Antibiotiques - resapath.anses.fr

Journée de formation RESAPATH - 19/10/2006

Antibiotiques, Antibiogrammes et Antibiorésistance

Antibiotiques

Antibiogrammes

Antibiorésistance

SIG

MA

AF

SS

A

INR

P

Eric JouyUnité Mycoplasmologie - Bactériologie

AFSSA - Site de Ploufragan



Au programme :

Les antibiotiques : Familles

Cibles cellulaires

Mécanismes d’action

L’antibiogramme : Principe

Méthodes

Catégorisation clinique

L’antibiorésistance : Résistances naturelles et acquises

Supports génétiques

Mécanismes biochimiques

Santé publique



Antibiotiques – les familles

Tétracyclines

Sulfamides / Triméthoprime

Macrolides et apparentés

Bêta-lactamines

Aminosides

Polymyxines

Quinolones et Fluoroquinolones

Phénicolés

Rifamycines

Acide fusidique

Fosfomycine

Glycopeptides

Nitrofuranes

Imidazolés

Oxazolidinones

Antituberculeux



Antibiotiques – les familles

Tétracyclines

Sulfamides / Triméthoprime


Bêta-lactamines

Aminosides

Polymyxines

Quinolones et Fluoroquinolones

Phénicolés

601

260

129

124

87

65

17 et 4

5

Tonnage d’antibiotiques

vendus en France en 2002

Animal(ANMV)

Homme(AFSSAPS)

14

21

110

499

1,8

1,3

4 et 34

0,04



chromosomecytoplasme

paroi(sauf Tenericutes)

membrane

cytoplasmique

Bactérie - cibles cellulaires des antibiotiques

ribosomes

Sous-unité 30S

ARNr 16S

21 protéines (S1-S21)

Sous-unité 50S

ARNr 23S

ARNr 5S

34 protéines (L1-L34)

ARNm

Site peptidyle

(P)

Site aminoacyl

(A)

5’ 3’

ARNtfMet

aa5

aa4

aa1 aa2 aa3



chromosomecytoplasme

paroi(sauf Tenericutes)

membrane

cytoplasmique

ribosomes

Bactérie - cibles cellulaires des antibiotiques

Aminosides

Bêta-lactamines

Glycopeptides

Polymyxines

Quinolones

Fluoroquinolones

Sulfamides

Triméthoprime Tétracyclines

Macrolides

et apparentés

Phénicolés

Sous-unité

30S

Sous-unité

50S



Antibiotiques - Mécanisme d’action

Tétracyclines- tétracycline, oxytétracycline, chlortétracycline

- doxycycline

- minocycline (H)

Sous-unité 30S

ARNr 16S


Sous-unité 50S

ARNr 23S

ARNr 5S


ARNm

Site peptidyle

(P)

Site aminoacyl

(A)

5’ 3’

ARNtfMet

aa5

aa4

aa1 aa2 aa3



AminosidesStreptomycine, Kanamycine, Néomycine, Gentamicine,

Apramycine (V), Spectinomycine

Sous-unité 30S

ARNr 16S


Sous-unité 50S

ARNr 23S

ARNr 5S


ARNm

Site peptidyle

(P)

Site aminoacyl

(A)

5’ 3’

ARNtfMet

aa5

aa4

aa1 aa2 aa3




Phénicolés- Chloramphénicol (animaux de compagnie)

- Thiamphénicol (utilisation cutanée)

- Florfénicol (injectable)

Sous-unité 30S

ARNr 16S


Sous-unité 50S

ARNr 23S

ARNr 5S


ARNm

Site peptidyle

(P)

Site aminoacyl

(A)

5’ 3’

ARNtfMet

aa5

aa4

aa1 aa2 aa3





Noyau à 14 atomes : Erythromycine, …

Noyau à 14 atomes, kétolides : Télithromycine (H)

Noyau à 15 atomes : Azithromycine (H), Tulathromycine (V)

Noyau à 16 atomes : Spiramycine, Tylosine (V), Tilmicosine (V),…

Lincosamides : Lincomycine, Clindamycine

Streptogramines : Pristinamycine (H)

Pleuromutilines : Tiamuline (V), Valnémuline (V)

Sous-unité 30S

ARNr 16S


Sous-unité 50S

ARNr 23S

ARNr 5S


ARNm

Site peptidyle

(P)

Site aminoacyl

(A)

5’ 3’

ARNtfMet

aa5

aa4

aa1 aa2 aa3




Sulfamides et triméthoprime- sulfamides : sulfadiazine, sulfadiméthoxine, sulfamidine,…

- triméthoprime


PAB

+ ptéridine

Dihydroptéroate

Dihydrofolate

Tétrahydrofolate

Acides nucléiques

Dihydroptéroate synthétase (DHPS)

Dihydrofolate réductase (DHFR)

sulfamides

triméthoprime

(-)

(-)



Polymyxines- Colistine (= polymyxine E)

- Polymyxine B


Attraction par la membrane externe

- affinité pour les LPS (charge négative)

- chélation des cations Mg2+ et Ca2+

Déstabilisation et rupture de la membrane externe

Pénétration des polymyxines dans l’espace périplasmique

Insertion des polymyxines dans la membrane cytoplasmique

Déstabilisation et rupture de la membrane cytoplasmique

Fuite des constituants intra-cellulaires et mort bactérienne



Polymyxines


Koike et al. (1969)

P. aeruginosa et polymyxine B



- pénicillines : pénicilline, ampicilline, amoxicilline, oxacilline, …

- céphalosporines :

C1g céfalexine, …

C2g céfamandole (H), céfuroxime (H), …

C3g céfotaxime (H), ceftriaxone (H), céfopérazone, ceftiofur (V), …

C4g céfépime (H), cefpirome (H), cefquinome (V), …

- pénèmes (H) : imipénème,…

- monolactames (H) : aztréonam, …

Les bêta-lactamines se fixent sur les PLP (protéines liant la

pénicilline) au niveau de la membrane bactérienne et inhibent la

synthèse du peptidoglycane (paroi bactérienne)


Bêta-lactamines



N-Ac-Mur N-Ac-Glc

L-aa1

D-Glu

L-aa2

D-Ala

D-Ala

Gly

N-Ac-Mur N-Ac-Glc

L-aa1

D-Glu

L-aa2

D-Ala

Gly

N-Ac-Mur N-Ac-Glc

N-Ac-Mur N-Ac-Glc

N-Ac-Mur N-Ac-Glc

L-aa1

D-Glu

L-aa2

D-Ala

D-Ala

Gly

cytoplasme paroi

Bêta-Lactamines

Glycopeptides(Vancomycine

Teicoplanine)

N-Ac-Mur : Acide N-acétylmuramique

N-Ac-Glc : N-acétylglucosamine

PLP(-)




Quinolones et fluoroquinolones

- quinolones : acide nalidixique (H), acide oxolinique, fluméquine, …

- fluoroquinolones : enrofloxacine (V), marbofloxacine (V), danofloxacine (V),

difloxacine (V), ciprofloxacine (H), …

Les quinolones et fluoroquinolones se fixent sur des enzymes

(topoisomérases) indispensables à la réplication de l’ADN.

Cette fixation entraîne l’arrêt de la réplication de l’ADN et donc

l’arrêt de la multiplication bactérienne.


topoisomérase II : 2 sous-unités A (Gyr A)

(ADN gyrase) 2 sous-unités B (Gyr B)

topoisomérase IV : 2 sous-unités C (ParC)

2 sous-unités E (ParE)



Antibiogrammes

= mesure in vitro de l’activité des antibiotiques vis-à-vis des

bactéries cibles

= Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) d’un antibiotique

vis-à-vis d’une bactérie cible

= plus petite concentration d’un antibiotique capable d’inhiber

la croissance visible de la bactérie cible

= mesure de la bactériostase

bactéricidie : - mesure de la CMB

- cinétique de bactéricidie



Antibiogrammes - Dilution en milieu gélosé

Technique de référence

L’antibiotique est testé à concentration croissante de raison 2, en

milieu gélosé :

… 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128… mg/L

Chaque gélose est ensemencée avec la (les) bactérie(s) à tester

CA-SFM 2006 :

inoculum = 104 UFC / dépôt (sauf exceptions)

= 1 µl d’une suspension à 0,5 McF diluée au 1/10




Inoculateur

multi-pointes

=

Ensemenceur

de Steers




0,5 1 2

4 8 16

ab

c

CMI de la bactérie :

a =

b =

c =

1 mg/L

4 mg/L

16 mg/L

E. coli / gentamicine

mg/L



Antibiogrammes - Dilution en milieu liquide

Concentration croissante de l’antibiotique

Différents

antibiotiques

Karlsson M., 2001



Antibiogrammes - E-test

E. coli / colistine

CMI = 24 mg / L



Antibiogrammes - Diffusion en milieu gélosé

Principe :

- L’antibiotique est contenu dans un support inerte (disque de

papier par ex.)

- A partir de ce support, l’antibiotique diffuse dans la gélose

préalablement ensemencée par une souche bactérienne

pure

- Après incubation, le diamètre de la zone d’inhibition formée

est inversement proportionnel à la CMI

Bauer, Kirby, Sherris and Turck, 1966




Méthodologies(ex. entérobactéries)

Isolement bactérien pur

sur milieu non sélectif

Culture en bouillon 4h à 6h

Dilution au 1 / 10 000

= inoculum

~ 10 6 UFC / mL

AFNOR NF U 47-107

Culture en bouillon 3h à 5h

ou

suspension

Ajustement de la densité

À 0,5 McF

Dilution au 1 / 100

= inoculum

~ 10 6 UFC / mL

= inoculum

~ 10 8 UFC / mL

CA-SFM / BSACCLSI (ex-NCCLS)




CA-SFM / BSACCLSI (ex-NCCLS)

AFNOR NF U 47-107

E. coli CIP 76.24




CA-SFM

CLSI (ex-NCCLS)

Amoxi. + clav. : 21 mm

Amoxi. + clav. : 24 mm

Céfotaxime : 29 mm

Céfotaxime : 35 mm

22,0 - 27,0

32,5 - 37,5

BSAC

19 - 25

29 - 35

34 - 44

20 - 26




Facteurs influençant la diffusion

Gélose de Mueller-Hinton coulage non horizontal

dessiccation

épaisseur (4 mm)

pH

teneur en thymidine, Ca2+ et Mg2+

Disques perte d’activité

péremption, mauvaise conservation

Inoculum taille, contamination

Dépose des disques

Incubation température, durée et atmosphère

Lecture

Nicolas-Chanoine M-H, 2006



Contrôle qualité interne :


E. coli CIP 76.24 ATCC 25922

S. aureus CIP 76.25 ATCC 25923

P. aeruginosa CIP 76.110 ATCC 27853

P. stuartii CIP 107808

E. faecalis CIP 103214 ATCC 29212

Valeurs attendues pour différentes molécules

= moyenne +/- 1 écart-type (8 centres x 50 répétitions)

CA-SFM 2006

CMI, vol 2

S11-S25, 1996

Fréquence : idéalement à chaque changement de lot

de Mueller-Hinton ou de disques

En pratique : fixer une fréquence temporelle

Contrôle qualité externe : 1er en 2002

2ème : en cours



Antibiogrammes - catégorisation clinique

= mesure in vitro de l’activité des antibiotiques vis-à-vis des

bactéries cibles

Objectif :

déterminer si la bactérie est :

- Sensible

- Intermédiaire

- Résistante

= catégorisation clinique

= transformer une CMI ou un diamètre en une

probabilité de succès ou d’échec thérapeutique

= guider le clinicien dans son choix thérapeutique :

efficacité : bactériologique / pharmacologique

coût

impact sur la flore commensale non pathogène

aux antibiotiques testés




Détermination et publication de valeurs critiques pour

chaque couple bactérie / antibiotique (CA-SFM) :

Concentrations critiques basse (c) et haute (C)

Diamètres critiques haut (D) et bas (d)

Ces valeurs critiques tiennent compte :

- de la distribution des CMI pour des populations de souches

définies et appartenant à chacune des espèces bactériennes

impliquées en pathologie humaine

- des concentrations humorales et tissulaires atteintes avec les

posologie recommandées dans le résumé des caractéristiques

du produit (RCP) rédigé par l’AFSSAPS

- de la confrontation des résultats obtenus in vitro et des

résultats obtenus in vivo

- de la variabilité statistique des méthodes utilisées pour

mesurer les CMI et les diamètres des zones d’inhibition



0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256

No

mb

re d

e s

ou

ch

es

CMI en mg / L

Sensible Intermédiaire Résistant





Catégorie sensible CMI c ou Ø D

= forte probabilité de succès thérapeutique avec un traitement par

voie systémique avec les posologies recommandées dans le RCP

Catégorie intermédiaire c < CMI C ou d Ø < D

= succès thérapeutique imprévisible

Catégorie résistance CMI > c ou Ø < d

= forte probabilité d’échec thérapeutique quels que soit le type de

traitement et la dose d’antibiotique utilisée



La résistance aux antibiotiques

Résistance naturelle ou intrinsèque

= la résistance est présente chez toutes les souches d’une

même espèce bactérienne

Résistance acquise

= suite à une modification du capital génétique, la résistance est

présente chez une partie des souches d’une même espèce

bactérienne



Les résistances naturelles (cf communiqué du CA-SFM)

Bacilles à Gram négatif non exigeants :

- pénicilline G

- macrolides et apparentés

- glycopeptides

Exemples :

Coques à Gram positif :

- colistine et polymyxine B

- quinolones

Mycoplasmes :

- bêta-lactamines

Anaérobies :

- aminosides

- triméthoprime

- quinolones



Résistance acquise - support génétique

= modification du capital génétique permettant à une bactérie de

tolérer une concentration d’antibiotique plus élevée que celle qui

inhibe les souches sensibles de la même espèce

Mutation(s) chromosomique(s)

Acquisition de gènes de résistance exogènes

ADN libre

Plasmides

Transposons

Intégrons



Mutation(s) chromosomique(s)

= apparition d’une (de) mutation(s) qui va entraîner une modification

des structures cellulaires préexistantes de la bactérie

1 mutation toutes les 105 à 1010 divisions

l’antibiotique ne provoque pas la mutation, il la sélectionne

si celle-ci entraîne la résistance correspondante

entraîne généralement la résistance à 1 antibiotique ou

1 famille d’antibiotiques

transmissible à la descendance (sauf mutation réverse)

non transmissible aux bactéries "voisines", de la même

espèce ou non




Acquisition de gènes de résistance exogènes (1)

Plasmides :

= molécules d'ADN bicaténaires circulaires, capables de se

répliquer de façon autonome

Transfert horizontal généralement par conjugaison

Spécificité d’hôte (étroite ou large)

Un même plasmide peut porter plusieurs gènes de résistance

Une même bactérie peut contenir plusieurs plasmides




Acquisition de gènes de résistance exogènes (2)

Transposons :

= gènes "sauteurs" capables de promouvoir leur translocation d'une

molécule d'ADN à une autre, incapables de se répliquer seuls

Peuvent être responsables de mutations par insertion

(activation ou inactivation de gènes de résistance)

Peuvent contenir, et donc transférer, un ou plusieurs gènes de

résistance

Intégrons :

= éléments génétiques capables de capter des gènes libres (cassettes),

de les cumuler (1 à 4 en général) et de les exprimer




Conjugaison :

transfert de plasmides ou de certains transposons (conjugatifs) entre 2

bactéries, par l’intermédiaire d’un pont cytoplasmique

Résistance acquise - mécanisme de transfert

Transformation :

transfert d’ADN libre entre une bactérie donatrice et une bactérie

réceptrice en état de compétence (en général proche génétiquement)

puis intégration au chromosome

Transduction :

transfert d’ADN bactérien par l’intermédiaire de bactériophages



Résistance acquise – mécanismes biochimiques

Inactivation enzymatique de l’antibiotique

Modification de la cible

Protection de la cible

Imperméabilité

Efflux actif



Inactivation enzymatique de l’antibiotique

Bêta-lactamines bêta-lactamases

Aminosides aminoside N-acétyltransférase : AAC

aminoside O-phosphotransférase : APH

aminoside O-nucléotydiltransférase : ANT

Phénicolés acétyl-transférases

etc…

TEM, SHV, TRI, OXA,

PSE, PER, VEB, GES,

CTX-M, CMY, …

+ de 250 ont été

identifiées (séquence aa,

substrats)




Modification de la cible (1)

Mutation topoisomérases quinolones

dihydroptéroate synthétase sulfamides

dihydrofolate réductase triméthoprime

LPS des Gram - colistine

Addition ARNr 16S aminosides

[ méthylation ]

ARNr 23S macrolides + lincosamides

+ streptogramine B


gène erm : méthylation adénine2058 = R = MLSB

gène cfr : méthylation adénine2503 = PhLOPSA

(Long et al., 2006)





Ex. : la résistance de E. coli aux quinolones et fluoroquinolones par

mutation(s) des cibles (Saenz et al., 2003)

souche ac. nal. cipro GyrA ParC

sauvage <1-16 < 0,06 - -

a 64 0,06 Asp-87 Gly -

b 256 0,5 Ser-83 Val -

c > 256 2 Ser-83 Leu Glu-84 Val

d > 256 16 Ser-83 Leu Ser-80 Ile

Asp-87 Tyr

e > 256 64 Ser-83 Leu Ser-80 Ile

Asp-87 Asn




Substitution PLP mosaïques bêta-lactamines

(partielle) chez S. pneumoniae

Amplification dihydrofolate réductase triméthoprime

[ surproduction ]

Cible

supplémentaire PLP2a / S. aureus (SARM) bêta-lactamines

2ème dihydroptéroate synthétase sulfamides

2ème dihydrofolate réductase triméthoprime




Protection de la cible

sous-unité 30S du ribosome Tétracyclines

[ protéines Tet(M), Tet(O), Tet(S) ]

topoisomérases Quinolones

[ protéines QnrA, QnrA2, QnrB, QnrS ]




Imperméabilité

concerne surtout les bactéries à Gram négatif

La modification ou la perte de porines de la membrane externe peut

conférer la résistance à différents antibiotiques

ex. : déficit en porine OprD chez P. aeruginosa

résistance aux carbapénèmes


Efflux

Surproduction de systèmes intrinsèques ou acquisition de systèmes

extrinsèques permettant l’expulsion de l’antibiotique

ex. : surproduction du système MexAB-OprM chez P. aeruginosa

résistance aux bêta-lactamines

(variable suivant les molécules)



Li and Nikaido, 2004




Résistance croisée

= un seul mécanisme entraîne la résistance à plusieurs

antibiotiques (d’une même famille ou non) chez une même bactérie

Ex. : S. aureus résistant à la méticilline = toutes les bêta-lactamines

Co-résistance ou résistances associées

= plusieurs mécanismes entraînent la résistance à différentes

familles d’antibiotiques (multi-résistance) chez une même bactérie

Ex. : Salmonella Typhimurium DT104 penta-résistante

Ampicilline, Chloramphénicol, Streptomycine, Sulfamides, Tétracyclines

Résistance hétérogène

= pour une souche donnée qui possède le gène de résistance,

seule une fraction de la population va exprimer cette résistance

Ex. : S. aureus résistant à la méticilline

blaPSE-1 floR aadA2 tet(G)sul1




Gènes Mutations, transferts = acquisition

Bactéries Extinction des sensibles = émergence

Survie des résistantes

Individu Colonisation = portage ou infection

Population Transmission inter-individus = diffusion

Homme Homme

Homme Animaux

Ecosystèmes

(alimentation, eau, sol)

Pression de sélection

- antibiotiques

- désinfectants

- autres molécules

Sélection de bactéries résistantes

Antibiorésistance - Santé publique




Infections communautaires

ex. : S. pneumoniae de sensibilité diminuée aux bêta-lactamines

Infections nosocomiales

ex. : S. aureus résistant à la méticilline

E. faecium résistant à la vancomycine

Pseudomonas et Acinetobacter multi-résistants

Zoonoses d’origine alimentaire

ex. : Salmonella et Campylobacter

Echec thérapeutique du traitement de première intention

(retard dans l’administration d’un antibiotique efficace)

Risque d’impasse thérapeutique



Médecine humaine : surveillance hospitalière et communautaire

Réseaux mis en place depuis plusieurs années et fédérés au sein d’une

association : ONERBA (www.onerba.org)

Médecine vétérinaire :

Programme AFSSA / DGAl depuis 1999 :

(Laboratoires de Fougères, Ploufragan, Lyon et Maisons-Alfort)

Usage et consommation des antibiotiques

Surveillance chez les bactéries sentinelles et zoonotiques

E. coli, Enterococcus, Salmonella, Campylobacter

Surveillance chez les bactéries pathogènes pour les animaux :

le RESAPATH (fédéré à l’ONERBA)

Surveillance chez les Salmonelles : Réseau Salmonella

Surveillance de l’évolution de la résistance




Références bibliographiques

Antibiogramme, 2006, Editions Eska

CA-SFM (www.sfm.asso.fr)

PubMed

Documents

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