Anomalies cytogénétiques et génétiques. Mutations « driver » et

évolution clonale. Pr Florence Nguyen-Khac

Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris 6 DES Hématologie Clinique, LLC

Paris, 25/09/2015

A Groupe

C Francophone de

L Cytogénétique

F Hématologique

I.1. Rappel ADN -> ARN -> protéines

I. « Commencer chaque cours par quelques diapos de base »

Acides aminés

Transcrits

Cytogénétique conventionnelle

Biologie moléculaire

Cytogénétique moléculaire

I.2. Les domaines d’analyse du génome

Les domaines d’analyse selon la résolution

1 bp

1-20 kb

100-500 kb

10 Mégabases

Cycle cellulaire : 2 temps principaux

Interphase : composée des phases G1, S et G2 : réplication de l’ADN, préparation

de la cellule à la mitose

Mitose : condensation de la chromatine, formation des chromosomes puis

répartition des chromosomes dans les deux cellules filles

I.3.Les chromosomes métaphasiques

La mitose

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Mitose/55schema24.htm#

Blocage des mitoses en métaphase : poison des fuseaux : colchicine

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

23 paires de chromosomes : caryotype

Autosomes

Chromosomes sexuels X et Y

Classement des chromosomes

En fonction

1. de la taille

2. de la position du centromère...

Bandes G Bandes R Marquage réciproque

3. et des bandes

Nomenclature

Expression des résultats : formule chromosomique (nomenclature internationale)

Formule normale en onco-hématologie : 46,XX[20] ou 46,XY[20]

-il faut lire 20 mitoses normales pour dire qu’un caryotype hématologique est normal

-si pas d’anomalie mais nombre de mitoses < 20 : échec

I.4. Autre technique utilisée en routine : hybridation in situ fluorescente (FISH)

• Détection in situ de séquences d’acides nucléiques sur

– métaphases

– noyaux interphasiques

• Ré-association moléculaire spécifique ADN-ADN :

– cible = ADN chromosomique

– sonde = ADN complémentaire marquée avec un fluorochrome

5’ 3’

Interphase Métaphase Sonde (séquence ADN) marquée

Hybridation moléculaire

Lavage Détection des sites hybridés

Indications de la FISH

• Diagnostic

– anomalie cryptique (non vue au caryotype)

– détection d’une anomalie récurrente essentielle au diagnostic en cas d’échec du caryotype

– précision ou confirmation d’anomalies observées au caryotype

• Suivi

– maladie résiduelle (anomalies non détectables par biologie moléculaire)

– allogreffe de moelle (sexe)

I.5. Anomalies chromosomiques en onco-hématologie

Acquises : présentes seulement dans les cellules tumorales Clonales

quand au moins 2 mitoses / 20 avec un même gain chromosomique ou

une même anomalie de structure

quand au moins 3 mitoses / 20 avec une même perte

Anomalies primaires : au diagnostic, présentes dans le clone tumoral initial /

Anomalies secondaires : apparition avec l’évolution de la maladie

Anomalies primaires :

clonales

Anomalies secondaires : sous-clonales

Absence d’anomalies

Trisomie

Monosomie

A A B B

Translocation

A B

Délétion Duplication

I.6. Anomalies chromosomiques :

Conséquences au niveau des gènes

Activation d'oncogènes

Inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs

- Trisomie, tétrasomie… : 3 ou 4 copies de gènes

- Monosomie, délétion : perte d’une copie d’un (ou des) gène(s)

inactivation d’une copie : haplo-insuffisance

inactivation des 2 copies (ex : délétion/mutation) : suppresseur de tumeur

- Translocation

- Création d’un gène de fusion

- Activation transcriptionnelle

II. Anomalies cytogénétiques dans la LLC

II.1. Caryotype cellules de LLC peu proliférantes in vitro Stimulation par CpG-ODN + IL2, 72 heures Anomalies dans 80-90% des cas Mauvais pronostic Caryotype complexe : > 3 anomalies Présence de translocations chromosomiques Evolution clonale : anomalies additionnelles

Mayr, Blood, 2006

Anomalies chromosomiques Caryotypes complexes

• Caryotype complexe associé à des facteurs de mauvais pronostic 1, 2

– IGHV non muté

– Expression du CD38

– Délétion TP53

– Délétion ATM

• Caryotype complexe : associé à un délai jusqu’au premier traitement raccourci 2 et à une survie plus courte 3, 4

– Y compris chez les cas avec délétion 13q isolée en FISH (OS diminuée) 2

– Y compris chez les cas avec IGHV muté (TTFT diminué) 2

1. Haferlach et al., Leukemia 2007 2. Baliakas et al., AJH, 2013 3. Haferlach et al., Genes Chrom & Cancer, 2010 4. Jaglowski et al., Br J Haematol, 2012

• Premières publications de l’ère du CpG/IL2 : translocations associées à un pronostic péjoratif, indépendamment du nombre d’anomalies (Mayr et al.,

Blood, 2006)

• Dernières études : les translocations ont un impact pronostique uniquement si déséquilibrées ou au sein d’un caryotype complexe (Baliakas et al., AJH, 2013)

• Translocations IGH : rares (~5%), signification pronostique dépend du gène partenaire – BCL2 : bon - BCL3, MYC : mauvais

Anomalies chromosomiques Translocations

Nguyen-Khac et al., AJBR, 2011

II.2. FISH

Döhner, NEJM, 2000

Classification hiérarchique pronostique (FISH) - délétion 13q isolée : très bon pronostic - Absence d’anomalie - Trisomie 12 : pronostic intermédiaire - Délétion 11q : mauvais pronostic - Délétion 17p : mauvais pronostic

4 sondes FISH (médiane : 1 anomalie / patient)

TFS

OS

Avantages de la FISH

- FISH interphasique

- Bonne sensibilité (env 5%) : détection des sous-clones

- Facilité et rapidité technique

Apport du caryotype dans les LLC

- Mise en évidence des caryotypes complexes

- LLC avec FISH 4 sondes normale

• Caryotype anormal dans env. 30% des cas

• Associé à un délai jusqu’au premier traitement et à une survie globale plus courtes

Anomalies dans plus de 80% des cas Non spécifiques Anomalies « classiques » • Délétion 13q14 : 55% • Trisomie 12 : 10-15% • Délétion 11q : 6% (Stades A) ; 20% (Stades B/C) • Délétion 17p : 5-8% Anomalies moins connues mais fréquentes • Délétion 6q : 6% • Gain 2p : 7-16%

Anomalies rares mais récurrentes (< 5%) Trisomie 18, trisomie 19, gain 8q24, t(14;18), t(14;19), t(8;14), del(14q), del(8p)

Anomalies chromosomiques dans la LLC

LPL

+++

Syndromes lymphoprolifératifs B matures

MM

+/-

++++

Hyper/Hypo

+++

++

LZM

++

t(11;18) +3q,7q-,+18q,8p

++

+

++

Délétion 6q

Trisomie 4

14q32/IGH

Autres

Trisomie 12

Délétion 13q14

Délétion TP53

Trisomie 18

Délétion ATM

LLC

+

+/-

++

++++

+

+/-

++

MW

++++

++

+/-

+

++

++

++

+/-

13

der(13)

der(13)

13q14

13q34

Délétion mono-allélique

13

13 der(13)

Délétion bi-allélique

der(13)

der(13)

13q34

Trisomie 12

12

12

12

12 12

Sonde centromérique du 12

12

17 der(17)

17 17

Sonde contrôle verte

TP53

11 11

11 der(11)

Sonde contrôle rouge

ATM

Délétion (11q) (ATM)

Délétion (17p) (TP53)

III. Anomalies génétiques dans la LLC III.1. Peu de gènes / miARN impliqués dans les anomalies chromosomiques del(17)(p13) : gène TP53 Mutation de l’autre allèle : 80% des cas del(11)(q22) : -gène ATM (« ataxie telangiectasia mutated gene ») Mutation de l’autre allèle : 30% des cas -gène BIRC3 del(13)(q14) : miR-15a, miR-16-1 Délétion Dleu2/miR-15a/miR-16-1 : syndrome lymphoprolifératif B (souris) (Calin et al., PNAS 2002 ; Klein et al., Cancer Cell 2010)

III.2. Trisomie 12 • 10 à 15% des cas • Pronostic intermédiaire • Atypique : morphologie, scores de Matutes • Zone minimale de duplication : 12q13-q15 • Gènes impliqués ? • Mutuellement exclusive avec del(17p)

• Associée à d’autres anomalies :

Bon pronostic, IGHV muté

trisomies 18, 19 (Ibbotson et al., Leukemia 2012 ; Baliakas et al., Am J Hematol 2013)

t(14;18)/variantes (BCL2) (Put et al., Leukemia 2009 ; Nguyen-Khac et al., Am J Blood Res

2011)

Mauvais pronostic, IGHV non muté t(14;19) (BCL3) (Martin-Subero et al., Leukemia 2007 ; Chapiro et al., Leukemia 2008)

t(8;14) (MYC) (Put et al., GFCH, Ann Hematol 2012)

del(14q) (Reindl, BJH 2010 ; Pospisilova, Leukemia 2012 ; Cosson et al., poster ASH 2013)

Les mutations géniques

Séquençage à haut débit : ≈ 3000 gènes mutés (Wang et al., N Eng J Med 2011; Puente et al., Nature 2011; Quesada et al., Nat Genetics 2011; Schuh et al., Blood 2012)

Mutations acquises non-passagères (« driver »)

Aucun événement unique

Fréquence de mutations < 20%

Les plus fréquentes : SF3B1, NOTCH1, TP53

Précoces et/ou tardives

Landau et al., Cell 2013

III.3. Mutations récurrentes découvertes par « whole exome sequencing » : séquences codantes

Whole Exome Sequencing

• Combinaisons de mutations différentes d’un patient à l’autre • Une même mutation peut être clonale chez un patient, et sous-clonale chez un autre patient

Damm et al, Cancer Discovery 2014

36

Impact pronostique

Association (coopération oncogénique ?)

anomalies cytogénétiques/mutations

Mutations entre elles

Guieze et al., Blood 2015

Rossi et al., Blood 2013

Fréquence de mutation élevée pour les gènes NFKBIE (10,7%) et EGR2 (8,3%)

EGR2 muté associé à des facteurs de mauvais pronostic

Expression CD38 (p=0,009)

TFS plus courte (p=0,0006)

OS sur 5 ans plus courte (p=0,04)

Damm et al, Cancer Discovery 2014

Séquençage Sanger de 168 patients LLC stades Binet B/C non-traités précédemment (protocole autoLLC, Sutton et al., Blood 2011)

Puente et al. (2011), Quesada et al. (2011), Wang et al. (2011), Fabbri et al. (2011), Rossi et al. (2011), Rossi et al. (2012), Oscier et al. (2013), Jeromin et al. (2013)

Gène Fonction Prévalence (%)

Association avec

Type de mutation

Pronostic

TP53 Apoptose, cycle cellulaire après dommages à l’ADN

4-12% Del 17p Inactivation Mauvais

ATM Apoptose, cycle cellulaire après dommages à l’ADN

~12% Del 11q Inactivation Mauvais

NOTCH1 Différenciation lymphoïde, prolifération,

apopotose

~10% Trisomie 12 Activation Mauvais

SF3B1 Composant du spliceosome

5-10% Del11q ? Inactivation ?

Mauvais

BIRC3 Régulateur négatif de la voie NFKB

~4% Del 11q Inactivation Mauvais

MYD88 Activateur de la voie NFKB

3-5% Del 13q Activation Bon

III.4. Mutations dans des régions non-codantes (WGS) (Puente et al., Nature 2015)

Region 3’ de NOTCH1 (stabilité et activité )

Enhancer de PAX5 (diminution de l’expression)

IV. Evolution clonale

Puente, Nat Genet, 2013

L Sutton & R Rosenquist, Haematologica, 2014

Mutations TP53 : Ultra-deep sequencing révèle que la présence de sous-clones TP53 mutés, même ultra-minoritaires (0,3%) a le même impact clinique péjoratif que les mutations clonales les mutations deviennent majoritaires à la rechute. Leur présence au diagnostic permet d’anticiper le développement de la chimio-résistance (Rossi et al., Blood, 2014)

Landau et al., Cell 2013

• 5 anomalies « driver » : del(13q), tri12, del(11q), del(17p), del(8p) • trisomie 12, del(13q) : « early » événements, clonal dans 80 à 100% des

cellules • del(11q)/ATM, del(17p)/TP53 : plus souvent sous-clonal, événements plus

tardifs, progression de la maladie, rechute

Origine de la LLC : développement à partir de cellules progénitrices ayant acquis des

mutations : nouveau concept

Développement de molécules ciblant également les cellules pré-leucémiques ?

2 3 4 1

Mutation(s) acquises non passagères dans de progéniteurs

Progéniteurs capables de se différencier dans les lignées lymphoïdes et myéloïdes

La LLC se développe à partir de cellules progénitrices

Damm et al, Cancer Discovery 2014

Recommandations

Société Française d’Hématologie 2009 Obligatoire : del(11q) and del(17p) par FISH avant traitement Recommandé : protocoles : caryotype, del(11q), del(17p), autres sondes Pospisilova et al., European Research Initiative on CLL (ERIC). Leukemia, 2012

del(17p) (and TP53mutation) before treatment Stilgenbauer et al. Blood, 2014

del(11q) and del(17p): independent prognostic factors on progression free survival del(17p): independent prognostic factor on overall survival 2015 Nouvelles mutations : choix des gènes ? Nouvelles technologies : mutations, gains et pertes ?