Amibes libres de l'environnement :, eau,écologie

7/30/2019 Amibes libres de l'environnement :, eau,cologie

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Amibes libres de l'environnement :

cologie et interactions avec des micro-

organismes pathognes mergents

Vincent Thomas

Mmoire prsent et soutenu publiquement le 11/05/2012

lUniversit Paris Sud-11, Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry

pour lobtention de l

Habilitation Diriger des Recherches

devant le Jury compos de

Pr Anne Collignon

Pr Gilbert Greub

Pr Yann Hchard

Pr Yves Lvi

Dr Jean-Yves Maillard

Vincent THOMAS Habilitation Diriger des Recherches 1/64

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Remerciements

Merci Anne Collignon, Gilbert Greub, Yann Hchard, Yves Lvi et Jean-Yves Maillard de

m'avoir fait l'amiti de bien vouloir faire partie du jury de ce mmoire d'HDR.

Merci tous ceux qui ont particip de prs ou de loin la construction de ma carrire

scientifique de microbiologiste, soit dans l'ordre chronologique :

Jacky Fourniat et Sylvie Bouttier la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry

(Laboratoire de Microbiologie Industrielle), Pierre Bourlioux, Anne Collignon et Hlne Bourreau la Facult de Pharmacie de

Chtenay-Malabry (Dpt Microbiologie), ainsi que Jol Dor et Violaine Rochet l'INRA de

Jouy,

Yves Lvi la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry (Dpt Sant Publique), ainsi que

Jean-Franois Loret et Michel Jousset (Suez), et Thodore Bouchez (Cemagref Antony),

Gilbert Greub et David Baud lhpital de Lausanne,

Gerry McDonnell chez STERIS, ainsi qu'Emmanuel Comoy et Jean-Philippe Deslys au CEA

de Fontenay et Romain Briandet l'INRA de Massy.

Merci enfin tous ceux avec qui j'ai pu collaborer / changer au cours de ces annes, dont je

ne citerai pas les noms de peur d'en oublier...


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Table des matiresChapitre 1 : Introduction................................................................................................................................................7

1.1- Curriculum vitae................................................................................................................................................71.1.1- tat civil.....................................................................................................................................................71.1.2- Adresse professionnelle...........................................................................................................................71.1.3- Titres universitaires...................................................................................................................................71.1.4- Parcours professionnel.............................................................................................................................81.1.5- Activits lies l'administration................................................................................................................81.1.6- Activits lies la recherche....................................................................................................................81.1.7- Encadrement scientifique.........................................................................................................................9

1.2- Liste des publications.....................................................................................................................................101.2.1- Revues comit de lecture....................................................................................................................101.2.2- Chapitres de livres..................................................................................................................................121.2.3- Confrences dans des congrs..............................................................................................................12

Chapitre 2 : Contexte de nos travaux.........................................................................................................................14

Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance des amibes la dsinfection............................................................183.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans les rseaux d'eau : de lasource au point d'usage.........................................................................................................................................18

3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine deproduction d'eau potable ..................................................................................................................................203.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau d'eauhospitalier..........................................................................................................................................................22

3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis en uvre dans les rseaux...........................233.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection etimplication dans la persistance des lgionelles................................................................................................233.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss dans lestablissements de soins ...................................................................................................................................253.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la rsistance deskystes drivs....................................................................................................................................................28

Chapitre 4 : Interactions amibes libres / micro-organismes ......................................................................................344.1- Les amibes libres de l'environnement : melting-pot du monde microbien...............................................344.2- Interactions des amibes avec de nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.................36

4.2.1- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Criblamydia sequanensis...........................................................................................................................................................................384.2.2- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydiacrassificans (25)................................................................................................................................................394.2.3- Publication : Implication de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Waddlia chondrophiladans les avortements chez la femme ..............................................................................................................394.2.4- Publication : Capacit de survie dans l'environnement des nouvelles espces bactriennesapparentes aux Chlamydia.............................................................................................................................40

4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries...........................................................................................434.3.1- Publication : Test de la virulence de diffrentes souches cliniques de Mycobacterium kansasii vis--visd'Acanthamoeba castellanii..............................................................................................................................44

4.4- Interactions des amibes avec les virus NCLDV.............................................................................................454.4.1- Publication : Lausannevirus, un nouveau virus d'amibes.......................................................................47

Chapitre 5 : Perspectives............................................................................................................................................515.1- Synthse de nos travaux................................................................................................................................515.2- Perspectives / dveloppements envisags....................................................................................................51

5.2.1- Protozoaires de l'environnement : interactions avec l'cosystme biofilm.............................................525.2.2- Protozoaires de l'environnement : rle dans la slection et la dissmination de bactries pathognes...........................................................................................................................................................................545.3.3- Protozoaires de l'environnement : amlioration des stratgies de contrle...........................................55

5.3- Collaborations en cours et envisages...........................................................................................................58Rfrences bibliographiques......................................................................................................................................59Rfrences fournies en annexe..................................................................................................................................64


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Liste des Figures

Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien..........................................................

Figure 2 : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales....

Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro-

organismes rsistants aux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire..................................

Figure 4 : Diversit morphologique des amibes retrouves aux diffrentes tapes de potabilisation..........

Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead................

Figure 6 : Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches

d'amibes......................................................................................................................................................

Figure 7 : Dtection des kystes permabiliss par le traitement SDS par marquage l'iodure de

propidium....................................................................................................................................................

Figure 8 : Proportion des kystes marqus par l'iodure de propidium avant et aprs traitement SDS..........

Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique transmission des kystes produits partir de

trophozoites cultivs sur cellules HEp-2......................................................................................................

Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au

calcofluor.....................................................................................................................................................

Figure 11 :Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage.....................................................

Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souches

d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG ou sur cellules HEp-2..........................

Figure 13 : Exemples d'changes d'information gntique entre micro-organismes intra-amibiens...........

Figure 14 : Arbre phylogntique mettant en vidence les relations phylogntiques entre les gnes

codant pour la sterol delta-7 reductase chez l'amibe Naegleria gruberi et chez les bactries

intracellulaires affilies aux lgionelles et aux Chlamydiae.........................................................................

Figure 15 : Arbre phylogntique des Chlamydiales bas sur la squence codant pour l'ARN ribosomal

16S..............................................................................................................................................................

Figure 16 : infection d'Acanthamoeba castellaniiparCriblamydia sequanensis.........................................

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Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis..................................

Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2.............................

Figure 19 : volution du pourcentage d'amibes infectes et du nombre de bactries par amibe lors de

l'infection d'Acanthamoeba castellaniipar diffrents sous-types de Mycobacterium kansasii......................

Figure 20 : Arbre phylogntique de virus reprsentatifs du groupe des NCLDV (nucleocytoplasmic

large DNA viruses)......................................................................................................................................

Figure 21 : Observation de Lausannevirus en coloration de Gimenez........................................................

Figure 22 : Observation de Lausannevirus en microscopie lectronique transmission............................

Figure 23 : droulement du cycle d'infection d'Acanthamoeba castellaniipar Lausannevirus.....................

Figure 24 : Nuage de points construit partir de l'emplacement dans le gnome des protines

orthologues entre Lausannevirus et Marseillevirus......................................................................................

Figure 25 : Phylognie et rpartition des motifs d'histones trouvs chez Lausannevirus et Marseillevirus..

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Liste des TablesTable 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs aux diffrentes tapes de potabilisation....................

Table 2 : Effet des traitements de dcontamination base de gluataraldhyde sur les trophozoites

amibiens.....................................................................................................................................................

Table 3 : Effet de diffrents traitements de dcontamination sur les kystes amibiens................................

Table 4 : Pathologies associes aux nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.........

Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like.............

Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like................................................

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AbrviationsADN : Acide dsoxyribonuclique

ARNr :Acide ribonuclique ribosomique

ATCC :American Type Culture Collection

EPA : US Environmental Protection Agency

GFP : Green Fluorescent Protein

IP : iodure de propidium

MALDI-TOF MS : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight mass spectrometry

NCLDV : nucleocytoplasmic large DNA viruses

NNA : Non-Nutrient Agar (agar non-nutritif utilis pour la culture des amibes surEscherichia coli)

NTM : non-tuberculous mycobacteria

PCR : Polymerase Chain Reaction

PYG : Proteose peptone, Yeast extract, Glucose (milieu utilis pour la culture axnique des amibes dugenreAcanthamoeba)

SDS : sodium dodecyl sulfate

VIH : virus de l'immunodeficience humaine


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Chapitre 1 : Introduction

1.1- Curriculum vitae

1.1.1- tat civil

Nom et prnom : THOMAS, Vincent

Date et lieu de naissance : 23 mai 1973 Paris, 14me arrondissement

Nationalit : Franais

1.1.2- Adresse professionnelle

Laboratoire de Recherche de la socit STERIS SA

Commissariat lnergie Atomique (CEA)

18, route du Panorama - 92265 Fontenay-aux-Roses FRANCE

E-mails : [email protected] (professionnel) ; [email protected](personnel)

Tlphone : +33 1 46 54 85 57 (fixe), +33 6 75 74 00 16 (portable)

1.1.3- Titres universitaires

2000-2004 : Thse de doctorat en cologie Microbienne ,Facult de Pharmacie, Universit Paris

11

Sujet : cologie de Legionella pneumophila dans les rseaux de distribution deau potable

Interactions biofilms/amibes valuation de lefficacit des traitements biocides.

Travail sous forme de convention CIFRE entre le Laboratoire de Sant Publique Environnement

de la Facult de Pharmacie (Pr Yves Levi) et le Centre International de Recherche sur lEau et

lEnvironnement du Groupe SUEZ (CIRSEE, Le Pecq).

Diplm avec mention du Jury. Manuscrit tlchargeable l'adresse suivante : http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116971

1997-1998 : Diplme dtudes Approfondies en cologie Microbienne, Pathogense et

Antibiothrapie,Facult de Pharmacie, Universit Paris 11

Sujet : tude dune flore de barrire Clostridium difficile.

Travail collaboratif entre le Dpartement de Microbiologie de la Facult (Pr Pierre Bourlioux) et

lINRA de Jouy-en-Josas (Dr Jol Dor).

1991-1997 : Docteur en Pharmacie, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11. Filire Industrie,

certificats de spcialisation en Bactriologie et Virologie.


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1.1.4- Parcours professionnel

Depuis Mai 2006 : Responsable R&D, employ par la socit STERIS pour dvelopper et diriger un

laboratoire de recherche en microbiologie hberg dans les locaux du CEA de Fontenay-aux-Roses. Responsable de cinq employs : un chercheur, deux techniciens et deux tudiants en thse.

En charge de la coordination de plusieurs projets de recherche pour ltude de pathognes

mergents et ltude de lefficacit des traitements biocides des vis--vis de nombreuses

espces/souches de bactries, de protozoaires, de virus et de prions.

Collaborations avec des laboratoires de R&D publics et privs en Europe et aux tats-Unis.

Reprsentant scientifique de la socit STERIS dans divers congrs internationaux de

microbiologie.

Mai 2004 - Avril 2006 : Post-doctorat dans le laboratoire de Recherche sur les BactriesIntracellulaires, Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire de Lausanne, Suisse (Dr

Gilbert Greub). tude de lcologie des amibes et de leurs htes intracellulaires : lgionelles,

mycobactries, chlamydia, nouveaux virus Installation du laboratoire, prise en charge de plusieurs

projets de recherche en vue dune publication rapide de rsultats. Formation de plusieurs tudiants et

techniciens. Rdaction de demandes de financement et de rapports dactivit.

Novembre 1998 - Dcembre 1999 : Assistant de Recherche,Facult de Pharmacie, Universit Paris

11. Dveloppement doutils molculaires (PCR, sondes spcifiques de dtection) pour ltude du

devenirin vivo de ferments lactiques. Projet men au sein du Dpartement de Microbiologie (P r Pierre

Bourlioux), en collaboration avec la compagnie Danone.

1.1.5- Activits lies l'administration

Reprsentant de la socit STERIS au Conseil dAdministration de la Fondation de Recherche

Alliance Biosecure (www.fondation-alliance-biosecure.org). Fondation reconnue dutilit publique qui lance

une deux fois par an des appels projets dans le domaine de la comprhension et de la matrise du risque

infectieux dans les produits biologiques. Participation la vie de la Fondation : dfinition des objectifs,

budgets, appels doffre, suivi des projets financs

1.1.6- Activits lies la recherche

Coordinateur du projet Plateforme Globale de Dcontamination labellis par le ple de

comptitivit Medicen Rgion Ile-de-France : rdaction et prsentation du projet devant les membres

du ple, coordination et suivi du projet (2007-2010). Ce projet dot dune subvention de 3,5 millions

dEuros a fait intervenir plusieurs quipes de R&D publiques (INRA, CEA, AP-HP, INSERM) et

prives (STERIS, LFB, Texcell, Genethon, Hutchinson Sant) .


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Participation des Comits de Pilotage de Thse :

Thse de Melle Emilie Fouque lUniversit de Poitiers (quipe Pr Yann Hchard, dmarrage en

novembre 2010) : Mise au point dune stratgie innovante de matrise des amibes dans les

biofilmsThse de Mr Arnaud Bridier ralise lINRA de Massy (quipe D r Romain Briandet, 2008 - 2011) :

tude de la formation de biofilms et de laction de traitements biocides sur ces biofilms

Plus de 25 articles de recherche reviews pour des revues internationales avec comit de lecture

depuis 2008. Reviewing de projets de R&D en rponse diffrents appels doffre.

Organisation avec la Fondation Alliance Biosecure dun colloque Risques infectieux mergents lis

aux biotechnologies : Principe de prcaution et Innovation qui sest tenu en juin 2010 au Ministre

de la Sant.

Participation des conseils scientifiques : CS du Colloque Rseau National Biofilm 2011.

Nombreuses collaborations internationales en cours.

1.1.7- Encadrement scientifique

Encadrement ( 75%) de la Thse de Melle Cline Coulon ralise doctobre 2007 mars 2011 sous

forme de convention CIFRE entre STERIS et la Facult de Pharmacie (P r Anne Collignon). Titre :

Amibes libres de lenvironnement : Rsistance aux traitements de dsinfection et interactions avec

les Chlamydiales . Thse soutenue en avril 2011 avec la mention Trs Honorable et proposition un

prix de Thse. Trois articles publis dans Journal of Clinical Microbiology , Journal of EukaryoticMicrobiology et FEMS Immunology and Medical Microbiology . Ces travaux ont aussi donn lieu

la prsentation de cinq posters et une communication orale dans des congrs internationaux. Le

manuscrit de la thse est tlchargeable l'adresse suivante :http://www.theses.fr/2011PA114806#

Co-encadrement ( 25%) de la Thse de Mme Anglique Egalon dbute en mars 2010 sous forme de

convention CIFRE entre STERIS et le CEA de Fontenay-aux-Roses (D r Jean-Philippe Deslys), en

partenariat avec l'INRA de Jouy-en-Josas (Dr Human Rezaei). Titre de la Thse : tude des

mcanismes sous-tendant linactivation des prions et application aux autres protines impliques dans

les pathologies amylodes . Pas de publications ni de posters pour le moment.

Encadrement ( 100%) du stage de Matrise de Melle Hedia Arfaoui (2006-2007, Universit Paris 7

Denis Diderot). Titre du mmoire : Dcontamination du matriel mdical: efficacit du traitement au

peroxyde dhydrogne gazeux VHP STERIS . Ce travail a donn lieu la prsentation dun poster au

congrs de la Socit Amricaine de Microbiologie (ASM) Boston en 2008.

Encadrement ( 75%) du stage BN Forschung de Mme Katia Herrera-Rimann (2005, Institut de

Microbiologie de lhpital de Lausanne, Suisse). Thme de recherche : Interactions amibes-espces

bactriennes rsistantes aux amibes. Ce travail a donn lieu la publication dun article dans Applied and Environmental Microbiology en 2006.


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1.2- Liste des publications

1.2.1- Revues comit de lecture

Liens internet sur le document lectronique: cliquer sur les caractres bleus pour avoir accs au

rsum de la publication correspondante, sur les caractres rouges pour avoir accs l'article au format pdf

(articles en libre accs). Les publications pour lesquelles les copies figurent en annexe de ce mmoire sont

indiques par la mention Publication en annexe.

Publications lies aux travaux de DEA

1. Thomas, V., V. Rochet, H. Boureau, C. Ekstrand, S. Bulteau, J. Dore, A. Collignon, and P. Bourlioux. 2002.

Molecular characterization and spatial analysis of a simplified gut microbiota displaying colonization resistance

against Clostridium difficile. Microb Ecol Health Dis14:203-210

Publications lies aux travaux de thse

2. Thomas, V., T. Bouchez, V. Nicolas, S. Robert, J. F. Loret, and Y. Lvi. 2004. Amoebae in domestic water

systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol97:950-

963. Publication en annexe

3. Loret, J., S. Robert, V. Thomas, A. J. Cooper, W. F. McCoy, and Y. Lvi. 2005. Comparison of disinfectants for

biofilm, protozoa and legionella control. Journal of Water and Health:423-433

Publications lies aux travaux de post-doctorat

4. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2006. Criblamydia sequanensis, a new intracellularChlamydiales isolated

from Seine river water using amoebal co-culture. Environmental Microbiology 8:2125-2135. Publication en

annexe

5. Thomas, V., K. Herrera-Rimann, D. S. Blanc, and G. Greub. 2006. Biodiversity of amoebae and amoebae-

resisting bacteria in a hospital water network. Applied and Environmental Microbiology 72:24282438.Publication en annexe

6. Goy, G., V. Thomas, K. Rimann, K. Jaton, G. Prod'hom, and G. Greub. 2007. The Neff-strain ofAcanthamoeba

castellanii, a tool to test the virulence of Mycobacterium kansasii. Research in Microbiology 158:393-397.

Publication en annexe

7. Corsaro, D., V. Thomas, G. Goy, D. Venditti, R. Radek, and G. Greub. 2007. ' Candidatus Rhabdochlamydia

crassificans', an intracellular bacterial pathogen of the cockroach Blatta orientalis (Insecta: Blattodea). Syst Appl

Microbiol 30:221-228

8. Baud, D., V. Thomas, A. Arafa, L. Regan, and G. Greub. 2007. Waddlia chondrophila, a potential agent of human

fetal death. Emerg Infect Dis 13:1239-43. Publication en annexe


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http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=14530008http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=14530008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15479410http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15479410http://www.iwaponline.com/jwh/003/0423/0030423.pdfhttp://www.iwaponline.com/jwh/003/0423/0030423.pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17107554http://aem.asm.org/cgi/content/full/72/4/2428?view=long&pmid=16597941http://aem.asm.org/cgi/content/full/72/4/2428?view=long&pmid=16597941http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17398074http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16934426http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16934426http://www.cdc.gov/eid/content/13/8/1239.htmhttp://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=14530008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15479410http://www.iwaponline.com/jwh/003/0423/0030423.pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17107554http://aem.asm.org/cgi/content/full/72/4/2428?view=long&pmid=16597941http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17398074http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16934426http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16934426http://www.cdc.gov/eid/content/13/8/1239.htm


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9. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2007. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources

by amoebal co-culture. Syst Appl Microbiol30:572-9

10. Loret, J. F., M. Jousset, S. Robert, G. Saucedo, F. Ribas, V. Thomas, and G. Greub. 2008. Amoebae-resisting

bacteria in drinking water: risk assessment and management. Water Sci Technol 58:571-577

11. Thomas, V., J. F. Loret, M. Jousset, and G. Greub. 2008. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting

bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology10:2728-2745. Publication en annexe

Publications lies aux travaux mens depuis 2006

12. Thomas, V., and G. McDonnell. 2007. Relationship between mycobacteria and amoebae: ecological and

epidemiological concerns. Lett Appl Microbiol 45:349-57. Publication en annexe

13. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2009. Disinfection efficacy against parvoviruses in comparison to

reference viruses. Journal of Hospital Infection 73:64-70

14. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Decontamination efficacy against Mycoplasma. Letters in

Applied Microbiology 52:150155

15. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Virucidal activity of disinfectants against parvoviruses and

reference viruses. Applied Biosafety: Journal of the American Biological Safety Association 15:165-171

16. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance ofAcanthamoeba cysts to disinfection

treatments used in health care settings.Journal of Clinical Microbiology48:2689-97. Publication en annexe

17. Thomas, V., G. McDonnell, S. P. Denyer, and J.-Y. Maillard. 2010. Free-living amoebae and their intracellular

pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiology Reviews 34:231-259. Publication en

annexe

18. Thomas, V., and G. Greub. 2010. Amoebae/amoebal symbionts genetic transfers: lessons from giant viruses

neighbours.Intervirology53:254-267. Publication en annexe

19. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, and R. Briandet. 2010. The biofilm architecture of sixty

opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods

82:64-70

20. Bridier, A., D. Le Coq, F. Dubois-Brissonnet, V. Thomas, S. Aymerich, and R. Briandet. 2011. The spatial

architecture ofBacillus subtilis biofilms deciphered using a surface-associated model and in situ imaging. PLoS

ONE6:e16177

21. Bridier, A., E. Tischenko, F. Dubois-Brissonnet, J. M. Herry, V. Thomas, F. Daddi-Oubekka, F. Waharte, K.

Steenkeste, M. P. Fontaine-Aupart, and R. Briandet. 2011. Deciphering biofilms structure and reactivity by

multiscale time-resolved fluorescence analysis.Advances in Experimental Medicine and Biology 715:333-49

22. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, G. Greub, V. Thomas, and R. Briandet. 2011. Dynamics of the action ofbiocides in Pseudomonas aeruginosa biofilms.Antimicrobial Agents and Chemotherapy55:2648-54


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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17706908http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17706908http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18725723http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18637950http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18637950http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17897376http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19646784http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21198694http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21198694http://jcm.asm.org/cgi/content/full/48/8/2689?view=long&pmid=20519477http://jcm.asm.org/cgi/content/full/48/8/2689?view=long&pmid=20519477http://jcm.asm.org/cgi/content/full/48/8/2689?view=long&pmid=20519477http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19744244http://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?DOI=000312910&typ=pdfhttp://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?DOI=000312910&typ=pdfhttp://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?DOI=000312910&typ=pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20433880http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0016177http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0016177http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0016177http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21557074http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21422224http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21422224http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21422224http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17706908http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18725723http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18637950http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17897376http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19646784http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21198694http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21198694http://jcm.asm.org/cgi/content/full/48/8/2689?view=long&pmid=20519477http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19744244http://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?DOI=000312910&typ=pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20433880http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0016177http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0016177http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21557074http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21422224


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23. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Comparative biocidal activity of peracetic

acid, benzalkonium chloride and ortho- phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection

78:208-213

24. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Resistance of bacterial biofilms to

disinfectants: a review Biofouling 27:1017-32

25. Thomas, V., C. Bertelli, F. Collyn, N. Casson, A. Telenti, A. Goesmann, A. Croxatto, and G. Greub. 2011.

Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environmental Microbiology 13:1454-56.


26. Coulon, C., M. Eterpi, G. Greub, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. Amoebal host-range, host-

free survival and disinfection susceptibility of environmental Chlamydiae as compared to Chlamydia trachomatis.

FEMS Immunology and Medical Microbiology - Accepted article - doi: 10.1111/j.1574-695X.2011.00919.x.


27. Coulon, C., N. Deschamps, T. Meylheuc, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. The effect of in vitro

growth conditions on the resistance of Acanthamoeba cysts. Journal of Eukaryotic Microbiology In Press.


28. Fouque, E., M.-C. Trouilh, V. Thomas, P. Hartemann, M.-H. Rodier, and Y. Hchard. 2012. Cellular and

molecular changes during encystment of free-living amoebae. Eukaryotic Cell - In Press.

1.2.2- Chapitres de livres

1. Thomas, V. 2012. Sensitivity and resistance of protozoa to biocides. In A. Fraise, Lambert, PA and Maillard, J-Y

(ed.),Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization- 5th edition - In Press

2. Thomas, V. 2012. Ecology and diversity of amoebal symbionts and amoebal pathogens. In G. Greub (ed.),

Free-living amoebae: an evolutionary crib for emerging pathogens In Press

1.2.3- Confrences dans des congrs

1. Thomas, V. 2006. La mesure et la prdiction de la virulence. Presented at the Colloque Ecomicth : "Lgionelles

et lgionellose : Avances effectives et questions sensibles", Paris, France, 27 Octobre.

2. Thomas, V., and J. Mills. 2008. Amsco V-ProTM 1 A new low temperature sterilization system by STERIS.

Presented at the 30rd CEFH meeting, Nantes, France, 8 April.

3. Thomas, V. 2011. La strilisation la vapeur sche H2O2. Presented at the 6me Forum du Dpartement

Gnie Biomdical de lEcole Suprieure dIngnieurs de Luminy Marseille, France, 30 November.

4. Thomas, V. 2011. A review of new sterilization technologies. Presented at the XIXth CEDEST Meeting Albacete,

Spain, 11-13 May.


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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21664534http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/08927014.2011.626899http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/08927014.2011.626899http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21392201http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22141597http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22141597http://www.amazon.co.uk/Principles-Practice-Disinfection-Preservation-Sterilization/dp/1444333259/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1305709127&sr=1-1http://www.amazon.co.uk/Principles-Practice-Disinfection-Preservation-Sterilization/dp/1444333259/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1305709127&sr=1-1http://www.amazon.co.uk/Principles-Practice-Disinfection-Preservation-Sterilization/dp/1444333259/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1305709127&sr=1-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21664534http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/08927014.2011.626899http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/08927014.2011.626899http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21392201http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22141597http://www.amazon.co.uk/Principles-Practice-Disinfection-Preservation-Sterilization/dp/1444333259/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1305709127&sr=1-1


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5. Thomas, V. 2011. Dveloppement et valuation de traitements biocides actifs contre les biofilms. Presented at

the Colloque Adebiotech / Rseau National Biofilms: Gestion des biofilms, enjeux industriels, Romainville,

France, 13 October.

6. Thomas, V. 2011. Amibes libres et pathognes intra-amibiens : le risque ne se limite pas aux lgionelles.

Presented at the Colloque de l'Association Scientifique Europenne pour l'Eau et la Sant, Paris, France, 18

November.

7. De Broglie, V., and V. Thomas. 2011. Enhancing precompetitive research to increase safety of biological

products in the field of emerging pathogens. Presented at the Ensuring Adventitious Agents Safety In Biologics,

Munich, Germany, 18-19 October.

8. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance of amoebal cysts and trophozoites to

disinfection treatments commonly used in healthcare settings. Presented at the ICAR 2010 meeting, Valladolid,Spain, 3-5 November.


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Chapitre 2 : Contexte de nos travaux

La matrise du risque infectieux au sein de diffrents environnements (hpitaux, industrie

agroalimentaire) passe par une meilleure comprhension des diffrents cosystmes microbiologiques en

place dans ces environnements. Ces deux dernires dcennies ont ainsi vu merg le concept de biofilm,

communaut microbienne complexe constitue de multiples espces bactriennes interagissant entre elles

(interactions mtaboliques, changes gntiques) et avec leur environnement. Ltude de ces biofilms a

clairement mis en vidence leur importance dans un grand nombre de problmatiques ayant trait au risque

infectieux : protection de micro-organismes pathognes vis--vis de traitements biocides, barrire biologique

empchant limplantation de flores pathognes Les biofilms rencontrs dans lenvironnement sont

complexes, composs de multiples espces bactriennes mais aussi de virus (phages) et de micro-

organismes eucaryotes. Une meilleure matrise de la composition de ces biofilms, et notamment de leur

colonisation par des micro-organismes pathognes, passe obligatoirement par une meilleure comprhension

de lcologie de ces biofilms et de limpact des activits humaines (traitements biocides, pollutions) sur leur

composition. Des travaux de plus en plus nombreux montrent que les amibes libres de lenvironnement

jouent un rle central dans l'cologie de l'cosystme biofilm. Ce sont des micro-organismes eucaryotes

unicellulaires dont les anctres sont apparus avant les organismes pluricellulaires. Elles sont ubiquitaires, se

nourrissant de bactries quelles broutent la surface des biofilms (Fig. 1), et rgulent ainsi de manire

importante les populations bactriennes de ces biofilms (47). Cependant de nombreuses espcesbactriennes (mais aussi eucaryotes et virales) ont dvelopp la capacit de rsister ces phagocytes

professionnels et peuvent tirer bnfice de l'interaction avec les amibes en rsistant la digestion

intracellulaire et/ou en prolifrant de manire importante dans le trophozoite amibien (cellule en tat de

croissance active). Or les mcanismes permettant la rsistance la digestion par les amibes sont

frquemment similaires ceux permettant aux micro-organismes infectieux de rsister la digestion par les

macrophages ; la consquence en est que les espces bactriennes qui ont dvelopp des mcanismes de

rsistance la digestion par les amibes au cours de leur volution sont aussi potentiellement pathognes

pour les organismes suprieurs, dont l'homme et les animaux. Ces similarits entre les mcanismes de

virulence vis--vis des amibes et des eucaryotes suprieurs ont t largement dmontres pour l'espce

bactrienne Legionella pneumophila (22) mais aussi pourMycobacterium avium (23) et plus rcemment

pour Salmonella enterica Typhimurium (72). Par ailleurs, parmi plus de 500 espces bactriennes

pathognes pour l'homme et les animaux recenses par lagence amricaine de protection de

lenvironnement (EPA), une revue exhaustive de la littrature nous a permis de dmontrer quau moins 20%

sont capables de rsister aux amibes ((96), publication en annexe). Une fois lintrieur des amibes les

bactries sont protges vis--vis de laction de traitements biocides utiliss dans les rseaux d'eau potable

(chlore) qui sont peu efficaces vis--vis des trophozoites amibiens, et peuvent ventuellement se multiplier

en grand nombre dans la cellule infecte (90). A titre d'exemple une amibe infecte par une lgionelle peut

librer plus de 103 nouvelles bactries en quelques heures (18). Les amibes constituent donc une niche

cologique dans laquelle des bactries potentiellement pathognes peuvent survivre, se multiplier, mais


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aussi changer des informations gntiques : l'analyse des gnomes de micro-organismes capables de

survivre dans les amibes dmontre clairement l'existence de ces changes gntiques entre bactries

intracellulaires ainsi qu'avec l'hte amibien et avec certains types de virus capables d'infecter les amibes (59,

75, 92). Un degr supplmentaire de protection des micro-organismes intra-amibiens vis--vis destraitements biocides est apport par la capacit de certaines de ces espces bactriennes survivre dans

les kystes amibiens. Ces kystes sont les formes de dormance dans lesquelles se diffrencient les amibes en

raction diffrents stress, leur paroi contient notamment de la cellulose et ils sont extrmement rsistants

aux tempratures leves, la dessiccation et diffrents types de traitements biocides (26, 96). En plus de

nombreuses espces responsables dinfections nosocomiales (Legionella, mycobactries, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus), de nombreuses espces bactriennes pathognes de premire

importance dans le domaine des industries agro-alimentaires sont concernes par ces interactions avec les

amibes (87, 96) :

Survie dans les trophozoites pour diffrentes espces de Listeria (contest), diffrentes espces

dAeromonas, Coxiella burnetiiet Helicobacter pylori;

Survie et croissance dans les trophozoites pour Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Escherichia

coliO157H7, Francisella philomiragia, Rhodococcus equi, Salmonella typhimurium ;

Survie et croissance dans les trophozoites ainsi que survie dans les kystes pour Mycobacterium

avium subspecies paratuberculosis (ainsi que la plupart des autres espces de mycobactries),

Francisella tularensis, Shigella sonneiet Shigella dysenteriae.

De nouvelles espces bactriennes considres comme pathognes mergents sont aussi capablesde se multiplier en grand nombre dans les amibes : cest le cas notamment de nouvelles espces

environnementales de Chlamydiales regroupes sous le terme Chlamydia-like qui sont aujourdhui

considres comme responsables probables de pneumonies dtiologie inconnue et davortements

spontans chez lhomme ainsi que d'avortements chez les bovins (9, 12, 55).

Les amibes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de leau (94) et sont donc

retrouves dans la plupart des rseaux deau domestique ou industrielle. Elles ont t isoles de plus de

90% des rseaux d'eau d'habitations (82), ainsi que des rseaux d'eau hospitaliers (93), de tours aro-rfrigrantes (67) Elles ont aussi t dtectes dans des levages de volaille (8), dans des rfrigrateurs

(100), sur des surfaces de travail d'abattoirs (98), dans des sols potentiellement utiliss pour le pturage

(amibes infectes parMycobacterium avium subspeciesparatuberculosis) (102) Il est donc de plus en plus

vident que les amibes constituent les Chevaux de Troie du monde microbien, permettant la slection, la

dissmination et la prolifration d'espces bactriennes pathognes via les rseaux d'eau (Fig.1).


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Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien. Les kystes (c) et les trophozoites (T) amibiens sont naturellement prsents dans les eaux de surfaces utilises pour laproduction d'eau potable, les kystes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de l'eau, une foisdans le rseau les amibes se dsenkystent et se nourrissent en ingrant les bactries des biofilms, les bactriesrsistant la digestion par les amibes peuvent ventuellement se multiplier dans les trophozoites et changer desinformations gntiques entre elles et avec l'hte, des quantits importantes de bactries ainsi que des vsiculesremplies de bactries sont libres partir des amibes infectes, en cas de stress environnemental les trophozoites

peuvent former des kystes dans lesquels certaines espces bactriennes peuvent survivre (dmontr pour leslgionelles, les mycobactries, Vibrio cholerae et Francisella), l'eau contamine peut servir de vecteur d'infection pourl'homme et l'animal par inhalation ou ingestion de bactries libres, d'amibes infectes ou de vsicules charges debactries, ou par contamination de surfaces ou de sols qui contamineront par la suite l'homme et les animaux .Illustration du biofilm adapte de Center for Biofilm Engineering, MSU-Bozeman 1996.


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Plan de prsentation de nos travaux de recherche

Afin de permettre une comprhension plus aise par le lecteur ces travaux ne sont pas repris dans

leur ordre chronologique de publication. Dans un premier temps nous reprenons dans le chapitre 3 le

cheminement dcrit dans la Figure 1 : tude environnementale de la diversit des amibes et des bactries

rsistantes aux amibes depuis la source servant la production d'eau potable jusqu'au point d'usage dans

les rseaux, et rsistance des kystes amibiens aux traitements de dsinfection mis en uvre dans ces

systmes. Dans le chapitre 4, nous dcrivons plus prcisment les interactions des amibes avec de

nouveaux microorganismes pathognes potentiels isols lors de nos tudes environnementales : nouvelles

espces de Chlamydiae, mycobactrieset nouveau virus.


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Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance desamibes la dsinfection

3.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes auxamibes dans les rseaux d'eau : de la source au point d'usage

Durant notre post-doctorat ralis au sein de l'Institut de Microbiologie de l'Hpital de Lausanne, en

Suisse, nous avons tudi l'cologie et la diversit des amibes dans diffrents types d'environnements, ainsi

que leurs interactions avec diffrents types de micro-organismes. Nous avons adapt (34) une mthode de

co-culture amibienne consistant ensemencer des chantillons environnementaux (eau filtre sur

membrane, biofilms) sur des amibes provenant de l'American Type Culture Collection (soucheAcanthamoeba castellaniiATCC 30010), et surveiller la prolifration ventuelle de micro-organismes dans

les amibes inocules l'aide de diffrents outils (colorations non spcifiques, coloration de Ziehl pour les

mycobactries, PCR spcifiques de lgionelles ou de Chlamydiae...) (Fig. 2). En cas de dtection de micro-

organismes dans les co-cultures amibiennes, diffrentes stratgies taient mises en uvre pour isoler et

purifier les micro-organismes : culture sur milieux spcifiques des mycobactries, culture sur milieux

spcifiques des lgionelles, r-ensemencement en dilution limite surA. castellaniiATCC 30010 L'objectif

tait d'isoler de nouvelles espces bactriennes non dtectes par culture sur les milieux classiques :

intracellulaires stricts non cultivables ou intracellulaires facultatifs qui, mmes s'ils sont cultivables, sont

normalement masqus par la flore majoritaire. L'intrt de la mthode est donc double : limination de la

flore majoritaire non pathogne qui est phagocyte et digre par les amibes, et slection de micro-

organismes dont la capacit rsister la digestion et survivre dans les amibes pourrait ventuellement

indiquer une pathognicit pour l'homme et/ou l'animal. La mthode a t applique deux types

d'environnements particulirement critiques : usine de production d'eau potable partir de l'eau de Seine et

eau du rseau de lhpital de Lausanne. Dans les deux cas les chantillons d'eau et de biofilms taient

ensemencs sur la souche d'amibe A. castellaniiATCC 30010 et une recherche d'amibes indignes

naturellement prsentes dans les chantillons tait ralise sur ces mmes chantillons afin de mieux

prciser l'tendue de la colonisation et de la diversit amibienne dans ces environnements. Les bactries et

les amibes taient identifies par PCR et squenage avec des amorces ciblant l'ARNr 16S et l'ARNr 18S,

respectivement.

Figure 2 (page suivante) : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales.

Les chantillons taient traits afin :

(1) d'isoler les amibes indignes naturellement prsentes dans les chantillons par ensemencement des

chantillons concentrs sur gloses non-nutritives + Es coliet repiquages successifs des amibes dtectes,

(2) d'isoler les micro-organismes rsistants aux amibes par ensemencement des chantillons concentrs et

dcontamins (pH acide, pH basique, traitement la chaleur) sur la souche d'Acanthamoeba castellaniiATCC30010.


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3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine

de production d'eau potable

Rfrence (94), publication en annexe

Les tudes ralises sur l'usine de production d'eau potable ont consist appliquer les mthodes de

co-culture amibienne et d'isolement des amibes indignes sur des chantillons d'eau et de biofilms prlevs

diffrentes tapes du procd de potabilisation (Fig. 3).

Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro-organismes rsistantsaux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire. eau de rivire, biofilm dpos sur le sable utilis pour la premire tape de filtration, eau filtre sur sable, eautraite par ozonation, biofilm dpos sur les granules de charbon actif, eau filtre sur charbon actif, eau chlore, eau en sortie d'usine et eau potable prleve en diffrents points du rseau.

Ces travaux, raliss en partenariat avec SUEZ et l'Institut de Microbiologie de Lausanne, avaient

pour objectif de dterminer si les usines qui produisent l'eau potable partir d'eau de rivire sont colonises

par les amibes, si oui quel niveau prfrentiel du processus de potabilisation et si les amibes sont

finalement relargues dans l'eau potable. La recherche de pathognes par co-culture avait pour objectif

d'tudier la distribution de nouvelles espces microbiennes ventuellement pathognes dans l'usine afin de

permettre une meilleure connaissance de leur cologie, et donc une meilleure gestion du risque ventuel.

Cinquante isolats amibiens indignes ont t cultivs, principalement partir de l'eau de rivire (19 isolats)

mais aussi partir des biofilms dvelopps sur le lit de sable (tape 2, 15 isolats) (Fig. 4). Quatorze isolats

ont t retrouvs aprs l'tape de filtration sur sable : 3 dans l'eau filtre sur sable (tape 3), 3 aprs l'tape

d'ozonation (tape 4), 6 sur le biofilm dpos sur les granules de charbon actif (tape 5) et 2 dans l'eau

filtre sur charbon (tape 6). De manire intressante la diversit amibienne changeait dans l'usine : alors

que des amibes appartenant principalement aux genres Acanthamoeba, Naegleria et Vannella taient

principalement retrouves dans la rivire et dans le biofilm sur sable (Table 1), on retrouvait ensuiteprincipalement des Hartmannella et des Echinamoeba dans l'usine. Ces deux genres taient aussi prsents

dans l'eau de rivire mais de faon minoritaire ; leur prvalence dans l'usine suggre que le processus de


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potabilisation slectionne prfrentiellement les amibes appartenant ces genres (amibes de petite taille,

souvent thermo-rsistantes). Aucune amibe n'a t retrouve en sortie d'usine mais cela est sans doute d

aux faibles volumes d'eau et de biofilms prlevs plutt qu' une efficacit relle de la chloration sur les

amibes car plusieurs tudes rapportent une efficacit limite du chlore sur les kystes amibiens (96).Concernant les bactries, quatre souches de bactries ont t retrouves partir des amibes indignes, dont

une mycobactrie (M. mucogenicum) cultive partir d'une souche d'amibe (Echinamoeba) retrouve dans

l'eau traite l'ozone. La co-culture des chantillons d'eau et de biofilm avec l'amibe A. castellaniiATCC

30010 a permis d'identifier 27 mycobactries (dont 8 dans l'usine aprs filtration sur sable) et 65 isolats

bactriens appartenant diffrentes classes (dont 21 dans l'usine aprs filtration sur sable). Parmi ces 65

isolats figuraient notamment des lgionelles ainsi que deux espces de Chlamydiae environnementales(cf

Chlamydiae plus loin): l'espce dj dcrite Parachlamydia acanthamoebae (retrouve partir de l'eau

de rivire et du biofilm sur charbon actif) et le premier reprsentant d'un nouveau genre de Chlamydiales :

Criblamydia sequanensis (isole partir de l'eau de rivire). Nous avons aussi dtect la prsence de petites

particules colores en coloration de Gimenez dans une des co-cultures ralises partir de l'eau de rivire.

Aucun ADN bactrien ne pouvait tre amplifi l'aide d'amorces universelles 16S ; ces particules se sont

rvles tre un nouveau virus d'amibe que nous avons dcrit par la suite (cf Lausannevirus plus loin).

Ces travaux ont donc clairement dmontr la prsence d'amibes et de bactries capables de crotre dans les

amibes dans l'usine de potabilisation, surtout dans les chantillons de biofilms prlevs sur le filtre sable et

sur le filtre charbon actif. Ces travaux, publis en 2008 (94) ont permis SUEZ de proposer une

optimisation des procdures de rtro-lavage de ces filtres, ceci afin de rduire la colonisation par les biofilms,

les amibes et les bactries potentiellement pathognes associes ces amibes. Par ailleurs ces travauxs'inscrivent dans des tudes visant promouvoir l'utilisation de membranes d'ultrafiltration en sortie d'usine

afin d'viter le relargage de micro-organismes dans les rseaux de distribution.

Figure 4 : Diversit morphologiquedes amibes retrouves auxdiffrentes tapes depotabilisation.Amibes affilies aux genresPlaytamoeba (A),Acanthamoeba

(B, D et K), Vanella (C), Glaeseria(E), Hartmannella (F et I),Naegleria (G et H) etEchinamoeba (J) sur la base dusquenage partiel du gnecodant pour l'ARNr 18S.


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Table 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs auxdiffrentes tapes de potabilisation.Les isolats indiqus par les flches verte (Echinamoebaexundans) et rouge (Hartmannella vermiformis) prsentaient dessquences d'ARNr18S identiques, suggrant qu'il pourrait s'agirde la mme souche retrouve tout le long du procd depotabilisation.

3.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau

d'eau hospitalier


Une tude semblable (et antrieure) celle dcrite ci-dessus a t entreprise l'hpital universitaire

de Lausanne. Il s'agissait l aussi de prlever de l'eau et des biofilms dans diffrents services (ranimation,

chirurgie...) et d'tudier la prvalence des amibes et la prsence de nouvelles espces bactriennes

rsistantes aux amibes. L'tiologie des infections acquises l'hpital n'tant pas toujours connue, nous

suspections que de nouveaux agents infectieux difficiles cultiver pourraient tre responsables d'une part de

ces infections, notamment des pneumonies. La co-culture amibienne pourrait tre un bon moyen de dtecter

ces nouveaux agents infectieux et c'est donc avec cet objectif que ces travaux ont t initis. Sur 200

chantillons analyss au cours de cette tude 13 ont t retrouvs coloniss par deux souches diffrentes de

l'amibe Hartmannella vermiformis (dont une thermorsistante capable de croitre 44C, et l'autre prsentant

un intron dans la squence codant pour l'ARNr18S), 1 par une souche d'Acanthamoeba polyphaga et 1 par

une nouvelle espce amibienne non clairement identifie. Une souche indigne d'H. vermiformis tait

colonise par L. pneumophila. Par ailleurs la co-culture des 200 chantillons avec la souche d'amibe A.

castellaniiATCC 30010 a permis l'amplification sur glose de 125 isolats bactriens (42,3% des chantillonsd'eau, 52,4% des biofilms prlevs sur les pommeaux de douches, 45,1% des biofilms prlevs sur les

robinets d'eau). En particulier, 43 isolats de mycobactries ont t identifis (espce peu pathogne


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Mycobacterium gordonae majoritairement, mais aussi espces pathognes Mycobacterium kansasii et

Mycobacterium xenopi), ainsi que 11 isolats de lgionelles (espce pathogne Legionella anisa

majoritairement, ainsi que L. pneumophila). Les chantillons positifs pour des amibes indignes taient

statistiquement plus frquemment coloniss par des lgionelles, ce qui avait dj t rapport dans lalittrature, mais aussi par des mycobactries, dmontrant pour la premire fois une association cologique

mycobactries-amibes. Ce dernier point tait important souligner lheure o les infections

mycobactries atypiques (ou mycobactries croissance rapide) sont de plus en plus frquemment

rapportes, avec une rsistance gnralement leve de ces mycobactries aux traitements antibiotiques

ainsi qu certains types de biocides. Par ailleurs nous avons aussi isol de nouvelles espces bactriennes.

Parmi elles une espce d'Alphaprotobactrie appartenant au genre Rhodoplanes a t retrouve dans 23

chantillons, suggrant une colonisation importante du rseau d'eau de l'hpital. Il est noter qu'une souche

de Rhodoplanes phylogntiquement proche de celle isole dans notre tude a t rcemment implique

pour la premire fois dans une infection fatale chez l'homme (105). Les autres souches isoles par co-culture

amibienne comprenaient deux souches de Pseudomonas aeruginosa ainsi que de nombreuses

Alphaprotobactries. Ces travaux publis en 2006 (93) sont frquemment cits dans les publications ayant

trait la thmatique de la contamination amibienne des rseaux et aux relations mycobactries-amibes, ils

ont contribu une meilleure connaissance de cette problmatique.

3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis enuvre dans les rseaux

Sachant que les amibes sont prsentes dans les rseaux de distribution d'eau, la question se pose de

savoir comment contrler le risque infectieux potentiel caus par les amibes et les bactries associes. Dans

cette partie nous exposons plusieurs tudes entreprises afin de contribuer rpondre cette question. La

premire tude porte sur l'efficacit des dsinfectants utiliss en faible concentration rsiduelle ou en

traitement de choc pour traiter l'eau potable dans les rseaux. La deuxime tude porte sur l'efficacit des

biocides utiliss pour traiter des matriels et des surfaces ventuellement en contact avec l'eau du rseau :

surfaces de travail, matriels lavs dans des machines laver alimentes en eau de rseau par exemple.

Enfin la troisime tude confirme l'importance cruciale des mthodes mises en uvre pour cultiver lestrophozoites et produire des kystes amibiens, avec des sensibilits des kystes la dsinfection qui varient

normment en fonction de ces mthodes.

3.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection

et implication dans la persistance des lgionelles


Nos travaux de thse ont port sur ltude de lactivit de traitements biocides couramment utiliss

pour la matrise du risque infectieux dans leau potable. Ces traitements sont utiliss de faon relativementempirique et leur impact rel sur les diffrentes populations bactriennes et les amibes prsentes dans les

biofilms sont peu ou mal connus. Ces travaux ont t mens en collaboration avec le centre de recherche


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sur l'eau et l'environnement (CIRSEE) de la socit SUEZ, toute particulirement concerne par la

problmatique de la colonisation des rseaux par les amibes et les lgionelles (L. pneumophila) qui

constituaient l'poque et constituent aujourd'hui encore un problme majeur de sant publique (pidmies

rptition dans plusieurs grandes villes franaises dont Paris pendant la coupe du monde de football de1998, pidmie dans le tout nouvel hpital europen Georges Pompidou en 2000...). L'enjeu principal de

l'tude tait de dterminer si certains traitements sont plus mme de contrler la prolifration des amibes

et des lgionelles dans les rseaux, voire mme de les radiquer. Afin d'valuer l'efficacit de 6 traitements

biocides diffrents nous avons d'abord mis en place un pilote reproduisant un rseau d'eau intrieur. Ce

pilote comprenait 7 boucles parallles, avec pour chacune un bras principal en acier galvanis (circulation

d'eau en continu) et un bras mort en cuivre (eau stagnante). Le pilote a d'abord t aliment avec de l'eau de

rivire filtre sur sable, progressivement remplace par de l'eau du rseau pour permettre la colonisation par

une flore microbienne reprsentative. Des systmes de coupons amovibles et de cartouches de billes de

verre taient installs sur le pilote afin de permettre des prlvements de biofilms pour analyse qualitative et

quantitative, respectivement. Lors de l'tape de colonisation nous avons dop la flore en lgionelles isoles

partir du pilote. Une fois la flore stabilise nous avons valu l'action de 6 traitements diffrents (+1 boucle

tmoin) sur la flore. Nous avons utilis des mthodes de quantification des diffrentes populations

bactriennes (hybridation fluorescente in situ avec des sondes spcifiques de groupe, dtection en

microscopie confocale et quantification par analyse d'images) et amibiennes (dnombrement) afin de mettre

en vidence les changements de composition des populations induits par les traitements. Des mthodes

dvaluation de la viabilit des populations bactriennes (marquage fluorescent Live/Dead coupl une

dtection en microscopie confocale) ont aussi t utilises pour mesurer lefficacit biocide des traitements.Les rsultats obtenus ont clairement dmontr que si parmi les 6 traitements tests (chlore, dioxyde de

chlore, monochloramine, ozone, ionisation cuivre-argent et lectro-chloration) le dioxyde de chlore paraissait

tre le plus efficace pour contrler les prolifrations dans le bras mort, aucun traitement ntait en revanche

capable dradiquer compltement les biofilms bactriens ainsi que les bactries du genre Legionella et les

amibes associes aux biofilms. La plupart des traitements permettaient de diminuer de faon plus ou moins

importante la flore totale ainsi que les lgionelles et les amibes dnombres sur glose mais leur interruption

menait invariablement une r-apparition rapide de la flore, y compris les amibes et les lgionelles. Par

ailleurs les amibes semblaient prolifrer sur les biofilms traits par certains biocides, se nourrissant debactries mortes (Fig. 5). Ces travaux dmontrent donc que des traitements mal maitriss peuvent conduire

une prolifration de ces micro-organismes eucaryotes et des pathognes associs dans les rseaux. Ces

travaux ont t publis en 2004 (90). Ils ont contribu une meilleure comprhension de l'efficacit relative

des biocides sur la flore des rseaux en conditions proches des conditions relles.


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Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead.Le biofilm trait au dioxyde de chlore est majoritairement constitu d'une flore bactrienne morte (marquage IP) mais denombreuses amibes sont prsentes (nombreuses tches jaunes, agrandies en B), suggrant un effet limit du traitementsur les amibes.

3.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss

dans les tablissements de soins


Suite deux revues exhaustives de la littrature portant sur l'efficacit des traitements biocides sur

les protozoaires (88) et plus particulirement sur les amibes libres de l'environnement (96), nous avonsconstat qu'il existait des tudes valuant les traitements utiliss pour la potabilisation de l'eau ou pour la

sanitisation des lentilles de contact (problme des kratite amibiennes) mais qu'il n'existait que trs peu de

donnes sur les biocides couramment utiliss pour traiter les surfaces et les matriels l'hpital mais aussi

dans l'industrie agro-alimentaire et l'industrie pharmaceutique. Or les amibes sont bien prsentes lhpital

(cf tude ci-dessus l'hpital de Lausanne), et il semblerait que dans certains cas elles puissent coloniser

des matriels mdicaux (74). Elles sont aussi prsentes dans les industries agroalimentaires o elles sont

notamment suspectes de servir de vecteur d'infection des levages de volailles par les campylobactries (6,

7, 78). Nous avons donc initi des travaux visant dterminer quels biocides utiliss pour traiter les surfaces

sont susceptibles d'tre efficaces contre les amibes sous forme de trophozoite (forme active) ou de kyste

(forme dormante). Alors que la plupart du temps seule une deux souches sont testes dans les tudes

d'efficacit des biocides sur les amibes nous avons utilis 9 souches diffrentes d'Acanthamoeba, dont 3

souches de collection et six souches isoles lors des tudes l'hpital et dans l'usine de potabilisation.

L'efficacit des traitements a t value contre les trophozoites (forme active) et contre les kystes (forme

dormante) en utilisant une simple mthode de mise en contact avec les produits tester suivie d'une

neutralisation de l'activit du biocide et d'un ensemencement des amibes traites sur gloses non nutritives +

Escherichia coli(les amibes se dveloppent en ingrant les bactrie , formant de vritables plages de lyse

sur la couche d'E. coli). Concernant les trophozoites (Table 2), tous les biocides se sont rvls pleinementefficaces l'exception notable de la glutaraldhyde 2% (seule ou en formulation) qui mme aprs un temps

de contact de 30 minutes ne permettait pas d'radiquer les amibes, certaines souches prsentant moins de 1


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log de rduction. Concernant les kystes (Table 3) nous avons mis en vidence leur rsistance une

exposition la chaleur (55C) ainsi qu' de nombreux traitements (glutaraldhyde, eau de Javel 250 ppm,

peroxyde d'hydrogne 7,5%) tandis que d'autres traitements taient nettement plus efficaces (peroxyde

d'hydrogne en formulation, acide peractique...). Par ailleurs nous avons constat que la paroi des kystesdes souches environnementales tait plus paisse que celle des souches de collection, et que ces souches

environnementales taient plus rsistantes la dsinfection (Fig. 6). Parmi elles, les souches isoles de

l'hpital de Lausanne taient les plus rsistantes. Ceci peut s'expliquer par la mise en uvre rgulire de

traitements chocs de dsinfection la chaleur ou au chlore dans ces rseaux, et donc la slection de

souches plus rsistantes. Ces travaux ont t publis en 2010 (26), ils ont permis de prciser l'efficacit

relative des traitements biocides vis--vis des amibes, et de montrer que les souches de collection

gnralement utilises dans ces essais sont peu reprsentatives des souches de terrain.

Figure 6 :Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches d'amibes.Kystes obtenus partir de souches de terrain isoles partir d'eau de rivire (A) ou d'eaux de rseaux hospitaliers (B etC), et kystes obtenus partir de la souche de collectionAcanthamoeba polyphaga CCAP 1501/18.Barre : 2 m.


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3.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la

rsistance des kystes drivs


Lors des travaux raliss en 2010 nous avons utilis des mthodes classiques de culture des amibes

en milieu synthtique Peptone-Yeast-Glucose (PYG) suivies d'un enkystement en tampon Neff afin de

produire les kystes soumettre aux traitements de dcontamination (65). Nous savions cependant que

plusieurs auteurs ont rapport la formation de kystes relativement peu matures lorsque ces mthodes sont

utilises, ceci d'autant plus si les souches d'amibes utilises ont t cultives pendant de nombreuses

gnrations en PYG (14, 17, 46, 54, 68). Par ailleurs des travaux publis en 2009 indiquent que si les

trophozoites amibiens sont cultivs sur couches de cellules HEp-2 plutt qu'en milieu PYG strile la virulence

et la capacit d'enkystement sont ractives (53). A l'heure o les mthodes utiliser pour valuer l'efficacit

des traitements de dsinfection sur les kystes amibiens sont en discussion (4), il nous a sembl intressantd'explorer la rsistance des kystes amibiens issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2, ceci afin de

pouvoir ventuellement proposer cette mthode de culture dans les futures normes d'essais de cysticidie .

Brivement, les amibes ont t :

cultives en milieu PYG puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C,

ou cultives sur cellules HEp-2 puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C.

La fragilit relative des kystes produits suivant les deux mthodes a t value grce un double

marquage calcofluor (marquage de la cellulose contenue dans la paroi des kystes) et iodure de propidium

(IP, intercalant ADN ne pntrant que dans les kystes permabiliss) avant et aprs traitement SDS 0,5%

pendant 10 min (Fig. 7 & 8). Cette premire caractrisation a permis de dmontrer que les kystes produits

partir de trophozoites cultivs en milieu PYG sont gnralement plus fragiles, donc plus permabiliss par le

traitement SDS et marqus en plus grande proportion par l'IP.

Figure 7 : Dtection des kystes permabilisspar le traitement SDS par marquage l'iodurede propidium.Le marquage au calcofluor (bleu) et l'iodurede propidium (rouge) permet de distinguer leskystes permabiliss par le traitement SDS.La proportion de kystes marqus IP est

gnralement plus importante chez les kystesproduits partir de trophozoites cultivs enPYG, ceci aussi bien avant (A) qu'aprs (B) letraitement SDS. Chez les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellulesHEp-2 la proportion moins importante dekystes marqus IP avant (C) et aprs (D)traitement SDS traduit une moindrepermabilit et une plus grande rsistance auSDS.


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Figure 8 : Proportion des kystesmarqus IP avant (colonnesblanches) et aprs (colonnesgrises) traitement SDS pour leskystes des 4 souchesd'Acanthamoeba obtenus partirde trophozoites cultivs en PYGou sur cellules HEp-2.

Des observations en microscopie lectronique transmission ont de plus permis de mettre en

vidence un nombre important de vacuoles lipidiques dans les kystes issus de trophozoites cultivs sur

cellules HEp-2 (Fig. 9) tandis qu'elles n'taient pas ou que peu prsentes chez les kystes issus de

trophozoites cultivs en PYG. Ces vacuoles lipidiques sont gnralement associes aux kystes matures (15).

L'analyse en cytomtrie en flux des kystes marqus au calcofluor (reflet du contenu en cellulose) a confirm

ces observations, avec une population htrogne constitue de kystes matures (contenu en cellulose lev)

et immatures (contenu en cellulose moins lev) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG,

tandis que les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 taient essentiellement

matures (Fig. 10). Les observations ralises en microscopie lectronique balayage sur une souche

d'Acanthamoeba ont confirm ces diffrences, avec des kystes matures (aspect pliss) et immatures (aspect

arrondi) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG, et essentiellement des kystes matures chez

les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 (Fig. 11).

Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique transmission des kystes produits partir de trophozoites

cultivs sur cellules HEp-2. De nombreuses goutteletteslipidiques sont visibles dans le corps cellulaire. Barre : 2 m.


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Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au calcofluor.Les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG sont constitus de deux populations : rgion A correspondant auxkystes immatures et B correspondant aux kystes matures. Les kystes issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2sont majoritairement constitus d'une population homogne de kystes matures (rgion C, la rgion D correspondantessentiellement des dbris cellulaires).


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Figure 11 :Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage.Les kystes matures (photos du haut) ont un aspect pliss (A) et une surface d'apparence granuleuse (B). Les kystesimmatures (photos du milieu) sont arrondis (C) et prsentent une surface d'apparence fibreuse (D). Des kystes

prsentant un aspect intermdiaire ont t observs dans les populations issues des trophozoites cultivs sur cellulesHEp-2 (photos du bas): apparence crnele (E) avec une surface fibreuse (F).


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Les kystes produits partir de trophozoites cultivs suivant les deux mthodes ont par la suite t

soumis des traitements de dcontamination. Les rsultats montrent clairement que les kystes issus de

trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 sont souvent plus, voire beaucoup plus rsistants certains

traitements (Fig.12 page suivante): chaleur (65C), eau de javel dilue 0,25%, produit base deglutaraldhyde 2%, peroxyde d'hydrogne 7,5% et produit base d'orthophtalaldhyde 0,55% voient leur

efficacit diminue de manire plus ou moins importante suivant les souches d'amibes considres. Le

produit base d'acide peractique 0,2% conserve son efficacit. Ces rsultats sont mettre en perspective

avec l'utilisation faite de certains de ces traitements sur le terrain. La glutaraldhyde est encore frquemment

utilise comme dsinfectant de haut niveau dans certains pays europens et aux US ; d'autres auteurs

avaient dj rapport une efficacit limite de cette molcule sur les kystes amibiens (43). Les donnes

concernant l'efficacit de la chaleur varient d'une tude l'autre. Turner et alrapportent qu'une exposition

46C pendant 30 min est efficace contre les trophozoites, tandis qu'une exposition pendant 30 min 56C

est ncessaire pour inactiver les kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts en

tampon Neff (97). Aksozek et alrapportent qu'une exposition une temprature de 65C pendant plus de 5

min est efficace pour inactiver des kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts sur

gloses non nutritives (3), tandis que Ludwig et alrapportent que des kystes deA. castellaniietA. polyphaga

produits par enkystement en milieu PYG ne sont inactivs qu'aprs exposition 80C pendant 10 min (57).

Inversement, des kystes d'une souche thermotolrante d'Acanthamoeba infects parL. pneumophila n'ont

pas t inactivs aprs une exposition 80C pendant 10 min (83). La rsistance accrue des kystes la

chaleur observe dans notre tude est un point important car des chocs thermiques 65C sont

frquemment utiliss pour contrler la prolifration de L. pneumophila dans les rseaux d'eau (63). Uneefficacit limite de ces chocs sur les kystes d'Acanthamoeba pourrait donc entrainer un risque accru de

contamination des rseaux.

Globalement, ces travaux confirment l'intrt de la mthode de culture des trophozoites amibiens sur

cellules HEp-2 plutt qu'en milieu synthtique PYG, permettant d'obtenir des kystes plus matures contre

lesquels les traitements de dcontamination peuvent tre tests de faon pertinente. Ils appellent d'autres

tudes de validation afin de mettre en place des mthodes standardises d'valuation de l'efficacit des

traitements sur les kystes.


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Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souchesd'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG (colonnes noires) ou sur cellules HEp-2 (colonnesgrises). > rduction maximale observable ; * diffrence significative avec P< 0,05 ; ** diffrence significative avec P 10

semaines en suspension dans de l'eau du robinet strile et gnralement > 10 semaines en milieu PYG (Fig.17). Concernant les spectres d'hte (Table 5) il est intressant de noter que les deux souches de P.

acanthamoebae ne prsentent pas exactement le mme spectre : la souche Bn9 n'est pas capable d'infecter

les deux souches d'Acanthamoeba lenticulata tandis que la souche Hall coccus l'est. Par ailleurs de

nombreuses vsicules (ou pseudo-kystes ?) sont observs la fin du cycle d'infection des amibes par

C. sequanensis, mis part lors de l'infection des deux souches d'A. lenticulata qui semble nettement moins

efficace. Enfin P. naegleriophila infecte efficacement toutes les souches amibiennes tandis que W.

chondrophila prsente un spectre plus limit avec une infection rellement productive chez seulement deux

souches d'amibes.

Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like.a: nombreuses vsicules observes la fin du cycle d'infection.

Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like.


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Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis.C. trachomatis (ligne en pointills), P. acanthamoebae souche Bn9 (carrs blancs), P. acanthamoebae souche Hallcoccus (carrs noirs), P. naegleriophila (losanges noirs), W. chondrophila (triangles noirs) et C. sequanensis (rondsnoirs) ont t schs en microplaques 96 puits en l'absence de souillures organiques (A) ou en prsence de srumalbumine bovine + sang (B), ou suspendus en eau du robinet strile (C) ou en bouillon PYG (D).

Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2.La dtection a t ralise l'aide du kit Bio-Rad Pathfinder (anticorps spcifiques) 7 jours aprs l'infection des amibes.


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L'infection des souches d'amibes par C. trachomatis n'a jamais donn lieu une prolifration

bactrienne dans les amibes directement visible au microscope comme pour la plupart des Chlamydia-like.

Par ailleurs l'utilisation de la PCR quantitative (50) n'a pas permis de mettre en vidence une augmentation

du nombre de copies d'ADN de C. trachomatis lors de l'infection des amibes : ce nombre de copies restaitgnralement relativement constant entre le premier jour et le douzime jour de l'infection. En revanche

l'utilisation du kit de dtection in situ des C. trachomatis a permis de mettre en vidence la prsence de ces

bactries dans les amibes infectes jusqu' 7 jours aprs l'infection (Fig. 18). Ce rsultat est intriguant est

appel des explorations complmentaires. Des exprimentations similaires avec Chlamydia abortus ont mis en

vidence une disparition rapide des bactries intra-amibiennes qui devenaient indtectables avec des

anticorps spcifiques (104). En revanche l'tude de Essig et alsemble dmontrer une survie, voire une faible

multiplication de Chlamydia pneumoniae dans les amibes (33). Nos rsultats, combins au fait que certains

auteurs ont rcemment rapports l'identification de bactries proches de C. trachomatis dans des amibes

isoles de cornes infectes (48), peuvent laisser supposer que C. trachomatis est capable de survivre dans

les amibes pendant une dure significative. Concernant enfin l 'effet des traitements de dsinfection sur les

bactries extracellulaires (Table 6), l'observation la plus notable est la rsistance importante des Chlamydia-

like la chaleur en comparaison avec C. trachomatis : la rduction de titre observe aprs exposition 55C

pendant 10 min est de l'ordre de 0,5 Log 10 pourPa. acanthamoebae Bn9 et Pr. naegleriophila, de 1,5 2,0

Log10 pour W. chondrophila et P. acanthamoebae Hall coccus, et de 3,5 Log10 pour C. sequanensis.

L'inactivation est complte pourC. trachomatis. Comme pour la rsistance des kystes amibiens la chaleur

(cf paragraphe 3.2.3), cette apparente rsistance des Chlamydia-like la chaleur pose question car la

chaleur est souvent utilise pour contrler les flores microbiennes dans les rseaux de distribution d'eau (63).

4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries

Le genre Mycobacterium comprend un grand nombre d'espces pathognes pour l'homme, dont les

plus connues sont Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae et Mycobacterium ulcerans

responsables respectivement de la tuberculose, de la lpre et de l'ulcre de Buruli. Par ailleurs les espces

regroupes sous l'appellation mycobactries non tuberculeuses (NTM en anglais) reprsentent ungroupe d'espces diverses qui sont largement prsentes dans l'environnement et frquemment isoles des

sols et des eaux (eaux de surface, eaux de rseaux). Ces espces sont responsables d'un nombre croissant

d'infection respiratoires, cutanes et des tissus mous (19, 30, 103). Les NTM appartenant au complexe

Mycobacterium avium, ainsi que les espces M. abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. fortuitum, M.

kansasiiet M. mucogenicum sont les plus frquemment isoles des patients. Les infections causes par ces

espces sont souvent considres comme opportunistes mais la prsence ubiquitaire de ces bactries dans

divers types d'eaux (y compris l'eau des rseaux hospitaliers) et la difficult qu'il y a traiter les infections

qu'elles causent en font un problme majeur de sant publique. Les tudes rapportant la capacit des

mycobactries survivre et / ou se multiplier dans les amibes libres de l'environnement sont de plus en plus

nombreuses. Nous en avons fait une revue en 2007, dmontrant clairement que la plu

Documents

Amibes libres de l'environnement :, eau,écologie