(Biofilm PACES Déf 2014 Valcarcel [Mode de …unsof.cerimes.fr/media/ressources-unsof/media/cours-montpellier/... · • Les biofilms sont des couches de micro-organismes associés

PACESPACESPACESPACES

LES BIOFILMS

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PLAN

• I. PRESENTATION

• II. DEFINITION ET PRINCIPAUX CRITERES

• III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS

• IV. FORMATION DES BIOFILMS

• V. REGULATION ET CONTRÔLE GENETIQUE DES BIOFILMS

• VI. EXEMPLES DE BIOFILMS

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• Les biofilms = première forme de vie (≈ 3,5 109 années)

• Les biofilms = présents partout dans l’environnement terrestre :

• pores au sein des glaciers

• Fumeurs noirs des abysses sous de hautes pressions (100 MPa)

• eau à haute concentration saline, milieu irradié, etc..

• Ces formations vivantes associent une colonisation de diversenvironnements avec un processus de survie et d’adaptation

• Ces biofilms se développent en santé sur de très nombreuses surfaces :– cathéters, valves, implants, tissus biologiques, peau, muqueuses, dents,

yeux poumons, nez, oreilles, etc..

– Conditions physiologique et pathologique (Infection nosocomiale)

I. PRESENTATION

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Omniprésence des biofilms dans la nature

Fumeurs noirs

glaciersgeyser

désert

Illustrations non au concours PACESD4


Biofilms & médecinecathéters, valves, implants

à éliminer après 4 jours (CLIN)Cathéters, endoscopes etc. sources de contamination

Nombreuses surfaces – désinfection difficile


65 % des infections bactérienneschez l’’homme dues à des biofilms

Chicurel M. Nature 2000 408 : 284-286


Biofilm in vivo - MEB

Colonie bactérienne in vivo chez l’homme Vue Canal dentaire obturé



• Dans les suspensions liquides :• la plupart des micro-organismes sont regroupés en amas mobiles

• animés par des mouvements browniens• dépourvues de toutes attaches à une surface : état planctonique

• Sur les surfaces (naturelles ou synthétiques) :

• la plupart des micro-organismes forment des amas adhérents

• avec un remaniement permanent dans le biofilm : état sessile

• Toutes ces communautés vivantes organisées = « Biofilm »

I. PRESENTATION (suite)

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I. PRESENTATION (suite)

Etude des micro-organismes dans ces biofilms in vivo montre :

• Organisation en communautés structurées

• hétérogène ou homogène dans l’espace et le temps• Liaison à une matrice de polymères exocellulaires (EPS)

• Tous ces micro-organismes se développent :

• non isolément et sous la forme de microcolonies

• de taille, de forme, de densité et d’organisation variées(agrégat, monocouche, multicouche, suspension ou adhérent)

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W. G. CHARACKLIS (1990) :« Un biofilm est une communauté microbienne adhérant à une surface et

fréquemment incluse dans une matrice de polymères exocellulaires »Cette matrice est aussi appelée « couche muqueuse »

• Les biofilms sont des couches de micro-organismes associés à un type de surface etconstitués d’un seul type ou de plusieurs types de micro-organismes (levures,bactéries, protozoaires ou combinaisons de toutes ces espèces)

• - Les critères principaux sont ceux d’une structure biologique :• avec plus microorganismes que de matrice exocellulaire

• avec un âge et une densité

• avec une limite de visibilité comprise entre deux seuils :

en dessous de 104 cellules/cm2 : pas de visibilité

au-dessus de 108 cellules /cm2: visibilité

II. DEFINITION ET CRITERES PRINCIPAUX

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Les biofilms se développent souvent de manière hétérogène :

• en microcolonies discontinues

• séparées par des espaces où circule librement des liquides et molécules

• Les biofilms se développent parfois de manière homogène :• s’ils sont organisés par des champs de forces

• dans des conditions expérimentales

• La structure des biofilms dépend :

• des micro-organismes qui le composent

• des molécules engagées dans leur formation

• des variations physico-chimiques de leur environnement

II. DEFINITION ET CRITERES PRINCIPAUX (suite)

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Microcolonie (30 µm Ø) Streptococcus mutans sur l’émail

Formation de microcolonies



Formation des clones

• Une micro colonie grandit pour former un clone comp osé de plusieurs colonies• Toutes les bactéries du clone sont identiques• Au début , il n’y a pas de mélange de clones différents• Au delà d’une certaine croissance , les clones différents vont s’interpénétrer



L’adhésion est :Accumulation de micro-organismes et matériels extracellulaires

sur une surface solide

• Processus s’effectuant en plusieurs étapes :

• Transport vers la surface• Adhésion non spécifique ou réversible• Adhésion spécifique ou irréversible

• L’adhésion est constituée de :

• Phénomènes physico-chimiques suivis de

• Phénomènes biologiques

III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS(suite)

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III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)

Tiré de Boutaleb N. thèse de chimie 2007



C’est un processus au cours duquel on constate :

• Variations avec modifications génétiques , phénotypiques et métaboliques• 40% des gènes sont modifiés pour E. coli (Prigent- Combaret et LeJeune, 1999)• 4% des gènes de P. aeruginosa (Chicurel, 2000).

• Variation des capacités d’adhésion aux surfaces intra/inter-espèces

• Variation de l’adhésion selon la nature et l’état de surface• La rugosité et les altérations des surfaces modifient la structure des biofilms

• Variations d’adhésion selon les conditions physico-chimique et biologique :• Concentration en cations divalents (Ca++, Mg++..) facilite + ou – l’adhésion• Surfaces modifiées par poly-éthylène glycol (PEG)

ou par groupements Arg-Gly-Asp (RGD) facilite l ’adhésion


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III. 1. Adhésion non spécifique :• Décrite pour les cellules au travers de la théorie DLVO

(DERJARGUIN –

LANDAU – VERWEY – OVERBEEK)

• Dues interactions non spécifiques des charges ou à l’énergie de surface

• Mécanismes :• Combinaison effets d’attraction de forces de Van der Walls et

+ effets de répulsion (Coulomb) par charges ioniques (double couche en surface)

• La théorie DVLO prend en compte la variation d’énergie entre :• l’énergie d’attraction (VA ) et• l’énergie de répulsion (VR), et ce• en fonction de la distance entre deux particules

• La résultante des 2 énergies VA et VR donne l’énergie totale d’interaction (VT)


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Répulsion

Attraction

Couche ionique

Rapport des Forces d’attraction et de répulsion pou r un micro-organisme à l’approche d’une surface solide

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Illustrations non au concours PACES



Les cations polyvalents augmentent l’adhésion entre les cellulessouvent chargées négativement dans les milieux biologiques

• Un pont intermoléculaire entre les cellules se constitue

par interaction électrostatique

• La répulsion électrostatique est fortement influencée par

concentration ionique de la solution :

• plus la concentration ionique est importante

• plus la force de répulsion électrostatique est faible• plus la distance entre les cellules se réduit

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III.2. Adhésion spécifique :• L’adhésion spécifique est le fait de :

• structures moléculaires à la surface des micro-organismes bactériens

(phospholipides, acides teichoïques, LPS, résidus d’acidesgras)

• d’appendices filamenteux ou organelles propres aux microorganismes

(pili ou fimbriae et flagelles)

• Structure des pili ou fimbriae :

• Les pili (pilus = poil) ou fimbriae (frange) :

� 2 types de pili (fimbriae): les pili communs d’attachements et les pilis «sexuels »

� Les pili communs : courts, nombreux sur la surface bactérienne

� Les pilis « sexuels » (F) : longs, polaire et favorisent les échanges (conjugaison)D19



•Les pili ou fimbriae communs sont issus :•de polymérisation protéines tubulaires fines, dites pilines

•pilines ensuite assemblées à des polypeptides comme l’adhésine

•assemblage des pilines distinctes forme un tube creux

•à l’extrémité du tube se trouve l’adhésine

•l’adhésine a une conformation moléculaire capable d’interagir et de fixer aux récepteursglycolipidiques ou glycoprotéiques des cellules eucaryot es

•Les pili ou fimbriae communs sont :•suffisamment minces (3-10 µm épais/0,3 à 2 µm long) pour que les cellules surmontentla répulsion électrostatique

•à l’origine de la stabilisation de l’adhésion aux surfaces ou aux cellules

•principalement sur la surface des micro-organismes gram négatifs

•rarement sur la surface des micro-organismes grams positifsD20



Schema du P-Pilus chez Escherichia coli

Structure majeure Pap A fixé mbrane externe par Pap H

Prot. fibrillum Pap E connectée à Pap A par prot. d’adaptation Pap K

Adhésine PapG connectée par une prot. d’adaptation Pap FD21




• Fonction des pili ou fimbriae :• Les microorganismes bactériens mobiles disposent des pili communs

pour leur mobilité au sein de systèmes de ciliatures divers :

� Ciliature monotriche pour un seul pili à un pôle

� Ciliature péritriche pour plusieurs pili autour de la cellule bactérienne

� Ciliature amphitriche pour un pili à chaque pôle opposé de la cellule bactérienne

� Ciliature lophotriche pour plusieurs pili sur le même pôle de la cellule bactérienne

• Les pili communs d’attachement sont des organelles d’adhésion

pour la colonisation des surfaces de l’environnement et la résistance aux flux

• Les pili sexuels , porteur d’un facteur de transfert F de matériel génétique ,pour les échanges génétiques entre les cellules lors de la conjugaison

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Adhésion bactérienne par flagelle et pili

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• L’adhésion spécifique intercellulaire :• La liaison spécifique entre l’adhésine bactérienne et le(s) récepteur(s)

cellulaires influence la formation et la composition du biofilm

• L’adhésine bactérienne se lie spécifiquement à un récepteur cellulairecomplémentaires différents selon le type de tissu(épithélium urinaire, gastro-intestinal, surfaces dentaires, co-agrégation interbactérienne)

• Différents récepteurs cellulaires interagissent selon une spécificitéintra ou inter espèces :

• La colonisation par E. coli CFA/I et CFA/II est limitée à l’homme

• La colonisation par E. coli K88 concerne le porc• La colonisation par E. coli K99 concerne les agneaux, veaux et porcelets

(de GRAAF F.K. et al.1994) D24



3 niveaux influencent la formation d’un biofilm :

- Le phénotype et le métabolisme bactérien

- Le type et état de surface

- L’environnement physico-chimique et biologique

• La formation se déroule en 5 étapes :

- L’adhésion initiale (non spécifique) de type réversible

- L’adhésion irréversible (spécifique) : colonies en surface avec attachements

- La colonisation avec 2 étapes de maturation :

� Maturation Iaire : croissance surface, formation EPS - biofilms monocouche (10 µm)

� Maturation II aire : croissance multicouches - biofilm multicouche (100 µm)

- La dispersion/dissolution : rupture liaisons inter-cellulaires et EPS

IV. FORMATION DU BIOFILMS

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IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)

La formation - croissance – dissociation du biofilm dépendent de :

• l’équilibre et le gradient des molécules biologique s au sein du biofilm soit :

� gradients molécules signals bactériennes des mêmes espèces (quorum sensing )

Favorise la croissance

� interactions molécules signals bactériennes d’espèces diverses (quorum quenching )

Limite la croissanceD26


IV.1. L’adhésion des micro-organismes

• 1ère étape rapide est l’adsorption des molécules en :

• Absorption molécules du milieu liquide sur surface (phénomène rapide)

• 2ème étape lente est l’adhésion par interactions physico-chimiques :

• Forces des Van der Waals + électrostatiques + acido-basiques

• Modification de la distance d’interaction entre la cellule et la surface

IV.2. La colonisation

• Dès adhésion, multiplication des micro-organismes

• Synthèse des polyosides à l’origine des polymères exocellulaires

• Formation la matrice exocellulaire (EPS)


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IV.2. La colonisation (suite)

• Interpénétration des micro-organismes dans EPS forment un « tissu »

• Échanges entre colonies de bactéries avec circulation de nutriments

• La production EPS a lieu grâce information génétique correspondante :

• P. aeruginosa active gène promoteur algC pour formation matrice d’alginates

• Arrêt de multiplication cellulaire n’est pas arrêt de formation du biofilm :

• Activité ATP toujours présente 4 mois après arrêt de multiplication

• Croissance biofilm peut se faire sur des mois et des années


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IV.2. La colonisation (suite)

• Formation biofilm aboutit à des structures en forme de champignons :

• Structures évoluant avec les conditions de croissance du milieu

• Structures de cellules génétiquement et phénotypiquement différentes

• Champignons composés de tiges ascendantes et de chapeaux :

• Tiges = cellules non mobiles (mutant non mobile pilA)

• Chapeaux = cellules motiles (sauvage mobile

pilA)

• Migration de cellules de + en + mobiles vers le haut des chapeaux


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Etapes de formation du biofilm

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FORMATION DU BIOFILM EN SURFACED’UN MATERIAU DENTAIRE



IV.3. Dispersion/dissolution

• La dispersion et la dissolution sont des retours vers l'état planctonique

• La dispersion et la dissolution du biofilm sont dues à :

• Impact des molécules de croissance du biofilm (quorum sensing )

• Impact des molécules de diminution du biofilm (quorum quenching )

• Interactions de ces molécules pour une régulation génétique et phénotypique

• Cet impact biochimique est dépendant de :

• L’environnement moléculaire du biofilm

• L’environnement physico-chimique du biofilmD32



IV.3. Dispersion/dissolution (suite)

• La dispersion est souvent liée à :

• Modifications en apport de nutriments du biofilm ,

• Fluctuations concentrations oxygène ou augmentation oxyde nitrique (NO)

• Les colonies mobiles permettent la dissociation du biofilm dès que la dissolution des liaisons de la matrice exocellulaire (EPS) a lieu :

• Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) (Kaplan J.B. et al. 2003)

• Bactérie à l’origine de maladie des gencives (maladie parodontale)

• Synthétise une enzyme la Dispersine B qui hydrolyse l’exopolymère du biofilm

• Libération A.a.


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Bactéries adhérentes sont :

• phénotypiquement différentes de celles en suspensio n

• Ont une expression génétiques différentes

• Production exopolymères a lieu qu’avec information génétique adéquate

V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS)

• « Quorum Sensing » vu avec Vibrio fisheri (bactérie bioluminescente marine)

• Vibrio fischeri capable en milieu liquide de produire de la lumière

• Production de lumière à partir d’une certaine concentration moléculaire

• Molécule dite activatrice de luminescence ou « Auto - Inducteur » (AI)

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V. Régulation de la formation des biofilms


Notion de « Quorum Sensing »

Capacité des bactéries à juger de leur densité ou nombre par l’intermédiaire de molécules appelées auto-inducteurs (AI)

1. Avant d’atteindre ce seuil ou « quorum » le génome bactérien n’est pas totalement exprimé.

1. Ce seuil atteint , les AI activent de nouveaux gènes qui confèrent aux bactéries des phénotypes différents mieux adaptés au milieu.

Illustrations non au concours PACES D35


V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS)

• Le « Quorum Sensing » correspond à :

- Atteinte Seuil de concentration moléculaire par populations

bactériennes

- Seuil induisant la formation d’un biofilm

• Les bactéries utilisent différents types d’auto-inducteurs :

- Gram négatifs :

� petite molécule signal, soluble, diffusible

� Action sur protéine de régulation de la transcription appelée protéine R

Majorité molécules signals sont :

- N-acyl L-homosérine lactones ou homosérine lactone (HSL) D36

V. Régulation de la formation des biofilms (suite)


Quorum sensing - découverte

Calamar Euprymna scolopes Organe lumineux qui le protège des prédateurs

Vibrio fisherii (fluorescent)À 108 / ml cette bactérie est luminescente

Illustrations non au concours PACES D37


V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS) (suite)- Accumulation dans le milieu avec la croissance bactérienne- Fixation sur un récepteur cellulaire de la protéine R qu’il active- Transcription de gènes- Diminution la mobilité , modifications de phénotypes : formation du biofilm

• Chez Gram + : la communication demande 3 composants moléculaires :- un peptide signal- un ligand membranaire (Histidine-Kinase – HK)- une molécule régulatrice de la réponse intracellula ire (RR)

• Les molécules peptidiques signal interagissent avec les HK

• Les HK sont portées par des récepteurs membranaires• La stimulation des récepteurs = transduction du signal transmembranaire

• La transduction signal par molécules régulatrices intracellulaires (RR)D38



V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS) (suite)

• Streptococcus mutans (S.m.) : bactérie donnant processus carieux, on a :

- Peptide signal : CSP (Competence Stimulating Peptide) codé gène ComC

- HK membranaire- Molécule régulatrice intracellulaire (RR)

• Mécanismes de Quorum Sensing chez S.m :- A partir d’un seuil de CSP , on a une stimulation HK membranaire

- HK membranaires stimule ensuite l’expression de molécules RR

- RR enclenche la transcription des gènes pour formation biofilm

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Diverses molécules intervenant dans le Quorum Sensi ng

•Les plus connues des N-acyl-L-homosérine lactones (HSL) sont :




V.2. Notion de « Quorum Quenching » (QQ)

• Quorum Sensing = processus de stimulation du biofilm

Communication inter-cellulaire via gradient mol. signal pour une espèce bact.

• Quorum Quenching = processus de régulation du biofilm

Communication inter-cellulaire via interactions gradients mol. signal entre bact. diff.

• Les interactions moléculaires du « Quorum Quenching » :- limitent la formation du biofilm ou

- assure la co-aggrégation entre espèces différentes

• Diff. enzymes/mol. bloquent ou régulent le communication inter-cellulaire :- Le triclosan induit la production de HSL

- Les furanones halogénées limitent aussi l’activité de HSL- Les lactonases et les acylases dégradent molécules de HSL dans les milieux


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Quorum Quenching (QQ) et auto-inducteurs

Les bactéries deviennent résistantes aux Antibiotiques (ATB) ce qui pose des problèmes sérieux dans le cas d’infections agressives et résistantes = bactéries Multi-Drug Résistantes (MDR)

La recherche d’enzymes ou de molécules inactivant les auto-inducteurs (QQ) est une alternative , d’actualité et prometteuse, parallèlement à la mise au point de nouveaux antibiotiques.

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