) Participants : M. Umber, P.-Y. Teycheney, D. Filloux Activité/méthode programmée sur 2015-2017 : Analyse in silico des EVE à partir des clones BAC obtenus en 5.1 afin d’en déterminer la structure génétique. Résultats obtenus


Une séquence du génome D. alata (accession: PRJEB10904), obtenue par une approche shotgun, est disponible sur GenBank. Elle a été utilisée pour y rechercher in silico des séquences endogènes d’espèces Badnavirus connues. Des analyses de type Megablast ont permis d’identifier une multitude de contigs de petite taille contenant des séquences d’une espèce Badnavirus récemment publiée, Dioscorea bacilliform RT virus 1 (DBRTV 1 ; Bömer et al. (2016), Viruses 8 : 188), avec des pourcentages d’homologie supérieurs à 95%. Des analyses complémentaires de type Blast N ont pour leur part permis d’identifier dans le génome D. alata le génome viral complet d’une espèce Badnavirus présentant 70% d’homologie avec DBRTV 1, qui correspond à l’espèce virale #15, dont le génome partiel est décrit par Bömer et al. (2016). Ce résultat a donc non seulement permis d’établir la séquence complète du génome DBTRV 1, mais également d’identifier pour la première fois la totalité d’un génome viral intégré dans le génome d’une igname. Ces travaux feront l’objet d’une publication en 2017.

5.3 Reséquençage de 10 accessions Dioscorea pour évaluer la diversité des EVE (INRA/CIRAD) Participants : M. Umber, P.-Y. Teycheney, C. Pavis, R.-M. Gomez Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Choix de 10 accessions de référence parmi les ressources Dioscorea. Reséquençage des EVEs de ces 10 accessions en se basant sur les résultats obtenus en 5.2. Résultats obtenus : la séquence assemblée et annotée du génome D. rotunsata-cayenensis n’étant toujours pas disponible, cette activité a dû être reportée.

5.4 Criblage des ressources génétiques Dioscorea du CRB-PT (INRA/CIRAD) Participants : M. Umber, P.-Y. Teycheney, C. Pavis, R.-M. Gomez, S. Gélabale Activité/méthode programmées sur 2015-2017: Création de marqueurs discriminant les différentes EVE identifiées. Criblage des accessions Dioscorea du CRB-PT et établissement d’une carte d’identité précise de chacune d’entre elles. Résultats obtenus : début d’activité programmé en 2018.

5.5 Suivi du potentiel d’activation des EVE présents chez l’igname (INRA/CIRAD) Participants : M. Umber, P.-Y. Teycheney, C. Pavis, R.-M. Gomez, S. Gélabale Activité/méthode programmées sur 2015-2017 : création de populations d’hybrides interspécifiques D. alala x D. trifida. Suivi de l’apparition de particules virales grâce aux méthodes d’indexation des Badnavirus pour déterminer l’infectiosité de chaque insertion. Résultats obtenus : L’activité qui devait être initiée en novembre 2016 n’a pu débuter, en raison du retard dans le déblocage du financement attribué à l’INRA.


WP 6- Valorisations économiques des innovations variétales

Partenaires INRA2, CIRAD1 Responsable WP : Jean-Marc Blazy2 Le WP6 répond à l’objectif O7 du projet. Il est structuré en deux sous WP. Les objectifs spécifiques du WP6.1 sont (i) d’évaluer les besoins en termes de plants de qualité d’ignames et les préférences des agriculteurs pour différents traits variétaux, compte tenu de l’importance de la culture dans leurs systèmes de production, des modes de culture pratiqués, des circuits de commercialisation empruntés et (ii) d’évaluer les différentes modalités d’adhésion à un schéma de multiplication-diffusion de plants sains d’ignames et d’agrumes par les agriculteurs (préférences pour différentes formes de diffusion des plants sains d’ignames : mini-set, boutures, plants issus de vitroplants, microtubercules in vitro, ainsi que les conditions optimales de l’adhésion à ces deux schémas de filière de plants (coût des plants selon leurs modes de diffusion, formes de contractualisation possibles avec les opérateurs de la filière, types d’aide possibles, possibilités de labellisation des plants, suivi technique des variétés diffusées).

WP6.1 Modélisation ex-ante des attentes et préférences des agriculteurs en matière d’innovations variétales (INRA2, CIRAD1). Participants : J.M. Blazy2, L. Guindé2, F. Causseret2, D. Cornet1 Activité-Méthode : (i) Organisation de « focus group » pour identifier les critères clés de l’adoption ; (ii) Construction de deux plans d’expériences de choix pour l’analyse conjointe ; (iii) Enquêtes sur un échantillon d’agriculteurs (n=200 pour l’igname, n= 50 pour les agrumes) et mise en œuvre des expériences de choix; (iv) Modélisation économétrique des préférences des producteurs pour les caractéristiques des nouvelles variétés ainsi que pour différentes modalités de schéma de multiplication-diffusion de plants sains. Résultats obtenus : cette action portée par l’INRA n’a pu débuter, en raison du retard dans le déblocage du financement attribué à l’INRA.

WP6.2 Impacts économiques des innovations pour le territoire (INRA) Participants : J.M. Blazy2, L. Guindé2, F. Causeret2 Activité-Méthode : un modèle d’offre agricole à l’échelle du territoire guadeloupéen sera utilisé. Ce modèle de programmation mathématique d’optimisation sous contraintes permettra d’intégrer des itinéraires techniques de production d’ignames et d’agrumes de manière explicite. L’allocation des itinéraires techniques est à l’échelle parcellaire. La prise de décision est modélisée à l’échelle de l’exploitation agricole. Une agrégation est ensuite réalisée au niveau du territoire guadeloupéen pour simuler le marché dans son ensemble. Le modèle sera paramétré pour le volet agricole avec les données biotechniques obtenus dans le WP6.1 et les autres WPs de Cavalbio. Pour le volet consommation, nous nous appuierons sur les données acquises dans le cadre de la thèse de Carla Barlagne (thèse soutenue et financée par le FEDER précédent) sur l’igname ainsi que sur des suivis de prix des agrumes. Résultats obtenus : cette action à laquelle ne contribue pas le CIRAD est programmée à partir de janvier 2017.


Indicateurs qualitatifs et quantitatifs (année 2016)

Matériel végétal innovant

122 hybrides de D. alata par croisement 2x X 4x

96 hybrides triploïdes citronnier 2x X limettier 4x

116 plantes issues d’hybridation tetrazyg Volkameriana 4x X Citrumello 4475 4x

115 plantes issues d’hybridation tetrazyg Volkameriana 4x X Citrandarin Ponc x Cleo 4x

Marqueurs et ressources moléculaires

Données GBS sur 48 variétés d’ignames

7836 SNPs identifiés et 192 marqueurs sélectionnés pour le développement de marqueurs KASPar sur Ignames

Référentiel de 14926 SNPs diagnostiques des taxons ancestraux des agrumes

Données GBS sur 120 hybrides de (citronnier 2x) X (lime 4x)

Accueils de stagiaires Marcel Borher (M1, Université de Strasbourg, du 13 juin au 22 juillet 2016) : Influence du niveau de

ploïdie sur la physiologie des ignames : mesure de la taille et de la densité stomatique ainsi que des surfaces d’ostiole.

Clementine Masson (M1, Montpellier SupAgro, du 1er août au 11 septembre 2016) : Influence du niveau de ploïdie sur la physiologie des ignames : mesures du taux photosynthétique, de la transpiration et de la conductance stomatique.

Rafaelle Reumaux (M2, Université de Copenhague, du 15 avril au 15 octobre 2016) : Etude de l’influence de la densité de plantation sur la compétition intraspécifique de l’igname en Guadeloupe

Christian Tshimanga (M2, Université de Picardie Jules Verne, du 2 mai au 31 août 2016) : Mise au point méthodologique et caractérisation variétale de la compétitivité des ignames vis-à-vis des plantes adventices

Clementine Masson (césure, Montpellier SupAgro, du 12 septembre 2016 au 29 janvier 2017) : Influence du niveau de ploïdie sur la physiologie des ignames et de la banane : mesures du taux photosynthétique, de la transpiration, de la conductance stomatique et des caractéristiques stomatiques.

Boris Palud (BTS, EPLEFPA, septembre 2016) : Techniques d’échantillonnages pour la mesure des traits d’architecture et de biomasse chez l’igname dans une expérimentation sur la compétition interplante.

Dimitri Bernier (L3, Université des Antilles, du 30 janvier au 23 février 2017) : Influence du niveau de ploïdie sur les composantes du rendement chez l’igname.

Lafie Reva (M1, Université des Antilles, du janvier au 23 février 2017) : Influence du niveau de ploïdie sur les caractéristiques stomatiques et la taille des grains d’amidon de deux espèces d’intérêt au Antilles : l’igname et la banane.

J. Castro (M1 en Biologie. Université de Barcelone, Espagne, octobre 2015- mars 2016). Contribution au développement d’une carte génétique de référence de l’igname D. alata à l’aide de marqueurs SNP et microsatellites.

JF Nadeau (Licence en Biologie moléculaire et cellulaire. Université de Sherbrooke, Quebec, septembre-décembre 2016). Contribution à la cartographie du génome de l’igname D. alata à l’aide de marqueurs SNP et microsatellites. Stage financé sur projet Africa-Yam.


MF Bossanyi (Licence en Biologie moléculaire et cellulaire. Université de Sherbrooke, Quebec. Septembre-décembre 2016). Contribution à la cartographie du génome de l’igname D. alata à l’aide de marqueurs SNP et microsatellites. Stage financé sur projet Africa-Yam.

Cécile Lony (Master II, SV-ECOBIOVALO : Sciences Végétales– ECOproduction et BIOVALOrisation Université Rouen Caen) : Caractérisation de l’impact de la polyploïdie chez les agrumes sur la tolérance au Huanglongbing.

Houssem Rouiss (Thèse de Doctorat, Université Polytechnique de Valencia, Espagne ; Octobre-décembre 2016). Biologie de la reproduction et polyploïdie chez les agrumes. Séjour financé par le MES (Espagne)

Publications Oliveira TM, ben Yahmed J, Dutra J, Maserti BE, Talon M, Navarro L, Ollitraut P, Gesteira A, Morillon

M. (2017). Better tolerance to water deficit in doubled diploid 'Carrizo citrange' compared to diploid seedlings is associated with more limited water consumption. Acta Physiologia Plantarum. Sous presse.

Sheela, MN., Abhilash, PV., Asha, KI., Arnau, G. 2016. Genetic diversity analysis in greater yam (Dioscorea alata L.) native to India using morphological and molecular markers. Acta Horticulturae 1118, 51-58.

Umber M., Gomez R.M., Gelabale S., Lange D., Bonheur L., Pavis C., Teycheney P.Y. (2016) Dioscorea bacilliform TR virus, a member of the genus Badnavirus infecting Dioscorea spp., shed light on endogenous Dioscorea bacilliform viruses. Arch. Virol. 162: 517-521

Présentation dans des colloques internationaux

Arnau, G., Maledon, E., Nudol, E., Gravillon, MC. 2016. Progress and challenges in genetic improvement of yam (Dioscorea alata L.). First World Congress on Root and Tuber Crops. WCRTC, 18-24 January 2016, Nanning, Guangxi, Chine.

Arnau, G., Lopez-Montes A., Maledon, E., Nudol, E. 2016. Meta-QTL analysis of the genetic control of quality related traits in Yam (Dioscorea alata L) [Poster]. First World Congress on Root and Tuber Crops. WCRTC, 18-24 January 2016,

Bruyère S., Luro F., Froelicher Y., Morillon R., Ollitrault P. 2016. Poncirus phylogenetic diagnostic SNPs markers are useful to analyse zygotic rates in diploid and tetraploid Citrus x Poncirus rootstock seedlings. In: Mattos Dirceu (ed.), Fermino Carlos Eduardo (ed.), Moreira Novelli Valdenice (ed.), Alves de Azevedo Fernando (ed.), Della Coletta Filho Helvécio (ed.), Vicente Contador Zaccheo Paulo (ed.). Abstract book Sustainable citriculture: the role of applied knowledge. Londrina: IAPAR, p. 125-125 International Citrus Congress, 2016-09-18/2016-09-23, Foz do Iguaçu (Brésil).

Chaïr, H., Scarcelli, N., Arnau, G., Pavis, C., Akakpo., Dansi, A., Petro, D., Alix, K., Lebot, V., Vigouroux, Y. 2016. CIRAD, IRD and INRA Yam genomic initiatives: unlocking genetic diversity and accelerating yam breeding. XXIV International Plant and Animal Genome Conference, 9-13 January 2016, San Diego, California.

Champoiseau P., Lévy L., Osseux J., Petro D., Tournebize R., Arnau G., Maledon E., Nudol E., Cornet D. 2016. A Yam collaborative selection plateform in Guadeloupe: a model for effective multipartenarial and participative program. 52nd Congress of the Caribbean Food Crop Society, CFCS, 10-16 July, Gosier, Guadeloupe.

Dutra J., Rodriguez V., Gesteira A., Ollitrault P., Morillon R. 2016. Whole genome expression in diploid and doubled diploid citrus seedlings in intra and interspecific contexts. In: Mattos Dirceu (ed.), Fermino Carlos Eduardo (ed.), Moreira Novelli Valdenice (ed.), Alves de Azevedo Fernando (ed.), Della Coletta Filho Helvécio (ed.), Vicente Contador Zaccheo Paulo (ed.).


Abstract book Sustainable citriculture: the role of applied knowledge. Londrina: IAPAR, p. 178-178 International Citrus Congress, 2016-09-18/2016-09-23, Foz do Iguaçu (Brésil).

Ollitrault P., Curk F., Ollitrault F., Garcia-Lor A., Navarro L., Morillon R. 2016. Usefulness of phylogentic diagnostic SNP markers of citrus ancestral taxa for genetics and breeding. In: Mattos Dirceu (ed.), Fermino Carlos Eduardo (ed.), Moreira Novelli Valdenice (ed.), Alves de Azevedo Fernando (ed.), Della Coletta Filho Helvécio (ed.), Vicente Contador Zaccheo Paulo (ed.). Abstract book Sustainable citriculture: the role of applied knowledge. Londrina: IAPAR, p. 126-127 International Citrus Congress, 2016-09-18/2016-09-23, Foz do Iguaçu (Brésil).

Reumaux R., Chopin P., J. Weiner, Tournebize R., Cornet D. 2016. Interplant competition and its consequences for a vining and creeping crop: The example of water yam (Dioscorea alata). Euroleague for life sciences Conference, 11-12 November 2016, Hohenheim, Germany.

Les posters présentés au congrès international de citriculture (Brésil) sont en annexe 3.

Communication auprès du grand public Agrumes

A) Fiche innovation à destination des partenaires du RITA (annexe 4):

« L’amplification « LAMP », une méthode simple et rapide pour caractériser le statut sanitaire de plants d’agrumes et des psylles vis-à-vis du Huanglongbing (HLB).

B) Action partenariale à l’occasion des manifestations dans le cadre du Joli mois de mai de l’Europe : « Les acteurs de la recherche, du développement et de la filière se mobilisent pour une relance de l’agrumiculture guadeloupéenne sous contrainte HLB ». Communication vers le grand publique et les institutionnels (Région; DAF) sur les activités de recherche et recherche/développement sur agrumes conduites en Guadeloupe en réponse à la crise HLB. En particulier, réalisation de cinq posters pour illustrer les recherches réalisées dans le cadre du Feder (annexe 5):

Le CIRAD s’engage autour des enjeux de l’agrumiculture des Antilles Françaises confrontée à la crise du citrus greening

Des porte-greffes chez les agrumes, pour quoi faire ?

Impact de la ploïdie sur la tolérance des agrumes aux stress biotiques et abiotiques

Le programme d’amélioration des porte-greffes d’agrumes au CIRAD

Diversification des limettiers triploïdes pour une tolérance accrue au HLB, un étalement des productions et une valeur santé améliorée

C) Reportage télévisé sur la collaboration entre les équipes Cirad de San Giuliano (Corse) et de Roujol (Guadeloupe) autour du projet intégré de lutte contre le HLB en Guadeloupe. Reportage diffusé sur France 3 Corse ViaStella_19/20 Corsica Sera le 28/03/2016 et en Guadeloupe sur France O, Journal de la Guadeloupe le 24/03/2016. Ignames A) Création d’un forum de discussion autour de la collection de travail igname (http://www2.antilles.inra.fr/colziyanm/). Ce forum est ouvert aux chercheurs et techniciens sur inscription. B) Présentation des résultats concernant l’influence de la densité sur la compétition interplante chez l’igname au comité technique du projet Prodimad (RITA).

http://www2.antilles.inra.fr/colziyanm/


Annexe 1

Etat d’avancement au 31 décembre 2016

par rapport aux livrables


Libellé Descriptif et livrables Date de début

Date de fin

Activités réalisées %

réalisation totale

Respect chrono.

Développement de ressources moléculaires et dynamique de la diversité

Développement de marqueurs moléculaires SNPs et caractérisation des collections

1.1.1 SNP mining chez l’igname

Analyse GBS (APEK1) de 48 variétés d'ignames

nov-15 déc-16

Constitution de banques GBS (PstI/MspI) de 47 variétés d'Ignames D. alata + 1 D. rotundata Séquençage Illumina HiSeq3000 Analyse des données de séquençage (pipe-line Tassel) 158695 polymorphismes SNP identifiés 3665 sites retenus sur paramètre qualité

100% Oui ==> base de données de polymorphisme SNP et Indel

1.1.2 SNP mining chez les agrumes

Mining in silico de SNPs à partir de séquence Sanger d'amplicons de divers Citrus et Poncirus (données de séquences pré-existantes); sélection de SNPs utiles pour l’étude des hybrides intergénériques Citrus x Poncirus utilisés dans Cavalbio pour l’amélioration des porte-greffes.

avr-15 déc-15

Séquençes de 45 fragments de gènes (5 par chromosomes); 6 génotypes Sélection de 44 DSNPs Poncirus

Identification de 14926 SNPs diagnostiques des taxons quatre taxons ancestraux des agrumes cultivés à partir de données GBS.

100% Oui

==> Listing de SNP discriminants du genre Poncirus sélectionnés pour le développement de marqueurs

1.1.3 Implémentation de set de marqueurs SNPs Kaspar pour agrumes et ignames

sélection de SNPs régulièrement répartis le long du génome et permettant de répondre aux questions de recherche et besoin de contrôle génétique dans le cadre du projet Cavalbio, définition d’amorces et validation sur un panel d'accession représentatif de la diversité de chaque espèce

janv-17 déc-17

Agrumes: Sélection de 44 DSNPs du genre Poncirus et développement de marqueurs Kaspar 26 marqueurs validés sur un panel de 31 accessions Communication par poster au Congrès ICC 2016 Ignames: Activité prévue en 2017 Sélection de 192 SNPs pour le développement de marqueurs Kaspar déjà réalisée

Agrumes 90%

Ignames 20%

oui ==> marqueurs Kaspar validés utilisables en routine en Guadeloupe

==> bases de données

==> publication sur le développement de marqueurs



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

1.1.4 Caractérisation des collections d’ignames

Génotypage de 300 accessions pour 90 marqueurs SNP (méthode Kaspar)

janv-17 déc-17

Programmé en 2017

0% Oui ==> base de données pour le contrôle de la conformité génétique des plantes en collection et des hybridations

==> arbre phylogénétique

WP 1.2 Etablissement d’une carte génétique de référence de l’igname

GBS sur 120 individus et génotypage après mappage sur la séquence de référence de D. alata. Etablissement des cartes génétiques (parents et consensus) à partir des données sur 240 hybrides (financement fondation gates pour les 120 hybrides additionnels).

oct-15 déc-17

Vérification conformité des hybrides Mise au point méthode de préparation des échantillons d'ADN pour la GBS ADNs extraits mais problème durant la réalisation de la banque GBS. Nouvelles extractions programmées en juin 2017 Génotypage microsatellite réalisé

30% Partiel

==> 1ere carte génétique saturée de l'igname

==> Publication dans une revue internationale

WP 1.3 Fonctionnement méiotique des génomes complexes

1.3.1 Méiose et structure des gamètes des géniteurs tétraploides interspécifiques et intergénérique d’agrumes

L'étude concernera deux hybrides interspécifiques (Volkameriana et limettier Mexicain) et deux hybrides intergénériques (Citrumello 4475 et Citrandarin), tous utilisés pour les projet d'amélioration des porte-greffes et des limettiers (i) validation de l’approche GBS (enzyme APEK1 et base de sélection) pour les géniteurs concernés par l’analyse de données de GBS préexistantes au projet Cavalbio ; (ii) analyse fine de l’hérédité des fragments chromosomiques et de la recombinaison par GBS à partir des populations tétraploïdes et triploïdes créées dans le WP2.

août-15 déc-17

Validation de l'approche GBS APEK1 Population Citronnier diploïde x Lime tétraploïde -7550 marqueurs utiles pour le limettier

Population porte-greffes tétrazyg -Volkameriana: 23900 marqueurs -Citrandarin et Citrumello : > supérieur 4600 SNPs GBS réalisée sur population 120 hybrides Citronnier diploïde x limettier tétraploïde Analyses des données en cours Fonctionnement méiotique des tétraploïdes -Limettier Giant Key et Citrumello: Intermédiaire préférentiellement disomique -Volkameriana : ségrégation intermédiaire

Population triploïde

Citronnier x lime:

75%

Population tetrazyg

intergénérique (porte-

greffe): 50%

Oui

==> Modèles de fonctionnement méiotique pour les différents géniteurs

==> Publication sur la méiose des agrumes polyploïdes



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

1.3.2 Impact de l’interspécificité sur les écarts au mendélisme

L’étude concernera le citronnier qui a une structure complexe impliquant trois espèces ancestrales du genre Citrus et qui est utilisé comme géniteur femelle dans le programme d’amélioration des limettiers à gros fruits. (i) validation pour le citronnier de l’approche GBS (enzyme APEK1 et base de sélection) par l’analyse de données de GBS préexistantes au projet Cavalbio ; (ii) analyse fine de l’hérédité des fragments chromosomiques et de la recombinaison par GBS à partir de la population triploïde créée dans le WP2.

juin-15 déc-17

Validation de l'approche GBS APEK1 -9590 marqueurs utiles pour le citronnier GBS réalisée sur population 120 hybrides Citronnier diploïde x limettier tétraploïde Analyse des données en cours

65% Oui

==> modèle de fonctionnement méiotique du citronnier

WP 2 - Création de ressources biologiques innovantes

WP 2.1 Ressources biologiques innovantes d’igname

2.1.1 Diploïdes doublés de géniteurs élites de D. alata

les diploïdes doublés de D. alata seront cherchés par traitement à la colchicine in vitro. la ploïdie et l’existence d’éventuelles chimères de ploïdie seront analysées par cytométrie en flux.

juin-16 sept-17

L'activité débutera en 2017 0% Oui

==> 5 lignées diploïdes doublés d'ignames

2.1.2 Populations diploïde pour la cartographie génétique et les analyses QTLs

Production d’une population de 250 hybrides entre deux géniteurs diploïdes D. alata non apparentés. Vérification de la conformité du croisement par marquage moléculaire. janv-15 déc-15 Population obtenue en 2015 100% Oui

==> Population de référence pour cartographie génétique et analyse d'associations



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

2.1.3 Hybrides tétraploïdes issus d’hybridation interploïde 2x x 4x

Les semences seront gérées par des techniques standardisées de pépinière. Les tétraploïdes seront sélectionnés par cytométrie en flux.

janv-16 déc-17 1076 pollinisations manuelles 2x x 4x (61F x VU472) réalisées 122 graines viables obtenues

50% Oui

==> Population tétraploïde issue de 2n gamètes pour étude sur la biologie de la reproduction (2018-2020)

WP 2.2 Ressources biologiques innovantes d’agrumes

2.2.1 Porte-greffes tétraploïdes d’agrumes

le Volkameriana tétraploïde sera hybridé en Corse avec trois autres géniteurs tétraploïdes : Citrumello4475, Citrandarin et Poncirus. Les semences tétraploïdes seront gérées suivant des techniques classiques de pépinière et la nature hybride testée par marquage moléculaire (SNP Kaspar).

janv-16 déc-17

80 hybrides tétrazyg obtenus pour la combinaison Volkameriana x Citrumello (vérifiés marqueurs et ploïdie) Ces hybrides sont greffés en serre insect proof 116 plants à partir de l’hybridation Volkameriana 4x X Citrumello 4x 115 plants à partir de l’hybridation Volkameriana 4x X Citrandarin PoncxCleo 4x Contrôle de la ploïdie et origine hybride de ces 231 plantes au premier trimestre 2017

70% Oui

==> Population de 150 hybrides intergénériques tétraploïdes greffés sous insect-proof

2.2.2 Limettiers triploïdes

Des citronniers diploïdes seront hybridés en Corse avec une lime mexicaine tétraploïde. Les embryons seront sauvés in vitro. La ploïdie des plantes obtenues sera testée par cytométrie en flux et la validité de la nature hybride par marquage moléculaire SNPs Kaspar. juin-15 déc-17

130 hybrides triploïdes obtenus (vérifiés ploïdie et marqueurs) Ces hybrides ont été greffés sur Flying-Dragon pour plantation début 2017 Nouvelle introduction de semences hybrides fin janvier 2017 80% Oui

==> Verger de 150 hybrides triploïdes de citron x limes greffés sur Flying dragon pour évaluation



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

WP 3 - Déterminants du développement, de l’adaptation et de la qualité

WP 3.1 Développement et adaptation des ignames

3.1.1 Mise au point d’outils de phénotypages adaptés à la culture d’ignames et application à la collection de référence

Phénotypage d’une collection de travail sans et avec une pression des plantes adventices pour l’identification des traits d’intérêts. Mise au point de méthodes rapides et non-destructives de mesures de ces traits.

janv-15 déc-17

1 protocole de phénotypage est rédigé. 1 collection de travail (18 variétés) est maintenue au champ (ColZyianm). 1 expérimentation de terrain comprenant 4 génotypes et deux traitements (avec et sans pression des adventices) est en cours (campagne 2016). 1 stage de M2 est réalisé dans ce contexte. 1 technicien est formé à l’utilisation de l’instrumentation.

60% Oui

==> Un protocole de phénotypage est disponible pour chaque trait identifié

==> Les techniciens de terrain sont formés à l'utilisation des protocoles

==> Les variétés les plus compétitives sont identifiées

==> Un protocole de détection de la tubérisation est rédigé

==> Publication sur les traits d'intérêts chez l'igname

3.1.2 Mise au point d’un modèle de culture générique pour la sélection de variétés adaptées aux systèmes à bas intrants

Simplification et traduction sous R de l’actuel modèle CropSyst VB Yam (Inra). Développement du modèle pour intégrer les traits variétaux d’intérêt. Validation du modèle par une expérimentation de terrain incluant la collection de travail.

oct-15 déc-17

1 expérimentation sur la compréhension et la modélisation des mécanismes de compétition interplante chez l’igname est en cours. 1 stage de M2 est réalisé dans ce contexte en collaboration avec l’Université de Copenhague.

30% Partiel ==> Un modèle de culture générique est disponible

==> Une publication sur le modèle de culture



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

3.1.3 Implication de la tétraploïdie sur le phénotype des ignames

Caractérisation physiologique de la différenciation phénotypique (anatomie, croissance, développement, rendement) entre génotypes 2x, 3x ou 4x cultivés en serre et au champ.

oct-15 déc-17

1 protocole d’évaluation est rédigé. 1 expérimentation de terrain comprenant 7 génotypes est en cours (campagne 2016). 2 stages de M1 et un stage de césure sont réalisés dans ce contexte.

60% Oui ==> Protocole d'évaluation de l'influence de la ploïdie sur l'anatomie et la physiologie des ignames

==> Identification des modifications phénotypiques (physiologie, vigueur/performance) associées à la polyploïdie et sélection du matériel le plus intéressant (vigueur, rendement)

==> Publication sur l'influence de la ploïdie sur l'anatomie et la physiologie des ignames

WP 3.2 Qualité physico-chimique des ignames

25 variétés de D. alata présentant des qualités contrastées seront phénotypées pour leurs caractéristiques physico-chimiques (teneurs en matière sèche, sucres, amidons, protéines, cellulose). L’héritabilité au sens large de ces caractères sera estimée. Des modèles de calibration seront recherchés pour une estimation en SPIR de ces composés sur la base de la variabilité des 25 variétés. juil-16 déc-17

La parcelle est en place Date de récolte prévisible Février/mars 2017

20% Oui

==> base de données sur la variabilité des qualités physicochimiques des ignames

==> Protocole pour l’évaluation des caractères physicochimiques par SPIR



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

WP 3.3 Polyploïdie et adaptation des porte-greffes d’agrumes aux contraintes abiotiques

3.3.1 Adaptation de couples de porte-greffes 2x et 4x aux sols calcaires

Application d’une carence en fer sur des couples de porte-greffes 2x et 4x. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, dosages d’ions et dosages d’enzymes impliquées dans la réduction du fer.

avr-16 mars-17

Obtention du dispositif expérimental agrumes en pot (étude carence en fer): différents couples de porte-greffes 2x et 4x (Poncirus, Mandarinier Cléopâtre, citrandarin Poncirus x Mandariner Clépâtre) sont en culture sur substrat neutre; Etablissement des protocoles de carence ferrique sur génotypes ayant des propriétés de tolérances contrastées L’expérimentation de carence en fer sera réalisée au printemps 2017.

30% oui

==> Protocoles d'évaluation de la tolérance à la chlorose ferrique chez les agrumes

==> Génotypes d’agrumes tolérants à la chlorose ferrique sélectionnés

==> Publication sur la tolérance des polyploïdes d’agrumes à la chlorose ferrique

3.3.2 Etude de couples de porte-greffes 2x et 4x francs de pied ou greffés sous contrainte hydrique

(i) Application d’un déficit hydrique sur des porte-greffes 2x et 4x francs de pied. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, mesures des potentiels hydriques des feuilles et du sol au cours du stress, étude de l’expression de gènes impliqués dans l’osmorégulation cellulaire. De même, il est proposé de mette au point la méthodologie pour les mesures d’hydraulique sur différents couples de plants 2x et 4x francs de pied.

juil-15 déc-17

Préparation du dispositif expérimental en pot (déficit hydrique). Evaluation d'un premier couple (citrange carrizo) 2x/4x sous contrainte hydrique franc de pied. Publication soumise et acceptée avec révision. Mesures de conductance hydraulique sur trois couples 2x et 4x (Poncirus, mandarinier Cléopâtre et citrandarin Poncirus x mandarinier Cléopâtre) franc de pied.

60% oui



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

(ii)- Application d’un déficit hydrique sur des porte-greffes 2x et 4x greffés avec du limettier 3x. Mesures de conductance stomatique, photosynthèse Fv/Fm, indice SPAD, mesures de potentiel hydrique et potentiel osmotique foliaire, de conductance hydraulique mais également dosages de proline.

Préparation du dispositif expérimental en pot (déficit hydrique) 2x/4x lime 3x.

Phénotypage d’agrumes tolérants au déficit hydrique sélectionné

==> Publication sur la tolérance des polyploïdes au déficit hydrique en lien avec l'hydraulique de la plante

3.3.3 Impact de la ploïdie sur le développement du porte-greffe dans le cadre de la mise en place d’un parc semencier

Préparation de 6 couples 2x et 4x de porte-greffes. Pour chaque génotype, des associations porte-greffe/greffon (2x/2x, 2x/4x, 4x/4x, 4x/2x) seront plantées au champ afin d’évaluer l’impact de la polyploïdie sur le développement et la croissance des arbres. In fine ce dispositif pourra servir de parc semencier dans le cadre du schéma de production de plants d’agrumes sains (RITA).

juil-15 déc-17

Préparation des associations porte-greffe/greffon (2x/2x, 2x/4x, 4x/4x, 4x/2x) en serre insect-proof réalisée. Suivi de croissance. Plantation au champ prévue en Janvier 2017.

60% oui ==> Parc semencier au champ de porte-greffes d'agrumes diploïdes et tétraploïdes



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

WP 3.4 Impact de la polyploïdie et de l’environnement sur l’apomixie des porte-greffes

3.4.1 : comparaison de couples diploïdes/diploïdes doublés pour l’apomixie

Quatre couples diploïdes/diploïdes doublés seront analysés : Citrumello 4475, Citrange Carrizo, Citrandarin Cleopatre x Poncirus et Volkameriana. Une centaine de plants de semis de chaque porte-greffe sera génotypée avec un minimum de 10 marqueurs héterozygotes (SNPs, méthode Kaspar) pour chaque porte-greffe. Les plants génétiquement conformes alimenteront les différents dispositifs d’essai de Cavalbio et du Rita. La variabilité phénotypique des plants zygotiques sera analysée pour identifier des critères de tri dans les pépinières commerciales.

juil-15 sept-17

Analyse par marquage moléculaire SNP de 4 couples 2x et 4x réalisée => près de 800 plants analysés avec 24 marqueurs Publication en cours de rédaction

90%

oui

==> Recommandations pour la gestion des plants de semis de porte-greffes tétraploïdes en pépinière.

==> Publication sur le taux d'apomixie pour différents couples 2x et 4x d'agrumes



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

3.4.2 : influence de l’environnement sur l’apomixie

Les taux d’apomixie dans des semences de FLHORAG1 (hybride somatique allotéraploïde entre mandarinier Commun et Poncirus Pomeroy, prometteur pour les enjeux de la Guadeloupe) provenant de Corse et de Guadeloupe seront comparés. Une centaine de plants de semis de chaque provenance sera génotypée avec un minimum de 10 marqueurs héterozygotes (SNPs, méthode Kaspar). Les plants génétiquement conformes alimenteront les différents dispositifs d’essai de Cavalbio et du Rita. La variabilité phénotypique des plants zygotiques sera analysée pour identifier des critères de tri dans les pépinières commerciales.

avr-16 mars-17

Analyse par marquage moléculaire (24 marqueurs) de 90 plants de semis du porte-greffe FLHORAG1 provenant de graines produites en Guadeloupe. Les graines produites en Corse ont été commandées. Elles seront semées et analysées avec 24 marqueurs SNPs durant le premier semestre 2017.

50% oui

==> Note technique sur l'impact de l'environnement sur le taux de conformité génétique chez le porte-greffe FLHORAG1

WP 4 - Déterminant de la tolérance aux maladies

WP 4.1 Marquage et utilisation de gènes de résistances à l’anthracnose des ignames

4.1.2 Phénotypage de la population Cirad

La population du Cirad sera introduite in vitro à partir de graines immatures pour permettre leur multiplication rapide par micropropagation. Le phénotypage sera réalisé à l’aide du test en conditions contrôlées développé à l’Inra (Onyeka et al. 2006b)

janv-17 déc-17 Population introduite in vitro et prête pour le phénotypage en fonction du calendrier de l'Inra. Début d’activité programmée sur 2017

25% Oui ==> Base de données sur la sensibilité à l'anthrachnose des hybrides du Cirad



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

4.1.3 Méta-analyse de QTLs de résistance à l'anthracnose

Analyse QTL sur la population Cirad (données GBS du WP1 et phénotypique du 4.1.2)

oct-17 déc-18

Test de 120 marqueurs microsatellites pour faire le lien entre les populations Marquage microsatellite en cours (pour GBS CF WP1.2)

10% Oui ==> Rapport sur l'analyse QTL pour la résistance à l'anthrachnose sur la population du Cirad

WP 4.2 Plasticité phénotypique et adaptation au Huanglongbing (HLB) chez les polyploïdes

4.2.1 Caractérisation écophysiologique sous contrainte HLB d’orangers sur 4 couples de porte-greffes 2x/4x

Etudes physiologiques sur vergers de 4 couples de porte-greffes 2x et 4x greffés avec de l’oranger (dispositif RITA ; partenariat ASSOFWI et INRA). Quantification par PCR de l’infection des plants par le HLB. Caractérisation physiologique (mesures de croissance, conductance stomatique, photosynthèse, Fv/Fm, indice SPAD, dosage d’amidon dans les feuilles). oct-15 déc-17

Préparation du dispositif expérimental agrumes en pot. Evaluation du développement et de la croissance des plants Mise au point de la détection HLB par amplification moléculaire LAMP Plantation prévue en janvier 2017

40% oui

==> Protocoles pour la mise en évidence du HLB dans des arbres malades

==> Rapport sur la physiologie des associations de porte-greffes 2x/4x avec des variétés 2x et 3x



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

4.2.2 Caractérisation anatomique et physiologique de limes 2x et 3x greffées sur porte-greffes 2x et 4x

Caractérisation physiologique (mesures de croissance, conductance stomatique, photosynthèse, Fv/Fm, indice SPAD et de conductance hydraulique) de différentes associations porte-greffe/greffon: 2x/2x, 2x/3x, 4x/2x, 4x/3x ayant poussé en serre ou au champ sous contrainte HLB. Quantification par PCR de l’infection des plants au champ par le HLB. Caractérisation par microscopie à balayage de l’ultra-structure des vaisseaux du phloème entre 2x, 3x et 4x de plants témoins et de plants infectés par le HLB. Etude d’expression (PCR quantitative) pour des gènes candidats impliqués dans la détoxication cellulaire et les mécanismes de résistance systémique induite.

oct-15 déc-17

Préparation du dispositif expérimental agrumes en pot et sur le terrain. Plantation sur le terrain en juillet 2016. Etablissement des protocoles pour préparation des échantillons à analyser par microscopie à balayage Analyse sur coupe microscopique à balayage du phloème de tissus de feuille, racine de 2x, 3x et 4x sur des plants sains (plants issus de serre) et des plants infectés (plantes au champ) Etablissement des protocoles de biologie moléculaire (LAMP) pour mettre en évidence l'infection des plants par le HLB Les protocoles d’analyses biochimiques (teneurs en amidon ; H2O2, activités enzymatiques de détoxication) ont été développés et une expérimentation préliminaire réalisée.

70% oui ==> Protocoles d'analyse par microscopie à balayage d'échantillons d'agrumes

==> Rapport sur la différenciation au niveau des vaisseaux du phloème de différents organes (feuille, racine) d’agrumes 2x, 3x et 4x

==> Publication sur la différenciation phénotypique et transcriptomique entre agrumes 2x, 3x et 4x

==> Publication sur l'impact du HLB chez les polyploides d'agrumes



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

WP 5- Caractérisation de séquences virales endogènes

WP 5.1 Criblage des banques BAC

Contribution à l'évaluation de la diversité des EVE présents dans le génome d’hybrides de D. alata, D. cayenensis-rotundata et D. trifida. Criblage des banques correspondantes avec cette diversité et séquençage des clones BAC positifs.

mars-16 déc-16

Deux banques BAC ont été créées et criblées à partir d’accessions du CRB PT: • D. alata (accession Oriental), avec un taux de couverture de 6.5x • D. trifida (accession Lac Bleu) avec un taux de couverture de 3x

65% Oui

==> Banque BAC D. cayenensis-rotundata

==> Séquences EVE

WP 5.2 Analyse structurale des EVEs présents dans les trois espèces principales de l’igname

Analyse in silico des EVE à partir des clones BAC obtenus en 5.1 afin d’en déterminer la structure génétique.

juil-16 mars-17

Les séquences virales endogènes Caulimoviridae ont été recherchées dans le pseudo-génome de D. alata assemblé par le Genome Analysis Centre (Norwich, Royaume Uni), en accès libre. Un total de 63 040 séquences Caulimoviridae a été recensé. Il correspond à 1503 séquences distinctes, dont l’analyse in silico est en cours afin de reconstituer tout ou partie de génomes viraux.

20% Partiel

==> Structure des EVE caractérisée

WP 5.3 Reséquençage de 10 accessions Dioscorea pour évaluer la diversité des EVE

Contribution au reséquençage et à l'analyse des EVEs de 10 accessions en se basant sur les résultats obtenus en 5.2.

mars-16 déc-17

La séquence assemblée et annotée du génome D. rotundata-cayenensis n’étant toujours pas disponible, cette activité a dû être reportée .

0% Non

==> Base de données sur les séquences des EVE et des séquences flanquantes

WP 5.4 Criblage des ressources génétiques Dioscorea du CRB-PT

Contribution au développement de marqueurs discriminant les différentes EVE identifiées. Criblage des accessions Dioscorea du CRB-PT et établissement d’une carte d’identité précise de chacune d’entre elles.

janv-18 oct-18 Début de l’activité programmée en 2018

0% Oui

==>Marqueurs PCR EVE valides



Date de fin


réalisation totale

Respect chrono.

WP 5.5 Suivi du potentiel d’activation des EVE présents chez l’igname

Contribution à la création de populations d’hybrides interspécifiques D. alala x D. trifida.

nov-16 déc-17 L’activité n’a pu débuter en 2016, en raison du retard dans le déblocage du financement attribué à l’INRA.

0% Non

==> Population intespécifique

WP 6- Valorisations économiques des innovations variétales

WP 6.1 Modélisation ex-ante des attentes et préférences des agriculteurs

Contribution à l'élaboration des questionnaires d'enquêtes et à l'analyse des enquêtes

janv-16 déc-17 L’activité n’a pu débuter en 2016, en raison du retard dans le déblocage du financement attribué à l’INRA.

0% Non ==> questionnaires d’enquêtes

==> Synthèse sur les attentes des agriculteurs en matière d’innovations variétales


Annexe 2

SNPs sélectionnés pour le développement de marqueurs

KASPar chez l’igname


Marker name Séquence flanquante

chr1-2272438 GAAACTGTTGTTAATTCAATGATCACTGCAGAAAAGAAATCGAAAAACTAGTATAAGAAT[C/T]ATCGTGTATCCGATCATTCTCTGTGTGTTACTGGTTTTGATTCAGAGCTTGATCAACAAT

chr1-2688272 TAGAAATGTACCTTGCCCGACTCTGGAAGCAATTCATAAGCAGTATGTGCTGACAAAAAA[C/A]CAGATATACGGTGGCGAGAAATCTCAAGGTCAGTATCAGCGCTTCTCAAAGCTGACTCCT

chr1-2944404 AAAACAGGAAACAATTGCAAACTCCCTCTAAACAGAAACAAATCACTGATAACACATGCA[A/C]AATCTACAAATAAATACAAAAACTGCAGCTTTAATGGAAAGAAACACCAACAATCACATT

chr1-3439349 TGATAACAGAAGTTAGTGGTAGAAAGTGCCGCAGCATTGGACAATGCAGGAGAACTGTCC[T/C]GTAACAGCATAACCACAAGAAACAAGTTCATAAACAGACAAGGTATATGATGAGTATATG

chr1-3516816 TGTACATTTAGATACCAGAAATCCAGTCTAGAATAGATGCTCAAGAAAATTCAAAATCAC[C/T]ACTTACCACCACGTAAACCTCCATATATGAAGATCAAGTCACCAACTGCAGCTGCTGCAT

chr1-4535125 TGGACATTTTATTCCAGGTTTGTTGGGAGTGATCTCTATGCTTATACTTTCACTGCACAA[A/C]AAGCTTCATGTCCTTTTTGCGATACTAGCGCTGACTGCAGGTAGTGCTGGAGTGGCTATA

chr1-4819577 TTTATTTTGGAATTTGTAGAATTTCCAATCTCAAGATTCATCTAAGATGTTATGGGTTGG[C/T]CCTGTCCCTGGTGACATTGCTGAACTTGAGGCATACTGCAGGATTTTTAGAGCTGCAGAA

chr1-5084421 TTAACTGAGTCTATCATGTAGGATAAATTTGGCTTTATATGATTTTTCTGCAGAAAAGAG[G/A]TTTTTATGTTAGCTGGCACCTGATCTTGTGGAAAATTTACAGAGTAATGAATGGTATAAA

chr1-6712136 CACAAGATTTGGCATTTCAAAGATGAAAGACAGTGTCCTGATGCTTGCGTCATTTGAGAA[A/G]ACTGCAGAGCACCTGTTTAATGCTTCATTCAGTGGTCGGGAGGACCAGATTGAGGGAGTT

chr1-6890046 TGAAGAACCGAAAAAGACTACAAGAAGAGGACGCAAAAAAGGTTCAACCACTTTCTTTCT[T/C]TCTTTCTTTCTTTCTTTATTTTTGTCAACAATTTGCAAGGTTGTCAAATATTTTGTTTCT

chr1-6909009 CATTGATTTCCTCGCAGATGCAGAAGAGCAATGTCTTCAGATACTTCTTCTGCAGTGCAT[C/T]GTATACCCCTGAAATCAAATATTTGACATATAAATATGGAAACCATGGGAAAAAGAAGTA

chr1-7185398 CGACATTCTAACAATCTCATCAATGAAAAATGTAAATGCTTGTATTCTCTAATTTTCAGG[T/C]TGTAATGAAACAGGAACAAAATGGGGCGCAAACTGCAGTCCAAAATGATTCCTGTGTTTG

chr1-7223278 AAATGGTAAAATAACGTTGCCAGATTGGGCAAGTGATATAACCAGTGTCTTGTGGTTTCC[T/C]GTCCGTGCTATAGATGACAGGATAGCAAGAGGAACATCTGCAGGTTCAGTAATTATTACC

chr1-10631276 AGCAGAAGAAAACAAACAAACTGCAGTGACTGAAAGTGAAGAAGCTTCTGTAGGAATTTC[T/A]ATGGCGTTTATACGTCAGAGCTTGAAACGTTGGCTTTTGAACAATCAGCATACATCCAGG

chr1-17510516 TGGGATAAAAAAGTACCATCCAATTAGTTTCATTGCTGCAGGTGTGGAGAGGAATTTCGT[A/T]CTGGAGCCATTACTCAACTTGAGAGATGAAACTTACACAGTTTATTTCAACTTTCATTGA

chr1-21062858 TTCATGTCTCCTGTTTTCAAGCTTGAAGAGAATAAATCATTTTATCAAAGGATCAGGAAA[C/A]AAAATCAGTCTGGATCTGCTGCAGGAATGATTTGGAAGATAGCAAACTAATAATAGCAGT

chr1-21076509 CGATGCCCAAAGCCACTAGCCACCGCTCACGACGGCGCACCTGCAGCTCCCACCAGCGGC[C/T]GCTTCTCCTGCGTTTCTGCGGATGATGCTGAGAGAGCTCGGAATCCGCGCCCAAGATCCC

chr1-22138576 AAAAGCCATCCTGTGAAAACTGTCCTGCAGGAGGTTGGTGGAGTGGCAGTCGTATGTTGG[C/T]ATATGATAAGTAGGTTACTTTTGTGCCGGTATCTTCTTCATATTTTTCTTTCTTGTTTAT

chr1-22656866 ATCCTCAGTATACCTACTAACGCTTTCTAAACCTGCAGGAAAAACTTTTGTTGTCAGAGA[A/G]TAGTTAGGATTACTAATTATCGTATTCCTCGGGTTTAGAAGTATGAAGTTGAGTGATTAC

chr1-22660464 TGTTGTGCTGCAACCTGGTTGGTTGATGGCATGCTTGACATTTTTAGTAAAATGCTACTC[G/A]GCTATTTAGTTGACGTTGAACAAATCCTTGCATGCCTTTCTGGTTACTTTTAAGGTTGCT

chr1-25055966 ACCATCAACTTTGAGCCGCATCGCCAGCACCTCGCCGACAGCTGCAGCCGCCTTGGCATT[G/A]CAGGTGCGCCCGCACTCAAGTCCTGCCTTGAGTGGCTTCTCGACAGAGGATGCTGTTACC

chr1-25062237 GCAGTACATGATGAAGGAATACCCAGGTAACGAGGAGGAAAAGATGAGAGCAGCAATAGG[A/G]CGTTTCGGGCTGTCTGGCAAAGCCCAGGTGATGCCTATGAAGAACCTTTCTGATGGCCAG

chr1-25978959 GATCTAGTTTTCCAAACATTGCATCTATATTTATCACGCCTTCTTAACTTTCGCTGCAGG[T/C]GGTGGGAAGATAATTCTAAATAACCAAGATGCCATGACGGCACCAATGAAGGGACTGATC

chr1-27621881 TTGAAGAGTGATAACAGTCCAGGGTGCATGGATGTAAGAAGGTGAGAGCTCAAACGAGAA[A/G]TGCTGCAGTATCATGCTAAGTGCTATCTTAGCTTCAATCAATGCAAAGTTCTGGCCAATG

chr1-28767592 ATTGAAAAAGCAGATGGTTTTGCTGGGGTTTTTCCAGGTTATTCTTTTTCTATATCTTTT[T/G]GCTTGTAAGACTCATAGATTATCCCTTCATGTCTACTAATTCTTCTACATTCTCTGCAGA

chr1-29132039 TTAGTACTGCAGGGCCATGTAGAACCTATTTCATTCTTTGCTACTTTTGACTGAAAAATC[G/A]CATAAAATAACTTAGTTTGATGTTGTTTCAAATTTCGCTTCAACATGTTTTCTTTATAAT

chr1-29971730 AAGGCCTGCAGTCATAACCAGGTAGATAACAACTTCCTGACGAAAATGGCAGTCAGCGCC[A/G]AAGGAGAGATTTCACAACTTGGAACATATATTTTTCATAGCTCTCGATGAATGATTCAAC

chr1-30803696 TACGGGAAGAAGTAACTTGTAACATTACCTTTTCATTGATGAGGTTAGAAGCCCCTTTTT[T/A]GCATACTAGCTCTCAGAAATTTCACTTGTTTGGTTTATCTGCAGTGCTGCTCTAACAACA

chr1-32835318 CTTACGTCGAAGCACTGCAGCGGAAAACGGAGGCCAAAGCCGGAACCCTCCATTCCCAGC[G/A]AGGGCTCCGACGTCGGCTCGCGCACACTTCGCCATCGGAGAATTGTCACATTGGTAGCAG

chr1-33244867 CAAATTGATTTTTTGAATCAAGTTGATAGAATTCTGGTAAATTGCTCTCTTTTCAGTTGA[A/G]TTCTAGAAAACAAATGTCAACATTTTATATTTTGTTTTTCTGCTGCAGGTTATGGAAAGT



chr1-35474397 AAACAAAAAGATCACTTCTATACGTCCGTATATATATATTTTCCTTTGTTTTTTTTTAAT[C/A]ACGCAGAAAGGAAAGGATAAATGTAACTCATGAGCGAATTCATAAACTTTTTGACTGCAG

chr1-37291627 TGTCAAGCTCCTTCACATGCTCCTGGAAGAGTTCCGTTCTATGTCACCTGCAGCAATAGG[C/T]TAGCTTGCAGTGAGGTTCGGGAATTCGAATTTCGTGAAGACTTCATCAGTAGCACCCTGG

chr1-38066867 GTAACCGCTGCAGCCATGGGTTGTTTGTTTGGGGATGAATGAATGTGCAGAGATTGGAGA[T/A]TGGTGAAGTTTGGGGTGATTAGGGTTCCTTACATCTGATGTTTTGATACTGTATCTGAGC

chr1-39135479 CAGATATCATTCACAAAAGTAAAAATTAAATGACTACCTGCAGCATAATTAGTGAGACCC[A/G]CTTCAAGCCCGTAATGAGGTAGTTCATGGGCATAAGCAGAGGCTAAAATCATATCTCCTG

chr1-40481233 CAGCACTTGCTTTGCTTTCTTTGCTTGGGCTTCAGTTGGGGAGCTCTCTAGAAGCATCCT[A/T]GCAAAATTGGAAGCAGTGGCATAATTTCCTCCCTTGAAGCAGATGGTCATAGCACTGGTG

chr1-42033565 TGGGCAAGGAGCTGATGTTGTCATCTATAACATTCTGATCCATGGCCTCTGTTCTGCAGG[G/C]AAAGCACAAGAAGCTTTGCATGTTACCAAGGAAATGAGACTGAAGAACTGCCTGCCAAAT

chr1-43747024 AAGTAGTATCAGAGATCAATCCATGATTCCACCAGAACTCAAATGTGCCTACATAATCAT[A/G]GTAATCATCTGTGACTGCATTGCCAACCTGCAGAAAACATCAGCAATCAAATAAATGCAA

chr1-43872958 AAAGACGGAAAAACGTTTCTTACTAGAGAAAAGAAGACTATGCACCATGTTCATGTCTTG[G/C]CAATATATCTGCAACTGCAGAGCAAAAAAACTTGCTGCAGATTTGAGAACAACAGTTAGT

chr1-44248381 CTGATAGTACAACTGATAAGTTTCCAAACAGCAAAACTTGAGGTACTGCACTGCAGCATG[A/G]GAGAAGTACAACACTTAGCTTGGTAATCTCTATGCTCTAATCCTTTCTATATAAACACAT

chr1-44503073 TTAGGCTATTAATGAGACAGGAGGCATGCATAGTTAATTAGACATGCTGCAGCACAAAGT[G/A]TTATTACTTTGTTATTGCAGCAATATGATGTCAGTGAAAATTTTAGTTTTGGTGATTCAT

chr1-45679269 AATAACAATAGGAACTTAGTTCTATAATCAGAACTGCAGCAATCAAACAAGTGAAAACAA[C/T]AGAAAGAAACCTCTCCGGAATGCACCACAGATAAGTCCTGTCAACTAATCACTCATAAAA

chr1-45761963 TTTTATCATGAACCGATCATCCTGAGACAGGTAGAAGAAGCTCCCACTCTTCCCAGGGGA[G/A]GATAATTCCCTCAAAGCATCACTTCCACAGATCGTCAACATATAATCTGCAGCATCAACC

chr1-47062142 TTCCTTGGATTTTTCTGTTTCTATTGATCCATCATTTGCTATTATGAGGAATCCTTTTTC[G/A]GAAAAGAAATGGAGAAAGTTCCAGATAGCAAGGTTATTCAGCAGTTCTTCTGCAGCAATC

chr1-47290396 GGAGGGAGCTGACCGGAAGATGCTGCAGGCGGCGCTGGATTGGGCGTGCGGGCCGGGGAA[G/A]GCGAATTGCAGTGAGATTCAGCCTGGAGAATCGTGCTATGATCCGAACACTGTAAAGGCG

chr1-48537949 TGCAGCAGTTTACTTGACTAGTAGTTCAACTCCATGGAAGGAATTGAGGATAAGTACACA[A/C]AGGATGGGACAACAGATATCCGTGGGAATCCTGCACTGAAGAAAAATACTGGAAAATGGA

chr1-50285233 CTTTTACTTTTGATTATTATTATTATTATTCCTGAAAAACATCCTGTGCTGCAGCTGGAG[C/A]GGATGATTCAAGCCGGTGGCACCAACAAGCCAAATGGAAAGTAAGAAGTTTCTAAGAGAG

chr1-51230763 GACATCATTGGGGAACCAAAACAATATGATACTGCTGCTGCTGGTTCACAGCTGCGAGCT[C/T]CTGTTTCTGCTCAGCCATCTGGCATGAATCAGTCCAGTATCCCTGCAGGGAATCCTCAAT

chr1-53823407 GGTACATTGGAGAGTCCCCGGAAGGGGAAAAATAGATTCAATGAACTAAAGAAAGTGACG[G/A]ATAAAACTTGCTTAGTGGTTCCAATGTACATGGAAGCAACTGCAGGCAAGTTAACCCCGT

chr1-54306110 TCTACTGCATCTCTGTGGTGGAGAGTTACTGCAGCACCATATAGAACAAGCACAGGAGTG[C/T]GGAGTTATGGGTCCATTACTAGAACTTGCCTCAAATGGAACAGAGAGAGGTAAGAGAAAG

chr1-55228930 ATTAATACTTCAAAGAAGCATTTAGAAAATTGTACTGCAGTGAATTTTATACTACAGCAC[A/G]TGTACTGATGTACATAAAAATACTTCTGACATCCTATCAATCAAAGAGTCAAAGATGAAT

chr1-58332890 TATGTCCTTTCTTGCATAACAATTTATGAGGTCATCAACAAAAGTCTGTTACTCTGCAGA[T/A]ATATATGAACAAAGAATCCAAAAGGAGATATCACGCACAATATACCTGCTCCCGATTTAT

chr1-62210903 AAAGGTTACTGGAGAACCCTTGGTTCAAAGGAAAGATGATACAGCTGCAGTTCTCAAGTC[A/G]AGGCTTGGAGCTTTTCACAAACAAACCGAACCGGTATGCTGTTTATTTCATTCTATTTGT

chr1-62762118 TGGAAAGAAACAACGGTTTCCTCTCCCCCATGTCAATGGATATGGTATTTATGTCGGTGC[C/T]AAGAATGCAGTCAGAAGCTGCAGCTAGCGCAGGTGGTTCACCAAGAATACATTCAGAACT

chr1-63400342 GAGCCAGTATTAGACAATCCAACACATCTCAACAGAGAAAGCTTAGCTGCAGAAGGCTCC[A/T]TTGATAATTCTCAAACTTCTTCTGAAAATGCTGTATCTCAAACAACATCACAATCAACTG

chr1-65376562 GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGAGAGAAAAACCCTCGTCTCGTCGCCGAATCGCTTCTA[T/A]TCGATCACTCCGTCCTTTTGCAGTCTCCTGCTGATCTCCGATCAGAGACAAACCTGCAGC

chr1-65399407 TGATATATGAGGCTGTAGTGATGTGCTTTTGTTGCCACTGCTGCAGGACCAGTACATACT[A/C]CACACTGCCGAGTCACAGAACATCTCATTGCCTTTCGCTTGCAGGCACGGTAATCCCTAT

chr1-66878388 AATTGTGACATCAGCAGCAATAAAATTTTTGAAAAACCACCGCCCAAAAAATTTATCAAA[A/G]AAAATTATCACTGTCTTGTGTCAAACATCATCACCAACTCCAAACCCATACTGCAGAAAA

chr1-68379361 TATAAAGAAAGCAAAGGTCTTGCGACGCGGCGCTGCAGCATCGGACACGCCGCACCGTGG[T/C]GACATGATCTGGGACAGCGTGCGGGAATCCAACCGACCCGTGATCGGGAGCCCGAGTCTG

chr1-71116801 TGAATTATCCGGTGGTGATGAATCGGAATGGAGTGAAAGTAAACCCTGTCTGCAGGACTT[G/T]AGCAAAGAGAGCAGCATGTCTATACTGAGTTCTTGTTGTACCACTCCTCTGTTCTGATCA

chr1-74818679 AATATCTATGTGATATACTGCAACAACACAGAGGTCATACTATACATCAGGTCCAGGGAA[C/A]AAGATCTGCAGCGTTAAGCTGTTAACCTGCATTGAGCCCTTGATGGACAGTTTGCCAATG



chr1-74924156 ACACGCCAACGCAGCTTGCCAACAATTGTTTCTCAATTATCAAAGTAAGTTTTACTAACC[A/C]TTGATTGTTAGAGGCGGTTTTTGTTTGGTATGCATCTAAGGGTTTAGTAGGTGTAGCTGC

chr1-78099239 CAGGTTTTCTTTTCAATTGCAAGAGACATCAAGCAAAGGCTTGCAGAAACCGATACCAAA[C/G]CTGAGGTAGTATGCTTATCATTTGTGATAAATTCAGTAAACCTGCAGGCAATTAGTAATG

chr1-78281101 TTCGCTGCTTCAAGGTACTGCAGTAACTACTACGACGACATCCAATCCGCCACCTCCAGC[G/A]TCTGTGACTGGTGTCTCAGTGAACAACGCAACGCATGTGCAACTAATACTAGTAAGACCA

chr1-78341124 TTTCCTTTCAGCTGAACTGCCATGTAAGGGTGGCGCAGACAAACTGGACAGAGGTTCATG[T/C]AGTGAATCCATAAATATATCTTCACTTTGAGCAAATGAATTTCCTCTCGCCTGCAGATCT

chr1-81368334 CTGCCTTAACTTCTGAATGTCACGCTGCAATTTCCTGGAGTAGCCATGTTTTACTGCAGG[A/G]AAGATAAAGCATATAACTTCCAAAAGGAGGCCTATAGTACATGGATTTACCTGGCTTCTT

chr1-81586905 GCCTTACAATTTTCACAACATTTTTTACACTTTCACCAGTTGGTATTCTACTAATTTCCT[T/C]TTCCTTTGTTTTACAGATCAATGCTGCCACTGATTCTGCAGTGAGAAATCTGAGAAACCG

chr1-83682998 GTGAGCTGCAGCACGTCTTTCTGTGGCAAGAGAAAAAGGACAGGGAATGGTAACATTAGA[G/A]CGTACTTCTGTGAATGGCTTGTGTGAAGCCGCTGAAGTTGATTTACTGTTGCTTGATACT

chr1-85054393 CACATCTGTTTTCTTCCTTGAGATTTCTACAATACAACCTGAGAAGTTCTGCCAAAAATT[G/A]TCTCTTTGCGGGGTAAAATATTTTTCTCTCCATAGGAGTGACAACAATATCTGCAGGCTT

chr1-85084887 ATAAGCTTTATTCTTTTATATAGTATCTTGCTTTCAGAAAATCAACACCAGAGAATGCCC[A/T]ATTTTGCCCTTTATGGTGCTAGTAGTTATTCCAGGAAACCTGCAGAATATTTACTCTTTT

chr1-86749745 CCCTTCTGATATTTGCTTGGAGTTGAGATGTCTGTTGAACTTTAGCTGGAAATTTTACAG[T/C]CAACTCTATGAATTGTGTTTTCTGATTCATACGCACATTTGTGATTTTGTGCCTGCAGAG

chr1-88497008 TGCATAGCATGAAAACCAAAACCACTGCTGGTAAGAACTTGACCTATCAACAAGCCCCTT[G/C]ACTGCGAACAAACAAGCAAGAACAGCAACCCAATCTGCAGGCATAACAGCCCTGTAACTA

chr1-88835504 AGCGAACATGCACTTGAAGGATTCCATGGAATTTCTTAGTTGTGATATCCTCTTCTGAAA[C/T]TTCCTCAAGGCATCATACAACTTCTTTCATCAGCAAGACATGAAAGACTGCAGGATCTAC

chr1-89458418 CAAGTGCTCTGCGGGTATATTCATCAATTGGGAATAACTGCAGCTTCAGTTTTCCAGAAG[A/G]ATGTACAAGCGTTTCTCTGATCTGATGTGAGCAGGTTTCTCCCAACAGAAAAGGGGGAGG

chr1-92076431 AGTGTTTTTACTGACAGAAATCTTAGCTGATCTTGCTGCAGGTGCAAGAACAACATGAAC[A/T]ACCTTGTCCTGTCACTTGCCCCTAGGTTCACAAAGCTTCAGTCTCTCAGTTTACGTCAAA

chr1-100101702 CAACTGGTGATTTTTACATTTGCAACAATTTCCCTTCTGGTTCATATGCAATGTTGACAT[T/C]GAAGTGCATACCAATGGATGCGAGCAAGACCAATTGTCTGCAGATGTGCCATGGAGGCAC

chr1-103758417 GTGTGTATATACCCACAAGCCTGTCATTCAACCAAAAAAATTCATCATTAGGTGTTTTCA[A/C]GGCTACCTAATAAATATATTCAAATTCTGCAGATAGATATACAAGAATATGTCTGATTCT

chr1-104554079 TTCCTTGGATTCATGTTTCATTTATTATTATCTTTCCCAGTGCATTTCCTCACCTGCAGG[A/T]TGCTCACTCGTACCGTACTCATACCACCTGATTTCTTTTCACATTATGTATACTGTCAAT

chr1-104705343 ATGAGCGGTCAAGCTGCAGGATATGCTGCAGCTGATTCTGTTCAGGTACAACTTCTATCC[T/G]TCCTTTTTTTCGCTTGAGAAGTGAATTCCATTGCATTAGTGAAAAGAACGGCGAAAACTT

chr1-104716546 CCATATCATCAGCATTATGTCCAGTAACAAGTTTCTCTGCTTTCATAACTGCAGCACCTC[T/G]ATCTAATGCCTATGATAATCAAGTGAAAAATAAAAATAATGTATACATAACTCAATGCAA

chr1-105342929 ACCTGATCCGGTTGGGCCTATTACAAGAATGTTGCTTTTCTCAAGCTCCACAGTTTCACC[A/G]TCACTTGCATTAGCTTCACCATTATTTGAATCTCCTGCAGGCCTAGACCATAAAAATTTA

chr1-112482584 TGCCCTTCACTTTTGACTCCAAAACAAATGAATGCGAGACAGTGGAACCACTGCAGTTTA[T/C]AAAATCAATTTTGATGTGGAAAAATTAGAGAAGCAACATCTTGAAGAGAAACAAAGGTGC

chr1-112781600 TTGCGTGTGATATGATTTCTATCCTCTCAGCATTCTCTAAATGCATAATGGTCAATTTGG[T/A]ATTACTATTTTGAGCTTGATGGAATATTGAAAACAACCAAGTCAATCAGGCTGCAGTGCC

chr1-117139360 TTATTCTGTCTCTGAACTGCAGGGAATCTCCGAAGACACCACAAAAAACCAAAATTATCC[G/A]GATTACTCTGCTGTGTATCAATTCAGGGAAGTACAAAGAAGGATGGTAGAGTTCATAAGA

chr1-120474539 GAGTGAGGGAATGGAAGTGGAGTGATCGCAGGAGATCTCGTAGCTGGTAGGGCTGCAGAA[A/G]GAATCGGAGGAGGAGAAGGGGAAGGAGACGGTGACGTTGCCGCAAGTGTAGGGAGCGCAG

chr1-122491505 ATGTAACATGGACGACAAAATAAAACTGCAGTAAACTCAACAAATGAAAAGGAAATGGCA[A/G]TGTGGAATGCCTTCTGCGTTCTATCATATATATTACCGGCTTCTTTGGAGATACTATTCA

chr1-123730656 ACTTGTTTAGACTCATCTATAAAAAATAAAATGTGTGAATCTTGATAAATCTTTGAAAAG[A/G]ACTATAAATACCTGCAGGTCTATCAACAGGCGAATGCCAACTTGGTCATACTCTTGGGTT

chr1-134745268 TTCTTCTTGGTTTTCCTCGGATCTCTAGTGATTTGGGTTTTGATTTCAGTGAGGGATGCA[A/G]CAAAGATGTCCCTGTGGTGTTGATTGACATGCATAGCTGCAGTCTTGATTCCAAAATCAG

chr1-136272150 ACGGCGATCACGATCACATCACACAACCTGGCGATTCTCCGGCAGAACAAATCATTCGCC[T/G]GCGATGTATTACTCCCGGACACGAAGGCGCCTCCATGGAACTGCAGCATCACCGGAAGCT

chr1-138043956 ATGCAATTGATTATTACACTGCCGAGATCGAGCAATTAACTACTGCAGTAAGTTTTAGAC[G/A]CCATATAAGAGACAAATAATGCTTTTACCTCTTGATAGGAGCTTCATGAAAACTTAGCTT

chr1-138539289 GCTCCAGCACCAGAATCATCAGCATTAGCTTCAGCAAAAGGATCTGCAACAAGAGGATTA[C/T]GTCTGAGAAAATCATACAAATAGATACTGCTACTGCAGCTAAAACAGGGTCCAGCATCAA



chr1-141675050 AGATCGTTTTAACAACTTCCCGGAAATTAGGTGGAAACGGTGCCCCTGCAGGAAAAGTAT[T/C]GGTTATCCACATGAAGATTTGTCAAAGGAATCATCATTCGGAATACCAAGACCATAAAAA

chr1-143554901 GCGGCCGAGGCCGGCGAAGGTTCCGGTGAAGGGACGGCATGTCTTCATTACCGGAGGATC[T/G]TCGGGGATTGGGCTAGCAATGGCGCTGCAGGCGGCGTCGGAGGGGGCTCGTGTGTCTATC

chr1-148404846 TATATGTCTCTAACTAACCTCAAACCATTTGATCTCACGCTGCATCTGCAGTGCAAACCC[T/C]TCGTCTTTGATGGTTGTTACAGCAGCATAATGCAGGATAGTGTTGTTCATCTCATCATCT

chr1-149711586 CGGCCTGGCAAAAGAAGCTTTCCGACTTTTCTTTCAGATGAGGAATTCTTCTATAGAACC[C/T]AATTATGTGACGTTTCTTGGTGTCCTTTGTGCCTGCAGTCATGCAGGCCTGGTAAGTGAA

chr1-152446535 TGCTGCAGATTATTGGCGATGGGAATAATGAAATATAACAATGACTGGGCATCCATTCGG[C/A]GGCACTATCTTCCTTGTAAAACTGATCATCAGGTTATTTCTATTCTAGTTTATTGAGGAT

chr1-152450683 GCCTAAGCGCCAAAAAATAAATAAGGATCGTGCTTGCAAGAGTTCTCCAAGTGCACCCAA[C/T]TCTCGTCCTACCAGAACAAGCAAAAAACGCAATCCGGAGAATTCCAACCTGCAGCATCTT

chr1-153561161 CTCCACAGTCGAATTCGAATTGCCAAACACAATGCACCGTTCTGGTATAACACTAAGAAG[C/T]TGAGCCGCATAAACAAACATCTCTGGATCCGGCTTCCCTCTATGCACATCCTCTGCAGCG

chr1-159629409 ACAGAATGTTGTTAATCATACAAAACTAAGATCAGGTTCACTAAGTGCTGCAACTGCAGA[G/T]CAGATTGCTGTCATTGAGATGTTAGTGCCTTCTGTTTTTAGGGCAGTTGTGTCATTGCAT

chr1-159654494 AGGATATTTCTACGTCAATGCCAAAGTCTGCAGACAGAATATAACTTCAACTACTTTTAG[C/A]AAGACTCGTGTAAATAACTGCTAACATCACAGAATAAATACAGCAATTCAACAAACATCA

chr1-161850144 GAACTGCCTCGGCATCCCTCGCTTCAGTGGCTGCATTTTTAGCTTTACTACCAAGCTGAA[C/T]GAAATCCTGAATTATCCTTGCATTTTCACCAATTTTCCACAGAATATCTGCTGCAGCAGA

chr1-164969922 AAAACACCAAGAACATGCTCAGAAGACAATAATACCCATAGCAACCGGATAATCAAAATG[C/T]TCTGCAGCAGGATCAAGATTCACAATGTGCATGGTCCTCCGAATAGTTTCACAGTGTTGA

chr1-167405118 TGCAGCATGATGGTCTCTGTCCTGCGTCAACTATGTAGTACTGCAGTGTGCCAATACATT[G/T]ACCAGGAACTCAGGCCATGATTAGTAGTTTGGCTTCTCAAGCTTTATTGGATCAGGTTCA

chr1-168937501 CTCTCACAAGTTCAATCACATACATGATGCATCTGCATATAGATAAAAAGCATATGCTTG[C/T]GTATTTATCTCACCAATATGGGAAAAAGAATAATCGTATATTGTGGTGGGGTTCCTGCAG

chr1-169899136 CCTCTAAACAAATATCTTAATGTAGTCTACTCTGCAGTATTGTTTTCATTCTAACTATGC[T/A]ATCGATAAATTTGTTTCTACCAATTATCATATGCTATTCATTTTCCGATGCTTATTAGTT

chr1-176815103 TTACTGCAACTCAATTTTAGCATGCCATGCCATAAAAGAAGAAGCTTAGCATGCAATTCC[G/T]CTTTTTACATGACATGTCATAAAAGAGGCAACTTAGCATGCAACTGCAGATCTTGCCTGT

chr1-177458315 GACTCAAGGCTCAGTGTCATCTGAAGGTGCCCAACCATCATCCTCAATCCCTGCAGCACT[C/A]CCTGACTCAAGTAATCCAGAATCAAACTGTCCTGACTCCAACCAAAAGTTTGAAGGTAAT

chr1-187511304 CAGCTGAAAAAAGAAACAAAGTTTGATGAAATGCATATCTTGATGATGAAATGTGAGATA[C/A]AAGTGACTGCAGTTGGTGACTCGTACGAGTTGTGCTTAATGACAAACAAAGCAGCCAGAT

chr1-188270158 CTTATCTTTATACAAAGCTGCAGTTGATAGACCAAAGGGGTCATAAAGAGTTACTATTAG[T/C]GCGGCAATGGATCATAGAAACTAGCAAAACCTATCATAAAGAAGTCAGATTATCCAAGCA

chr1-194851236 CTACGGCGCAGATTAGTGATGCTATGTTAGTTTTATTGTCATGGTGAATCTATTTATCAT[C/T]GATATAACATTCTATCTGCGGAATAATTCGATGTAGGAACTATGTGTCTGCAGGCTTGGT

chr1-194922339 AATGTATTGCAAGTTTGAAGTGCATGCATAGATTTTATGGCCTCCATTTGGTACTATAGT[C/A]TTCTTGAATATGCTGCAGAAGTAATATATTTCTCAATTTGAAATGTGGAAATGCATGTAT

chr1-200898167 ATGTGGCATCAATTCTGTCAGTCCATGCTGATTCAATTAGGAAGATAAATCTTCATGACT[T/C]TGAAAGTCTCACAAAGTTTTTTGAAGGTGCTGCAGGAGAACCTTTTGAATATACTTTACC

chr1-207546035 TAAAACACTATGTTTGGCAAATTGCACAATTTGGCTTCGCCACTTTTAGATAATTGCAAA[C/T]TGCTTGTTATAGTTATTACTAGTTAGCATCTGGTTTGAAAAGCCTAAGTTTTTGCTTTCT

chr1-215210599 GCTGCAGGGAGAGAGGAAGAGGAAAAAAAGAGGTGGTAAGTACTCATCTCGTCTATGGCG[G/A]CCGGGTTGCTTCCGAGTTGCCGCCACCGATCCTTCTCCGGCGAAGACTGGTGCAGAGGAG

chr1-215931800 AAATTACCTGCAGATCAGGGGTTCTTCGTCTCGGATTCTTGGGCGCTGGGGTTCTTGGAG[A/T]GGAAATGGGGATCGGGTGGACTGCATTGAGATTCGAGATGGAAACAAGGGTTTCGAATTT

chr1-220358774 GGGATTGACAAAAGCACAATCATTTACATGCTGCAGATTCGGCAGATTTTGCTGCAGATG[G/T]TGCTCCACCATCATCATTGGCAAAGGGGTAGCCTGATTTCCATGGGACACTTGGAGAAAG

chr1-220443240 TGAATCTGATAACTAAAACAAGTAAACAACAAGTTACAGTATGCTGTACTGAAATGTGAA[A/C]TATAACTCAACATCTATAAACAAATTTGAGCAACTTATTTCTATTCTGTCTCAATCTGCA

chr1-223956293 TAGTAGTCAAAATAAAAGTAACCCAAACATAAAACACACCTGATGCGATATCATGGCTGG[C/T]TCTGACTTGGATTTCTTCAGCTCTAGCAGTTATGGAAGCATCATCCATCAGCTGACCTGC

chr1-225694107 AAAGTCCACCTCTGAAAAAGTTACCATTGACTTCGAAATGGGTTCTGCAGTCAAACATTG[A/G]AGTCAAATGTCACACTTCTTCTCCCGCCTAACACTCTCCAATCTCATGAAAAGGAAAATG

chr1-241317177 TATATGATTGATATATTATTTCTGCTTATGAGGTGAAGGACATCTTGTTAGGGATGCATT[G/C]AAAGGCCAAGTTTATGCTAGGCATCAGTGTGAGGATCCAGTGAGGCTTGGCGAACCTGCA

chr1-248121039 AATGCAAATATCATTAGGTTTTCAAGGACGAGCAATTTCTACGTGCAGCTGCAGACGCTG[T/C]AGAAGTGGTTTGGAACCGGGGGCTGCTAAAGAGGGTTGGAATATGCCATGGAGTGAGTGG



chr1-253646575 CAATTTTCAGTAGTAACTGACCTTTGAGAGTCTCTGCAGTGCCTACATTCGTCTTTTGAT[G/A]TAATATCCAATGCCGGGGAAGAGCTGAAGAAGGCTGTGGAGGAGCTTCAGCAAAATCTAA

chr1-264638132 TTATTGCTGTTCTCCTGGTCACCATCATGGCCTTCTGGTCATCAGATTATCATATGCAAA[C/A]ATTACTAGGAAAAATTTCATGGACTTTTGTTGCAAAATCAATGATGTGTCATATGACTGC

chr1-266790035 GATTGTATTGAAGCCCAAGCAGGAAATGGTGGCTAAATCTGCAGCACAGATTGTGAGTGA[G/A]CAACGTGGGAAGTAAGTGTGGCTTGAATCCTCTCTTTATGGTCCTGTTTCAGTCTTGCCA

chr1-268783790 ATATATAAAGCTTTGTACTTGTTGTATTATCAATACTGTATCTTTTTGAAGGTTATTGTT[G/A]CATGTATTTCGAACTAGATATCTGCAGGTTTTCAAAGTTGATTGAGGTGTGTATGTTCAT

chr1-275668018 ATTAATATTAAATAAGATGAAAATAACTGCAGGAAGAATGAGGCAACATATCTAACATTG[C/T]CAAACTAGTCGCATGGAGTATCTTCCTAAAATGCTTGAAGGGACTTACCACCAAAGGAAT

chr1-279910017 GGCAGCTTCCAGGGCTCGGGAGCTACCAAGATGGAGTTTGCTATCCACGGATTTGTTCCA[C/T]GAATCTGTAGCTCCATCGTATACCCTGAGCCTGCAGCCGTCTCTGCAGTCCAGAGCATAA

chr1-281113016 CCTGTGAAAGAACAACTTTGGTTCAATGGCACATGGTAACTAACTGTTGTTTACCTAGAG[A/T]GATTATGGGCTAATGAACACATAACCCTTTCAAAGTTTTGTGATACCTGCAGTAGAGGAT

chr1-282880967 AATCTTACCTCTGTGATTTGATTCTGCAGTAATTTCAAAATCAGGAGCAGGGCAGCTGGA[T/C]CTTCTAATATTGGATACACTGTACAAGGTTGATTATCCTCTTTTCCTTTCTGCTATGTCT

chr1-284067696 TGCTGGTATATTCAAAGGGTTTTCCATATCTTGCTCTTTTACAGGAGCATCAGAACAGTT[C/G]TTGGGTATAAATATTGAATGGCTGAGCCAAACTAACATACTAAAGAGCTGCAGTTAGTAC

chr1-287120685 AGTATGACGGCAATGTCCACGGAGGTGAGTGCCGGCGATTTGAGGGAAAGCATGACGGCA[A/G]CGTCCCCTGATGCGAGACCGGACGATTTGAGTGCCAGAACGATGGGAACGTCTGCAGGGG

chr1-289294117 AAATTTCAAGATGTAAACTAAAAAGCATGCGAAAAGTTTACGATAAATTTGCTGCAGGCT[T/G]TAGCATTAGAACCACATAACATATACTTGTCAGTGTCGACACCACCGCTATCTCCAGAAT

chr1-293682610 TCATTTGAGACTTGGTTTTATAGAATTTTCTTTTTGGAAGTTGATAGTTCATCCATATGC[C/G]TGTACATTACTTTCACTAAAAAAATAGCATCAGGGTCTCAAAAATGGTTTCTGCAGTTGA

chr1-304925865 TCCATCTGACACCAGCATGTAACTGATGATGACATTGAAGCACTTATTTCTGATGAAATA[T/G]TCCAGACTCAGGTGATATGGTTGCTTGGTGATCTGCAGGTGAAGTCTCAGTTCATTATTT

chr1-318331393 ATCCATGCAAGGACTTGAGAAACTTATGAAAGAGAACAAGTTGGATGGTATTGTGACACC[G/A]GGTGCAAAGATTGTAAGTGTTCTGGGCATTGGTGGATATCCTGGGATCAGTGTTCCTGCA

chr1-321999704 GACTGTTGTCTATGCTAGTGCAAAGGACATATTGCATTGTCTGCAGATAGAGAAGGCAGC[A/C]CCAATAACAATAAAATATATGGCAAGTTACTAATGCGTATCATTGCAAACAGAAAAGGTG

chr1-329502524 CCTTCCCATTGCCATCCCTTTGTACAATAATCAAAGCAAAAGATAACAAATACCACCAAA[T/C]ACTAACCATGCTCTCAAAGCAATCCTCGCACACCACTCCCTTTGACGACCTCGTGAGCTG

chr1-336507130 AATACAGCTTTGATCCCGGGCGGACTTGTTCAACATTTCCGAGAATTACTCTGCACAAGA[G/T]TATATACTGGATTCCTTTTTCGTCAACATCACAAAGATTCACGCTGCAGGTCAACAGAAC

chr1-336727643 CTTCCGGAGGGATGCATCTCGACTGTGTTCTCTCTAACCTCGCCAGCAGATGTATGCAGG[A/G]CTGCGATGGTCTCCCCGGTATTCCGGTCAGCCGCCGCCTCCGACACCGTTTGGGAACGCT

chr1-351412860 CAACCCTGTCATCAATTTAAATAATGAAGATTCAATAATACCTGGTTTCGGTCCTTTTCT[A/G]ATTGCTCCATTATCGTAAAGACTCGCTCAATTCCCAGGCTGACACCAACTGCAGGGACTG

chr1-351412926 TCCATTATCGTAAAGACTCGCTCAATTCCCAGGCTGACACCAACTGCAGGGACTGCCTTT[C/G]CACTGAACATTCCAACCAAATTATCATAACGTCCACCAGCTGCAATGGAACCAACCTAGG

chr1-352413390 CTTTCTTGGCAAACAGTTCTGCAGTAGATTTGAAGTCAGCTTCTTCTACAAGTCTACCAA[A/G]AGAGGATTCCAAGTCAGTGAATGGATATGATCAATTTGCATGACTGCTTGAAAAGTCGGG

chr1-354851895 CAGAGATGCAATGAGGAAGAGACATTTATATAATCTGCAGATGACTAAGTCAAACTCTAG[T/C]CTGTTTCTAATTCCTTTCTCAGGTTCTCCACCCACCAGTGTAGAGTTAGCTAGAGAAGAT

chr1-361267627 GTGTGTGTATGTAGTATTGGGCCCGATCGATGTATACTTGAAACTGCAGCACACTACCAC[C/T]GAGTACTAAGTTACTAACCACCGCGCTTGCTACTCACTTTATACCTCACGTGAAGCCTAC

chr1-370493692 TGAGCAACAAAGTCTGGGAACACCAACCTCCATGGCTTTCTTAACTTGAGCTGCAGCATA[T/C]GCATATACAGCAACCTCAGGGCTGAAAATATTAAATAATGGTATCACATCAAGTTAGCAC

chr1-370545721 TCAATTCTTGCTGTCTGACTGACAAAGTTTGACAGGGCACTAGATTGGCTGCAGATTATG[G/A]TGGTGTTTATTTGACTTCAGTTTGGAGAGGTTCCATAAAAAGTGAATTTCTAAACTCTAT

chr1-371206807 GTGACTCCAAAAACTGCAGATGGGTCGGCAGCAACAGTTTCAGAAGATATTATTGCATCA[C/A]CTGCTGATGAACCCCCAACCAATGATCTTTCTGGTTTAGTCCTAGCTTTCTTAGGTTGGG

chr2-4597706 ATTTGTTTGCAAGAAGGTGATAATGCAGTGATAATAAATAAACAAAATTTGGATAAATAG[A/G]CTTGCATGAAGAAAATTCTTCCACTAAAACAGCTGAGATAGTCACCTGCAGTGCACTATC

chr2-11085125 TAGGTTTTGCGGCTGTTTCTGTTTTATGGTTTATTAGGGTGTACTAGATTTGTGTAATGG[A/G]TTAGATGCAGCTTTCAATAATTCTGCAGTGTACTGTACTCCTTTGTAAGATCAGACGCTG

chr2-11177319 CCAAATGGGAGGCTAGTTCTGTATTGTAAGGTTATCATTGTGACTCAAATCTTCATATTT[G/T]TTTCTCCTATCGAACAACTTGGCCCCAATGAAAAATGGTGCTCTGCAGGGTGCCGATTCT

chr2-22871079 GTATATGACAAGGAATTCTCAACCCAGAATAACTAGTGGTGGAAGCAATCTTGGAATTCC[C/T]GCTGATGGGACAAGAAATTGAAGCTGCAGAGTCACCATCTTCGACTTCATGACGAGAATT



chr2-26769535 TATTGGAATCGAATACCGAATGTTCATTGTGATGCATGTTCATATTTTCTTCACTAAAAA[T/A]TTGGAGAAGTTTGTTGGTAATTGGACTTATTCTTGTCTGCAGGTATTTTGGTGAAAAGTA

chr2-27530335 CATCTCACCTGCAGTAGTCATCAACAAGCATAAAGCTTCTATATTTTTTTCATCAGGATT[C/T]TGATACCCTTCTAACAACTTCTGAATGATATGATGCATGAGTTTTGAGGGCATCATTGTC

chr2-38984426 TGCATCTGAAATCTTCGGCATGAGCATACAGATGCAAGTAGACCCTTTGTCTCTTTGTCT[G/T]TGTGTCTCTCATGGTTACGGAATGATTGCTTTGCAGGCTCAGGGACTACTGCAGAGTACA

chr2-42909623 AGACCCTTGTGAACTAATCTAATGAAATTAGAATAATTGCAGAAAACTCATGTGTGCAAG[G/T]CCTCGAGGAATGACACAGTGCTTCAGAACAACAGAGTTCATCTGCAGTAATTGTGATTGC

chr2-44577106 TCTTCTTCTGCAGAGACATGACAGAATTGACTTTAGCCTTCCAGAAAAAAGCACCTCAGA[C/T]TATGTAGTCTTGTGGTTGACAAAATAGACTAAAGTTCACAATTCTTACCTGCAATGGACA

chr2-49944371 CCTTTATTTGTCGCACGTCATGTCTGAAATTGTATGACATGTATACTGAATTTGAGTAGC[G/A]AATAAAACCTGCATATTTTACTGCTAGTTCATGATGGTCGGTATTGTTTTTCCTGCAGAG

chr2-54601557 CTTCCGAGCCTCCCGCCTCGTCTGCCCCTGCAGATCTTGCGTTTCGGCCGGCAGCCGCCC[A/C]ATCCGGTGGTTCCCGCTGGGGCAGTGGCCCTATTCGTGACGCTGCGCGCCATGGGTTTGG

chr2-56930568 CTTGTATAAGAACACCTTCCATCCCCAACGGCTCCGCAAGCAACCAGCAAGCAGGAACTT[C/G]GATCATGGAGGTCCTTCAATGGCTTCTTCTTCACTGAAGATCTAGAGCAATGCCTGCAGA

chr2-58198829 AATGGCATACAGGTCTAGATTTCCACTCTGCAGATCAAGTAAGAACTCCTTTGCAGTTGC[T/C]CTAGCTTGCTCATTCCTCCTGAAAAGGAAATAATATGTGAAAAACTATTTAGCCCCCGCT

chr2-59331218 ACCACCCTCAGCTTTGTGCTTGGCCAAAGCCGGAATGTCTATGCCATCGGGCTTTCTGAT[T/C]GCACCATTTACATCTGAAATTGCGACAATCTTGCCACCTCTACCATGTATGAGATCTGCA

chr2-60474133 ACCTTGGTTCCTCCTGCAGAACATTTAGTGGAAATTTACTCATGACTAACAAAGTTTCCA[T/C]CCTAGGCCAACTTGTGCCAATCGCCGGCAGCTGAACCTCGCTTCATTGTGCTTGTCACCA

chr2-60538036 ACAATACCCACAAGTTTGGCAACCCGATCTGCAGGAACAAGAAGAATCCACCAAACAAAA[A/T]ACCTTAGATGGCTAGATGCAGCAAATTCAACTGAACAACAAGCCTTGATGCCAGAATCCT

chr2-64299996 GACACACGAACTCACGTATCAACTGGGCAGAGAAGCATGCACTCATCCCCTTGAGAGCTC[C/T]GAAAAACTCTTCTAATTGTGCATTCTAGAGGCAAATTATTTGTAGCATCAACCTGCAGAT

chr2-65411854 TTTCTGAAACTTTTAGATGCTTGGACAAAGCAGCACTGCAGATCAAAGAAGATGGTTCAG[A/G]CCCTAGTCCATGGAGGCTCTGCACTGTGACACAAGTCGAAGAAGTGAAAATACTCGTGAA

chr2-66796155 AACATAAACAACCAATTTACTTCGAATCTGTATGTAATCTGCACTGCCTGCAGGGGCGAC[G/A]AAATTCGTTTATGCTCCGGAACCATTTGATGTTGGGCGATTCTTGCAAGTGGAACTTTTT

chr2-68428035 ATCATATGTCAGGATCTTGTTTTGAAATCTTGTTTTGAAATTCAAAGTCAGGCTCTGTAC[A/C]TTGTGATTTACACTGCCTTGTAGCCTTGTTATTGGTGTATCATGGTATTCAACTGCAGTT

chr2-68614579 TCTGGAGTCTCTGCAGTTCGTGATTTCCCAATTGGAACCGGAAAAGACACCACAGATGGT[A/C]GTAGTATCCCTGCAAGACGCCGAAGTATGGATGACACAATGGTGCTTATTGGTGGTTCAG

chr2-75408946 GTTCAACATGGCACCAAGTTCACAAGGGCATCTCGAGACTGATCTTGGACTAAATTTACA[A/G]CTGTTTTCTGGTGAAAGGGTGCAGGGTCGATACCCAGGTTATGCTAGCTCAGTTACTGCA

chr2-82823480 AAAAACTCACAACCAATACCTGCAGGTTGGGGTGAAAGCTCCAGGAACACCAAAGAGCAC[A/G]ATCTTCTTGCCAGCGGCGAGGGAATGGATGGGGACTTGCTGGAGCTCATCCTTCTCATCG

chr3-4276754 GGATTTATATATACATAAATGGCTTCATTCTCAAGGGCTGAGATGAAGAAGGTATTCAAC[T/A]GTTTTGATGAGGATGGAGATGGAAAAATCTCTGCAGAGGAGCTGAAGAATAAAATGAGAA

chr3-6085930 ACTAAATGAGAATTGATGATACAATCAGTCCCCGAATGGAACACCCGCAAACAGGGCAGG[A/C]AACCCATTCCACATCATATGGAAGGTCCCCAGGTTTCTCAGAATGTGCAGCTGCAGAGCA

chr3-12262342 GGCAAGCAAGCTGAACAAGAGTCCAGGCCAGGTTCTTATCAAATGGGCACTGCAGAGAGG[A/G]ACTAGTGTGATCCCCAAGTCCACCCATGCTGAAAGAATCCATGAGAATATTCAGGTTTTT

chr3-17461752 TGAAGGCCTATACAAGCAAGGCATAAGAACACCAACTGCAGAACAAATACAACAAATCAC[A/T]TCAAGGTTGAAGCAATATGGCTGCATTGAGGGCAAGAATGTCTTTTATTGGTTCCAAAAC

chr3-21831647 AATTTAACTGCCTTGACGACAAGGTCTGCAGCTTCCAACATTCTTTGGATAAGGGAAGTC[T/C]GTTTCCCTTCCTTGCCAACCTCCATTTGTTCTCATTCCTAGCAGCTGGGACATATAGAGG

chr3-29087692 ATGCGAGGATGGGCTCCCGGTGCTGCTCCAGCTGATCCTCAAATTCAAGGGATCCCTACT[G/A]CTGGTGCTGCTGCTCACCAAGATCAAGCTGGCCTTCATGGTGCTTCCGCTCCTCCTGCAG

chr3-41959527 GTAGCCAACTTTGCTTTTGGTCAATGCAAGCTGATGGATATCAGTCAGCGTTGGTTGGAG[T/C]TGCTGCACTGTAAGCATTGATGATAAGCTTGCAGTATAACTTTGCTGCAGAATCAGGACT

chr3-54014897 CAATAAATTTAGAAGCTCTTCTTCATTTTGTTCAAATTCGATATATACTAGATATGTTCC[A/G]TTGTCAGATAGGTCTGCAGGTGCCACACATTTGATTATCAAAAACTTGAATAAATCTCTG

chr3-62771502 AGAGATCCTAGCCTGTGATAAGACATCACTCAGATCACCTTCCTGCAGGTGATCTATATA[G/T]TTTGGGAAAATCTCTTTCGCTAGATAAGTGGTAAGTGAGGTCACCATTGCTGAAATCCAC

chr4-5274324 GCATCTCCAGCTTTGCAAGCTCATTTCCAGGGCAAGAATGGGTCCCATTCCCAAATGGCA[T/C]GAAAGTGTTAGCCTTTGGAGACCTCTGCAGTACAATAGAGGAATTCAAGTGCATCTCTTG

chr4-10074500 AAAATTACTGTTCACGCGACCGCGTCAAAATCTCACGCGACCGCGTGGAAATTCTGCAGC[C/T]CACGCGGTCGCGTGAAGACACGCAGTTGGCGCGATTCAGGCTTATAAATAGCCCTTCTCG



chr4-24338235 TTGTCCAGAGTTGTTTTCACCATTGGTAACCATATGGGTTGTCGATGATAAAAGTGTAGC[G/A]GCAGCATCAGGGATCACCTTCGCTGGTGAGTTCTTGGTCTCCTCTGCAGTAACAAATCAT

chr4-28712264 ACTCTCTAAATGCATAGCTAGATTGTATTGCAAAATATGTGTAGCCTGATTTCCTGCAGG[T/C]CCCTTTATTTTGTTTGTCATAGCACATTATTCTTCTTCTGTCAAGAGAGGTCTTTGGATG

chr4-40960807 ACACTCAGGATCATTTGATGTCACTTATATGGCATGCTTGCCAAACATGGTTGTCATGGC[T/G]CCTTCTGACGAGGCTGAGCTATTTCACATGGTAGCAACTGCAGCGGCCATCAATGACCGT

chr4-41353083 ATACCATGCATGTAGAACAGCCCTTTATGAGAACCCAACCAGGCTCTCCAACTCTGGTCC[A/G]ATTCCCATTTACTTTCATGATGCCAAACTGTTTCTTCACTTGATTGTTGTATATCTGCAG

chr4-42253940 AGTTGAACATCTAATATTCATGTCAGGATCAGTTCACCAAAGATTTGATCATATGACTAA[T/C]CGCGTATTTCTTGTATATCATAGACACGAGAATCATTCTGCAGAAATAGCGATGTCAAAT

chr4-42800180 TATGTGGACTGCAATTCTAAATTTCGCTCTCTTATTTACTGCTTAGTTATTGATGAAATA[A/G]TCTCTCCTGAGGTTCAGCTGTTTTACTAGCTTGTTCATGTTCTTTTGCTGCAGATCTCAT

chr4-46153419 CCAAGCACAACCGAGGAACTACGCAGGTTCATGATATTGTACCAAAGAATAGGGGAGTTT[T/C]GGTAAGAGTAGTTTGTCATAAGGCAGTGCAACCATATCTGCAGAGTAAATAATTAGAAAA

chr5-2696102 CTTAAGAAGTCCTACAGCTCGCCATTGATTTGGGCTTGTGTAACCTGCAGAGGAAAAGGA[A/C]AGGAATTTGGATGTAAATAGTTATCTGTACAACTTGTGAGCCATTTGCTTCTTCTAATTC

chr5-12429240 GATTTGACAAATTTGAGTGAATCAAAGTTCACAATCAAAGACCAAGGTTCATCATTGAAA[A/G]AACTGAATTTTACAAAATTCTTAGATTGCCTCCAAGTAGAAACATGAGAGATCTGCAGAA

chr5-12429334 AAGTAGAAACATGAGAGATCTGCAGAAATTTTCAGATCAAGAAAGAAATCAGGGTTGTAG[T/C]ATGTCCATATCAACTCACATAATCAGAGGAACTAACACATTACCATGACACTAAATGCTA

chr5-15951507 TCTCCAACAATGGCGATCAAGAGTAAGCGCTGCAGAGTAGAGCTAGAGTTTCCATTCGAG[A/C]GCTAGGGTTAGGGTTTGGTTCCGTAATGGCATTGGAGCTCGCTCCCTCGAAGGGGAGAGG

chr5-19451641 AAATCATAAATTTCAAGATTCTGAGAAATGTAGACACCTAAGACAATGACATATCCGAAA[T/G]TCACATTATTTGGAGAACTACTCAACTTGTAACATTCATTTGAACCTCCAACTATTTCTG


Annexe 3

Posters présentés à l’« International Citrus Congress »

18-09-2016 au 23-09-2016

Foz do Iguaçu ; Brésil


Poncirus phylogenetic diagnotic SNPs markers are useful to analyse zygotic rates in diploid and tetraploid Citrus x Poncirus rootstock seedlings

APMV

Funding: Feder Guadeloupe “Cavalbio” project

Diploid Citrus x Poncirus rootstocks are used by the citrus industry worldwide. A new generationof promising allotetraploid rootstocks (doubled diploids, somatic hybrids and tetrazygs) have alsobeen developed. As citrus rootstocks are generally propagated by seeds, the rate ofnucellar/zygotic plants among seedlings is a key trait for the production of genetically conformtrees. Isozymes and SSRs have been successfully used for the detection of zygotic plants in diploidseedlings but their application in heterozygotic tetraploids is more difficult. In this work we havedeveloped new nuclear SNPs markers (KASPar technology) phylogenetically diagnostic of thePoncirus genus (DSNPs) and therefore heterozygous for all Citrus x Poncirus intergeneric hybrids offirst generation. They were applied to evaluate the rate of zygotic plantlets in seedlings of diploidand tetraploid rootstocks.

Introduction

Zugotic plants

TTTC

Bruyère S1, Luro F2, Froelicher Y3, Morillon R1 and Ollitrault P1

1 UMR Agap, Cirad, Station de Roujol, F-97170, Petit-Bourg, Guadeloupe; 2 UMR Agap, Inra, F-20230 San Giuliano, France; 3 UMR Agap, Cirad, F-20230 San Giuliano, France.

• DSNPs were mined from sanger sequencing of candidate genes for abiotic stresstolerances and additional gene sequences providing a coverage of the 9 citruschromosomes.

• A total of 45 (5 genes/chromosome) gene fragments were targeted and amplified by PCRfrom one representative of each of the Citrus basic taxa (ie: C. maxima, C. medica, C.micrantha and C. reticulata) and 2 Poncirus (Pomeroy and Rubidoux).

• Sequences were aligned with BIOEDIT software and SNPs differentiating totally the fourCitrus accessions from the two Poncirus ones were selected to develop KASPar markers.

• The inter-genus diagnostic value of the successfully developed markers was checked in asample of 31 accessions including 12 Citrus, 5 Poncirus, 8 intergeneric (Citrus x Poncirus)hybrids, 2 Fortunella, 1 Eremocitrus, 1 Microcitrus, 1 Clymenia, 1 Murraya.

• The validated DSNPs were applied to identify zygotic plants in seedlings of diploid anddoubled diploid Carrizo Citrange, 4475Citrumello, Cleopatra x Poncirus Citrandarin and ofthe tetraploid somatic hybrid FLHORAG1.

Material and methods

KASPar markers were developed from 44 potential DSNPs. Sixteenprovided technically inconsistent results and were thus removed.Among the 28 remaining markers, the 1P1141520 marker was not fullydiagnostic of the Poncirus genus but of the Citrus/Poncirusdifferentiation (Figure 1B) and the 3P342458 markers did not displayheterozygosity for the Citrus x Poncirus hybrids and was removed. Bythe end, 26 poncirus DSNPs KASPar markers plus one diagnostic markerof the Citrus/Poncirus differentiation were successfully developed(Table 1)

Results

Carrizo Citrange

4475 Citrumelo

Cleopatra x Poncirus

CitrandarinFlhorag1

2X 1.1% 0% 5.9%

4X 3.6% 29.8% 2.4% 5.9%

Table 1: Selected KASPar markers

Figure 1: Example of genotyping results with KASPar markers for 30 « true citrus » accessions plus Murraya paniculata.

A B C

Poncirus accessions

Citrus x Poncirus hybrids

Non Poncirus accessions

Water control

A: perfect Poncirus diagnostic markers with complete differentiation between the fivePoncirus accessions and the non Poncirus accessions plus all Citrus x Poncirus hybrids inheterozygosity (5P14956622 marker)

B: the Poncirus allele is shared with Clymenia polyandra (E6), Eremocitrus glauca(F6),Microcitrus australis (A7) and Murraya paniculata (B7); however it is a perfectmarker of Poncirus/Citrus differentiation (1P1141520)

C: Interspecific hybrids does dot display heterozygosity. Therefore it is not a usefulPoncirus diagnostic marker (3P3424583)

Markers Scaffold Position SNP Gene

1P1141520 1 1141520 A/G Ciclev10008100m.g

1P11229738 1 11229738 C/T Ciclev10008610m.g

1P25641955 1 25641955 T/A Ciclev10007908m.g

1P28585533 1 28585533 G/A Ciclev10008091m.g

2P4896487 2 4896487 T/C Ciclev10015783m.g

3P14994208 3 14994208 T/C Ciclev10021170m.g

3P23008479 3 23008479 T/C Ciclev10018655m.g

3P25648486 3 25648486 C/T Ciclev10021021m.g

3P28405925 3 28405925 A/T Ciclev10020481m.g

3P46649515 3 46649515 C/T Ciclev10018822m.g

4P6610895 4 6610895 C/T Ciclev10030962m.g

4P9553887 4 9553887 A/G Ciclev10030474m.g

5P2054006 5 2054006 C/T Ciclev10000216m.g

5P14956622 5 14956622 T/C Ciclev10002429m.g

5P20077026 5 20077026 T/A Ciclev10001966m.g

5P34258651 5 34258651 T/C Ciclev10001308m.g

5P42490333 5 42490333 C/T Ciclev10002349m.g

5P42707277 5 42707277 A/G Ciclev10000951m.g

6P2293706 6 2293706 A/G Ciclev10011832m.g

6P5990430 6 5990430 G/C Ciclev10013115m.g

6P15286512 6 15286512 A/T Ciclev10011574m.g

7P11523501 7 11523501 C/T Ciclev10025464m.g

7P15485199 7 15485199 G/A Ciclev10025845m.g

8P1410540 8 1410540 G/A Ciclev10027748m.g

8P15415232 8 15415232 T/C Ciclev10029197m.g

8P18112800 8 18112800 G/A Ciclev10028962m.g

9P28012147 9 28012147 T/G Ciclev10004259m.g

Twenty five of the selected markers covering the nine chromosomes were used for theidentification of zygotic plants in intergeneric Citrus x Poncirus rootstock seedlings.Around 90 plants obtained from seeds provided by the INRA/CIRAD “CRB Citrus”collection (Corsica) were analyzed for each rootstock. The 25 markers were efficient forallele doses estimation in tetraploid plants (Figure 2). A plant was considered as zygotic ifit displayed a zygotic profile, at least for one marker. The rates of zygotic plants wererelatively low (<6%) for most rootstocks excepted for tetraploid citrumello 4475 that wasclose to 30% (Table 2). This high zygotic rate should preclude, the propagation oftetraploid 4475Citrumello by seeds.

Table 2: zygotic rates in 2x and 4x rootstocks

TT

TC

CC

AA

AG

GG

TT

CC

DiagPonc DiagPonc DiagPonc

Figure 2: Genotyping of Citrumello 4x seedlings (5P14956622 marker)

Conform seedlings with the

mother tree genotype

CCTT

Poncirus references

2x and 4x (CC et CCCC)

Pomelo references

2x and 4x (TT et TTTT)

Zygotic plants

TCCC

C

T

Zygotic plants

TTTC


0 0.2

100

100

72

82

68

68

98

100

71

66

64

Citrons

Mandarins

Volkamer lemon

Figure 5: Analysis of gamete population from Volkamer lemon 4X with 21 C. medica DSNPs covering the nine chromosomes

Usefulness of phylogenetic diagnostic KASPar SNP markers of Citrusancestral taxa for genetics and breeding

Funding: Min. Ec.Comp’, Feder, Spain,CTPS France and Feder Guadeloupe “Cavalbio” project

Cultivated Citrus result from genome admixtures of four ancestral taxa (C. reticulata, C. maxima, C. medica and C. micrantha).Phylogenomics is therefore a key to decipher the origin of modern varieties, to understand the molecular basis of phenotypicvariability and to optimize breeding schemes. Next Generation Sequencing technologies have considerably modified our capacityto explore genomic variation and to understand the complex citrus genomic structures. It also allowed the development of highthroughput genotyping arrays. However, low cost, discrete, flexible and scalable genotyping methods with highly reliable markersmay be sufficient to address numerous research questions. We present here the development of SNP phylogenetic diagnosticmarkers of the four Citrus ancestral taxa based on KASPar technology and their usefulness for citrus genetics and breeding.

Introduction

Ollitrault P1, Curk F2, Ollitrault F3, Garcia-Lor A3, Cuenca J3, Aleza P3,Luro F2, Ancillo G3, Froelicher Y4, Navarro L3 and Morillon R1

1 UMR Agap, Cirad, Station de Roujol, F-97170, Petit-Bourg, Guadeloupe; 2 UMR Agap, Inra, F-20230 San Giuliano, France; 3 IVIA, Moncada, Valencia, Spain;4 UMR Agap, Cirad, F-20230 San Giuliano, France.

454 and Sanger sequencing data of gene fragments dispersed on the ninechromosomes were used to select SNPs totally discriminant of each of thefour ancestral taxa (DSNPs). 26% of the mined SNPs were found to bediagnostic for a single ancestral taxon. One hundred and five selectedDSNPs covering the nine chromosomes (figure 1) were successfullyconverted into KASPar markers (Garcia Lor et al. 2013a,b, Curk et al. 2015).They provided highly reliable genotyping in diploid and polyploid citrusallowing allele doses estimation (figure 2; Cuenca et al., 2013).

KASPar DNSPs marker development

One hundred and five DSNPs were used to analyze theadmixture structure of Citrus germplasm (figure 3; Curk et al.,2015, 2016). This revealed C. maxima introgressions in most ofthe old and in all recent selections of mandarins, and suggestedthat C. reticulata × C. maxima reticulation and introgressionprocesses were important in edible mandarin domestication.Inferred admixture structures were in agreement with previoushypotheses regarding the origin of several secondary speciesand also revealed the origins of acid citrus varieties that implynumerous reticulation events (figure 3).

Analysis of secondary citrus species origin

DSNPs are also very useful for the routine identification of zygotic seedlings of citrus rootstocks deriving from directhybridization between ancestral taxa (ie: Sour orange = C. maxima x C. reticulata, Rough lemon, Volkamer lemon, Rangpurlime: C. reticulata x C. medica; Alemow: C. micrantha x C. medica). Figure 4 illustrates the identification of zygotic plants inVolkamer lemon seedlings using C. medica DSNPs. For diploid rootstocks, the analysis of 9 independent markers (one for eachchromosome) allow to identify 99.8% (1- 0.59) of the zygotic plants. For tetraploid rootstocks the potency of the molecularmarker analysis depends on the meiotic behavior (tetrasomic/disomic segregation). The zygotic rate estimated for diploidVolkamer lemon was 7.5%.

Zygotic rates estimation in interspecific rootstock seedlings

Tetraploid parents are used for the creation of seedless triploid varieties and tetrazygrootstocks breeding. Interspecific genomic structure can lead to disomic orintermediate segregations which limit the variability of the progenies. Understandingthe meiotic behavior of tetraploid parents is therefore a key to optimize the breedingschemes. DSNPs are very useful when using doubled diploids of direct interspecifichybrids such Volkamer lemon (C. reticulata x C. medica). The genotyping of a tetrazygprogeny with 21 C. medica DSNPs revealed an intermediate segregation leading to agamete population relatively close to Volkamer lemon (figure 5).

Meiotic mechanisms in tetraploidinterspecific parents

Citrons

Mandarins+ 2nd parent + hybrids

Volkamer lemon+ hybrids

hybrids

8P44391

TT

CTCCTT

CC + CCCC

CCCT

Chr1 Chr2 Chr3 Chr4 Chr5 Chr6 Chr7 Chr8 Chr9

77% 86% 75% 87% 70% 80% 87% 87% 79%

Heterozygosity restitution

3P11355960Citrons+ 1 zygotic seedling

Volkamer lemon control+ Congruent seedlings

Mandarins+ 2 zygotic seedlings

AA

GG

AG

Figure 4 : zygotic seedlings ofVolkamer lemon identification

with C. medica DSNPs

Figure 1: Distribution of the DSNP markers on the 9 chromosomes (from Cuk et al., 2015)

References Cuenca J, Aleza P, Navarro L and Ollitrault P. 2013. Assignment of SNP allelic configuration in polyploids using competitive allele-specific PCR: application to citrus triploid progeny. Ann Bot (2013) 111(4): 731-742. Curk F, Ancillo G, Ollitrault F, Perrier X, Jacquemoud-Collet JP, Garcia-Lor A, Navarro L, Ollitrault P. 2015. Nuclear Species-Diagnostic SNP Markers Mined from 454 Amplicon Sequencing Reveal Admixture Genomic Structure of Modern Citrus Varieties. Plos ONE, 10(5): e0125628Curk F, Ollitrault F, Garcia-Lor A, Luro F, Navarro L, Ollitrault P. 2016. Phylogenetic origin of limes and lemons revealed by cytoplasmic and nuclear markers. Annals of Botany. 117(4):565-83. DOI: 10.1093/aob/mcw005.Garcia-Lor A., Curk F., Snoussi-Trifa H., Morillon R., Ancillo G., Luro F., Navarro L., Ollitrault P. 2013. A nuclear phylogenetic analysis: SNPs, indels and SSRs deliver new insights into the relationships in the ‘true citrus fruit trees’ group (Citrinae, Rutaceae) and the origin of cultivated species. Annals of Botany. 111 (1): 1-19. Garcia-Lor A, Ancillo G, Navarro L and Ollitrault P. 2013. Citrus (Rutaceae) SNP Markers Based on Competitive Allele-Specific PCR; Transferability Across the Aurantioideae SubfamilyApplications in Plant Sciences 1(4):1200406. 2013.

Figure 3: Deciphering the origin of secondary citrus specieswith 105 DSNPs of the four ancestral taxa (From Curk et al., 2015, 2016).

Taxon DM: diagnostic markers for the considered taxon; FMHom, FMHet, FMabs, FPHom, FPHet, FPAbs, FCHom, FCHet, FCAbs, FMicHom, FMicHet, and FMicAbs are, respectively, the frequency of homozygous, heterozygous, and absent specific alleles for C. reticulata, C. maxima, C. medica, and C. micrantha.

Figure 2 : Estimation of allele doses in triploid progenies (Clementine x

Nadorcott); from Cuenca et al. 2013

APMV


Kto

tal

/ cro

ss s

ecti

on

al

are

a

Ks t

ota

l (x

10

-1)

0

1

2

3

4

5

Leaf

sp

ecif

ic c

on

du

cta

nce K

tota

l/le

af

Kg

.s-1

m-2

MP

a-1

(x 1

0- 5

)

0

2

4

6

8

10

12

14

Carb

on

eff

ecie

ncy o

f ro

ot

CE

Rt

Kg

. s

-1 g

-1 M

Pa

-1 (

x 1

0-7

)

0

1

2

3

4

5

Cleopatra

mandarin

Cleopatra

mandarin

Trifoliate

orange

a

a

a

a

a

b aa

Trifoliate orange x

Cleopatra mandarin

Trifoliate orange x

Cleopatra mandarin

Trifoliate

orange

aa

a a

Cleopatra

mandarin

Trifoliate

orange

Trifoliate orange x

Cleopatra mandarin

Leaf

sp

ecif

ic c

on

du

cta

nce K

roo

t/le

af

Kg

.s-1

m-2

MP

a-1

(x 1

0- 5

)

0

2

4

6

8

10

12

Cleopatra

mandarin

Trifoliate

orange

Trifoliate orange x

Cleopatra mandarin

a

a

a

b

2x 4x

2x 4x 2x 4x

2x 4x

Whole genome expression in diploid and doubled diploid

citrus seedlings in intra and interspecific contexts

Dutra J1,4,5,Rodrigues V2, Barigah T3, Ollitrault P4, Gesteira A5, Morillon R4

1UESC, Campus Soane Nazaré, Km 16, Rodovia Ilhéus-Itabuna, 45662-900, Ilhéus- Bahia, Brasil ;2UMR CMAEE Montpellier, France3UMR PIAF INRA / UBP, 5 chemin de Beaulieu, 63 039 Clermont- Ferrand Cedex 02, France 4UMR Agap, Cirad, Station de Roujol, F-97170, Petit-Bourg, Guadeloupe;5Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua Embrapa, s/n, Cruz das Almas, Bahia, Brasil, 44380-000

• Diploid and 4x Trifoliate orange and Cleopatra mandarin did not present changes of gene expression.

•Large changes of gene expression were observed when comparing the 2x intergeneric hybrid Cleopatra mandarin × Trifoliate orange and its respective 4x suggesting that

this doubled diploid of an intergeneric cross behaves as an allotetraploid regarding it genome expression.

• When comparing gene expression in 2x or in 4x, large changes of expression were also noted.

•Investigations of CERt and specific conductances (Ktotal/leaf, Ktotal/cross sectional are, Kroot/leaf) did not reveal much difference between 2x and 4x of Trifoliate orange

except for CERt. Unfortunately we did not have 2x Cleopatra mandarin in experimental design, and comparisons between 2x and 4x was thus not possible. Regarding the

comparison between the 2x intergeneric hybrid Cleopatra mandarin × Trifoliate orange and its respective 4x, only Kroot/leaf was significantly different. This suggest that

tetraploidy do not induces large changes in hydraulic architecture in absence of stress. Since doubled diploid were showed to present greater traits of adaption to stress, it

would be necessary to do such physiological measurement under stress conditions to decipher the impact of polyploidy.

•Hydraulic architecture was investigated (CERt, Specific conductances: Ktotal/leaf, Ktotal/cross sectional are, Kroot/leaf) and did not reveal large changes between

2x and 4x couples, except CERt between 2x and 4x Trifoliate orange and Kroot/leaf between 2x and 4x hybrid Cleopatra mandarin × Trifoliate orange (Fig. 2)

Conclusions

Tetraploids may be allopolyploids or autotetraploid and may result either from sexual reproduction via 2n gametes or by duplication of the entire nucellar

chromosome set. Allopolyploids inherit different subgenomes after interspecific hybridization whereas subgenomes of autotetraploid arise from the same

species. Currently, genome expression changes in allotetraploids are considered to be more strongly affected by genome hybridization than by genome

ploidy changes. Thus, interactions among genomes are considered to play an important role in the development of new phenotypes in allopolyploids.

Studies aimed at identifying changes in genome expression patterns of autotetraploid are less numerous than for allotetraploids. Investigation in potato,

using microarrays showed that gene expression changes were very limited (Stupar et al., 2007). These results suggest that doubled diploids, that derive

all of their alleles from a single species, may undergo fewer alterations in their regulatory networks, resulting in very limited changes of gene expression

between diploid and doubled diploid genotypes (Stupar et al., 2007). Genome doubling can produce autoteraploid (with intraspecific diploid) but also

alloteraploid (from interspecific diploid). Gene expression changes observed in between diploid and doubled diploid genotypes could be attributed to

nuclear dosage and ploidy-driven cellular modifications leading to physiological changes such as cell size, division rate, or organellar composition but

also to modifications of instable regulation network or epigenetic marks in interspecific hybrids. In addition, the genome doubling confers better

adaptability to various environmental stresses included a higher tolerance to salinity (Saleh et al, 2008, Mouhaya, 2010, Ruiz et al, 2016) and water

deficit (Allario et al 2013; Oliveira et al 2016). In this work, using microarrays we investigated the genome expression in root of diploid of Trifoliate

Orange and Cleopatra mandarin, their respective doubled diploid, the diploid intergeneric hybrid Cleopatra mandarin × Trifoliate orange and its

respective doubled diploid. Also we investigated the hydraulic architecture of these plants. Our goal was to verify if the phenotypic differentiation due to

polyploidy led to changes regarding the plant hydraulic and if it could be related to specific genome expression.

Material & Methods:

Introduction

Root genome expression in 2x and 4x genotypes of Trifoliate Orange, Cleopatra mandarin, and

in the intergeneric hybrid Cleopatra mandarin Trifoliate orange – Hydraulic architecure

Figure 1: Comparison of gene expression in 2x versus 4x genotypes.

Analysis was performed using Genespring software.

Results

References:- Allario T, Brumos J, Colmenero-Flores JM, Iglesias DJ, Pina JA, Navarro L, Talon M, Ollitrault P, Morillon R. (2013) Tetraploid Rangpur lime rootstock increases drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant Cell Environ. 36: 856-68.

- Mouhaya W, Allario T, Brumos J, Andrés F, Froelicher Y, Luro F, Talon M, Ollitrault P, Morillon R (2010) Sensitivity to high salinity in tetraploid citrus seedlings increases with water availability and correlates with expression of candidate genes. Functional Plant Biology, 37: 674-685

- Oliveira TM, Ben Yahmed J, Dutra J, Maserti BE, Talon M, Navarro L, Ollitraut P, Gesteira A, Morillon R. (2016) Better tolerance to water deficit in doubled diploid ‘Carrizo citrange’ compared to diploid seedlings is associated with more limited water consumption and better H2O2 scavenging. Acta Physiologia Plantarum. In press.

- Ruiz M, Quiñones A, Martínez- Cuenca, M-R; Aleza P, Morillon R, Navarro L, Primo-Millo E, Martinez Alcantara B. (2016). Tetraploidy improves salinity tolerance in Carrizo citrange seedlings (Citrus sinensis L. Osb. x Poncirus trifoliata L. Raf.). Journal of Plant Physiology. In press.

- Saleh B., Allario T., Dambier D., Ollitrault P. Morillon R. (2008). Tetraploid citrus rootstocks are more tolerant to salt stress than diploid. Comptes Rendus de Biologie de l’Académie des sciences 331: 703-710.

- Stupar RM, Bhaskar PB, Yandell BS, et al. 2007. Phenotypic and transcriptomic changes associated with potato autopolyploidization Genetics 176, 2055–2067

- Tyree, M.T., Patiño, S., Bennink, J., Alexander, J., 1995. Dynamic measurements of root hydraulic conductance using a high-pressure flowmeter in the laboratory and field. J Exp Bot. 46, 83-94

Fundings: J. Dutra was granted by CAPES, Brazil. This work was funded by a French CTPS project AAP12n°3/C2012-01” and by Feder Guadeloupe “Cavalbio” project.

Genome expression and hydraulic architecture Plant material: diploid (2x) Trifoliate orange (Poncirus trifoliata) and Cleopatra mandarin (Citrus reshni), their respective doubled diploid (4x), the 2x intergeneric hybrid

Cleopatra mandarin × Trifoliate orange (Citrus reshni × Poncirus trifoliata) and its respective 4x were investigated in absence of stress. Plants were 18 months old.

Secondary root samples were harvested and RNA extracted. Gene expression in root of the different genotypes was investigated using 44K citrus Agilent microarrays.

Using a HPFM (High Pressure Flow Meter ) Carbon efficiency of root (CERt,) Specific conductances (Ktotal /leaf, Ktotal/cross sectional are, Kroot/leaf) were measured in the

different genotypes except 2x Cleopatra mandarin that was not included in the experimental design. Measurements were taken at ambient temperature according to Tyree et

al. (1995). The stem was cut at 3 cm above the soil surface, the stump was connected to the HPFM with a water-tight seal.

Figure 2: Specific conductances (Ktotal /leaf, Ktotal/cross sectional are,

Kshoot/leaf, Kroot/leaf) and CERt were measured in the different

genotypes. Different letters indicate a statistical difference between 2x

and 4x belonging to the same genotype (t-test, P ≤ 0.05).

• Root gene expression was

investigated by comparing 2x and

4x couples. Just a few genes

presented a significant differential

expression between 2x and 4x

Trifoliate Orange (data not

showed). In Cleopatra, mandarin

very limited number of genes (<

0.1%) presented a gene

expression change > 2 fold

(Fig.1).

• Large changes of expression

were observed when comparing

the 2x intergeneric hybrid

Cleopatra mandarin × Trifoliate

orange and its respective 4x,

2826 being over expressed and

2378 genes being down-regulated

(expression change > 2 fold) .

Log2 (Fold change)

-lo

g1

0 (

co

rre

cte

dP

va

lue

)

Log2 (Fold change)

-lo

g1

0 (

co

rre

cte

dP

va

lue

)

Cleopatra mandarin

Intergeneric Hybrid

Cleopatra mandarin x

Trifoliate Orange

Root genome expression

Hydraulic architecture


Annexe 4

Fiche innovation à destination des partenaires du RITA

L’amplification « LAMP », une méthode simple et rapide pour

caractériser le statut sanitaire de plants d’agrumes et des psylles

vis-à-vis du Huanglongbing (HLB).


Catalogue des innovations du Cirad aux Antilles-Guyane

Type de production

Végétal

Filière Agrumes

Type d’innovation Innovation technique

Thématique Analyse du statut sanitaire des plants d’agrume et de psylles vis-à-vis du HLB

Titre L’amplification « LAMP », une méthode simple et rapide pour caractériser le statut sanitaire de plants d’agrumes et des psylles vis-à-vis du Huanglongbing (HLB).

L’agrumiculture Guadeloupéenne est aujourd’hui confrontée à une crise phytosanitaire très grave avec l’arrivée en 2012 du citrus greening ou huanglongbing (HLB), maladie bactérienne transmise par un insecte, le psylle asiatique (Diaphorina citri). Cette bactérie du phloème (Liberibacter Asiaticus) conduit à la mort rapide des arbres. Un suivi sanitaire des vergers est donc absolument nécessaire. Le CIRAD a acquis dans le cadre du projet INTER-REG 2015 une machine permettant au moyen de kits de vérifier si les arbres ou les psylles sont infectés par le HLB. L’analyse repose sur une amplification de l’ADN de la bactérie par la technique isothermale appelée « LAMP » (pour loop mediated isothermal amplification).

La « LAMP », une méthode simple et rapide pour faire de l’autocontrôle du statut sanitaire des arbres ou des psylles vis-à-vis du HLB. La technique présente un très haut niveau de spécificité, lié à l’utilisation de plusieurs couples d’amorces. Elle est moins onéreuse que les autres techniques comme la PCR en temps réel. Elle permet d’amplifier une séquence d’ADN cible dans des conditions isothermales. Huit échantillons peuvent être analysés en une heure environ. La méthode reste simple, ne nécessitant pas de matériel sophistiqué, ni de personnel particulièrement qualifié.

L’amplification LAMP Au laboratoire, les échantillons de pétioles de feuilles sont prélevés à l’emporte-pièce. Les échantillons de pétioles ou les psylles sont ajoutés à un tampon réactionnel dans un micro tube afin d’extraire l’ADN. Le surnageant est ensuite transféré dans différents tubes contenant les réactifs nécessaires pour amplifier et détecter spécifiquement l’ADN de Liberibacter Asiaticus. S’il est présent l’ADN est détecté en temps réel et les résultats sont directement affichés sur la machine.

Protocole de prélèvement des échantillons • Prélever des feuilles (avec leur pétioles) suspectées malades (4 par arbre) et les stocker dans des sachets avec un morceau de papier humide. Pour l’analyse des psylles, ceux-ci sont prélevés au champ et conservés dans de l’alcool à 90°. Les analyses sont réalisées par lot de huit échantillons. Il est important de disposer d’un témoin négatif et d’un témoin positif. • Annoter soigneusement les sacs individuellement. • Conservé au frais à 4°C, les échantillons de feuilles devront être réalisées dans les 48h ; conservé -20°C, les échantillons pourront être analysés extemporanément.

Analyse au laboratoire


L’analyse est réalisée au moyeu de kit pour travailler sur pétiole de feuille (Envirologix: DNAble® Detection Kit for HLB Pathogen in Citrus Petiole, Part # 11783) ou sur des psylles (Envirologix: DNAble® Detection Kit for HLB Pathogen in Psyllids, Part # 11764) : Protocole pour l’analyse HLB d’échantillons de feuilles :

1. 500 µL de tampon MB5 sont ajoutés à chacun des 8 micro-tubes.

2. 4 échantillons de pétioles de feuilles d’un même arbre sont prélevés à l’emporte-

pièce et sont ajoutés au tampon réactionnel MB5 afin d’extraire l’ADN.

3. Les tubes sont placés à 95°C sur un bloc chauffant pendant 5 minutes afin de

favoriser l’extraction de l’ADN. Mélanger.

4. 500 µL de tampon D1 sont ajoutés à chacun des tubes. Mélanger.

5. 10 µL de solution de chaque échantillon sont prélevés et ajoutés à chacun des 8

tubes bleus contenant un troisième tampon. Mélanger.

6. 50 µL de la préparation sont ajoutés au « HLB Master Mix » (tubes blancs) et les

tubes hermétiquement bouchés.

7. La réaction d’amplification est réalisée en suivant le protocole de la machine

(Envirlogix : Amplifier DNAble 8-well Reader)

8. L’affiche des résultats est obtenu en 15 minutes :

Stade de transfert et niveau de diffusion :

La machine est facilement transportable (moins de 2kg) et peut donc être mise à la disposition de l’ensemble des partenaires du RITA. Il est également proposé que la FREDON puisse réaliser avec la machine les analyses pour la profession dans le cadre d’autocontrôles.

Propriété intellectuelle :

La machine et les kits ont été développés par la société Envirologix. http://www.envirologix.com/

Bailleurs et projets contributeurs - Projet Inter-Reg – 2015 - Projet FEDER CAVALBIO – 2015-2017 - Projet RITA PARADE-HLB – 2016-2018

Contact : [email protected]

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Am

plif

ica

tio

ns

Temps

Exemples de résultats d’amplification

Témoin négatif

Plants

infectés

mailto:[email protected]


Annexe 5

Posters en liens avec Cavalbio présentés à l’occasion du joli

mois de mai de l’Europe

« Les acteurs de la recherche, du développement et de la filière se

mobilisent pour une relance de l’agrumiculture guadeloupéenne

sous contrainte HLB »

Mai-juin 2016

Station de Roujol ; Petit-Bourg Guadeloupe






Documents

ale d’intérêt agronomique « CAVALBIO » Rapport Intermédiaire d’ 01.01.2016 … · 2019-11-19 · RIE 2016 - Projet PO AVALIO pour l’innovation variétale Page 1 Résumé