44
Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien Maillet NGS Industry Manager

Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

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Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing)dans le management de la sécurité

et de la qualité des aliments

Aurélien Maillet

NGS Industry Manager

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Contexte

2

Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou

d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon

environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Pathogènes

Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?

Altération/Incident de fabrication

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Caractérisation et identification

3

...

Classe

Ordre

Famille

Genre

Espèce

Sérotype

Type

Souche

Virulome

Résistome

NiveauxIsolat bactérien

Caractérisation niveau 1 - Molecular subtyping / Ribotyping

(Riboprinter®)

- MLST

- PFGE

Caractérisation niveau 2

NGS

Identification- MALDI-TOF

-16S ARNr (500pb-1500pb)

- ITS2

Communauté

microbienne

Caractérisation du

microbiome

- Culture

microbiologique

NGS

Page 4: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Des millions de brins d’ ADN séquencés à haut débit en in 1 seule analyse

Next Generation Sequencing (NGS)

4Source : http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/abs/nrg2626.html,

"Next generation sequencing"

Plateformes de séquençages développées après 2005

Page 5: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Des technologies de plus en plus utilisées …

5

ISO/TC 34/SC 9 : Microbiology

WG 25 Whole-genome sequencing for typing and genomic

characterization

ILSI Europe Food Safety Task Force (Nestlé, Unilever, Mondelez, Arla, Mc Donald’s,

Mérieux NutriSciences ...)

‘Next Generation Sequencing (NGS): Translation into Practice’.

http://ilsi.eu/task-forces/food-safety/microbiological-food-safety/

Page 6: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

6

NGSWhole Genome

Sequencing (WGS) Metabarcoding

SOURCE : ACTEMIUM, SCIENCE PHOTO LIBRARY, ISTEMA-HUMANO.COM.AR

Next Generation Sequencing (NGS)

Communauté

microbienneIsolat bactérien

Page 7: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

NGS pour l’IndustrieAgroalimentaire

7

Extraction de l’ADN

Analyse des séquences par Bioinformatique

Echantillon

alimentaire ou

environnementalIsolat

bactérien

ADN ADN

PCRSéquençage

du génome

complet

(WGS)

Metabarcoding

Caractérisation du génome

Typage isolats bactériens

Composition

microbienne

Communauté microbienne

Page 8: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

8

WGS Metabarcoding

ID & Phylogénie

8Diversité Ecosystème

NGS pour l’Industrie Agroalimentaire

Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630

Page 9: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

9

WGS

ID & Phylogénie

9

NGS pour l’Industrie Agroalimentaire

Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630

Page 10: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Whole Genome Sequencing (WGS)

◼ Le Whole Genome Sequencing (WGS) permet d’obtenir la sequence d’ADN complète d’un génome bactérien en uneseule fois

◼ Détails précis sur les microorganismes : gènes, plasmides, facteurs de virulence, sérotype, gènes de résistance (désinfectants, antibiotiques).

◼ Le WGS permet d’évaluer des différences au niveaunucléotidique

◼ Relations phylogénétiques entre isolats (typage)

◼ Niveau le plus fin de caractérisation bactérienne

Source: Teresa M. Bergholz et al. Applied and Environmental Microbiology 82(3) · November 2015Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370

10Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630

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WGS comment ça marche ?

11

Page 12: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

WGS pour quoi faire ?

Meilleure connaissances (études rétrospectives)

▪ Base de données d’isolats et de leur historique

(caractérisation précise des évènements passés de

contamination/évolution des différents isolats)

▪Evènement de persistance de pathogènes

12

Traçabilité et résolution de crises/TIAC

▪ Ingrédient responsable dans une recette complexe

▪ Origine des contaminations

▪ Lien entre TIAC et source alimentaire

Management de la sécurité des aliments

▪ Monitoring des environnements de production

▪ Meilleure prévention des risques bactériens

Passé

Présent

Futur

Page 13: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

13

WGS Exemple

PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES

SURGELES

Contrôles positifs redondants dans les produits finis

Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés

Le processus de fabrication est-il maitrisé ?

D’où vient la contamination ?

Utilisation du WGS

Prélèvements produits/Environnement de production

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14

WGS Exemple

Lm Trémis

Lm Tapis

Convoyage

Lm Tunnel de

Surgélation

Lm Produit

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15

WGS Exemple

1029 km

1431 km

Tour Eiffel

ColiséeSagrada Familia

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16

WGS Exemple

1029 SNP

1431 SNP

Tour Eiffel

ColiséeSagrada Familia

Peu éloigné LointainProche Distinguable DifférenteIndistinguable

Page 17: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

17

WGS Exemple

Lm Trémis

Lm Tapis

Convoyage

Lm Tunnel de

Surgélation

Lm Produit1500 SNP

1000 SNP

5 SNP

Distinguable DifférenteIndistinguable

Page 18: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

18

WGS Exemple

PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES

SURGELES

Contrôles positifs redondants dans les produits finis

Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés

WGS :

Identification de la source de contamination

Mesures correctives:

Procédures de nettoyage adaptées

Changement équipements/surfaces

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Contexte

19

Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou

d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon

environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Pathogènes

Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?

Altération/Incident de fabrication

Page 20: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Contexte

20

Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou

d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon

environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Pathogènes

Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?

Altération/Incident de fabrication

Page 21: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

21

Metabarcoding

21Diversité Ecosystème

NGS pour l’Industrie Agroalimentaire

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MetabarcodingComment ça marche ?

22

Matrice Alimentaire

et/ou

Environnementale

Extraction de

l’ADN bactérien

Séquençage d’un

gène bactérien

universel Composition/

Empreinte bactérienne

des échantillons

Page 23: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Metabarcoding

23

Genre 1

Genre 2

Genre 3

Genre N

Ech

an

tillo

n1 …

Ech

an

tillo

n2 … …

Rela

tive A

bundance

(%)

100

10

1

0.1

0

Composition bactérienne des

échantillons

Heatmap Barplot

Source: Mérieux NutriSciences

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Diversité d’échantillons

24

◼ Environnement de production

◼ Matières premières, Matières en cours de fabrication, Produits finis

◼ Incidents de Fabrication

https://www.slideshare.net/yashgajwani1/microbiology-of-milk-59033370 http://canacopegdl.com/images/spoilage/spoilage-14.jpg

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Mauvaises odeurs

Mauvais goût

Réclamations clients

Metabarcoding Exemple

Utilisation du

METABARCODING

Identification de toute la

communauté bactérienne du

produit au cours de sa durée de vie

Source: Mérieux NutriSciences

ALTEROBIO25

Identification de la

population d’altération

du produit au cours de

sa durée de vie

J0 J14 J21 J28

Quelle est l’origine de l’altération de mon

produit ?

Page 26: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Echantillons

Environnementaux

Metabarcoding Exemple

Utilisation du

METABARCODING

Identification de toute la

population bactérienne de

l’usine de production

(équipements, surfaces, …)

Source: Mérieux NutriSciences

ALTEROBIO

Knights et al., 2011 26

Comparaison des données

produits/environnement

« Machine Learning »

Réception/Filletage Traitement Packaging

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Mauvaises odeurs

Mauvais goût

Réclamations clients

Metabarcoding Exemple

Source: Mérieux NutriSciences

ALTEROBIO27

METABARCODING :

Identification de la flore d’altération

Identification de la source de contamination

Mesures correctives:

Procédures de nettoyage plus ciblées

Révision plan de nettoyage/plan de contrôle

ou

Adaptation atmosphère conditionnement/Biopréservation

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Take home messages

28

WGSInvestigation pathogènes

Caractérisation isolats

Typage/Résistance stress

Attribution de source de contamination

Meilleure maîtrise process

MetabarcodingInvestigation flores d’altération/incident de fabrication

Caractérisation du microbiote d’un produit ou d’un environnement d’usine

Compréhension écologie produit/environnement

Meilleure maîtrise process Extension durée de vie

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29

Merci de votre attention

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Typage Bactérien

30

Levels

...

Class

Order

Family

Genus

Species

Serotype

Type

Strain

➢ Comparaisons isolat/isolat pour déterminer leur proximité

➢ Investigations épidémiologiques

➢ Identifications de routes de transmission d’agents infectieux

?

?

?

?

?????

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◼ Méthodes Phénotypiques

◼Ex: Sérotypage

Typage Bactérien

31

➢ Nécessite un œil

expérimenté

➢ Sérums onéreux

➢ Faible pouvoir

discriminant

➢ Rapide

➢ Peut être standardisé

Owais et al., 2014

Page 32: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼ Méthodes moléculaires

◼Ex: MLST

Typage Bactérien

32Aanensen DM, Spratt BG (2005) The multilocus sequence typing network: mlst.net Nucleic Acids Res. Jul

1;33(Web Server issue):W728-33

Page 33: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼ Méthodes moléculaires

◼Ex: MLST

Typage Bactérien

33

➢ Temps d’analyse

pouvant être

importants

➢ Faible pouvoir

discriminant -> 7

gènes

➢ Pas disponible pour

toutes les bactéries

➢ Caractérisation précise

➢ Schémas complets pour

un certain nombre

d’espèces bactériennes

Page 34: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼Ex: PFGE

Typage Bactérien

34

Source : PulseNet CDC

Page 35: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼Ex: PFGE

Typage Bactérien

35

➢ Temps d’analyse importants

(4 à 5 jours)

➢ Coûts élevés de mise en

place (équipement, logiciel

d’analyse, réactifs)

➢ Nécessite un personnel très

qualifié

➢ Biais d’analyses

➢ Pouvoir discriminant

important

➢ Grande résolution

➢ Reproductible

➢ Applicable à un grand

nombre d’espèces

bactériennes

Page 36: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼Ex: PFGE

Typage Bactérien

36Adapté de Tunover et al., 1995

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Quelles analyses ?

37

wgSNP

(L. monocytogenes)

≈ 3 000 000 basepairs

wgMLST

wgMLST

(L. monocytogenes)

4797 loci

(hqSNP)-based clustering pipelines

wgSNP

Page 38: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Quelles analyses ?

38

wgMLST SNP

Unité de mesure

Polymorphisme de

gène – plusieurs type

de mutation

Uniquement mutation

de nucléotide simple

Pré-requisBase de données

génique

Génome de référence

complet et de très

bonne qualité

Avantages

Rapide – ne dépend

pas de génomes de

référence

Résolution extrême –

méthodes publiées

Inconvénients

Base de données

géniques à mettre à

jour – Accès aux

bases de données

difficile – Expertise

bioinformatique

Génome de référence

– Ressource

informatique

importante -

Expertise

bioinformatique

Page 39: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Quelles analyses ?

39

wgSNP

(L. monocytogenes)

≈ 3 000 000 basepairs

wgMLST

wgMLST

(L. monocytogenes)

4797 loci

Indistinguable Distinguable Distinguable DifférenteIndistinguable

(hqSNP)-based clustering pipelines

wgSNP

Page 40: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

◼ Microbial population shift

Products shelf life studies

40

unclassified

Pseudomonas 55%

Lactococcus, Leuconostoc….

Production date Use by Date (UBD) UBD + 10

Source: Mérieux NutriSciences

Page 41: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

41

Etude de Durée de Vie de Produits

Source: Mérieux NutriSciences

◼ Microbial population shift

Production date Use by Date (UBD) UBD + 10

Page 42: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Coagulated UHT milk

Off odors

No culture on petri dishes

Food Defect

Other

Unclassified

Cellulomonas

Dermacoccus

Microbacterium

Propionibacterium

Chryseobacterium

Barnesiella

Alistipes

Pedobacter

Clostridium

Finegoldia

Staphyloccocus

Streptococcus

Massilia

Pseudomonas

Akkermansia

gen

re

Ab

on

da

nc

e r

ela

tive

(%

)

100

10

1

0.1

0

Spoiled Milk Ref

16S METABARCODING use

Whole bacterial community

identification within the spoiled product

and comparison with a non spoiled

product (Ref)

Chryseobacterium within the

spoiled product (90% relative

abundance) / absent within the Ref

Source: Mérieux NutriSciences 42

Thermoresistant

proteases

Page 43: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

Random

blown-packed effect

Packaging defect

Food Defect

ReferenceSpoiled Product

METABARCODING use

Whole bacterial community

identification within the spoiled product

and comparison with a non spoiled

product (Ref)

Source: Mérieux NutriSciences

mapaq.gouv.qc.ca43

Lactobacillus within the spoiled

product (57% relative abundance)

/ absent within the reference

Page 44: Apport des outils de NGS (Next Generation … - 11h30...Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments Aurélien

44

Dominant population culture on

appropriate media

Lactobacillus enumeration

Species Identification

Mass Spectrometry MALDI-TOF

Lactobacillus buchneri

Food Defect