Analyse g&Gtique de la maladie d6myGlinisante induite par le virus de Theiler

Jean-Franqois Bureau, Arible Azoulay, Franck Bihl, Laurence Fiette

Le virus de Theiler induit une maladie dkmyklisante chez des souris susceptibles. Cette affection constitue un modsle de choix pour une 6tude gknktique de l’interaction virus-hate, ainsi que pour celle des processus physiopathologiques responsables de la dkmyklisation. Les techniques rkentes et les paradigmes de la g&Gtique de la souris seront ainsi prCsent6s.

Unit6 des virus lents, URA CNRS 1157, lnstitut Pasteur, bstiment A- Lwoff, 28, ruedu Docteur- Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.

L a recherche des gPnes de pr@- disposition aux maladies mul- tifactorielles humaines et ani-

males devient un des enjeux de la biologie de cette fin du XX’ siPcle. Deux approches s’avkent possi- bles : le criblage de l’ensemble du gkome & l’aide de sondes ano- nymes trPs polymorphes comme les microsatellites, et l’emploi de gPnes candidats. Chez l/animal, c’est-& dire actuellement le rat et la souris, la premiPre mkthode a montrk toute sa puissance. Chez l’homme, des r& sultats pkliminaires ont &5 obte- nus dans le cas du diabkte insulino- dkpendant [7, 121. Cependant, son efficacitk dans d’autres maladies humaines reste 2 dkmontrer. C’est le cas, par exemple, pour des mala- dies auto-immunes plus rares et aussi pour des maladies oti le r61e de I’environnement est majeur comme les maladies infectieuses. La deuxiPme approche par l’ktude des g&es candidats a eu un certain suc- c+s 1201, bien que seuls les genes connus puissent @tre &udi&. La re- cherche de nouveaux genes candi- dats est done nkcessaire. Les mo- deles animaux sont intkressants 5 cet Ggard. Depuis 3 a 4 ans, la possibilitk de cribler la totalitk du gknome de la souris et du rat dans des situations experimentales a permis & de nom- breuses kquipes d’aborder l’ktude de maladies multigkniques aussi varikes que le diab&e insulino-de- pendant [8,31] l’hypertension art& rielle 1131, l’kpilepsie [261, le lupus [241. Dans un petit nombre de cas, ces criblages ont non seulement lo- calisk des g&es de prkdisposition, mais de plus des g&es candidats sont actuellement test& [32]. Par

exemple, jusqu’g dix gPnes de prk- disposition ont k? localis& dans le cas du diabkte insulino-dependant de la souris NOD. Deux apports majeurs sont atten- dus des maladies animales mo- dPles : la mise en evidence des gPnes de predisposition associee aux te- chniques de transgenke et de re- combinaison homologue permet une dissection des mkcanismes physiopathologiques qui devrait considkrablement aider B la com- prkhension de la maladie humaine. Par ailleurs, l’existence d’un g&e de p&disposition 2 une maladie hu- maine peut etre recherchke en utili- sant les don&es obtenues chez l’a- nimal, m@me si le gene n’a pas en- core &Z identifik. En effet, la bonne conservation de l’organisation du genome entre l’homme et la souris permet de tester rapidement si des regions homologues humaines, ap- pelkes rkgions homosyntkniques, contiennent ou non ce gene. Cepen- dant, dans le cas du diabkte insuli- no-dkpendant, seuls 30% des gPnes localisk chez la souris NOD ont vu leur localisation vQifike chez l’homme [7]. Une des explications est la non-conservation inter-espPce des polymorphismes impliquks. Un bon exemple est celui des pompes TAP qui transportent les peptides a l’intkrieur du rkticulum endoplas- mique avant qu’ils ne soient fixes aux moltkules du CMH de classe I. Suivant les lignkes consanguines de rats, ces pompes peuvent transpor- ter un peptide dont le dernier acide amink est soit acide ou hydrophobe, soit uniquement hydrophobe. Cela est lie & un polymorphisme dans la rkgion terminale de la chaine TAP2.

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Chez la souris, le seul allele existant permet le transport d’oligopeptides dont le dernier acide amine est hydrophobe et chez I’homme au contraire le seul allele existant est celui permettant le transport d’oli- gopeptides dont le dernier acide a- mine est acide ou hydrophobe. Ce polymorphisme, s’il jouait un role dans la sensibilite des rats, ne pour- rait pas le faire dans une maladie humaine. Cependant, la connaissance du gene definit habituellement une voie metabolique importante dans cette affection. Tous les genes de cette voie metabolique deviennent alors candidats par leur fonction dans la maladie humaine corre- spondante. Par exemple, la mise en evidence du role des pompes TAP chez le rat, dans une maladie mo- dele fera supposer une fonction du systeme immunitaire classe I res- treint. 11 sera alors possible d’etu- dier si d’autres genes agissant dans la m@me voie metabolique, comme par exemple les molecules du CMH de classe I elles-memes, ne sont pas responsables d’une sensibilite diffe- rentielle a la maladie humaine. La sclerose en plaques (SEP) est la maladie neurologique la plus fre- quente de I’adulte jeune. Elle en- traine dans un grand nombre des cas une longue invalidite fonction- nelle aboutissant apres une longue evolution a un &at grabataire et a la mort. En France, environ 50 000 per- sonnes sont atteintes par cette mala- die dont l’etiologie est inconnue. Une predisposition genetique est cependant admise par la majorite des specialistes ainsi qu’un role de l’environnement a travers un ou des agent(s) infectieux. Deux modeles murins de la SEP ont ete principale- ment developpes : l’encephalite al- lergique experimentale (EAE), un modele immunologique, et l’infec- tion par le virus de Theiler, un mo- dele viral. De facon interessante, les trois souches de souris les plus sen- sibles a ces deux maladies sont les memes (la souris SJL/J, la souris SWR et la souris PL/ J) . Cela ne sem- ble pas @tre dti uniquement au ha- sard, et certains mecanismes phy- siopathologiques pourraient etre

communs & ces deux maladies. La decouverte des genes de predispo- sition a ces affections murines per- mettrait de mieux comprendre les processus de demyelinisation et de tester si certains genes intervenant dans les memes voies biochimiques ne sont pas aussi des genes de pre- disposition a la SEP.

GMtique de la maladie dCImyCIlinisante induite par le virus de Theiler

n Effets respectifs de la souche virale, la dose infectieuse et la sensibilitk de l’h6te

Le virus de Theiler est un picornavi- rus capable d’induire chez la souris deux types de pathologies neurolo- giques : une encephalomyelite ai- gue et une maladie inflammatoire chronique et demyelinisante de la substance blanche de la moelle epi- niere. Dans la nature, l’infection se fait par la voie orale et le virus se multiplie dans le tube digestif. Dans un petit nombre de cas (environ l/6000), l’infection se propage au SNC et entra^me une maladie neuro- logique. L’apparition de ces compli- cations neurologiques tient princi- palement a trois facteurs, la souche kale, la dose infectieuse et la sensi- bilite de la souris. 11 existe en effet des souches t&s virulentes, dont le prototype est le virus GDVII, qui tuent au tours de la maladie aigue toutes les souris infectees par voie intracerebrale, meme a une dose aussi faible qu’une ufp. Cependant, les souches virales habituellement isolees dans la nature, comme les souches DA ou BeAn, sont moins virulentes et in- duisent, apres leur inoculation in- tracerebrale, une encephalomyelite aigue qui n’est habituellement pas mortelle. Trois a quatre semaines plus tard, apparait, uniquement chez les souris sensibles, une mala- die inflammatoire et demyelini- Sante de la substance blanche de la moelle epiniere. Cette maladie, qui est toujours associee a la persitance du virus, va durer toute la vie de l’animal [ 171. Les cellules infectees sont principalement l’oligodendro-

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cyte, la cellule qui synthetise la mye- line dans le systeme nerveux central et le macrophage. Lastrocyte, une autre cellule gliale, est prob- ablement moins atteint 11, 61. Lap- parition et la gravite des signes cli- niques dependent de la dose infec- tieuse : lo4 ufp de la souche DA injectee par voie intracranienne n’induisent qu’exceptionnellement des signes cliniques dans la lignee de souris la plus sensible, la souris SJL/ J ; les symptomes ne sont appa- rents qu’apres une inoculation de 2 x 10’ ufp et ne sont constants qu’avec 2 x lo6 ufp. En pathologie humaine, l’ignorance de ces deux facteurs, la virulence de I’agent infectieux et la dose infectieuse, rendent excessive- ment difficile l’analyse de la sensibi- lite genetique aux maladies infec- tieuses. A l’inverse, en situation experimen- tale chez l’animal, la maitrise de ces deux parametres permet d’aborder le probleme de la sensibilite de l’hote a I/infection.

W Recherche des genes de prCdisposition g la maladie dCmyClini.sante

C’est en 1984 que H Lipton et R Melvold [18] ont aborde l’etude de la sensibilite de la souris a la maladie demyelinisante induite par le virus de Theiler. 11s ont apporte des arguments t&s en faveur de la presence d’un gene de predisposi- tion a la maladie demyelinisante a I’interieur de la region H-2, qui contient les genes codant pour les molecules d’histocompatiblite de classe I et de classe II. Leurs etudes ulterieures associees a celles du groupe de Rodriguez permirent de confirmer et de preciser cette locali- sation. Le gene de predisposition devait @tre localise dans une toute petite partie de la region H-2D qui contient presque uniquement des genes codant pour des molecules d’histocompatibilite de classe I 15, 27,281. Les haplotypes resistants b, d et k sont dominants sur les haplo- types sensibles s, f, p, r, u ou q. [271. Cette demonstration fut faite grace a l’utilisation de souris congeniques pour la region H-2. Ces souris sont

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genetiquement identiques except& pour une region tres bien definie, en l’occurence tout ou partie de la re- gion H-2. Une variabilite de la sen- sibilite a la maladie demyelinisante chez ces souris peut etre expliquee simplement par l’haplotype de la region H-2D. La situation est en fait plus com- plexe car des etudes genetiques ul- terieures ont montre qu’il devait exister des genes de predisposition a la maladie demy&nisante en de- hors de cette region H-2. La locali- sation de ces genes de predisposi- tion s’est revelee difficile. Deux ap- proches ont ete utilisees. La premiere utilise des lignees de souris recombinantes consan- guines. Ces lignees sont obtenues par des croisements frere-scour suc- cessifs a partir de deux parents ap- partenant a des lignees consan- guines differentes. Quand ces li- g&es recombinantes redeviennent consanguines, chacune Porte en moyenne 50% du genome d’un pa- rent et 50% du genome de l’autre parent, distribues au hasard le long des chromosomes. Elles sont done toutes genetiquement differentes. Si les deux parents ont des sensibilites differentes a la demyelinisation in- duite par le virus de Theiler, l’etude de la sensibilite des lignees recom- binantes consanguines permettra de preciser le nombre et la localisa- tion des genes de predisposition. Pour cela, la sensibilite de chacune de ces lignees est tout d’abord defi- nie. Puis une correlation entre ce phenotype et les genotypes definis sur differents marqueurs poly- morphes prealablement cartogra- phi& permet de localiser les genes de predisposition. Si un marqueur est proche dun gene de predisposi- tion, une correlation doit apparaitre entre la sensibilite a la maladie et le genotype de ce marqueur dans la serie de souris recombinantes consanguines (encadre 1). Cette cor- relation n’existera pas si le mar- queur est tres eloigne d’un gene de predisposition. De cette facon, Melvold et al ont lo- calise des regions potentiellement associees a la sensibilite dans la re- gion du chromosome 6 a proximite

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de la chaine l?! du rkcepteur T [21J et dans la region du chromosome 3 a proximite du marqueur anhydrase carbonique 2 [22]. Cependant, l’in- terpretation de ces resultats est dis- cutable : le nombre de lignees deve- loppees doit etre eleve pour que cette correlation soit statistique- ment significative. Ces criteres n’e- taient pas atteints dans l’etude concernant le chromosome 6. Peu de series de lignees recombinantes consanguines cornportent un nom- bre eleve de lignees. L’obtention de nouvelles lignees est tres longue (plus de 3 ans en pratique) limitant beaucoup l’utilisation de cette te- chnique. Une autre approche consiste a cri- bler un croisement en retour ou un croisement F2 judicieusement choi- si, avec des marqueurs couvrant soit tout le genome, soit des regions candidates et de rechercher une cor- relation entre le phenotype et le ge- notype des differents individus du croisement (encadre 1) . En utilisant l’approche des genes candidats, Rodriguez et al [301 ne detect&rent pas de gene de predis- position a proximite de la chaine beta du recepteur T chez la souris SJL/J en contradiction avec le tra- vail de Melvold et al [21]. Cepen- dant, ils montrerent que pour un autre couple de souris, un gene de predisposition a la maladie demye- linisante pouvait exister dans cette region. La lignee de souris parentale

sensible utilisee, la souris RIII, a une deletion de plus de 50% des regions variables de la chaine beta du recep- teur T. Cette deletion, en reduisant le repertoire T, pourrait etre respon- sable de la sensibilite a la maladie demyelinisante.

n Localisation des g&es de p&disposition P l’infection persistante

La demyelinisation induite par le virus de Theiler est probablement un phenomene complexe. De nom- breux parametres susceptibles d’e- tre control& genetiquement doi- vent entrer en jeu, par exemple la persistance du virus, l’inflamma- tion, la sensibilite des oligodendro- cytes a une agression et leur capaci- te a remyeliniser. L’etude du deter- minisme genetique d’un tel processus est difficile car le nombre de genes impliques pourrait etre tres eleve, rendant necessaire une analyse quantitative. Cette quantifi- cation de la demyelinisation est te- chniquement extremement diffi- tile. Dans ces conditions, nous avons de- cide d’aborder dans un premier temps, l’etude du controle de la per- sistance virale. Cette &ape est en effet absolument necessaire au de- veloppement de la demyelinisation. Un test semi-quantitatif de la persi- stance virale a ete developpe qui mesure la quantite de genomes vi-

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raux presents au niveau de la moelle epiniere, siege des lesions demyelinisantes (fig 1). La quantite de genomes viraux est tres variable entre les differentes li- gnees de souris consanguines comme entre leurs croisements Fl avec la lignee de souris la plus sen- sible, la lignee SJL/J (fig 2). Une bonne correlation, mais qui n’est pas absolue, est mise en evidence entre cette quantite de genomes vi- raux et la sensibilite a la demyelini-

sation. Le controle de la persistance virale joue done un role important dans le controle de la demyelinisa- tion mais d’autres processus eux aussi genetiquement control& doi- vent exister. Au tours de cette etude, la variabi- lite dans la quantite de genomes vi- raux a pu @tre expliquee par l’inte- raction de deux groupes de genes 141. En effet, chez 16 des 17 lignees de souris etudiees, la quantite de genomes viraux peut etre predite uniquement par la connaissance de l’haplotype de la region H-2D. L’ha- plotype resistant b est dominant sur les haplotypes intermediaires s, d et k et sensible 9 (fig 2). Ce gene est done tres probablement le mZme que celui decrit par les groupes de Rodriguez et de Lipton dans le contrble de la demyelinisation. Mais une lignee de souris, la lignee SJL/ J, est plus sensible a l’infection persistante que ne le prkdit son ha- plotype H-2 . D’autres genes situ& en dehors de la region H-2 doivent done contrbler la persistance virale chez cette souris. Pour les localiser, l’ensemble du ge- nome murin a ete crib14 dans un croisement en retour de 79 souris Fl (SJL/J x BIO.S) x BIO.S avec 89 mar- queurs polymorphes 131. La souris BIO.S ayant le m@me haplotype W-2” que la souris SJLIJ, I’effet du gene de predisposition locali& dans la

region H-2 est ainsi &nine. Pour chacun des marqueurs, les souris sont divisees en deux groupes selon leur genotype heterozygote ou ho- mozygote (identique a celui de la souris BIO.S). La quantite de ge- nomes viraux presents dans la moelle epiniitre est ensuite compa- ree entre ces deux groupes (encadre 1). Si le marqueur etudie est proche d’un gene de predisposition, une difference significative dans la quantite de genomes viraux doit ap- paraitre entre ces deux groupes. Ainsi, un gene de predisposition a la persistance virale a ete localisk a l’extremite du chromosome 10 a proximite du locus de l’interferon gamma (fig 3). Cependant, ce gPne a lui seul ne peut expliquer la difference de sen- sibilite entre les parents Fl (SJL/J x BIO.S) et B1O.S. Un gene de predis- position supplementaire doit exis- ter. 11 pourrait etre localise a l’extre- mitk du chromosome 18 B proximite du locus de la proteine basique de la myGline. Mais la probabilite de liai- son (P = 0,002) entre la persistance virale et les marqueurs de cette re- gion n’est pas suffisante pour que nous soyons certains de cette locali- sation. Trois genes de predisposi- tion a la persistance du virus de Theiler dans le systeme nerveux central ont done ete mis en evi- dence : le premier est situe dans la

Fig 1. A. Protocole d’.&de de la persistance du virus de Theiler dans la moelle PpinOre des souris. 8. Exem- p/e de Dot Blot ufilis6 pour mesurer la quantit4 de gknomes virauxpr6sent.s dans /es /&ions. Deuxsouris infect6es sent &dikes pour chaque lign6e. Pour cha- que souris, la dilution la p/us Blevie dormant un signal d’hybridafion est utilis& comme mesure de /a quanfitk de g&ome viral. Le score de chaque souris est indiqu6 en bas de la figure.

CSH.BlO C3H C3H.Q C57BUlOBlO.D2 BlO.BR 610-Q B1O.S SJL/J

b k 4 b d k 9 s s

Fig 2. VariabiM de la persistance virale parmi diffkentes @@es de sour& cong&iques pour la @ion H-2. La quantitd de gbnome viral pr&ent dans la moelle kpini&e esf mesur& chez neuf lig&es de souris de fond C3H ou C57BUIO (barre continue) ef chez leur hybride Ff avec /es souris SJUJ (barre hachurke). L’haplotype de /a @gigion H-2 est indique sous le nom de cbaque lignge. La moyenne et /Ucart type de /a moyenne des scores sontpr&ent& pour chaque lignee apr& transformation du score en titre de virus.

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1995) 6,2 151

rkgion H-2D du chromosome 17 ; le deuxieme est localis B l’extrkmitk du chromosome 10 B proximitk du locus de l’interfkon gamma et le dernier pourrait @tre local%! B l’ex- trkmitk du chromosome 18 & proxi- mit6 du locus de la protkine basique de la mykline. L’objectif suivant est de caractkiser ces trois g&es (enca- drtS 2).

souris sensible doit la rendre r&i- stante 2 l’infection persistante par le virus de Theiler.

sa configuration gknomique ont &? obtenues [21.

La souris F’VB se pr&e Ws bien & cette expkrience : son haplotype H-29 la rend tr6s sensible g l’infec- tion par le virus de Theiler et elle est une des souris consanguines chez qui la transgenke fonctionne le mieux. Deux lignees de sourit FVB transgkniques pour le g&e D dans

Dans les deux lignkes, l’expression du transggne ?I la surface de lym- phocytes B a et6 confirmke par im- munofluorescence. Une souris FVB transgbnique pour le gke Db A l’Gtat hkkozygote a kti! croiske avec une souris FVB non-transg&i- que (encadre 2). La descendance a &k infect&e par la souche DA du

n Le gike H-2D

L’utilisation de mutants de la r&ion H-2D avait permis de localiser trks prkiskment un gene de sensibilite 2 la dkmyklinisation. Ce gPne est trPs probablement le meme que celui qui contrGle la persistance virale [4, 291. Dans la lignke de souris BlO.D2 qui a recu la region H-2 de la souris DBA2, la rkgion H-2D contient cinq ggnes de classe I : D, D2, D3, D4 et L. Chez la souris B10.D2dm’, une recombinaison entre les gitnes D et L a entra*mi! d’une part l’apparition d’un gPne fonctionnel chimPre (en- tre les gPnes D et L) et d’autre part la dklktion des genes 02, 03 et 04. La souris BlO.D2 etant rksistante & la dkmyClinisfti?n et la souris mu- tante BlO.D2 etant sensible, le gPne de prkdisposition doit @tre lo- calis entre le gi?ne D et le g&e L. Dans cette petite rkgion, se trouvent presque uniquement des g&es d’histocompatibilitb de classe I. Par ailleurs, des souris resistantes chez qui le gene codant pour la b@ta2-microglobuline a &e inactivk par recombinaison homologue (et qui n’expriment done plus de mol& cule d’histocompatibiliM de classe I) deviennent sensibles 2 l’infection persistante par le virus de Theiler [lo, 25,281. L’ensemble de ces faits suggke tr& fortement qu’un gilne codant pour une mokule d’histocompatibilitk de classe I localisk dans la region H-2D contrBle la persistance virale. La souris rksistante C57BL6 pos- s&de un seul g&ne d’histocompatibi- lit4 de claase J dans la r6gion H-2D, le g&e D Si le gPne D contrale la persistfnce virale, l’introduction du g&e D dont l’haplotype rkistant b est dominant sur les haplotypes sensibles, dans le gknome d’une

&cadrt? 2 - WIti des techniques de la g&&ique classique, et de la recombinaison homolugue des maladies multig&iques.

Lasourisde pr&Espo&ition sur L g&wme. ont 6t4 m&es au point chez la souris.

la caractkisation des gknes de n effet, outre nos connaissances e et la recombinaison homologue

Apstrs qu’un g&w de pMispo$ion a &5 IocalisC par les techniques prksentkes dans l’encadr~ 1, la confiiation d&nitive de cette localisation est obtenue par l’utilisation de souris congt%iques. Chez ees sourk, une rbgion dCfiie du gCnome murin est transfkr& d’une lign& consangtie i# une autre par une s&e de croisements en retour. Une diff&enc~ de sensiblli&& B la maladie entre la souris congbnique et le parent receveur d6montre la pr&ence d’un g&ne de p&disposition dans la r&ion transfkk. G&ice B une cartograpbie gtn&ique de haute r&olution et g&e B la s3ection d’une s&k de lignks cong&iques, une localisation t&s prkcise du g&ne de p&l&position peut &e ainsi abrenue. Cetke technique ne pennet cependant pas d’identifier le g&e respsable de tel phbnotype. ParalMement, la recombinaison homologue permet de tester si un gkne candidat par la position l’est aussi par la fonction. Des cellules souches qui ont la capacitk de s’intr5grer barmoniensement dans le dkveloppement d’un embryon apr&s y avoir 6t6 inje&es, sent cultivables in vitro et peuvent &re ginkiquement modifites. Dans la recombinaison homologue, une construction contenant une skquence facilement dkelable (comme une enzyme pro&&ant une substance color& permettant de recon- na%re la cellule modifi& ou rendant la cellule r&&ante 2 nne mkkunent) est ins6r6e spkifiquement dam le gt?ne B inactiver. La spkificit6 de I’insertion est obtenue en encadrant la construction par une rkgion du gbne ?I inactiver. Apes injection de la construction dans le noyau des cellules souches, dans un petit nombre de cas, les deux regions homologues s’apparient et la construction est ins&&e au bon endroit. Apr&s &e&ion de la cellule ainsi modifk, celle-ci est inject& dam un embryon et si sa descenclance participe au d6veloppement de la lignke germinale, la mutation peut &re tmnsmise B la descendance. L&s mutants de la souris obtenus spontankment ou par l’utikisation de substances mutagknes sont une seconde source d’animaux pour tester le r&e de tel ou kl g&e. La tramg+&se est actuellement la technique de choix pour prouver d&initivement qu’un g&e p&dispose B une maladie, La possibilitk d’ins6rer dam le gknome de la souris un g&e &ranger permet en effet de vkifier si celni-ci est capable de modifier 2 lui seul le phkwtype observ&

cette d&nonstration soit satisfaisante, I’utilisation de lignke re- comme la lignee FVB, s’avkre nkessaire. En effet, si la trans-

gen&se est rt%lis& s& un animal non consanguin, la difI%rence observ6e pourrait &tre due 2 la &grkgation d’autres haplotypes que celui associ4 au transg&ne. L’&ude de la sensibiliti d’une fratrie compos6e de souris transgkniques et non trans- gbniques permet de limiter ce grobl&me car cette h&t&-og6n6iG pourra Ctre d&&e en faisant Ia moyenae des r&ukata. L’6ude d’au mobnk dwx &@&es de sowis transgkiiques obtenues de fqon ind&endante est n&essaire pour &miner b problame de la zone d’insertion du transgke qui pour& modifier sa fonctionnaliti.

152 ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1995) 6,2

virus de Theiler. La persistance vi- rale et l’inflammation dans la moelle epiniere ont ete evaluees 45 jours apres infection. Les souris peuvent etre divisees en deux groupes : un groupe peu ou pas infect6 chez qui l’inflammation etait minimale et un groupe de sou- ris tres infectees, avec une inflam- mation massive. AprPs avoir deter- mine le genotype (ie la presence ou l’absence du transgene) des 29 sou- ris etudiees, une correlation absolue entre le genotype et le phenotype (ie l’elimination du virus ou sa persi- stance) a ete observee (fig 4). La presence de gene Db chez les sou- ris sensibles FVB rend ces souris re- sistantes a l’infection par le virus de Theiler : le gene D controle done bien la persistance virale.

n Le ghe de I’interfkron gamma

L’etude de la persistance virale dans le croisement en retour Fl (SJL/J x Bl0.S) x BIO.S a permis de localiser un gene de predisposition a l’extre- mite telomerique du chromosome 10. Dans cette rggion se trouve le gene codant pour l’interferon gam- ma. Cette molecule, bien connue pour ses activites antivirales et pour son controle du systeme immuni- taire, pourrait moduler l’infection par le virus de Theiler. Les expe- riences d&rites ci-dessous demon- trent que le systeme de I’interferon gamma intervient dans la persi- stance de l’infection. Des souris 129, normalement resi- stantes a l’infection par le virus de Theiler dont le gene codant pour le recepteur a l’interferon gamma a ete inactive par recombinaison homo- logue, les souris IFNyR”‘, ont ete infect&es par la souche DA du virus de Theiler [ 11 I. Une maladie chroni- que t&s severe est apparue chez ces animaux. A partir de la troisieme semaine post-infection, les souris IFN~R”‘o ont presente des paraly- sies qui s’aggravaient progressive- ment, conduisant a la mort de sept souris sur huit avant la fin de la septieme semaine &infection. Ces symptbmes etaient dus a des lesions inflammatoires et dkmyeli-

nisantes tres importantes (fig 5). La quantite de genomes viraux pre- sents dans la moelle epiniere etait t&s klevee et l’infection s’etendait a des regions du SNC normale- ment non atteintes (cervelet, cer- veau) (fig 6). Ces resultats confirment que le gene de I’interferon gamma est par sa po- sition a l’extremite du chromosome 10 et par sa fonction, un gene impor-

tant pour lc controle de la persi- stance virale. En revanche, les souris 129 dont le gene codant pour le recepteur aux interferons alpha-beta a et& inactive par recombinaison homologue rka- gissent differemment a l’infection par le virus de Theiler. Ces souris meurent tres precocement de la ma- ladie precoce. Dix jours apres l’ino- culation intracranienne du virus

Fig 3 Localisation sur /a carte g6n&ique des diff&ents marqueurs po/ymorphes entre /es souris SJUJ et BIOS. Les rggions hachurkes correspondent aux 85% du ghome de la souris dans lesquels la prksence ou /‘absence d’un g&e de prkfisposition a pu &re &Se (pour des explications plus prtkises voir Bureau et al 131.

ANNALES DE L’INSTITUT PASTEUR / actualit& (1995) 6,2 153

Fl FVB Db FVB

Les sour~s de 3 2 4 semaines sent Infectkes

par vole intracra nlr?nne

les souris sont sacriflees 45 jours post InfectIon

::-,

PHENOTYPE GENOTYPE

lmmunoperoxydase antI-TMEV Extractlon D’ADN

PCR avec le microsatelllte Db

1

Corrdation entre le phenotype et le gknotype

Lien& I

FO

2" portee

1111111111’11111111111 ciKlEdOOOOOQOclOn~clnOOOOO F1

llllllll~lllil’lllllll 0~0~~~00~86880~00~0~~ F2

+++ 0 ++ 0 0 + +++ 0 0 0 0 0 + ++ +++ ttt 0 ++ 0 0 Persistance kale

+++ 0 l ++o 0 +++++ 0 0 0 0 0 + +++++++++o +++ 0 0 Inflammation

++ ++ 0 0 0 l ++ +++ ++ ++ Perslstnnce virale

++++ 0 0 0 +++ +++ ++ ++ Inflnmmation

Fig 4 : Pfotocole utilisk pour mettre en Evidence le Me du g&e D dans le contr$e de la persistance. AMe transghique ; femelle non transghigue ; mA/e dk%db.

DA, six souris sur huit sont mortes apres avoir present6 des signes d’encephalite. EARN viral est de- tecte en grande quantite dans le cer- veau a des niveaux bien superieurs a celui observe chez les souris 129 controles ou les souris IFNyR”‘. Cette infection aigue massive s’ac- compagne de lesions inflamma- toires du cerveau, avec en particu- lier une infection et une n&rose des plexus choro’ides. Ces structures sont specialisees dans la secretion du liquide cephalo-rachidien. 11s sont frequemment la voie d/entree des agents infectieux dans le sys- teme nerveux central. Ces observations montrent done que les deux types d’interferons jouent un role distinct, non redon- dant, au tours de l’infection par le virus de Theiler. Les IFNo/ p jouent un role important dans la phase ai- gue, alors que lWNycontr6le la per- sistance virale.

Perspectives et conclusion L’utilisation des nouveaux out& de genetique associes aux techniques de transgenese et de recombinaison homologue et a l’utilisation de mu- tants de la souris font de cet animal un sujet de choix pour l’etude des maladies multifactorielles a compo- Sante genetique (annexe). Nous pensons pouvoir dans un laps de temps raisonnable caracteriser defi- nitivement les trois genes et les po-

Fig 5. Zone de dkmy6linisation (indiqu6e par une f/&he) sur une coupe transversale de moelle 6piniGre de souris 129 dont le g&e du rbcepteur de I’interfkron gamma a 416 inactivb par recombinaison homologue. La souris a 6t6 sacrifibe 28j apr& infection par voie infracr.Menne.

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mouse central nervous system contain infectious Theiler’s murine encepha- lomyelitis virus (TMEV). Virology. 176, 244-254 Davies JL, Kawaguchi Y, Bennett ST et al (1994) A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes. Nature 371, 130-136 lie Gouyon B, Melanitou E, Richard MF et al (1993) Genetic analvsis of diabetes and insulitis in an inzerspe- cific cross of the nonobese diabetic mouse with Mu spuetus. Proc Natl Acad Sci USA 90, 1877-1881

FI$ 6. lmmunocytochimie avec un anticorps polyclonal dirigk confre /es profknes de capsides du virus de Theiler sur une coupe longitudinale de moelle 6pini&e contre -color&e par la mbthode luxol Fast Blue. Les cellules co/o&es en brun (indiqukes par une f/&he) sont infect&s par le virus.

lymorphismes responsables des dif- ferences de phgnotype observkes.

Ziirich) pour leur collaboration dans l’ktude des souris Knock-out

Nous pourrons alors aborder leur mode d’action et leurs interactions.

et 5 M Gau pour son aide pr&ieuse

L’infection par le virus de Theiler dans la dactylographie de ce ma- nuscrit.

sera alors l’une des Tares maladies infectieuses oti la pr6disposition de l’hbte aura DU @tre analvsee aussi RkfCrences finement. r\jous tenterdns d’kva- 1

luer dans des maladies humaines, et en particulier dans la sclerose en plaques, le r6le des gPnes que nous aurons mis en 6vidence chez la souris. 2

Aubert C, Chamorro M, Brahic M (1987) Identification of Theiler’s virus infected cells in the central nervous

Remerciements

Nous tenons tout particulii?rement 3

6 remercier le Pr M Brahic pour son aide dans la rkdaction de ce manus- crit et pour l’ensemble de sa contri- bution 5 la conception et B la &ali- 4 sation de ce projet. Nos remercie- ments s’adressent aussi aux Pr JL Gu6net et au Dr X Montagutelli (unit6 de g&+tique des mammi- f&es, Institut Pasteur) pour leur 5

contribution a cette &ude, aux Dr C Babinet et P Marchand (unit6 de g&?tique des mammifhres, Institut Pasteur) pour la construction des souris transg&iques, au Dr M A- guet et ses collaborateurs, les Dr U Miiller et S Huang (Institiit fiir

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Molekularbiologie, Universit6 de

system of the mouse during demye- linating disease. Microb Pathogen 3, 319-326 Azoulay A, Brahic M, Bureau JF (1994) FVB mice transgenic for the Db gene become resistant to persistent infec- tion by Theiler’s virus. ] Viral 68,4049- 4052 Bureau JF, Montagutelli X, Bihl F, Le- febvre S, GuCnet JL, Brahic M (1993) Mapping loci influencing the persist- ence of Theiler’s virus in the murine central nervous system. Nattlve Genet 5, 87-91 Bureau JF, Montagutelli X, Lefebvre S, G&net JL, Pla M, Brahic M (1992) The interaction of two groups of mu- rine genes controls thepersIstence of Theiler’s virus in the central nervous system. J Virol 66, 4698-4704 Clatch RJ, Melvold RW, Miller SD, Lipton HL (1985) Theiler’s murine en- cephalomyelitis virus (TMEV) indu- ced demyelinating disease in mice is influenced by the H-2D region: cor- relation with TMEV specific delayed- type hypersensitivity, ] Immu~zol 135, 1408-1413 Clatch RJ, Miller SD, Metzner R, Dal Canto MC, Lipton HL (1990) Mono- cytes/macrophages isolated from the

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netic control of susceptibility to Thei- ler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV)-induced demyelinating di- sease I. Differences between suscep- tible SJL/J and resistant BALB/c strains map near the T cell P-chain constant gene on chromosome 6. ] Im- mud 138, 1429-1433 Melvold RW, Jokinen DM, Miller SD, Dal Canto MC. Liuton HL (1990) i- dentification df a’locus on’ mouse chromosome-3 involved in differen- tial susceptibility to Theiler’s murine encephalomyelitis virus-induced de- myelinating disease. J viral 64 (2), 686- 690 Montagutelli X (1990) GeneLink: a program in Pascal for backcross ge- netic linkage analysis. J Heredity 81, 490-491 Morel L, Rudofsky UH, Longmate JA, Schiffenbauer J, Wakeland EK (1994) c( Polygenic control of susceptibility

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5 microsatellites

La demi&re version de oes b8nques de krqueurs peut &e c&&me sur le rtfseau Internet via ftp B I’adresse genome.wi.mit.edu.

Les pragrammes d’analysa g&&@e Une revue r&et&e sur la g6irktiw des m&a&es comI&xes e$t pame dans la revue Science [16J. X MontaguteBi a d&elop~@ let qui fonetionne sur bs ardiiateurs compatibles PC pour l’analyse g6ktique des croisements en retour oW @a@itemeut SW demande B : X MontaguteIli, Unit6 de g&tique des ds B&&xx, 757% Paris Cedex 15. E-mail : ~oti~~~ur.~

t-2 qui teurs Macintosh pour l’analyse g&&ique des censsu~ines EWI. Ce me peut &e obtenw gratuitement sur demande.

b gmupe de E La&&r et qui peuvent &re obtenus sur le r&e&u Iutemet viu ftp k

aits, lkats-Unis) a d&&opp~5 use setie de banques de don&es SW Ia g&&tique de la souris SW Be lshseau hemet via WNINV QM ftp :

les mammifkz.,

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