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Acta Botanica Gallica: BotanyLettersPublication details, including instructions for authorsand subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/tabg20

Analyse en serre de plantes depomme de terre transforméespar Agrobacterium rhizogenesAgnès Dobigny a , Annick Ambroise a , Van Egger a &Line Rossignol aa Laboratoire de Morphogenèse végétaleexpérimentale , bât. 360, Université Paris-Sud ,F-91405 , Orsay CedexPublished online: 26 Apr 2013.

To cite this article: Agnès Dobigny , Annick Ambroise , Van Egger & LineRossignol (1994) Analyse en serre de plantes de pomme de terre transformées parAgrobacterium rhizogenes , Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 141:1, 15-26, DOI:10.1080/12538078.1994.10515131

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Acta bot. GaUica, 1994, 141 (1), 15-26.

Analyse en serre de plantes de pomme de terre transformees par Agrobacterium rhizogenes

par Agnes Dobigny, Annick Ambroise, Van Egger et Line Rossignol

Laboratoire de Morphogene5e vegetale experimentale, biit. 360, Universite Paris-Sud, F-91405 Orsay Cedex

(Manwcrit re~u le 25 mars 1993; accepte le 21 septembre 1993)

Resume.- Une etude morphologique de plantas de pomme de terre transfor­mees par Agrobacterium rhizogenes (souches a mannopine et a cucumopine) a ete realisee en serre. L'analyse moleculaire par Dot Blot a confirms !'inte­gration du T-DNA du plasmide Ri dans ces plantas. Les plantas transformees, obtenues par regeneration a partir de clones racinaires transformes ou direc­tement neoformees sur section d'entre-nc:euds, ant montre une grande diversi­te ph9notypique. Plusieurs niveaux de variations ant ete mis en evidence : Ia variation entre plantas issues d'un mArne clone racinaire est mains etendue que cella entre plantas regenerees a partir de clones racinaires independants. D'autre part, les plantas neoformees directement sur section d'entre-nc:euds sont les mains perturoees morphologiquement. Ainsi, ce nouveau mode de transformation permet de limiter Ires nettement Ia variation somaclonale.

Summary.- A morphological study of potato plants transformed by Agrobac­terium rhizogenes (mannopine and cucumopine strains) was conducted in the greenhouse. A Dot Blot analysis confirmed the integration of the Ri plasmid T­DNA in these plants. The transformed plants obtained by regeneration from transformed root lines or directly formed on internode sections showed a great variation in their phenotypes. Several variation levels have been observed : variation was less extended between plants issued from a same root line than between plants regenerated from independant root lines. Moreover, plants directly produced on internode sections were morphologically less disturbed. This new transformation process seems, therefore, to limit somaclonal varia­tion.

Key words : Solanum tuberosum - Agrobacterium rhizogenes - trans­formation -greenhouse morphology- Dot Blot.

©Societe botanique de France 1994. ISSN 1253-8078.

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INTRODUCTION

Les travaux sur Ia transformation de Ia pomme de terre par des souches sauva­ges d'Agrobacterium rhizogenes (15834 ou 1855) ou a l'aide de constructions bacteriennes contenant un plasmide Ri ont debute il y a une dizaine d'annees (Willmitzer et al., 1982). Seuls les plas­mides Ri a agropine contenant deux re­gions T (TL et TR) ont ete utilises par differents auteurs pour transformer un petit nomhre de varietes (Bintje, Desi­ree, Maris Bard) (Ooms et al., 1985; Hanisch ten Cate et al., 1987) et quel­ques genotypes diplo'ides et monohaplo'i­des (De Vries-Uijtewaal et al., 1988; Visser et al., 1989). La region TR porte les gimes codant pour Ia biosynthese de l'auxine et de l'agropine. La region TL est homologue de l'unique region T des souches a mannopine et a cucumopine (Spano et al., 1982). La presence d'une seule region T dans ces souches est un avantage majeur puisque, grace a Ia presence constante d'opine(s), Ia mise en evidence de l'etat transforme des cel­lules vegetales est tres rapide et tres ai­see. Nous avons alors choisi d'etudier }'influence de souches d'Agrobacterium rhizogenes a cucumopine et a manno­pine, non encore employees pour Ia transformation de Ia pomme de terre, sur deux varietes : BF15 et Fanette. Ces souches bacteriennes, non pathogenes dans un premier temps, ont ete utili­sees efficacement grace a une bonne maitrise d'un apport auxinique exogene (induction d'ANA a 5 mg.I·1

) et endo­gene (changement de polarite). L'effica­cite de cotransformation, etablie par Ia mise en evidence des opines et de l'acti­vite du gene codant pour Ia 13-glucuro­nidase, est tres Clevee. La regeneration de plantes entieres a partir des racines transformees a ete obtenue rapidement apres passage par un cal. Une methode de transformation efficace et rapide a

done ete mise au point (Dobigny et al., 1992a). Mais, suite a l'inoculation avec ces souches, un phenomene nouveau est apparu : le developpement de bourgeons transformes directement sur Ia section des entre-nreuds. L'analyse histologique de ces bourgeons montre que ces tiges sont neoformees a partir de cellules cor­ticales de l'entre-nreud et non a partir d'une racine (Dohigny et al., 1992b). Nous avons choisi de transferer en serre un certain nombre' de plantes transfor­mees afrn de les comparer en tenant compte de leur mode d'obtention : re­generations a partir de clones racinai­res ou neoformations directes sur sec­tions d'entre-nreuds. Nous avons pro­cede, alors, a des experiences d'hybri­dations moleculaires afin de confirmer leur etat transforme et effectue une etude morphologique qui porte sur des caracteres des appareils vegetatif et reproducteur.

MATERIEL ET METHODES

Materiel vegetal L'analyse a porte sur : • les deux variates temoins BF15 (INRA, 1947) et

Fanette (INRA, 1984), • un echantillon de quatorze plantas transforrnees,

obtenues ~ partir de clones racinaires transforrnes qui no us ont paru constituer un echantillon representat~ de !'ensemble des plantas transforrnees obtenues par cette methode. Ouatre plantas sont regenerees ~ partir de clones racinaires independants et, pour chacun des deux clones racinaires R4 et R5, cinq plantas issues de cals dille rents ont ate retenues,

• les sept plantas transformees apparues directe­ment sur section d'entre-nO!!uds.

Ces plantas transforrnees et les 2 temoins ayant ate clones, l'essai a porte sur 23 clones au total, cha­que clone etant represent& par 4 ~ 7 individus. Les plantas transformees ont ate obtenues apres inocula­tion avec les souches ~ cucumopine (2659 et 2659 GUS) et ~ mannopine (8196 GUS) (Dobigny et a/., 1992a).

Mise en place de l'essal et conditions envlronne­mentales de Ia serre Insect-proof

Des plantas in vitro agees de 4 semaines sont trans­ferees pour sevrage dans une serre dans des pots contenant un melange de terreau de Baal (2/5), de

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terreau de feuilles de Mtre (1/5), de terre vegetale (1/5), de sable de Loire (1/5). Trois semaines plus lard, ces plantas sent repiquees en container contenant de Ia terre sablo-limoneuse dans une serre experi­mentale insect-proof, refroidie par un systilme de type ·cooling·. La temperature varia de 15 a 22•c. Les plantas sent disposees au hasard, avec un espace­ment de 0,60 m d'une plante a !'autre dans Ia mAma rangee et de 1 m d'ecart entre les rangees. A Ia fin de l'essai, les plantas, a !'exception des tubercules, ont ate detruites en conform~e avec les rilgles en vigueur.

Analyse moleculalra des plantas par Dot Blot L'ADN genomique est extrait a partir de 10 g de

matiilre fralche salon le protocole decrit par Phelep el a/. (1991 ). L'ADN est purifie par centrnugation sur gra­dient de CsCI (Maniatis at a/., 1982). Les ADNs plas­midiques utilises comma sondes sent extraHs par lyse alcaline (Maniatis el a/., 1982). La sonde DB 145 est un fragment Hindiii-EcoRI de 2,3 Kb qui contient Ia bordure droHe du T-DNA et le gilne de synthilse de Ia cucumopine. La sonde T 218 est un fragment BamH1 de 25 Kb qui recouvre tout le T-DNA, notamment Ia bordure droite, le gilne de synthilse de Ia mannopine, les gilnes assimiles aux gilnes rol (Hansen, 1991 ). Les ADNs vegetaux et plasmidiques sent digeres a 37•c pendant 5h et 1 h respectivement par !'endonuclease de restriction appropriee (1 0 U/~g d'ADN de plante, 1 U/~g d'ADN plasmidique) salon le protocole du four-

Parametres etudles Les observations morphologiques ont ate effectuees

au bout de deux mois et ont porte sur l'appareil vege­tatif et reproducteur. Les paramiltres mesures et ob­serves sent regroupes dans le tableau I.

Tableau 1.- Paramiltres mesures et observes sur les appareils vegetatif et reproducteur des plantas transferees en serre insect-proof.

Table 1.- Measured and observed parameters on vegetative and reproductive parts of plants transferred in an insect-proof greenhouse.

Caract~res mesur~s et observ~s

- Hauteur de Ia base de Ia plante 11. Ia base de Ia premi~re cyme infl orescen tielle.

La tige 0 Nombre de cycles inflorescentiels, chacun d'eux se terminant par une inflorescence. Le relais v~g~tatif, qui donner a naissance

principale au nouveau cycle, est assur~ par un bourgeon axillaire de !'avant-derni~re feuille situ~e so us !'inflorescence (Benzine-Tizroutine et coli., 1993). - Surface moyenne de Ia troisi~me feuille situ~e so us !'inflorescence dans Ie deuxi~me cycle (calcul~e 11. I' aide d'un planim~tre Delta T, Area Meter). - Couleur du feuillag~ : Ia Fanette a un feuillage vert clair mat qui contraste avec le vert plus fonc~ brillant des feuilles de BF15. La

Le feuillage couleur des feuilles des pi antes transform~es peut etre vert clair mat (comme Fanette), vert fonc~ brill ant (comme BF15) ou vert tr~s fonc~ brill ant. - Gaufrage du feuillage : les plantes transform~es pr~sentent une grande variation qui va d'une absence de gaufrage (com me Ies t~moins Fanette et BF15) 11. un feuillaRe tr~s Raufr~.

Le syst~me - Intensit~ d'enracinement secondaire. racinaire - Taille des racines principales.

Les fleurs et - Floraison et viabilit~ du pollen (estim~e par Ia coloration rouge

Ies fruits des grains de pollen viables apr~s traitement au carmin ac~tique). 0 Fructification ou non fructification des plantes. 0 Nombre de tu hercules/pied.

Les - Masse de tubercules en g/pied. tubercules Seuls les tubercules de masse sup~rieure 11. 5 g ont ~t~ pris en

compte.

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nisseur (Boehringer). Apres denaturation, les fragments d'ADN de plante sont deposes sur une membrane (Hy­bond-N, Amersham). Les sondes sont marquees radio­active men! par de l'a32P dCTP grace au kit megaprime (Amersham). Les conditions d'hybridation sont celles decrites par Maniatis er at. (1982). Les membranes hybridees sont autoradiographiees sur film Kodak XOmat.

RESULTATS

1 - Verification de l'etat transforme des plantes

L'ADN des plantes transformees par les souches a cucumopine (2659 et 2659 GUS) est hybride avec Ia sonde DB 145 et celui des plantes transformees par Ia souche a mannopine (8196 GUS) est hybride avec Ia sonde T 218. Au­cune hybridation n'a lieu entre les son­des et I'ADN genomique des plantes te­moins BF15 et Fanette (Pl. I). Chaque spot montre que l'hybridation a lieu pour chaque clone transforme et revele done Ia presence d'au moins une copie du T-DNA integre dans le genome de ces plantes transformees de pomme de terre. Les resultats presentes sur Ia planche I montrent Ia nature transfor­mee pour 14 plantes sur 23 etudiees mais nous avons detecte Ia presence du T-DNA dans toutes les plantes transfe­rees en serre insect-proof.

2 - Classcmcnt des plantcs transfor­mccs etudiecs

Nous avons choisi de traiter separe­ment les deux populations de plantes : les plantes neoformees a partir de clo­nes racinaires transformes et celles neo­formces directement sur section d'en­tre-nreuds. Un certain nombre de me­sures ont cte utilisces pour repartir les 23 clones en groupes et sous-groupes. Ainsi, celles portant sur le caractere hauteur moycnne de Ia plante (h) ont permis de faire un premier classement en etablissant trois groupes de plantes : un groupe tcmoin (T) comprenant Ia

BF15 et Ia Fanette (h = 78 em) et deux autres groupes G

1 h = 37 em) et G

2 (h = 13 em) constitues des 21 clones transformes. Nous avons ensuite affine le classement. A l'interieur du groupe G

1, trois sous-groupes ont pu etre cons­

titues : G1., G 1b et G1c en tenant compte

de Ia surface foliaire, de Ia masse de tubercules par pied et du nombre de cycles inflorescentiels. Les resultats por­tant sur les caracteres mesures sont pre­sentes dans les tableaux II et III (dans lesquels, pour chaque groupe ou sous­groupe, nous avons indique Ia moyenne sur n mesures effectuees et Ia variation observee).

3 - Etude des differents parametres • Caracteres lies a Ia tige principale Toutes les plantes transformees sont

plus petites que les temoins. Celles du groupe G

2 presentent d'ailleurs un na­

nisme aigu. La premiere inflorescence rencontree est tres basse chez les clones possedant un nombre eleve de cycles in­florescentiels. II en est ainsi en particu­lier pour toutes les plantes transformees qui ont un nombre de cycles inflores­centiels plus eleve que celui du temoin Fanette (F7, F9 et F12). Le nombre de cycles inflorescentiels est un bon critere pour evaluer le degre de perturbation du fonctionnement de Ia plante. Les groupes G

1c et G

2 ont un fonctionnement

tres aberrant : le nombre de cycles est en moyenne de 1 ,2.

• Caracteres lies au feuillage Les plantes transformees a fonction­

nement perturbe, regroupees en Glc et G

2 vieillissent tres rapidement, de sorte

qu'au moment de !'observation, un cer­tain nombre d'entre elles avaient perdu leurs fcuilles aux deux premiers cycles inflorcscenticls. Ainsi, le nombrc de me­sures concernant le feuillagc s'cn est trouve tres reduit, notamment pour les mesurcs de surface foliaire. La planche IIA montre les graduations du

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Planche 1.- Analyse moleculaire des plantas par Dot Blot. A - Plantas transformees avec les souches 2659 et 2659 GUS. a- representation d'une partie de Ia carte de restriction (Hindiii-EcoRI) de Ia region T du plasmide pRi 2659 (Combard et a/., 1987). Le fragment DB 145, localise sur cette carte, est utilise comma sonde ; b - Dots blots realises avec Ia sonde DB 145. B- Plantas transformees avec Ia souche 8196 GUS. a- representation d'une partie de Ia carte de restriction (BamH1) de Ia region T du plasmide pRi 8196 (David et Tempe, 1987). Le fragment T 218, localise sur cette carte, est utilise comma sonde : b - Dots blots realises avec Ia sonde T 218.

Plate I .- Molecular analysis of plants by Dot Blot. A - Plants transformed with 2659 and 2659 GUS strains. a- representation of a part of the restriction map (Hindiii-EcoRI) of the pRi 2659 T region (Combard et a/., 1987). The fragment DB 145, placed on this map, is used as probe ; b - Dots blots realized with the DB 145 probe. B - Transformed plants with the 8196 GUS strain. a - representation of a part of the restriction map (BamH1) of the pRi 8196 T region (David and Tempe, 1987). The fragment T 218, placed on this map, is used as probe; b- Dots blots realized with the T 218 strain.

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Tableau 11.- Caracteres mesures sur las plantas regenerees a partir de clones racinaires transformes. Table 11.- Measured characters on plants regenerated from transformed root lines.

Groupe No clone

T

Gt

Fanette

BF15

F12 , B21 G 1a et B23

Gtb

G1c

B17, Bl8, Bl9 et

B20 B10, Bt3, Bl4, B15

et B24

Btl et B22

Mesures

moyenne variation nombre

moyenne variation nombre

moyenne v ari at ion nombre

moyenne variation nombre

moyenne variation nombre

moyenne variation nombre

Hauteur I Nombre sous la l o tu berc. infloresc. par pied

(em) 7 0

52-90 n = 14

85 77-98 n = 14

3 6 25-52 n = 17

4 0 21-5 8 n = 25

3 6 20-64 n = 21

1 4 9-21 n=8

9,3 3-20

n = 14 5,9 4-13

n = 14

10,4 4-19

n = 17 9,2 2-12

n = 25 6,3 2-15

n = 32

1 '5 0-7

n = 10

Masse tuberc.

par pied (g)

1637 850-2510

n = 14 326

83-654 n = 14

347 157-580

n = 17 2 2 1

77-370 n = 25 1 2 1

12-266 n = 33

1 4 7-49 n = 9

Surface foliaire (mm2J

i Nombre 1 cycles ! infloresc. ~

16 3 4 I 419-39521

n = 14 I

1687 ! 33s-3soo 1

n = 14 i 7 6 4 !

261-21701 n = 14 I 3 2 9 !

75-514 I n = 24 i 1 7 1 !

113-323 1 n = 6 1

1 1 8 i 115-122 I

n = 2 !

3,4 2-4

n = 14

1 '2 1-2

n = 14

3,5 3-5

n = 17 2,7 1 -4

n = 25

1 '3 0-3

n = 22

1 '2 0-4

n = 8

lnflores. = inflorescence ; n = nombre de mesures effecturees. BX BF15 ; FY = plante transformee Y issue de Fanette.

plante transformee X issue de

Tableau Ill.- Caracteres mesures sur las plantas neoformees directement sur Ia section d'entre-nceuds. Table Ill.- Measured characters on plants directly produced on internode sections

Hauteur Nombre Masse Surface i Nombre Groupe No clone Mesures sous Ia 1 o tu berc. tuberc. foliaire I cycles

infloresc. par pied par pied (mm2) I infloresc. (em) (g) !

moyenne 7 0 9,3 1637 1634 i 3,4 Fanette variation 52-90 3-20 850-2510 419-39521 2-4

nombre n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 I n = 14

T moyenne 8 5 5,9 326 1 6 8 7 ! 1 '2 BF15 variation 77-98 4-13 83-654 335-3soo 1 1-2

nombre n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 I n = 14

moyenne 3 4 9,9 562 11 9 0 I 3,8 Gta F7 et F9 variation 24-45 5-17 139-1117 733-305lf 3-5

nombre n = 10 n = 10 n = 10 n=8 I n = 10

Gt moyenne 3 9 12' 6 244 58 7 i 3 '1 Gtb

B3. B5 et variation 25-61 4-26 97-486 221-11261 2-4

B6 nombre n- 21 n = 21 n = 21 n = 20 n = 21

moyenne 1 2 0,5 9 8 9 I 1. 2 Gz F4 et F8 v ari ati on 5-29 0-2 5-38 44-131 I 0-2 I

nombre n = 8 n = 11 n = 11 n=4 I n = 8

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gaufrage au niveau des feuilles des dif­ferentes plantes transformees etudiees. La couleur varie du vert clair mat a vert tres fonce brillant en passant par vert fonce brillant. Le gaufrage le plus prononce est tres souvent associe a Ia couleur vert tres fonce. Le feuillage peut etre majoritairement vert clair pour des plantes transformees issues de Fanette ou vert fonce pour des plantes trans­formees issues de BFlS. Les plantes les plus proches des temoins, par leur ab­sence de gaufrage et leur couleur, sont les clones B21, Bl4, B3, BS, B6 (pro­ches de Ia BFlS) et F7, F9 (proches de Ia Fanette). Toutefois, Ia surface foliaire de ces plantes est en general plus re­duite que celle des temoins (reduction de moitie pour F7 a plus de 9/lOeme pour Bl4) sauf pour F9 pour lequel Ia surface foliaire moyenne est egale a celle du temoin Fanette (Tableaux II et III).

• Caracteres lies au systeme racinaire Nous constatons que toutes les plan­

tes transformees etudiees ont des raci­nes de plus faible diametre que les te­moins alors que l'intensite d'enracine­ment secondaire peut etre plus forte, notamment pour les plantes transfor­mees directement sur Ia section d'entre­nreuds, pour lesquelles les racines for­ment le plus souvent un chevelu impor­tant. La taille des racines principales diminue progressivement et le diametre est le plus faible pour les plantes les plus aberrantes (G2).

La taille plus reduite, Ia surface des feuilles en general plus petite et le sys­teme racinaire plus chetif de ces plan­tes transformees montrent qu'elles man­quent de vigueur et qu'elles ont un fonc­tionnement perturbe. QueUe que soil leur origine, elles vieillissent toutes plus vite que les temoins.

• Caracteres lies aux fleurs et aux fruits

Toutes les plantes transformces ap­partenant au groupe G fleurissent et mcme souvent celles de (;th" Fanette est

connue pour sa faible fertilite pollini­que qui fait d'elle un mauvais parent male en croisement. Dans notre essai, Ia viabilite pollinique du tcmoin Fanette est Ia meme que celle des plantes trans­formees de cette meme variete les moins perturbces du groupe G

1a (F9, F7 et

Fl2) : environ 10 %. Nous avons cva­lue Ia viabilitc pollinique pour deux plantes transformees issues de BFlS : celle de B6 est de 38 % et celle de B3 de 52 %. Ces chiffres sont un peu plus fai­bles que ceux obtenus pour le tcmoin BFlS dont Ia viabilite pollinique s'eleve a 70 % mais ils ont ete obtenus pour des individus du groupe G1h et non Gia. Tres peu de plantes ont fructifie au cours de l'essai : les deux temoins BF15 et Fanette et seulement deux plantes transformees du groupe G

1a

issues de Fanette obtenues directe­ment sur section d'entre-nreuds (F7 et F9).

• Caracteres lies aux tubercules La tuberisation des plantes transfor­

mees est perturbee au niveau de Ia masse de tubercules par pied, toujours plus reduite que celle des temoins. Par contre, nous avons note que quelques plantes transformees ont un nombre de tubercules plus eleve que les temoins (B21, F7, B3, BS et B6). Les plantes du groupe G2 ont une tuberisation quasi nulle, notamment le clone B22 qui n'a donne qu'un tubercule de masse infe­rieure a 5 g pour une plante sur trois. Les tubercules des plantes transformees sont tous de plus petite taille que ceux des temoins : Ia masse moyenne d'un tu­bercule de plante transformee issue de Fanette ne represente au maximum qu'un tiers de celle du temoin (Pl. liB). Mais c'est l'aspect du tubercule chez ces plantes transformees qui est le plus per­turbe : ils sont tous allongcs avec des ycux proeminents. Quelques clones pre­sentent des yeux avec des feuilles en ccailles charnues (B21, B23, B3, BS et B6) qui donncnt a ces tubercules un as­pect de "pomme de pin".

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Planche 11.- Analyse morphologique des plantes en serre. A - Graduation du gaufrage de feuilles de plantas transformees. a- gaufrage (-): temoin Fanette (pas de gaufrage): b- gaufrage (-) (F9) (pas de gaufrage: c­gaufrage (+) (F12): d- gaufrage (++)(BIB): e- gaufrage (+++) (824). B- Comparaison de Ia taille des tubercules. a - FS : b - F12 : c - temoin Fanette : d - Morphologie perturbee des tubercules. C - Comparaison des plantas en fonction de leur mode d'obtention. a- temoin Fanette : b- F9 : plante directement formee sur section d'entre-nooud : c - F12 : plante regeneree a partir d'un clone racinaire transforme.

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A. 0081GNY ET COLL. 23

4 - Comparaison des plantes transfor­mees en fonction de leur mode d'ob­tention : sur entrc-nreud ou sur ra­cine

Les observations portant sur les ca­racteres mesures (Tableau II et III) et observes permettent de comparer les plantes du groupe G

1 en fonction de leur

mode d'obtention : neoformations direc­tes sur section d'entre-nceuds ou a par­tir de racines. Le groupe G

2 n'etant

constitue que de plantes aberrantes, nous ne les comparerons pas. Les me­sures quantitatives, telles que la sur­face foliaire, Ia masse de tubercules et le nombre de cycles inflorescentiels, sont plus grandes pour les groupes G1• et G 1h

des neoformations sur section d'entre­nceuds que pour ceux des neoformations sur racines. D'autre part, seul ce pre­mier type de plante a fructifie lors de notre etude (F7 et F9). Elles ne presen­tent pas de gaufrage, elles possedent l'in­tensite d'enracinement secondaire Ia plus importante. La couleur varie de vert clair a vert fonce et aucune d'entre elles n'est vert tres fonce. Ceci montre que le fonctionnement des plantes est, de fat;on generale, beaucoup moins per­turbe pour les neoformations directes sur entre-nceuds (Pl. IIC).

5 - Correlation entre la morphologic des plantes transformees et le clone racinaire dont elles sont issues

Nous avons choisi dans notre essai de comparer des plantes issues de six clones racinaircs differents et d'autres, neoformees a partir d'un meme clone. Deux clones racinaires transformes (R4 ct RS) ont donne naissance a de nom­breuscs regenerations. Pour chacun de

ces deux clones, cinq neoformations ont ete choisies et transferees en serre ex­perimentale pour les analyser morpho­logiquement (Tableau IV).

Nous constatons que Ia plus grande variation morphologique est observee entre les plantes issues de clones raci­naires independants : toutefois, il existe egalement des differences entre les plan­tes issues d'un meme clone. Ceci est par­ticulierement net pour les plantes neo­formees a partir de R4 : une plante (B20) est classee dans le groupe G1h,

3 plantes (BlO, B20 et B24) dans G1c et

une plante (B22) dans le groupe G2

,

c'est-a-dire parmi les plantes les plus perturbees. Ce dernier clone (B22) ne tuberise que tres rarement, ne produit aucune inflorescence et ne depasse pas IS em de hauteur totale, alors que le clone B20 produit en moyenne 13 tu­bercules pour une masse de 233 g par pied et environ 2 cycles inflorescentiels le long de la tige principale.

DISCUSSION ET CONCLUSION

La nature transformee des plantes que nous avons choisies d'etudier en serre insect-proof avait ete precedemment ve­rifiee par Ia presence d'opine (cucumo­pine ou mannopine) et/ou par Ia detec­tion de l'activite du gene GUS (Dobigny et al., 1992a et b). L'integration du T­DNA a ete confirmee ici par une ana­lyse moleculaire en Dot Blot. Les plan­tes transformees, quelle que soit leur origine, ont manifeste une grande di­versite phenotypique. Cette amplitude de variation a deja ete soulignee par les equipes ayant travaille sur Ia transfor-

Plate 11.- Morphological analysis of plants in greenhouse. A - Variation of foliage crinkling of transformed plants. a - crinkling (-): Fanette control (no crinkling); b - crinkling (-) (F9) (no crinkling) ; c - crinkling (+) (F12) ; d- crinkling (++) (818) ; e -crinkling (+++) (824). 8 -Comparison of the tuber size. a- FS ; b- F12 ; c­Fanet1e (control) ; d - disturbed morphology of tubers. C - Comparison of plants in correlation with their obtention method. a - Fanette (control) ; b - F9 : plant directly formed on internode sections ; c - F12 : plant regenerated from a transformed root line.

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Tableau IV.- Correspondance entre les clones racinaires transformes et les plantas regenerees qui en son! issues.

Table IV.- Correspondence between transformed root lines and regenerated plants issued from lhPose root lines.

Groupe N° plante Clone racinaire

F12 R14 Gta B21 R12

B23 B17 R5

Gtb B18 B19

Gt B20 BlO R4 B15

Gtc B24 B 13 R5 B14 R45 B 11 R24

02 B22 R4

FY : plante Y issue de Fanette. BX : plante X issue de BF15.

mation de la pomme de terre (Ooms et al., 1985; Hanisch ten Cate et al., 1988). De nombreux caracteres sont modifies tant sur le plan morphologi­que que physiologique. Nous avions deja observe in vitro des differences entre les clones et surtout entre les clones transformes et les clones temoins (Do­higny, 1992) : nous avons vu ici qu'il existe une correlation entre la morpho­logic des clones in vitro et celle de ces memes clones en serre. Malgre un fonc­tionnement parfois perturhe, tous les clones transformes ont tuherise meme si les tuhercules produits sont tres pe­tits et peu nombreux, commc dans le cas du clone B22. Ainsi, la fonction de tuberisation, primordiale pour la cul­ture de la pommc de terre, n'est jamais totalement dHieiente.

Nous avons distingue les resultats obtenus en fonction du mode d'obten­tion des plantes transformees. Les nco­formations sur sections d'entre-nceuds sont moins perturbees que les plantes issues de clones racinaires transformes. Certaines neoformations directes (F7 et F9) presentent d'ailleurs des caracteres tres proches du temoin Fanette. Ce type de neoformation est obtenu direetement sur sections d'entre-nceuds sans l'inter­mediaire d'une racine ni d'un cal ma­croscopiquement visible. Elle ne ncces­site aucun apport exogene de substan­ces de croissance. Ces conditions pour­raient etre un moyen de limiter Ia va­riation constatcc in vitro qui pcrturbe souvent le developpement des plantcs de pomme de terre.

Nous avons note une proportion plus

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importante de clones aberrants par rap­port aux temoins parmi les plantes re­generees a partir de racines transfor­mees. Cette constatation permet de de­terminer que la large gamme de varia­tion morphologique observee est due, chez les clones neoformes a partir de racines, pour une part aux genes du T­DNA integres et, pour une autre part, au processus de regeneration in vitro. En effet, il est desormais admis que la part la plus importante de la variation provoquee par la culture in vitro, et qualifiee de variation somaclonale (Lar­kin et Scowcroft, 1981), est attrihuable a la phase cal, comme l'atteste le fait qu'il peut emerger d'un meme cal des plantes tres dissemblables (Rossignol­Bancilhon et al., 1980 ; Benzine-Tizrou­tine, 1989 ; Benzine-Tizroutine et al., 1993). Les comptages chromosomiques que nous avons deja realises n'ont por­te que sur des plantes de BF15 neofor­mees a partir de clones racinaires trans­formes par des souches a agropine (15834). Le denomhrement chromoso­mique a montn~ que ces plantes, meme les plus aberrantes, sont a un niveau tetraplolde ou proche de la tetraplol­die: variation de 44 a 48 chromosomes. Nous avons vu qu'il peut exister des for­mes morphologiques tres differentes du temoin BF15 et tres perturbees qui pos­sedent le meme nombre chromosomique et, inversement, des plantes transfor­mees assez proches du temoin phenoty­piquement peuvent etre aneuploldes. Ainsi, aucune correlation n'a pu etre clairement etablie entre la perturbation morphologique et l'aneuploldie.

Hanisch ten Cate et al. (1988) obser­vent que les plantes transformees issues de Bintje different toutes du temoin et presentent une tres large gamme de va­riation phenotypique. Les caracteristi-

ques de ces plantes sont similaires lors­qu'elles sont issues d'un meme clone racinaire mais different si elles sont neoformees a partir de clones racinai­res independants. Par contre, les plan­tes transformees provenant de Desiree sont toutes semhlables entre elles, quel que soit le clone racinaire dont elles sont issues, et ont un phenotype et un deve­loppement distincts de ceux du temoin non transforme (Ooms et al., 1985). Ainsi, ces auteurs montrent !'influence de Ia variete de pomme de terre em­ployee sur les variations de plantes transformees. Nos observations ont por­te sur des plantes transformees de BF15 et de Fanette mais le nombre de clones testes issus de Ia variete Fanette n'est pas assez grand pour comparer le com­portement des plantes transformees is­sues des deux varietes. Toutefois, nous avons mis en evidence !'existence de deux niveaux de variation au sein des plantes transformees de BF15 : varia­tion entre les plantes neoformees a partir de clones racinaires indepen­dants et variation, moins etendue sem­ble-t-il, entre les plantes regenerees a partir d'un meme clone racinaire trans­forme.

L'analyse realisee en serre insect­proof fermee a permis d'etudier Ia mor­phologic des plantes transformees dans les conditions les plus proches des con­ditions naturelles. En effet, cette etude n'a pas pu etre menee au champ comp­te tenu des conditions de culture impo­sees par Ia Commission de Genie Bio­moleculaire concernant !'experimenta­tion sur les plantes issues de genie ge­netique.

Remerciements. · No us tenons a remercier M. Ros­signol pour Ia lecture du manuscrit, J.L. David pour les cultures en serre, M.J. Defoug et D. Froger pour !'illus­tration.

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BIBLIOGRAPHIE

Benzine-Tizroutine S., 1989.- Apports de Ia morpholo­gie, de Ia cytog€metique et de Ia caryologie a Ia comprehension de Ia variation somaclonale chez Ia pomme de terre dihaplo.lde BF15. These Doct. Sciences, UPS, Orsay, 247 p.

Benzine-Tizroutine S., L. Rossignol, M. Rossignol, A. Ambroise & C. Gaisne, 1993.- La variation soma­clonale chez Ia pomme de terre : phenomenes lies a Ia floraison. Acta bot. Ga/lica, 140 (1), 5-16.

Combard A., J. Brevet, D. Borowski , K. Cam & J. Tempe, 1987.- Physical map of the T-DNA region of Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB 2659. Plasmid, 18, 70-75.

David C & J. Tempe, 1987.- Segregation of T-DNA copies in the progeny of a regenerant plant from a mannopine-positive hairy root line. Plant Molecular Biology, 9, 585-592.

De Vries-Uijtewaal E., L.J.W. Gilissen, E. Flipse, K. Sree Ramulu & B. de Groot, 1988.- Characteriza­tion of root clones obtained after transformation of monohaploid and diploid potato genotypes with hai­ry root inducing strains of Agrobacterium. Plant Science, 58, 193-202.

Dobigny A., 1992.- Optimisation de Ia transformation de Ia pomme de terre (variate Fanette et BF15) par Agrobacterium rhizogenes (souches a mannopine et cucumopine). These Doct. Sciences, UPS Or­say, 213 p.

Dobigny A., V. Truong, R. Haicour, C. David, L. Rossi­gnol & P. Rousselle, 1992a.- Amelioration d'une methode de transformation de Ia pomme de terre par A. rhizogenes : application a !'introduction d'une resistance a Ia !eigne de Ia pomme de terre chez Ia variate Fanette. Joint EAPA-Breeding & EUCAR­PIA - Potato sections conference - Landerneau ( 12-17 janvier), 87-91.

Dobigny A., V. Truong, R. Haicour, C. David, C. Gaisne & L. Rossignol, 1992b.- Nouvelle possibilite de trans­formation avec Agrobacterium rhizogenes chez Ia pomme de terre. Forum jeunes chercheurs "du gene a l'entreprise", Amiens (22-23 juin).

Hanisch Ten Gate C. H., K. Sree Ramulu, P. Dijkhuis & B. de Groot, 1987.- Genetic stability of cu~ured hai­ry root induced by Agrobacterium rhizogenes on tuber discs of potato cv. Bintje. Plant Science, 49, 217-222.

Hanisch Ten Gate C.H., E. Emmik, S. Roest, K. Sree Ramulu, P. Dijkhuis & B. de Groot, 1988.- Regene­ration and characterization of plants from potato root lines transformed by Agrobacterium rhizoge­nes. Theor. Appl. Genet., 75, 452-459.

Hansen G., 1991.- Etude du T-DNA du plasmide pRi 8196 a mannopine d'Agrobacterium rhizogenes: sequences impliquees dans le transfer! et fonctions induisant Ia rhizogenese. These Ooct. Sciences, UPS, Orsay, 95 p.

Larkin P.J. & W.R. Scowcroft, 1981.- Somaclonal va­riation. A novel source of variability from cell cultu­res for plant improvement. Theor. Appl. Genet., 60, 197-214.

Maniatis T., E. F. Frisch & J. Sambrook, 1982.- Molecu­lar cloning. A laboratory manual. Cold Spring Har­bour Laboratory. Cold Spring Harbour, New York.

Ooms G., A. Karp, M.M. Burrell, D. Twell & J. Roberts, 1985.- Genetic modification of potato development using Ri T-DNA. Theor. Appl. Genet., 70, 440-446.

Phelep M., A. Lepetit, L. Martin, E. Duhoux & J. Tem­pe, 1991.- Transformation and regeneration of a nitrogen-fixing tree, A/locasuarina verticil/ala Lam. Biotechnology, 9, 461-466.

Rossignoi-Bancilhon L., R. Nozeran, A. Quraishi & A. Darpas, 1980.- Debut d'exploration d'un des moyens d'extension de Ia variabilite chez Ia pomme de terre : neoformations sur cals. In : Application de Ia Cul­ture in vitro a !'amelioration des Plantas potage res. Reunion EUCARPIA, section Legumes. CNRA, Ver­sailles, 192-200.

Spano L., M. Pomponi, P. Costantino, G.M.S. Van Slog­teren & J. Tempe, 1982.- Identification of T-DNA in the root inducing plasmid of the agropine type Agro­bacterium rhizogenes 1855. Plant Mol. Bioi., 1, 291-300.

Visser R.G.F., A. Hesseling-Meinders, E. Jacobsen, H. Nijdam, B. Wilhoit & W.J. Feenstra, 1989.- Expres­sion and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacterium rhizogenes transfor­med potato (Solanum tuberosum L.). Theor. Appl. Genet., 78, 705-714.

Willmitzer L., J. Sanchez-Serrano, E. Buschfeld & J. Schell, 1982.- DNA from Agrobacterium rhizogenes is transferred to an expressed in axenic hairy root plant tissues. Mol. Gen. Genet., 186, 16-22.

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