Appl. Environ. Microbiol. 1991 Périé 2240 5

8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5

1/7

1991, 57(8):2240.Appl. Environ. Microbiol.

F H Pri and M H Goldby the white rot fungus Dichomitus squalens.peroxidase expression and lignin degradationManganese regulation of manganese

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2/7

V o l .

5 7 ,

N o . 8

P P L I E D AND ENVIRONMENTAL

M I C R O B I O L O G Y , A u g . 1 9 9 1 ,

p . 2 2 4 0 - 2 2 4 5

0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 1 / 0 8 2 2 4 0 - 0 6 0 2 . 0 0 / 0

C o p y r i g h t

C

1 9 9 1 ,

A m e r i c a n

S o c i e t y

f o r

M i c r o b i o l o g y

M a n g a n e s e

R e g u l a t i o n

o f

M a n g a n e s e

P e r o x i d a s e

E x p r e s s i o n a n d

L i g n i n

D e g r a d a t i o n b y

t h e

W h i t e

R o t

F u n g u s

D i c h o m i t u s

s q u a l e n s

FREDERIC

H .

PERIE AND

MICHAEL H .

GOLD*

D e p a r t m e n t o f

C h e m i c a l and

B i o l o g i c a l S c i e n c e s ,

O r e g o n

Graduate I n s t i t u t e

o f

S c i e n c e and

T e c h n o l o g y ,

1 9 6 0 0

N . W .

vo n

Neumann

D r i v e , B e a v e r t o n ,

O r e g o n

9 7 0 0 6 - 1 9 9 9

R e c e i v e d 4

A p r i l

1 9 9 1 / A c c e p t e d 3 J u n e 1 9 9 1

E x t r a c e l l u l a r

ma ng a n es e

p e r o x i d a s e

and l a c c a s e a c t i v i t i e s

w e r e

d e t e c t e d i n c u l t u r e s

o f

D i c h o m i t u s

s q u a l e n s

( P o l y p o r u s

a n c e p s )

u n d e r c o n d i t i o n s

f a v o r i n g l i g n i n

d e g r a d a t i o n .

I n

c o n t r a s t ,

n e i t h e r e x t r a c e l l u l a r

l i g n i n

p e r o x i d a s e

n or

a r y l

a l c o h o l o x i d as e

a c t i v i t y

was d e t e c t e d i n c u l t u r e s

grown

under a wide

v a r i e t y

o f

c o n d i t i o n s .

T h e m i n e r a l i z a t i o n

o f

' 4 C - r i n g - ,

- s i d e

c h a i n - ,

and

- m e t h o x y - l a b e l e d s y n t h e t i c

g u a i a c y l

l i g n i n s b y

D.

s q u a l e n s

a n d

t h e

e x p r e s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r

m angan es e

p e r o x i d a s e

we r e

d e p e n d e n t

on

t h e

p r e s e n c e

o f

M n ( I I ) ,

s u g g e s t i n g

t h a t

m a n g a n e s e p e r o x i d a s e

i s a n

i m p o r t a n t c o m p o n e n t

o f t h i s

o r g a n i s m ' s

l i g n i n

d e g r a d a t i o n s y s t e m .

The

e x p r e s s i o n

o f

l a c c a s e

a c t i v i t y

wa s

i n d e p e n d e n t

o f

manganese.

I n c o n t r a s t

t o

p r e v i o u s

f i n d i n g s

w i t h

P h a n e r o -

c h a e t e

c h r y s o s p o r i u m ,

l i g n i n d e g r a d a t i o n

b y

D .

s q u a l e n s

p r o c e e d e d

i n

t h e

c u l t u r e s

c o n t a i n i n g

excess carbon

a n d

n i t r o g e n .

L i g n i n

i s

a c o m p l e x ,

h e t e r o g e n e o u s ,

a n d

r a n d o m

p h e n y l -

p r o p a n o i d p o l y m e r

t h a t c o n s t i t u t e s

2 0

t o

30

o f

w o o d y

p l a n t s

9 ,

3 6 ) . W h i t e r o t

b a s i d i o m y c e t o u s f u n g i a r e

p r i m a r i l y

r e s p o n s i b l e

f o r t h e i n i t i a t i o n

o f l i g n i n

d e c o m p o s i t i o n i n wood

( 7 , 1 8 , 2 6 ) .

Wh e n c u l t u r e d

u n d e r

l i g n i n o l y t i c

c o n d i t i o n s ,

P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ,

t h e b e s t - s t u d i e d w h i t e r o t

b a s i d i o m y c e t e ,

p r o d u c e s t w o

e x t r a c e l l u l a r

h e m e p e r o x i -

d a s e s - m a n g a n e s e

p e r o x i d a s e ( M n P ) a n d

l i g n i n p e r o x i d a s e

( L i P ) - w h i c h , a l o n g

w i t h a n

H 2 0 2 - g e n e r a t i n g

s y s t e m , c o n -

s t i t u t e t h e

m a j o r

c o m p o n e n t s o f i t s

l i g n i n - d e g r a d i n g s y s t e m

( 1 8 , 2 4 ,

2 6 ,

2 8 ) .

O t h e r

w h i t e

r o t

f u n g i

a p p a r e n t l y

s e c r e t e

u n i q u e

c o m b i n a t i o n s

o f p e r o x i d a s e s

a n d

o x i d a s e s .

C o r i o l u s

v e r s i c o l o r a n d

P h l e b i a

r a d i a t a

e a c h

p r o d u c e o n e o r

m o r e

l a c c a s e s i n

a d d i t i o n

t o

L i P a n d M n P ( 1 0 , 1 1 ,

2 3 , 3 1 ,

3 2 ) .

P l e u r o t u s

s a j o r - c a j u

s e c r e t e s

a n

a r y l

a l c o h o l

o x i d a s e

( 5 ) ,

a

l a c c a s e , a n d

s e v e r a l

p e r o x i d a s e s

( 1 3 ) .

B j e r k e nd e r a a du s t a

s e c r e t e s

a n

a r y l

a l c o h o l o x i d a s e

( 2 9 ) ,

a n d

R i g i d o p o r u s

l i g n o -

s u s

a p p a r e n t l y s e c r e t e s

a l a c c a s e

a n d a

M n P

( 1 4 ) .

P r e v i o u s

r e p o r t s d e m o n s t r a t e d t h a t

D i c h o m i t u s

s q u a l e n s

( P o l y p o r u s

a n c e p s ) , u n d e r

v a r i o u s


e f f i c i e n t l y

d e g r a d e s

n a t u r a l

l i g n i n f r o m

b i r c h

( 2 ) , a s p e n ( 3 0 ) ,

a n d

s p r u c e

wood

( 8 ) a n d

f r o m w h e a t ,

b a r l e y , a n d

g r a p e s t r aw ( 4 3 ) .

To

b r o a d e n

o u r

u n de r s t a n d i ng o f

t h e l i g n i n o l y t i c

e n z y m e s e l a b -

o r a t e d

b y

v a r i o u s

w h i t e

r o t

f u n g i ,

we

h a v e u n d e r t a k e n

t h e

t a s k o f

i d e n t i f y i n g

a n d

c h a r a c t e r i z i n g t h e

e x t r a c e l l u l a r o x i -

d a t i v e

e n z y m e s

o f

D .

s q u a l e n s a n d t h e i r r e g u l a t i o n .

I n t h i s

r e p o r t ,

we e x a m i n e

t h e a b i l i t y o f D .

s q u a l e n s t o d e g r a d e

s y n t h e t i c

l i g n i n s u n d e r

v a r i o u s c o n d i t i o n s .

I n a d d i t i o n ,

we

d e m o n s t r a t e

t h a t

u n d e r l i g n i n o l y t i c

c o n d i t i o n s

t h i s

o r g a n i s m

e x p r e s s e s a l a cc as e

( 3 4 )

a n d

a

M n P

a n d

t h a t

t h e

e x p r e s s i o n

o f M n P

i s

r e g u l a t e d b y Mn.

I n

c o n t r a s t ,

n e i t h e r


L i P

n o r

v e r a t r y l a l c o h o l

o x i d a s e a c t i v i t y w a s

d e t e c t e d

i n

c u l t u r e s

g r o w n u n d e r

a w i d e

v a r i e t y o f c o n d i t i o n s .

MATERIALS A N D

METHODS

O r g a n i s m .

D i c h o m i t u s

s q u a l e n s ( K a r s t ) R e i d

( P o l y p o r u s

a n c e p s P e ck ) ( C B S

4 3 2 . 3 4 )

w a s o b t a i n e d f r o m F .

Z a d r a z i l

a n d

m a i n t a i n e d

o n

p o t a t o

d e x t r o s e - y e a s t e x t r a c t

a g a r s l a n t s .

*

C o r r e s p o n d i n g

a u t h o r .

M y c e l i a l c l a m p

c o n n e c t i o n s w e r e

r e a d i l y

o b s e r v e d ,

i n d i c a t -

i n g

t h a t t h e i s o l a t e

w a s m a i n t a i n e d i n

t h e d i k ar y o t i c s t a t e

( 1 2 ,

3 5 ) .

C u l t u r e c o n d i t i o n s .

The

o r g a n i s m was

g r o w n

a t

2 8 C i n

2 5 0 - m l

E r l e n m e y e r

f l a s k s

i n e i t h e r

1 0 0 - m l

s h a k i n g c u l t u r e s

( 1 5 0 r p m , 2 . 5 - c m

r a d i u s ) o r 2 0 - m l

s t a t i o n a r y c u l t u r e s ,

a s

i n d i c a t e d .

C u l t u r e s

w e r e

i n c u b a t e d u n d e r a i r f o r

6

d a y s ,

a f t e r

w h i c h

t i m e t h e y

w e r e p u r g e d e v e r y

t h r e e d a y s w i t h

100

o x y g e n . A

v a r i e t y o f

g r o w t h m e d i a w e r e

u s e d

i n o u r

a t -

t e m p t s

t o i d e n t i f y t h e e x t r a c e l l u l a r

p e r o x i d a s e s a n d

o x i d a s e s

p r o d u c e d

b y

D .

s q u a l e n s . T h e o r g a n i s m

w a s

r o u t i n e l y

g r o w n

i n

s h a k i n g

c u l t u r e s

i n h i g h - c a r b o n ,

l o w - n i t r o g e n

(HCLN)

medium

( 2 g l u c o s e , 1 . 2

mM

ammonium

t a r t r a t e )

c o n t a i n -

i n g 3 F i M

m a n g a n e s e a s

p r e v i o u s l y d e s c r i b e d

( 2 7 )

o r

i n

a

s y n t h e t i c

medium

c o n t a i n i n g t h e

f o l l o w i n g

c o m p o n e n t s

( p e r

l i t e r ) : 2 0

g

o f g l u c o s e ,

2 . 5

g o f L - a s p a r a g i n e ,

0 . 1 5

g

o f L -

p h e n y l a l a n i n e ,

0 . 0 3

g

o f

a d e n i n e , 0 . 1 mg

o f

t h i a m i n e ,

1

g o f

KH2PO4, 0 . 1

g o f N a 2 P O 4 , 0 . 5

g o f MgSO4

7 H 2 0 , 1 0

mg

o f

FeSO4

7 H 2 0 , 5 mg

o f

CuSO4

5 H 2 0 , a n d

1 6

mg

o f

MnSO4 H 2 0 ,

a s w e l l a s 0 . 0 1

Tween 8 0 .

I n s p e c i f i c

e x p e r i m e n t s ,

t h e f i n a l Mn

c o n c e n t r a t i o n i n t h e

m e d i a

d e s c r i b e d

a b o v e was

a d j u s t e d

t o 0 ,

1 , 2 , 5 , 1 0 , a n d

1 0 0

, u M . I n

a d d i t i o n , v e r a t r y l

a l c o h o l ( 6 mM),

b e n z y l

a l c o h o l ( 6

mM), o r

g u a i a c y l

l i g n i n

d e h y d r o p o l y m e r i z a t e

( D H P ) ( 2

m g )

w a s a d d e d t o

t h e m e d i a d e s c r i b e d

a b o v e

c o n t a i n i n g 1 0 , u M

M n ,

a s

a

p o t e n t i a l

i n d u c e r

o f

L i P

( 2 5 ) .

A d d i t i o n a l m e d i a w e r e

u s e d i n

s t a t i o n a r y c u l t u r e s

i n

a t t e m p t s

t o d e t e c t L i P

a c t i v i t y .

S e v e r a l d i f f e r e n t

i n o r g a n i c

s a l t a n d

v i t a m i n

r e c i p e s ( 1 0 ,

2 1 , 2 7 )

w e r e

u s e d

i n

c o n j u n c t i o n

w i t h t h e

f o l l o w i n g m e d i a :

HCLN, 2 g l u c o s e a n d 1 . 2

mM

ammonium

t a r t r a t e ;

h i g h c a r b o n ,

h i g h n i t r o g e n

(HCHN), 2

g l u c o s e a n d 1 2

mM

ammonium t a r t r a t e ;

l o w

c a r b o n ,

h i g h

n i t r o g e n

( L C H N ) , 0 . 2

g l u c o s e a n d

1 2 mM

ammonium

t a r t r a t e ;

l o w

c a r b o n ,

l o w n i t r o g e n

( L C L N ) , 0 . 2

g l u c o s e

a n d

1 . 2 mM

ammonium

t a r t r a t e .

L i g n o c e l l u l o s e - c o n t a i n i n g m e d i a . T h e

o r g a n i s m

w a s

c u l -

t u r e d u n d e r

s t a t i o n a r y

c o n d i t i o n s o n

b i r c h

o r s p r u ce s a w d u s t

o r o n

g r o u n d

w h e a t

s t r a w

s a t u r a t e d w i t h

w a t e r . T h i s medium

was

n o t

s u p p l e m e n t e d

w i t h a n y

a d d i t i o n a l

n u t r i e n t s .

Two

s e t s

o f

s t a t i o n a r y

c u l t u r e s

w e r e

p r e p a r e d

w i t h

e a c h medium

(HCLN, HCHN, LCHN,

a n d

LCLN,

c o n t a i n i n g t h e

d e -

2 2 4 0


3/7

MANGANESE

PEROXIDASE O F

DICHOMITUS

SQUALENS 2 2 4 1

s c r i b e d s a l t s [ 2 7 ] ) a s w e l l a s w i t h t h e b i r c h s a w d u s t m e d i u m .

T h e

f i r s t

s e t was a s d e s c r i b e d

h e r e; t h e

s e c o n d s e t c o n t a i n e d

v e r a t r y l a l c o h o l ( 6

m M ) .

Enzyme

a s s a y s .

U n l e s s

o t h e r w i s e

i n d i c a t e d ,

e n z y m e

a s -

s a y s

w e r e c o n d u c t e d

i n

1 - m l r e a c t i o n m i x t u r e s a t 3 0 C b y

u s i n g t h e e x t r a c e l l u l a r medium o f f u n g a l c u l t ur es a s a n

enzyme s o u r c e .

L a c c a s e

a c t i v i t y

w a s m e a s u r e d b y

m o n i t o r i n g

t h e

o x i d a -

t i o n

o f 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l

a t

A 4 6 9 .

R ea c t i o n m i x t u r e s

c o n t a i n e d

2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l ( 0 . 2

mM )

a n d enzyme i n 2 0

mM s u c c i n a t e b u f f e r ( p H 3 . 0 ) .

M n P a c t i v i t y

w a s m e a s u r e d b y

m o n i t o r i n g t h e

f o r m a t i o n

o f

a

M n ( I I I ) - m a l o n a t e

c o m p l e x a t A 2 7 0 ( 4 1 ) . R e a c t i o n m i x -

t u r e s c o n t a i n e d

MnSO4

( 0 . 2 mM), H202

( 0 . 1

mM), a n d

enzyme i n 5 0 mM s o d i u m m a l o n a t e ( p H 4 . 5 ) .

C e l l

e n v e l o p e - b o u n d M n P

w a s

a s s a y e d

b y

m o n i t o r i n g

t h e

o x i d a t i o n

o f 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l a t A 4 6 9 .

R e a c t i o n

m i x t u r e s

c o nt a i ne d 2 , 6 - di m e t h o x y p h e no l ( 0 . 2

mM),

H202 ( 0 . 1 m M ) ,

MnSO4

( 0 . 2 m M ) ,

a n d c e l l

e n v e l o p e enzyme f r a c t i o n ( 1 0 m g )

i n

5 0

mM s o d i u m

m a l o n a t e ( p H

4 . 5 ) . T h e

r e a c t i o n w a s

i n c u b a t e d

f o r

1 h a t 2 8 C , a f t e r w h i c h t i m e t h e c e l l

d e b r i s

w a s

r e m o v e d

b y

c e n t r i f u g a t i o n

a t 3 , 0 0 0

x

g a n d t h e A 4 6 9 o f t h e

s u p e r n a t a n t

was

m e a s u r e d .

I n t a c t - c e l l - b o u n d M n P was

m e a su r e d b y s u s p e n d i n g

a

m y c e l i a l p e l l e t i n a

r e a c t i o n m i x t u r e

c o n t a i n i n g 2 , 6 -

d i m e t h o x y p h e n o l ( 0 . 2 m M ) ,

H 2 0 2

( 0 . 1

mM),

a n d MnSO4

( 0 . 2

mM)

i n

5 0 mM s o d i u m

m a l o n a t e

( p H 4 . 5 ) . T h e r e a c t i o n w a s

i n c u b a t e d

f o r 1 5 m i n ,

a f t e r w h i c h

t i m e

t h e

m y c e l i u m

w a s

r e m o v e d

b y

f i l t r a t i o n a n d t h e

A 4 6 9

o f t h e f i l t r a t e w a s m e a -

s u r e d .

L i P

a c t i v i t y

was m e a s u r e d

b y m o n i t o r i n g t h e o x i d a t i o n

o f

v e r a t r y l a l c o h o l a t A 3 1 0 ( 1 8 , 2 6 ) . E x t r a c e l l u l a r L i P a c t i v i t y

was

a l s o

m e a s u r e d b y

m o n i t o r i n g

t h e o x i d a t i o n o f

a

d i a r y l -

p r o p a n e a t A 3 1 0

a s p r e v i o us l y d es cr i b e d

( 2 8 ) .

R e a c t i o n

m i x t u r e s

c o n t a i n e d v e r a t r y l

a l c o h o l

( 2 . 5 m M ) , H 2 0 2 ( 0 . 1

m M ) , a n d enzyme i n 2 0

mM

s o d i u m

s u c c i n a t e b u f f e r ( p H

3 . 0 ) .

A r y l a l c o h o l o x i d a s e a c t i v i t y

w a s

m e a s u r e d b y m o n i t o r i n g

t h e

o x i d a t i o n o f v e r a t r y l o r a n i s y l a l c o h o l a t A 3 1 0 o r

A 2 9 0 ,

r e s p e c t i v e l y ,

a s

p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 5 , 2 9 ) . R ea c t i o n m i x -

t u r e s c o n t a i n e d

v e r a t r y l o r

a n i s y l

a l c o h o l

( 2 . 5 mM) i n

2 0

mM

s o d i u m

s u c c i n a t e

( p H 3 t o

5 . 5 )

o r

i n

2 0 mM s o d i u m p h o s -

p h a t e

( p H 6

t o 7 ) .

C e l l

e n v e l o p e e n z y m e p r e p a r a t i o n .

C u l t u r e s

w e r e f i l t e r e d

t h r o u g h M i r a c l o t h a n d t h e c e l l s w e r e

w a s h e d

w i t h

i c e - c o l d

0 . 0 5

N a C l . T h e

c e l l s

( 0 . 5 g )

w e r e

f r o z e n

i n

l i q u i d n i t r o g e n

a n d

g r o u n d

w i t h

s a n d

i n

a m o r t a r

a n d

p e s t l e . O n e

m i l l i l i t e r

o f

1 0

mM

s o d i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g g l y c e r o l ( 1 0 )

a n d

p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l

f l u o r i d e

( 0 . 5 mM) ( b u f f e r A )

was

a d d e d ,

a n d

t h e e x t r a c t

was s t i r r e d

f o r

5

m i n

a t

4 C . A f t e r t h e

s a n d

wa s

r e m o v e d

b y s e d i m e n t a t i o n ,

t h e

e x t r a c t

wa s

c e n t r i -

f u g e d

a t

3 , 0 0 0

x

g

f o r

1 0

m i n ; t h e

p e l l e t

was w a s h e d

i n b u f f e r

A

a n d

r e c e n t r i f u g e d

a t

3 , 0 0 0

x

g .

F i n a l l y t h e

p e l l e t

was

s u s p e n d e d

i n

5 0

mM s o d i u m

m a l o n a t e

( p H

4 . 5 ) .

M i c r o s c o p i c

e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d

t h a t

t h e c e l l s

w e r e

u n i f o r m l y

b r o k e n .

' 4 C - D H P


2 - 1 4 C - s i d e

c h a i n - ,

1 4 C - m e t h o x y - ,

a n d

U - 1 4 C - r i n g - l a b e l e d

g u a i a c y l

DHPs w e r e

p r e p a r e d

f r o m

l a b e l e d

c o n i f e r y l a l c o h o l

p r e c u r s o r s

a s

p r e v i o u s l y

d e s c r i b e d

( 1 7 ) .

T h e

s p e c i f i c

a c t i v i t y

o f

e a c h s u b s t r a t e

wa s

a d j u s t e d

t o

3

x

1 0 5

cpm/mg w i t h u n l a b e l e d g u a i a c y l

DHP.

R a d i o l a b e l e d

s u b s t r a t e s

( 5 0 , 0 0 0 cp m

p e r

f l a s k

i n

2 5

, u l

o f

d i m e t h y l f o r m -

a m i d e )

w e r e

a d d e d t o

e a c h

a g i t a t e d

c u l t u r e

on

t h e

t h i r d

d a y

o f

g r o w t h .

E v o l v e d

1 4 C O 2

wa s

m e a s u r e d

e v e r y

t h r e e

d a y s

a s

d e s c r i b e d

p r e v i o u s l y

( 1 7 ,

2 7 ) .

Ammonium

i o n ,

a m i n o

a c i d ,

a n d

g l u c o s e

d e t e r m i n a t i o n s .

P r i o r t o

a n a l y s i s , s a m p l e s

o f t h e e x t r a c e l l u l a r

f l u i d were

a

1

i

E

c

c

1 . 0

05

_:

E

EE

0

L

b

1 5

1 -

0

c

. 2

o

_ ._

_ .

0

0

SC

CC

3 0 0

-

E

c 2 0 0

.

u

1 0 0

3 0 0

E

-

-

2 00

V

_ 1

u

1 00

a

_

o

_

_ w

0

D a y s

F I G .

1 .

M i n e r a l i z a t i o n o f ' 4 C - l a b e l e d

DHPs

b y

D .

s q u a l e n s . ( a )

Time

course

f o r t h e e v o l ut i o n o f

1 4 C O 2

f r o m

m e t h o x y - ( A ) ,

s i d e

c h a i n -

( O ) , a n d

r i n g - l a b e l e d

( A ) DHP

i n

HCLN

c u l t u r e s .

The

t i m e

d e p e n d e n c e

o f

m y c e l i u m d r y

w ei g h t ( 0 )

a n d

n i t r o g en d e p l et i o n ( 0 )

i s

a l s o

s h o w n .

( b )

Time

course

f o r t h e

e v o l u t i o n o f

1 ' 4 C O 2

f r o m

m e t h o x y -

( A ) ,

s i d e

c h a i n -

( O ) ,

a n d

r i n g - l a b e l e d ( A )

DHP

i n A s n - P h e

c u l t u r e s . Th e t i m e

d e p e n d e n c e

o f

m y c e l i u m

d r y w ei g h t

( 0 ) ,

Asn

( V ) , a n d P h e ( 0 ) c o n c e n t r a t i o n s i s a l s o s h o w n . S h a k i n g

c u l t u r e s

were p u r g e d p e r i o d i c a l l y w i t h

100

02, a n d

e v o l v e d ' 4 C O 2

was

m e a s u r e d as d e s c r i b e d i n t h e t e x t .

u l t r a f i l t e r e d

t h r o u g h

a n Amicon D i a f l o

YCO5

membrane

( 5 0 0 - m o l e c u l a r - w e i g h t

c u t o f f ) .

The

c o n c e n t r a t i o n o f

ammo-

n i u m i o n

i n

HCLN

c u l t u r e s

was

m o n i t o r e d

b y

t h e

i n d o p h e -

n o l b l u e

m e t h o d ( 2 0 ) .

The t o t a l c o n ce n t r a t i o n o f

amino a c i d s

i n

t h e

medi um o f

A s n - P h e

c u l t u r e s

was

m o n i t o r e d

b y

t h e

n i n h y d r i n m e t h o d ( 4 2 ) .

The

i n d i v i d u a l

c o n c e n t r a t i o n s

o f Asn

a n d

P h e

were

m e a s u r e d

b y

h i g h - p e r f o r m a n c e

l i q u i d

c h r o m a -

t o g r a p h y

on

a

C 8

r e v e r s e - p h a s e

column

(Beckmann

U l t r a -

s p h e r e ,

5

p . m ) a f t e r

d e r i v a t i z a t i o n

w i t h

o - p h t h a l a l d e h y d e

( 3 )

b y

u s i n g

i s o c r a t i c

e l u t i o n w i t h

m e t h a n o l - w a t e r

( 7 : 3 ) .

F r e e

g l u c o s e

i n

t h e

e x t r a c e l l u l a r f l u i d

was d e t e r m i n e d

b y

t h e

p h e n o l - s u l f u r i c

a c i d method

( 1 ) .

RESULTS

A

t i m e course

f o r DHP

d e g r a d a t i o n

i n HCLN

s h a k i n g

c u l t u r e s

o f D .

s q u a l e n s

i s

shown

i n

F i g .

l a . Under t h e s e


D.

s q u a l e n s

m i n e r a l i z e d

40

t o 5 0

o f

e a c h

s u b s t r a t e .

Th e

r e s i d u a l

ammoni um

c o n c e n t r a t i o n and

t h e

g r o w t h

c u r v e

f o r

t h e

o r g a n i s m

under

t h e s e c o n d i t i o n s are

a l s o shown

i n

F i g .

l a .

Th e

d r y

w e i g h t

o f t h e

m y c e l i u m

i n

t h e

-w

0~

D a y s

V O L .

5 7 ,

1 9 9 1


4/7

2 2 4 2 P t R I E AND GOLD

c u l t u r e i n c r e a s e d u n t i l

d a y

2 0 ,

a f t e r

w h i c h

t i m e i t d e c r e a s e d

s i g n i f i c a n t l y ,

p r o b a b l y

a s

a

r e s u l t

o f

a u t o l y s i s .

T h e f r e e

ammonium c o n c e n t r a t i o n

i n

HCLN c u l t u r e s d e c r e a s e d

r a p -

i d l y

o v e r

t h e f i r s t

7

d a y s

a n d

wa s

n o t

d e t e c t a b l e a f t e r

d a y 1 0 .

A t i m e c o u r s e f o r

DHP


i n

A s n - P h e

c u l t u r e s i s

s h o w n i n

F i g .

l b .

C o m p a r i s o n

o f

t h e r e s u l t s

f r o m

t h e

t w o

c u l t u r e

c o n d i t i o n s d e m o n s t r a t e s t h a t

D .

s q u a l e n s

wa s

a b l e t o

d e g r a d e

DHP

i n

e i t h e r

medium

b u t

t h a t

r i n g -

a n d

s i d e

c h a i n - l a b e l e d

DHPs

were

d e g r a d e d

more

e x t e n s i v e l y

i n

HCLN m e d i u m . I n

c o n t r a s t ,

t h e

A s n - P h e

m e d i u m

s u p p o r t e d

a

c o n s i d e r a b l y

f a s t e r r a t e

a n d e x t e n t

o f

g r o w t h .

T h e

m a x i -

mum

m y c e l i u m

d r y w e i g h t

a c h i e v e d

i n

A s n - P h e m e d i u m was

a p p r o x i m a t e l y

1 5 0 o f

t h a t

i n

HCLN

m e d i u m .

D .

s q u a l e n s

a l s o

d e g r a d e d

s i d e


DHP

i n

HCHN

c u l t u r e s

( d a t a

n o t

s h o w n ) .

T h e

e x t e n t o f

s i d e


DHP


i n HCHN c u l t u r e s

was 3 3

a n d

50

o f t h a t

a c h i e v e d i n HCLN

a n d A s n - P h e

c u l t u r e s ,

r e s p e c t i v e l y .

A

t i m e

c o u r s e

( d a y

3

t h r o u g h

d a y

3 0 )

f o r


M n P

a n d

l a c c a s e

e n z y m a t i c a c t i v i t y

i n HCLN

s h a k i n g

c u l t u r e s

c o n t a i n i n g

3

, u M

Mn i s

s h o w n i n

F i g .

2 a . C u l t u r e s

g r o w n

i n

t h e

a b s e n c e

o f

M n

h a d no d e t e c t a b l e M n P

a c t i v i t y t h r o u g h -

o u t t h e

c o u r s e o f t h e

e x p e r i m e n t ,

w h e r e a s

i n

c u l t u r e s

c o n t a i n i n g

M n ,

s o l u b l e e x t r a c e l l u l a r

M n P

a c t i v i t y

wa s

f i r s t

d e t e c t a b l e on

d a y 5 ,

r e a c h e d

a

maximum o n

d a y

1 8 ,

a n d

p e r s i s t e d

t h r o u g h o u t

t h e c o u r s e

o f t h e

e x p e r i m e n t .

I n

c o n -

t r a s t ,

e x t r a c e l l u l a r l a c c a s e

a c t i v i t y

a p p e a r e d

o n

d a y

3

a n d

r e a c h e d a

maximum o n

d a y 9 ,

a f t e r w h i c h t i m e

i t

s l o w l y

d e c l i n e d .

F u r t h e r m o r e ,

t h e

e x p r e s s i o n

o f l a c c a s e

a c t i v i t y

wa s

n o t

d e p e n d e n t

o n t h e

p r e s e n c e

o f Mn.

B e c a u s e

s o l u b l e


M n P

a c t i v i t y

wa s f i r s t d e t e c t a b l e

o n l y

a f t e r

5

d a y s

o f

g r o w t h

i n

HCLN

c u l t u r e s ,

c e l l

e n v e l o p e - b o u n d

M n P

a c t i v i t y

was a l s o

a s s a y e d .

A s s h o w n

i n

F i g . 3 a ,

c e l l

e n v e -

l o p e - b o u n d

M n P

a c t i v i t y

was d e t e c t a b l e

on

d a y

3

a n d

i n c r e a s e d

s i g n i f i c a n t l y b e y o n d d a y

1 0 .

T h e

a p p e a r a n c e

o f

t h i s

c e l l


a c t i v i t y

a l s o wa s

c o m p l e t e l y

d e p e n -

d e n t

o n t h e

p r e s e n c e

o f Mn i n t h e

m e d i u m

( d a t a

n o t

s h o w n ) .

T h e

a p p e a r a n c e

o f

c e l l

e n v e l o p e - b o u n d a c t i v i t y

c o r r e l a t e d

w e l l w i t h t h e M n P

a c t i v i t y

m e a s u r e d

i n t h e

i n t a c t - c e l l

a s s a y .

A

t i m e

c o u r s e

f o r e x t r a c e l l u l a r

M n P a n d l a c c a s e

a c t i v i t y

i n

A s n - P h e

c u l t u r e s

g r o w n

i n

t h e

p r e s e n c e

o r a b s e n c e o f

5 0

, M

Mn

i s

s h o w n

i n

F i g .

2 b .

A g a i n ,

c u l t u r e s

g r o w n

i n

t h e a b s e n c e

o f

M n

e x h i b i t e d no d e t e c t a b l e


M n P

a c t i v i t y

t h r o u g h o u t

t h e

c o u r s e o f

t h e


I n

c o n t r a s t ,

i n

c u l t u r e s

g r o w n

i n

t h e

p r e s e n c e

o f

M n ,


M n P

a c t i v i t y

wa s

f i r s t d e t e c t a b l e

o n

d a y

3 a n d r e a c h e d a f i r s t

maximum a t

d a y

1 2 . A f t e r a b r i e f

d e c l i n e ,

M n P

a c t i v i t y

t h e n

i n c r e a s e d

s t e a d i l y

u n t i l

a p p r o x i m a t e l y d a y 2 4 ,

a f t e r

w h i c h

t i m e

i t r e m a i n e d

c o n s t a n t

t h r o u g h

d a y

3 0 .

A g a i n ,

t h e

e x p r e s -

s i o n o f l a c c a s e

a c t i v i t y

wa s

n o t

d e p e n d e n t

o n

t h e

p r e s e n c e

o f

Mn

i n

A s n - P h e

c u l t u r e s .

N o n - M n - d e p e n d e n t

l a c c a s e

a c t i v i t y

r e a c h e d a maximum

o n

a p p r o x i m a t e l y d a y

1 0

a n d

t h e n

s l o w l y

d e c l i n e d . T h e

l e v e l o f

l a c c a s e

a c t i v i t y

a t t a i n e d

i n

A s n - P h e

c u l t u r e s

( F i g . 2 b )

wa s

c o n s i s t e n t l y

a t l e a s t f i v e - t o

s i x f o l d

g r e a t e r

t h a n

t h a t

a t t a i n e d

i n

HCLN

c u l t u r e s ( F i g .

2 a ) .

I n

c o n t r a s t

t o

t h e r e s u l t s

d e s c r i b e d

a b o v e ,

n e i t h e r L i P n o r

a r y l

a l c o h o l

o x i d a s e

a c t i v i t y

wa s d e t e c t e d

i n

t h e

e x t r a c e l l u -

l a r

m e d i u m

o f HCLN

o r

A s n - P h e

s h a k i n g o r s t a t i o n a r y

c u l t u r e s i n c u b a t e d

i n t h e

p r e s e n c e

o f

0 ,

1 ,

2 , 5 , 1 0 ,

o r

1 0 0

, u M

M n S O 4 .

F u r t h e r m o r e ,

n e i t h e r

e x t r a c e l l u l a r L i P

n o r

a r y l

a l c o h o l o x i d a s e

a c t i v i t y

was

d e t e c t e d i n

s h a k i n g

o r s t a t i o n -

a r y

c u l t u r e s

c o n t a i n i n g HCHN, LCHN, LCLN,

o r

t h e

l i g n o c e l l u l o s e

m e d i u m w i t h

a n y

o f

t h e

p u t a t i v e i n d u c e r s

d e s c r i b e d

i n

M a t e r i a l s

a n d

M e t h o d s .

T h e

e f f e c t

o f t h e

p r e s e n c e

o f

M n

o n t h e


o f

1 4 C - l a b e l e d

DHP

i s

s h o w n i n

F i g .

3 . A

t i m e c o u r s e f o r

t h e


o f

1 4 C - r i n g - ,

- s i d e

c h a i n - ,

a n d

- m e t h o x y - l a b e l e d

a

'O

0 . 8

4

'h i

W

o

a,

0 . 6

: 2 E

x

0

o

.

a .

e

e

4

0 . 4

c

0

0 . 2

U

0

b

E

4

._

I

E

4

V

i

D a y s

D o

y s

F I G . 2 .

E f f e c t

o f

Mn

o n

t h e

e x p r e s s i o n

o f e x t r a c e l l u l a r

M n P a n d

l a c c a s e

a c t i v i t y .

S o l u b l e

M n P

a c t i v i t y

f r o m

c u l t u r e s

g r o w n

i n t h e

p r e s e n c e

( 0 )

a n d

a b s e n c e

( 0 )

o f

M n ,

s o l u b l e

l a c c a s e a c t i v i t y

f r o m

c u l t u r e s

g r o w n

i n t h e

p r e s e n c e

( U )

a n d

a b s e n c e

( O )

o f

M n ,

a n d c e l l


M n P

a c t i v i t y

f r o m

c u l t u r e s

g r o w n

i n

t h e

p r e s e n c e

( A )

o f

M n

w e r e

d e t e r m i n e d a s

d e s c r i b e d

i n t h e t e x t .

S h a k i n g

c u l t u r e s

w e r e

g r o w n

i n HCLN

( a )

a n d

A s n - P h e

( b )

m e d i a .

DHP i n

HCLN

c u l t u r e s

c o n t a i n i n g

3

, u M

Mn i s s h o w n

i n

F i g .

3 a . A l l t h r e e

l a b e l e d

DHPs w e r e

d e g r a d e d

e x t e n s i v e l y

o v e r

t h e

3 0

d a y s

o f

t h e

e x p e r i m e n t

i n

M n - c o n t a i n i n g

c u l t u r e s .

T h e

su m o f t h e

1 4 C O 2

e v o l v e d a f t e r 3 0

d a y s

was

b e t w e e n

4 0 a n d

50 o f t h a t i n t r o d u c e d

f o r e a c h o f

t h e s u b s t r a t e s .

I n

c o n -

t r a s t ,

i n

c u l t u r e s

g r o w n

i n t h e a b s e n c e

o f

M n ,

a l l

t h r e e

l a b e l e d

DHPs w e r e

d e g r a d e d

v e r y s l o w l y ,

w i t h

l e s s

t h a n

10 o f t h e l ab e l ed DHPs

b e i n g

m i n e r a l i z e d

d u r i n g

t h e

3 0 - d a y


A

t i m e

c o u r s e f o r

t h e e v o l u t i o n o f

1 4 C O 2 f r o m

l a b e l e d

DHPs

i n

A s n - P h e

c u l t u r e s i s

s h o w n i n

F i g .

3 b . I n

A s n - P h e

m e d i u m ,

t h e


o f b o t h

1 4 C - r i n g -

a n d - s i d e c h a i n -

l a b e l e d

DHP

a l s o

was

d e p e n d e n t o n

t h e

p r e s e n c e o f Mn

i n

t h e m e d i u m .

F o r

t h e s e t w o DHPs, t h e e x t e n t

o f

1 4 C O 2

e v o l v e d i n

t h e

a b s e n c e

o f Mn

was

l e s s

t h a n

15

o f t h a t

e v o l v e d

i n t h e

p r e s e n c e

o f Mn.

I n

c o n t r a s t , s i g n i f i c a n t

a m o u n t s

o f

1 4 C O 2

w e r e

e v o l v e d i n

A s n - P h e

c u l t u r e s

i n c u -

b a t e d

w i t h

1 4 C - m e t h o x y - l a b e l e d

DHP


o f

Mn.

A f t e r

3 0

d a y s ,

c u l t u r e s

i n c u b a t e d

w i t h

1 4 C - m e t h o x y - l a b e l e d

DHP

i n

t h e

a b s e n c e

o f Mn e v o l v e d


70

a s

much

C O 2

a s

t h a t e v o l v e d i n

t h e

p r e s e n c e o f

Mn.

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


5/7

MANGANESE

PEROXIDASE

OF

DICHOMITUS

SQUALENS

2 2 4 3

U6

5

2

I.

o

G

0

1 - 0

w

U

10

2 0

Days

3 0

Days

F I G .

3 .

E f f e c t

o f

Mn

on

t h e m i n e r a l i z a t i o n

o f 1 4 C - l a b el e d

DHPs.

Th e e v o l u t i o n of

4 C O 2

f r o m r i n g - l a b e l e d DHP i n t h e

presence

( 0 )

a n d

a b s e n c e

( 0 )

o f

Mn

i s s h o w n ,

a s a re t h e

e v o l u t i o n

o f

4 C O 2 f r o m

s i d e c h a i n - l a b e l e d DHP i n t h e presence

( M )

a n d

a b s e n c e

O I ) o f Mn

and

t h e e v o l u t i o n of 1 4 C O 2 f r o m

m e t h o x y - l a b e l e d

DHP i n

t h e

presence ( A )

a n d

a b s e n c e ( A )

o f

Mn.

S h a k i n g c u l t u r e s were grown

i n HCLN

( a )

a n d A sn -P h e

( b)

m e d i a .

DISCUSSION

LiP a n d MnP

were f i r s t i s o l a t e d f r o m t h e e xt r ac el l u la r

m e d i u m o f P . c h r y s o s p o r i u m ( 1 8 , 2 6 ,

2 8 ) , a n d t h e

enzymes

from

t h i s

o r g a n i s m

h a v e b een c h a r a c t e r i z e d e x t e n s i v e l y .

Both

enzymes are

e x t r a c e l l u l a r h e m e - c o n t a i n i n g

g l y c o p r o -

t e i n s which e x i s t

a s

a

s e r i e s o f i s o z y m e s .

C o n s i d e r a b l e

c h e m i c a l

and

p h y s i o l o g i c a l

e v i d e n c e

r e v i e w e d

p r e v i o u s l y

( 7 ,

1 8 , 2 2 ,

2 6 ,

2 8 , 3 7 ) suggests t h a t t h e s e

enzymes

c o n s t i t u t e

t h e

m a j o r c o m p o n e n t s

o f t h e l i g n i n d e g r a d a t i v e system

o f

P .

c h r y s o s p o r i u m .

Li P

c a t a l y z e s

t h e o x i d a t i v e

c l e a v a g e

o f

n o n p h e n o l i c l i g n i n

model

compounds

b y

a

mechanism i n -

v o l v i n g t h e

f o r m a t i o n

o f

a

s u b s t r a t e a r y l c a t i o n r a d i c a l

( 1 8 ,

2 2 , 2 6 ,

3 7 ) . A r ecen t report a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t

c r u d e

l i g n i n p e r o x i d a s e p r e p a r a t i o n s c a t a l y z e , a t

l e a s t p a r t i a l l y ,

t h e

d e p o l y m e r i z a t i o n o f s y n t h e t i c a n g i o s p e r m

l i g n i n ( 1 9 ) . M n P

c a t a l y z e s t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I) t o M n ( I I I ) , a n d

t h e

l a t t e r ,

complexed w i t h an o r g a n i c a c i d ,

r e a d i l y o x i d i z e s

p h e n o l i c

l i g n i n

model

compounds

( 1 5 ,

1 6 ,

3 3 , 3 8 ,

3 9 ) .

R e c e n t l y , we

demonstrated t h a t homogeneous MnP a l s o

c a t a l y z e s

p a r -

t i a l l y t h e

d e p o l y m e r i z a t i o n

o f s y n t h e t i c

a n g i o s p e r m

a n d

gymnosperm l i g n i n

( 4 0 ) . I n

a d d i t i o n , i t

h a s

b e e n

d e m o n -

s t r a t e d

r e c e n t l y

i n P .

c h r y s o s p o r i u m

t h a t

M n ,

t h e

p r i m a r y

s u b s t r a t e o f

MnP,

r e g u l a t e s

t h e

e x p r e s s i o n

o f t h e

e n z y m e

( 4 ,

6 )

b y

a c t i v a t i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e

M n P

g e n e

( 6 ) .

I n t h i s

p a p e r ,

we e x t e n d o u r

s t u d i e s o n

l i g n i n


b y

e x a m i n i n g t h e e x t r a c e l l u l a r

e n z y m e s

e l a b o r a t e d

b y t h e

l i g -

n i n - d e g r a d i n g

f u n g u s D .

s q u a l e n s .

T h e

r e s u l t s

s h o w n i n

F i g . 1

d e m o n s t r a t e t h a t ,

u n l i k e P .


( 1 8 , 2 6 ) , D . s q u a l e n s

d e g r a d e s

l i g n i n

u n d e r

n i t r o g e n - s u f f i c i e n t c o n d i t i o n s a s

w e l l

a s

n i t r o g e n - l i m i t i n g

c o n d i t i o n s .

As

s h o w n i n

F i g .

l b ,

a f t e r a n

i n i t i a l

l a g l i g n i n


p r o c e e d s

e f f i c i e n t l y i n

A s n - P h e

c u l t u r e s a n d

i n

HCLN

c u l t u r e s . F u r t h er m o r e , D .

s q u a l e n s

d e g r a d e s

s i d e


DHP

i n HCHN medium

t o


33

o f t h e

e x t e n t

o f t h e


i n

HCLN

m e d i u m

( d a t a

n o t

s h o w n ) .

M n P a c t i v i t y i s r e a d i l y

d e t e c t e d

i n

t h e

m e d i u m

f r o m

A s n - P h e

c u l t u r e s , a n d

t h e t i m e

c o u r s e s

f o r

b o t h


M n P

a n d l a c c a s e a c t i v i t i e s

c o r r e l a t e

w e l l

w i t h t h a t

f o r DHP


( F i g .

l b

a n d 2 b ) . I n

c o n t r a s t , i n

HCLN Mn-

c o n t a i n i n g

c u l t u r e s ,

s o l u b l e

M n P

a c t i v i t y

i s

d e t e c t a b l e

o n l y

a f t e r

5

d a y s

a n d

r e a c h e s

a

maximum

o n d a y

1 8 ,

w h e r e a s

l i g n i n


p r o c e e d s

r a p i d l y f r o m

d a y

6

o n

( F i g .

l a

a n d

2 a ) . H o w e v e r , u n d e r

HCLN


s i g n i f i c a n t

l e v e l s

o f c e l l e n v e l o p e - b o u n d

M n P

a c t i v i t y

a r e

d e t e c t a b l e

o n

d a y 4 , a n d t h i s

a c t i v i t y

p r o b a b l y

a c c o u n t s

f o r

t h e

e a r l y

o n s e t

o f l i g n i n d e g r a d a t i o n .

C e l l

e n v e l o p e - b o u n d M n P

a c t i v i t y

h a s

a l s o b e e n

d e t e c t e d i n

P .


( 3 3 ) .

P r e s u m a b l y

b o t h c e l l


a n d

s o l u b l e

e x t r a c e l l u l a r Mn P a r e

c a p a b l e

o f g en e r a t i n g f r e e l y

d i f f u s i b l e

M n ( I I I ) ,

w h i c h

i n

t u r n

o x i d i z e s

t h e t e r m i n a l

p h e n o l i c

s u b s t r a t e , l i g n i n .

W e

h a v e

v e r i f i e d

t h a t

c e l l


M n P i s

c a p a b l e o f

o x i d i z i n g

2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l

i n b o t h

c e l l - f r e e

a n d i n t a c t - c e l l

a s s a y

s y s t e m s .

T h e r e s u l t s

s h o w n

i n F i g .

2


t h a t

u n d e r

b o t h

h i g h - a n d

l o w - n i t r o g e n


D .

s q u a l e n s

s e c r e t e s

b o t h

a l a c ca se a n d a

MnP.

H o w e v e r , i n

c o n t r a s t t o

P .

c h r y s o -

s p o r i u m ,

n o L i P

a c t i v i t y

i s

d e t e c t a b l e

i n

D . s q u a l e n s

c u l t u r e s

g r o w n u n d e r

a v a r i e t y

o f


i n c l u d i n g t h e

p r e s e n c e

o f

v a r i o u s

c o n c e n t r a t i o n s

o f

c a r b o n ,

n i t r o g e n ,

a n d

M n

i n

b o t h

a g i t a t e d a n d

s t a t i o n a r y f l a s k s .

L i k e w i s e , L i P

a c t i v i t y

i s

n o t d et e c t e d

i n

D .

s q u a l e n s

c u l t u r e s

t r e a t e d

w i t h v a r i o u s

p u t a t i v e

i n d uc er s o f

P .

c h r y s o s p o r i u m L i P

a c t i v i t y

( 2 5 ) .

I n

a d d i t i o n , n o

e x t r a c e l l u l a r a r y l

a l c o h o l

o x i d a s e

i s d e t e c t a b l e

i n t h i s

o r g a n i s m .

T h e s e

r e s u l t s ,

a l o n g w i t h t h e

p r e v i o u s

r e p o r t s d e s c r i b e d a b o v e

( 1 4 ,

2 9 ) ,

s u g g e s t t h a t L i P

ma y

n o t

b e

a n e s s e n t i a l

c o m p o n e n t

o f t h e

l i g n i n


s y s t e m

o f

e v e r y w h i t e

r o t

f u n g u s a n d

t h a t

a l t e r n a t i v e

o x i d a t i v e

e n -

z y m e s ,

s u c h a s

MnP,

a r e

c a p a b l e

o f

d e g r a d i n g

l i g n i n .

I n c o n t r a s t

t o

t h e

r e s u l t s

w i t h

n u t r i e n t

n i t r o g e n ,

t h e

p r e s e n c e o f M n

i n D .

s q u a l e n s

c u l t u r e s c o n t r o l s

t h e

e x p r e s -

s i o n

o f

Mn P a n d t h e

e x t e n t

o f l i g n i n


T h e

r e s u l t s

i n

F i g .

2


t h a t

D .

s q u a l e n s p r o d u c e s

a n

e x t r a -

c e l l u l a r l a c c a s e i n

HCLN a n d

A s n - P h e

m e d i a

i n

t h e

p r e s e n c e

a n d a bs e n c e

o f

M n . I n

c o n t r a s t ,

t h e

a p p e a r a n c e

o f

b o t h

e x t r a c e l l u l a r s o l u b l e

a n d

c e l l


M n P

a c t i v i t y

i s c o m p l e t e l y

d e p e n d e n t

o n

t h e p r e s e n c e

o f

M n

i n t h e

m e d i u m .

I n

HCLN

c u l t u r e s ,

t h e

e x t e n t o f

DHP



o f M n

i s

l e s s

t h a n 15

o f

t h a t

i n

t h e

p r e s e n c e

o f

M n . T h e

s m a l l

a m o u n t

of

4 C O 2

e v o l u t i o n

o b s e r v e d

may

b e a r e s u l t o f

l i g n i n


b y

t h e l a c c a s e

w h i c h

i s

e x p r e s s e d

i n t h e

a b s e n c e

o f

M n

o r

b y

a n o t h e r

e n z y m e .

I t

i s

l i k e l y

t h a t

t h e

M n

e f f e c t

o n

l i g n i n


i s

t h e

r e s u l t

o f

M n i n d u c t i o n

o f

Mn P

e x p r e s s i o n ,

a s

h a s b e e n

s h o w n f o r P .


( 6 ) ,

a n d o f

t h e f a c t

t h a t Mn

s e r v e s

a s

t h e

a

0

~~~~~~~~~~~~

i o

o

6

0

o

o

3

o~~~~~6-

VOL.

5 7 ,

1 9 9 1


6/7

2 2 4 4 PERIE AND

GOLD

s u b s t r a t e f o r

M n P .

H o w e v e r ,

a t

t h i s t i m e

we

c a n n o t r u l e

o u t

t h e l e s s

l i k e l y p o s s i b i l i t y

t h a t

a n o t h e r

M n - d e p e n d e n t e n z y m e

i s

i n v o l v e d

i n

l i g n i n d e g r a d a t i o n .

Enzyme a s s a y s

demon-

s t r a t e

t h a t D.

s q u a l e n s

MnP

e n z y m a t i c a c t i v i t y

i s

d e p e n d e n t

on

Mn,

and t h e r e s u l t s i n

F i g .

2 show t h a t

Mn

r e g u l a t e s

M n P

e x p r e s s i o n

i n D.

s q u a l e n s .

Th e r e s u l t s i n

F i g .

3 b

demonstrate t h a t

m e t h o x y - l a b e l e d

l i g n i n

i s

d e g r a d e d

i n

Asn-Phe

m e d i u m

b u t n o t

i n

HCLN

m e d i u m

i n t h e

absence

o f

M n ,

c o r r e l a t i n g

w i t h

t h e

e x p r e s -

s i o n

o f

l a c c a s e . Laccase

e x p r e s s i o n

i n

t h i s

o r g a n i s m

i s

i n d e p e n d e n t

o f

Mn

and i s a c t i v a t e d

b y

g r o w t h

under

h i g h -

n i t r o g e n

c o n d i t i o n s . These r e s u l t s

s u g g e s t

t h a t t h e

e x t r a c e l -

l u l a r

l a c c a s e i s

c a p a b l e

o f

d e m e t h o x y l a t i n g g u a i a c y l

DHP

i n

v i v o .

Th e

o x i d a t i o n

o f d i m e r i c

l i g n i n

model

c o m p o u n d s

b y

l a c c a s e

h a s

be e n

d e s c r i b e d

p r e v i o u s l y

( 2 2 ) .

I n

c o n c l u s i o n ,

t h e s e

r e s u l t s

s u g g e s t

t h a t

MnP

and

p r o b a -

b l y

l a c c a s e

p l a y

i m p o r t a n t

r o l e s

i n t h e


o f

l i g n i n

b y

a t l e a s t some

white

r o t

f u n g i

and t h a t

Li P

m a y

n o t

b e

a n

i n d i s p e n s i b l e c o m p o n e n t

o f t h e

l i g n i n

d e g r a d a t i v e

s y s t e m

o f

e v e r y

w h i t e r o t

f u n g u s .

Th e

r e s u l t s

a l s o

s u g g e s t

t h a t a

v a r i e t y

o f o x i d a t i v e

e n z y m es

m a y

b e

u t i l i z e d

b y

w h i t e

r o t

f u n g i

f o r

l i g n i n


We

are

c o n t i n u i n g

ou r

s t u d i e s

on t h e

l i g n i n


s y s t e m

o f D .

s q u a l e n s

t o

i d e n t i f y

t h e

enzymes

i n v o l v e d .

ACKNOWLEDGMENTS

This

work was

s u p p o r t e d

b y

G r o u p e m e n t

d e Recherches d e

L a c q - E l f

A q u i t a i n e ,

t h e

N a t i o n a l

S c i e n c e Foundation

( g r a n t

DMB-

8 9 0 4 3 5 8 ) ,

a n d

t h e U.S.

D e p a r t m e n t

o f

E n e r g y ,

O f f i c e

o f

B a s i c

E n e r g y

Sciences

( g r a n t

D E - F G 0 6 - 8 7 - E R 1 3 7 1 5 ) .

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L i g n i n

d i s t r i b u t i o n

i n c e l l

w a l l s

o f b i r c h

wood

d e c a y e d b y

w h i t e r o t

b a s i d i o m y c e t e s . P h y t o p a t h o l o g y

7 7 : 6 8 4 - 6 9 0 .

3 .

B l a n k e n s h i p ,

D .

T . ,

M .

A .

K r i v a n e k ,

B . L .

A c k e r m a n ,

a n d A . D .

Cardin.

1 9 8 9 .

H i g h

s e n s i t i v i t y

amino

a c i d

a n a l y s i s

b y

d e r i v a t i -

zation with

o - p h t h a l a l d e h y d e

and

9 - f l u o r e n y l m e t h y l

c h l o r o f o r -

ma t e

u s i n g

f l u o r e s c e n c e

d e t e c t i o n :

a p p l i c a t i o n

i n

p r o t e i n

s t r u c -

t u r e d e t e r m i n a t i o n .

A n a l .

Biochem.

1 7 8 : 2 2 7 - 2 3 2 .

4 .

B o n a r m e , P . ,

and

T . W .

J e i f r i e s .

1 9 9 0 .

M n ( I I ) r e g u l a t i o n

o f

l i g n i n p e r o x i d a s e s

and

m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e s

f r o m

l i g n i n - d e g r a d i n g

w h i t e r o t

f u n g i .

A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l .

56:210-217.

5 .

B o u r b o n n a i s , R . ,

and

M.

G .

P a i c e .

1 9 8 8 .

V e r a t r y l

a l c o h o l

oxidases

from t h e

l i g n i n - d e g r a d i n g

b a s i d i o m y c e t e

P l e u r o t u s

s a j o r - c a j u .

Biochem.

J .

2 5 5 : 4 4 5 - 4 5 0 .

6 .

B r o w n ,

J .

A . ,

J .

K.

G l e n n ,

and

M.

H .

G o l d . 1 9 9 0 .

M a n g a n e s e

r e g u l a t e s

t h e

e x p r e s s i o n

o f

manganese

p e r o x i d a s e

b y

P h a n e r o -

chaete


J .

B a c t e r i o l .

1 7 2 : 3 1 2 5 - 3 1 3 0 .

7 .

B u s w e l l ,

J .

A . ,

and E .

O d i e r .

1 9 8 7 .

L i g n i n b i o de g r ad a t io n .

C r i t .

Rev.

B i o t e c h n o l . 6 : 1 - 6 0 .

8 .

C h a n g ,

H . - M . ,

C . - L .

C h e n ,

and T . K .

K i r k . 1 9 8 0 .

T h e

c h e m i s t r y

of

l i g n i n


b y

w h i t e - r o t

f u n g i ,

p .

2 1 5 - 2 3 0 . I n T .

K .

K i r k ,

T .

H i g u c h i ,

and

H.-M.

C h a n g ( e d . ) ,

L i g n i n

b i o d e g r a d a -

t i o n :

m i c r o b i o l o gy , c h e m i st r y ,

and

p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s , v o l . I .

CRC

P r e s s ,

I n c . ,

Boca

R a t o n ,

F l a .

9 .

C r a w f o r d ,

R . L .

1 9 8 1 .

L i g n i n

b i o d e g r a d a t i o n .

J o h n

W i l e y

S o n s ,

I n c . ,

New

Y o r k .

1 0 .

D o d s o n ,

P .

J . ,

C . S .

E v a n s ,

P .

J .

H a r v e y ,

a n d J . M.

P a l m e r .

1 9 8 7 .

P r o d u c t i o n and

p r o p e r t i e s

o f a n

e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e

fr om

C o r i o l u s

v e r s i c o l o r

which

c a t a l y z e s

C a - C 1 3

c l e a v a g e i n a

l i g n i n

model

c o m p o u n d .

FEMS

M i c r o b i o l . L e t t .

4 2 : 1 7 - 2 2 .

1 1 .

F a h r a e u s ,

G . ,

and B .

Reinhammar. 1 9 6 7 .

L a r g e - s c a l e

p r o d u c -

t i o n a nd

p u r i f i c a t i o n

o f

l a c c a s e

from

c u l t u r e s o f

P o l y p o r u s

v e r s i c o l o r

and some

p r o p e r t i e s

o f l a c c a s e

A . A c t a C h e m .

S c a n d .

2 1 : 2 3 6 7 - 2 3 7 8 .

1 2 .

F i n c h a m , J .

R .

S . ,

P .

R .

D a y ,

a n d A . R ad f o r d. 1 9 7 9 .

F u n g a l

g e n e t i c s ,

v o l .

4 .

B o t a n i c a l

m o n o g r a p h s .

U n i v e r s i t y

o f C a l i f o r n i a

P r e s s , B e r k e l e y .

1 3 .

F u k u z u m i ,

T .

1 9 8 7 .

L i g n i n o l y t i c e n z y m e s

o f

P l e u r o t u s

s a j o r -

c a j u , p .

1 3 7 - 1 4 2 . I n

E . O d i e r

e d . ) ,

L i g n i n

e n z y m i c

a n d

m i c r o -

b i a l


I n s t i t u t N a t i o n a l d e

l a R e c h e r c h e

A g r o n o -

m i q u e ,

P a r i s .

1 4 .

G a l l i a n o ,

H . ,

G .

G a s ,

a n d

A .

B o u d e t . 1 9 8 8 .

B i o d e g r a d a t i o n

o f

Hevea

b r a s i l i e n s i s

l i g n o c e l l u l o s e

b y

R i g i d o p o r u s

l i g n o s u s :

i n -

f l u e n c e

o f c u l t u r e c o n d i t i o n s

a n d

i n v o l v e m e n t

o f

o x i d i z i n g

e n z y m e s .

P l a n t

P h y s i o l .

B i o c h e m .

2 6 : 6 1 9 - 6 2 7 .

1 5 .

G l e n n , J . K . ,

L .

A k i l e s w a r a n ,

a n d M. H .

G o l d .

1 9 8 6 .

M n ( l I )

o x i d a t i o n

i s t h e

p r i n c i p a l

f u n c t i o n o f t h e

e x t r a c e l l u l a r M n -

p e r o x i d a s e

f r o m

P h a n e r o c h a e t e


A r c h .

B i o -

c h e m .

B i o p h y s .

2 5 1 : 6 8 8 - 6 9 6 .

1 6 .

G l e n n ,

J .

K . ,

a n d

M. H .

G o l d . 1 9 8 5 .

P u r i f i c a t i o n

a n d

c h a r a c t e r -

i z a t i o n o f

a n e x t r a c e l l u l a r

M n ( I l ) - d e p e n d e n t

p e r o x i d a s e

f r o m

t h e

l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e ,


c h r y s o -

s p o r i u m .

A r c h . B i o c h e m .

B i o p h y s .

2 4 2 : 3 2 9 - 3 4 1 .

1 7 . G o l d ,

M.

H . ,

M.

B .

M a y f i e l d ,

T .

M.

C h e n g ,

K .

K r i s n a n g k u r a ,

A .

E n o k i ,

M.

S h i m a d a ,

a n d

J .

K .

G l e n n .

1 9 8 2 . A



m u t a n t

d e f e c t i v e

i n

l i g n i n d e g r a d a t i o n

a s

w e l l

a s

s e v e r a l

o t h e r

s e c o n d a r y

m e t a b o l i c f u n c t i o n s . A r c h .

M i c r o b i o l .

1 3 2 : 1 1 5 - 1 2 2 .

1 8 . G o l d , M. H . , H . W a r i i s h i ,

a n d

K .

V a l l i .

1 9 8 9 . E x t r a c e l l u l a r

p e r o x i d a s e s

i n v o l v e d

i n

l i g n i n


b y

t h e

w h i t e

r o t

b a s i d i o m y c e t e



Am. C h e m .

S o c .

S y m p .

S e r . 3 8 9 : 1 2 7 - 1 4 0 .

1 9 .

H a m m e l ,

K .

E . ,

a n d

M. A . M o e n . 1 9 9 1 .

D e p o l y m e r i z a t i o n

o f a

s y n t h e t i c l i g n i n

i n v i t r o

b y l i g n i n

p e r o x i d a s e .

E n z y m e

M i c r o b .

T e c h n o l . 1 3 : 1 5 - 1 8 .

2 0 . H a n s o n , R .

S . ,

a n d

J .

A .

P h i l l i p s .

1 9 8 1 .

C h e m i c a l

c o m p o s i t i o n ,

p .

3 2 8 - 3 6 4 .

I n P .

G e r h a r d t ,

R .

G . E .

M u r r a y , R . N .

C o s t i l o w ,

E . W.

N e s t e r ,

W.

A .

W o o d ,

N . R .

K r i e g ,

a n d

G .

B .

P h i l l i p s

( e d . ) ,

M a n u a l

o f

m e t h o d s

f o r

g e n e r a l b a c t e r i o l o g y .

A m e r i c a n

S o c i e t y

f o r

M i c r o b i o l o g y ,

W a s h i n g t o n ,

D . C .

2 1 . H a t a k k a , A .

I . ,

a n d

A .

K .

U u s i - R a u v a . 1 9 8 3 . D e g r a d a t i o n

o f

' 4 C - l a b e l e d

p o p l a r

wood

l i g n i n

b y

s e l e c t e d

w h i t e r o t

f u n g i . E u r .

J . A p p l . M i cr o bi o l . B i o t e ch n o l .

1 7 : 2 3 5 - 2 4 2 .

2 2 .

H i g u c h i ,

T .

1 9 9 0 .

L i g n i n b i o c h e m i s t r y :

b i o s y n t h e s i s a n d

b i o d e g -

r a d a t i o n . Wood

S c i . T e c h n o l .

2 4 : 2 3 - 6 3 .

2 3 .

J o h a n s s o n , T . ,

a n d

P . 0 .

N y m a n . 1 9 8 7 . A

m a n g a n e s e ( I I ) -

d e p e n d e n t


p e r o x i d a s e

f r o m

t h e

w h i t e

r o t

f u n g u s

T r a m e t e s

v e r s i c o l o r . A c t a

C h e m . S c a n d .

B 4 1 : 7 6 2 - 7 6 5 .

2 4 . K e r s t e n

P .

J . ,

a n d

T . K .

K i r k . 1 9 8 7 . I n v o l v e m e n t

o f

a

new

e n z y m e , g l y o x a l o x i d a s e , i n


H 2 0 2 p r o d u c t i o n

b y

P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m .

J .

B a c t e r i o l .

1 6 9 : 2 1 9 5 - 2 2 0 2 .

2 5 .

K i r k , T . K . , S .

C r o a n , M. T i e n ,

K . E . M u r t a g h , a n d

R .

L .

F a r r e l l .

1 9 8 6

P r o d uc t i o n o f m u l t i p l e l i g n i n a s e s

b y

P h a n e r o c h a -

e t e

c h r y s o s p o r i u m :

e f f e c t o f s e l e c t e d g r o w t h

c o n d i t i o n s a n d

u s e

o f a m u t a n t

s t r a i n . Enzyme M i c r o b . T e c h n o l .

8 : 2 7 - 3 2 .

2 6 . K i r k, T . K . , a n d R .

L . F a r r e l l . 1 9 8 7 .

E n z y m a t i c

c o m b u s t i o n :

t h e m i c r o b i a l

d e g r a d a t i o n o f

l i g n i n .

A n n u .

R e v .

M i c r o b i o l .

4 1 : 4 6 5 - 5 0 5 .

2 7 . K i r k , T . K . ,

E . S c h u l t z W. J . C o n n o r s ,

L . F .

L o r e n z ,

a n d J .

G .

Z e i k u s . 1 9 7 8 . I n f l u e n c e o f

c u l t u r e

p a r a m e t e r s o n

l i g n i n

m e t a b o -

l i s m b y P h an e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m .

A r c h . M i c r o b i o l .

1 1 7 :

2 2 7 - 2 8 5 .

2 8 .

K u w a h a r a , M . ,

J .

K . G l e n n ,

M.

A . M o r g a n , a n d

M. H .

G o l d .

1 9 8 4 .

S e p a r a t i o n

a n d

c h a r a c t e r i z a t i o n

o f

t w o


H 1 0 2 - d e p e n d e n t

o x i d a s e s f r o m l i g n i n o l y t i c

c u l t u r e s o f

P h a n e r -

o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . FEBS L e t t .

1 6 9 : 2 4 7 - 2 4 9 .

2 9 .

Muheim,

A . , R . W a l d n e r , M. S . A . L e i s o l a ,

a n d

A .

F i e c h t e r .

1 9 9 0 . An e x t r a c e l l u l a r

a r y l a l c o h o l o x i d a s e

f r o m

t h e

w h i t e

r o t

f u n gu s B j e r k e nd e r a

a d u s t a . Enzyme M i c r o b . T e ch n o l .

1 2 : 2 0 4 -

2 0 9 .

3 0 .

M y e r s ,

G .

C . , G .

F . L e a t h a m , T .

H . W e g n e r ,

a n d

R .

A .

B l a n c h e t t e . 1 9 8 8 . F u n g a l

p r e t r e a t m e n t

o f

a s p e n c h i p s

i m p r o v e s

s t r e n g t h o f r e f i n e d m e c h a n i c a l

p u l p s .

TAPPI J .

7 1 : 1 0 5 - 1 0 8 .

3 1 .

N i k u - P a a v o l a ,

M. L . ,

E .

K a r h u n e n , A . K a n t e l i n e n , L . V i i k a r i ,

T

L u n d e l l ,

a n d

A . H a t a k k a .

1 9 9 0 . T h e e f f e c t o f

c u l t u r e

c o n d i t i o n s

o n t h e

p r o d u ct i o n o f

l i g n i n - m o d i f y i n g

e n z y m e s b y

t h e

w h i t e - r o t

f u n gu s P h l eb i a

r a d i a t a .

J .

B i o t e c h n o l .

1 3 : 2 1 1 - 2 2 1 .

A P P L . E N V I R O N .

M I C R O B I O L .


7/7

Documents

Appl. Environ. Microbiol. 1991 Périé 2240 5