ECOLOGIE MICROBIENNE DES BIOFILMS RESPONSABLES DE …pagesperso.univ-brest.fr/~maignien/doc/Trigodet_M2... · 2016. 3. 25. · inoxydables en milieu marin” a été réalisé par

UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE UFR Sciences et Techniques

Année universitaire 2014/2015

Master Sciences Technologies Santé

Mention Biologie-Santé

Spécialité : MICROBIOLOGIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

ECOLOGIE MICROBIENNE DES BIOFILMS

RESPONSABLES DE L’ANOBLISSEMENT DES

ACIERS INOXYDABLES EN MILIEU MARIN

Mémoire présenté le 19 juin 2015

Par Florian TRIGODET

Laboratoire d’accueil :

Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes

Institut de la Corrosion

Supervisé par :

Loïs Maignien

Nicolas Larché

Cette étude a été réalisée en vu de l'obtention du Master spécialité Microbiologie Fondamentale et

Appliquée de l'Université de Bretagne Occidentale, durant l'année universitaire 2014-2015. Ce

rapport, intitulé “Écologie microbienne des biofilms responsables de l’anoblissement des aciers

inoxydables en milieu marin” a été réalisé par Florian Trigodet sous la supervision de Loïs

Maignien et Nicolas Larché, respectivement du Laboratoire de Microbiologie des Environnements

Extrêmes (Rue Dumont d'Urville, 29280 Plouzané) et de l’Institut de la Corrosion (220 Rue Pierre

Rivoalon, 29200 Brest). Le stage a débuté le 9 Janvier, et s'est achevé le 12 Juin 2015.

REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier Loïs Maignien pour les opportunités, les conseils, l’inspiration et le

soutien qu’il m’a offert depuis plus d’un an.

Je remercie autant Nicolas Larché pour son accueil, encadrement, enthousiasme dans mon

intégration au sein de l’Institut de la Corrosion. Merci d’avoir accueilli un microbiologiste parmi

l’équipe de corrosion marine.

Je remercie Mohamed Jebbar, directeur du Laboratoire de Microbiologie des Environnements

Extrêmes de m’avoir accueilli dans le laboratoire et m’avoir permis de réaliser ce stage.

Je remercie aussi Dominique Thierry, directeur de l’Institut de la Corrosion, d’être à l’origine du

projet et de m’avoir permit de rejoindre l’Institut et l’équipe de corrosion marine.

Je remercie les membres du jury pour le temps et l’attention qu’ils porteront à ce rapport.

Parmi les personnes présentes au LM2E, je tiens à remercier Myriam, Alex, Stéphane, Yann,

Morgane, Sam pour leur nombreux et inestimables conseils et discussions.

Je remercie aussi l’ensemble des thésards : Cécile, Coraline, Damien, Gwendoline, Junwei,

Matthieu, Tiphaine pour tous ce qu’on a pu partager. Et aussi Kévin (Batman) pour ses visites

impromptus mais indispensables.

Merci aussi à toute l’équipe de corrosion marine : Erwan, Charles, Etienne, Pascal, Flavien pour

tout ce que vous m’avez appris et pour la très bonne ambiance qui ne vous quitte jamais.

Un petit merci à Vanessa et Audrey de l’institut de la corrosion et Stéphanie du LM2E pour leur

motivation à me faire faire des gâteaux. Vous avez toujours cru en moi.

Un très grand merci à Clarisse avec qui j’ai pu partager presque tous mes doutes, idées et soirées

rédactions. Merci d’être la passagère presqu’à l’heure tous les matins.

Merci à Aurélien et les discussions très instructives malgré le décalage horaire, j’espère bien

continuer à échanger, au moins autant que lors de ces 6 derniers mois.

Merci aux stagiaires M2 avec qui j’ai partagé l’aventure : Ellynn, Lisa, Sébastien, Alexia, Caroline.

Et aux autres stagiaires qui ont séjournés avec nous : Julia, Jules, Sarah, Julien, Amaia, Julie,

Priscilla et Olivier, Linjing, et Ines. Merci pour tous ces moments !

Enfin, je remercie mes parents pour leur soutien inconditionnel et leur aide à la relecture.

TABLE DES MATIERES Introduction ....................................................................................................................... 1

Système microbien et corrosion ............................................................................................... 1

Microbial Influenced Corrosion (MIC). .................................................................................... 2

Anoblissement des aciers inoxydables ................................................................................... 3

Objectifs et méthodologie ........................................................................................................ 6

Matériels et Méthodes ...................................................................................................... 8

Design expérimental ................................................................................................................. 8

Préparation des acier inoxydable et collecte des biofilms .................................................. 8

Filtration et extraction d’ADN .................................................................................................. 10

PCR, purification, dosage de l’ADN et séquençage ............................................................ 11

Bioinformatique ........................................................................................................................ 12

Préparation des données brutes ......................................................................................... 12

Assignation taxonomique ..................................................................................................... 12

Regroupement par similarité de séquence ....................................................................... 13

Analyse de la diversité .......................................................................................................... 13

Résultats et Discussion .................................................................................................... 14

Evolution du biofilm dans le temps ........................................................................................ 14

Singapour ............................................................................................................................... 14

Brest, été 2014 ........................................................................................................................ 17

Evolution du biofilm avec la température ............................................................................. 20

Brest été 2014 ......................................................................................................................... 20

Brest, Fevrier 2015 .................................................................................................................. 23

Reproductibilité du biofilm ...................................................................................................... 24

Brest, Fevrier 2015 .................................................................................................................. 24

Conclusions et prospectives .......................................................................................... 26

Références ....................................................................................................................... 27

TABLE DES FIGURES Figure 1. Suivi temporel du potentiel électrochimique. ....................................................................... 5

Figure 2. Représentation schématique du système d’acquisition du potentiel électrochimique. ......... 9

Figure 3. Schéma du système de filtration. ........................................................................................ 10

Figure 4. Potentiel électrochimique au cours du temps à Singapour. ................................................ 14

Figure 5. Distribution relative des taxonomies et OTUs dans les échantillons de Singapour. .......... 16

Figure 6. Représentation en réseau des échantillons de Singapour. .................................................. 17

Figure 7. Potentiel électrochimique au cours du temps à 30°C, Brest. .............................................. 18

Figure 8. Distribution relative des taxonomies et OTUs dans les échantillons de Brest. .................. 19

Figure 9. Représentation en réseau des échantillons de Brest. .......................................................... 20

Figure 10. Potentiel électrochimique au cours du temps à 30 et 40°C, Brest. ................................... 21

Figure 11. Distribution relative des taxonomies et OTUs pour 30 et 40°C à Brest. .......................... 22

Figure 12. Représentation en réseau des échantillons à 30 et 40°C, Brest. ....................................... 23

Figure 13. Potentiel électrochimique à 30, 33, 36, 38 et 40°C, Brest. ............................................... 24

Figure 14. Potentiel électrochimique de 25 réplicas à température ambiante, Brest. ........................ 25

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1. Composition de différents aciers inoxydables. .................................................................. 4

Tableau 2. Mélange réactionnel de PCR ............................................................................................ 11

Tableau 3. Caractéristiques des différents jeux de donnés d’ADNr 16s. .......................................... 15

LISTE DES ABREVIATIONS BSR : Bactérie Sulfato-Réductrice

CAPARMOR : CAlcul PARallèle Mutualisé pour l’Océanographie et la Recherche

CMIC : Chemical Microbially Influenced Corrosion

Ecorr : Potentiel de Corrosion

EMIC : Electrical Microbially Influenced corrosion

EPC : Embedded Personal Computer (PC embarqué)

EPS : Extracellular Polymeric Substances (Substances Extra-Polymériques)

MIC : Microbiologically Infuenced Corrosion (Corrosion Induite par les Microorganismes)

OTU : Operational Taxonomic Unit (Unité Taxonomique Opérationnel)

TBS : Tris Buffer Saline

1

INTRODUCTION

SYSTEME MICROBIEN ET CORROSION

La corrosion fait intervenir deux demi-réactions électrochimiques impliquant l’oxydation d’un

composé métallique, à l’anode (exemple du Fer (Fe)):

Fe° ! Fe2+ + 2e-

E°’= -0,88V

Ainsi que la réduction d’un accepteur d’électron, à la cathode (exemple de l’hydrogène (H)):

2H+ + 2e- ! H2 E°’= -0,41V

Dans le cas d’un métal, la demi-réaction d’oxydation correspond à la corrosion, qui ne peut avoir

lieu qu’en présence d’une demi-réaction cathodique associée, qui permet la consommation des

électrons. Au final la réaction appelée réaction d’oxydoréduction, peut s’écrire :

Fe° + 2 H+! Fe2+ + H2

Les sites anodiques et cathodiques sont caractérisés par leur potentiel électrochimique et le flux

d’électrons se fera du potentiel le plus négatif vers le potentiel le plus positif. La thermodynamique

permet de prédire la quantité d’électrons et leur sens de réaction, mais c’est la cinétique des deux

demi-réactions et qui définit le flux électron réel entre l’anode et la cathode, entre la réaction

d’oxydation et la réaction de réduction (1).

D’un point de vue microbiologiste, les sources d’énergie microbienne viennent aussi de réaction

d’oxydoréduction et de transfert d’électron : l’oxydation de substrat organique ou inorganique pour

les chimiotrophes, les radiations lumineuses pour les phototrophes ; la réduction de composés

accepteur d’électrons comme l’oxygène pour la respiration aérobie, ou les nitrates, sulfates, fer (III),

ou dioxyde de carbone pour les respirations anaérobies (2). Tout comme pour les réactions

impliquées dans la corrosion, le flux d’électrons résulte d’une différence de potentiels

électrochimiques entre un donneur et un accepteur d’électrons, d’un potentiel le plus négatif vers le

plus positif.

La capacité de conversion en énergie du transfert d’électron chez les microorganismes est la

principale différence entre les deux systèmes. En effet la réaction de corrosion n’est que dissipation

d’énergie. Le premier système est donc dans un état de flux énergétique stable mais dynamique,

tandis que le second est associé à une perte continue d’énergie.

2

MICROBIAL INFLUENCED CORROSION (MIC).

Bien que le sujet principal de cette étude soit focalisé sur les aciers inoxydables il est important de

s’intéresser à la littérature des interactions entre microorganismes et autres matériaux. En effet, il

est essentiel de savoir quelles ont été les approches dans ce domaine : entre les métabolismes

microbiens et la chimie du biofilm.

La mise en place d’un biofilm sur la surface d’un métal débute dès l’immersion de ce dernier en eau

de mer. C’est tout d’abord un dépôt de composés inorganiques et organiques dans les minutes qui

suivent l’immersion qui permet l’attachement des premiers microorganismes. Ensuite, le

développement de ce biofilm conduit à la mise en place d’une matrice constituée d’EPS

(Extracellular Polymeric Substances), produite par les bactéries (3–5). Par cette matrice, le biofilm

est en interaction directe avec la surface du métal et devient par conséquent l’environnement direct

de ce métal (interface). Les microorganismes et la matrice sont alors impliqués dans toutes réactions

de réduction (cathode) complémentaire à l’oxydation du métal.

L’hypothèse d’un lien entre microorganismes et corrosion existe depuis 1910 avec Richard H.

Gaines. (6). En effet, des produits sulfurés de corrosion ont été associés avec une corrosion en

condition d’anaérobie, et l’hypothèse émise à l’époque fut une connexion avec le cycle microbien

du souffre. C’est seulement en 1934 que von Wolzogen Kühr et van der Vlugt (7) ont mis en

évidence l’implication des bactéries sulfato-réductrices (BSR) dans la corrosion des tuyaux de fer

dans les sols riches en sulfates et anaérobie.

En absence d’oxydant et en condition acide, l’accepteur d’électron principal est le proton qui va

former du dihydrogène H2 (8). Cet hydrogène est ensuite consommé par les BSR qui réduiront les

sulfates en sulfure d’hydrogène :

Réaction cathodique de corrosion : 2H+ + 2e- ! H2 Réduction du sulfate : SO42- + 4H2 + H+ ! HS- + 4H2O

Ce phénomène est la base de la « théorie de la dépolarisation cathodique » qui propose une action

des microorganismes sur la corrosion via un déplacement de l’équilibre réactionnel vers la réaction

de réduction (cathode) en consommant l’hydrogène produit lors de la corrosion, mais sans interagir

directement avec le métal (9). C’est une hypothèse qui ne sera pas remise en cause avant les années

70 où l’ajout de lactate comme donneur d’électron à la place de l’hydrogène n’empêchait pas une

dépolarisation cathodique (10). C’est ainsi que l’effet corrosif du sulfure d’hydrogène fut mis en

avant comme principale cause de la corrosion, avec la production de sulfure de fer (8). Enfin depuis

récemment, il a été montré que certaines BSR sont capables d’utiliser le fer élémentaire (Fe0)

3

comme donneur direct d’électron et le taux de corrosion qui en résulte est 71 fois plus élevé (11).

Ce processus, très différent de la production de sulfure d’hydrogène, fais l’objet d’une nouvelle

appellation : « electrical microbially influenced corrosion » (EMIC) à contrario de l’ancienne

« chemical microbially influenced corrosion » (CMIC) pour la production d’H2S pour les BSR.

Bien entendu, d’autres types de microorganismes peuvent être impliqués comme les bactéries sulfo-

oxydantes, ferro-oxydants/réductrices, manganèse oxydants, et toutes celles qui peuvent produire

des composés acides. Ces microorganismes coexistent en milieu naturel et leur association dans un

biofilm permet des interactions synergétiques qui augmentent la réaction de corrosion (12).

Néanmoins, il ne faut pas négliger l’impact des composés organiques constitutifs de la matrice d’un

biofilm : que ce soit des enzymes ou des EPS chélateurs d’ions métalliques. Dans le premier cas, les

bactéries sulfato-réductrices qui consomment le H2 utilisent une hydrogénase. Cette enzyme

catalyse la réaction de réduction des protons en hydrogène, même purifiée et en l’absence de

microorganismes (13). Dans le cas de Desulfovibrio vulgaris, dont le génome a été séquencé en

2004, les hydrogénases périplasmiques sont liées à des cytochromes de type C (14), démontrant

ainsi la possible utilisation du dihydrogène issu de la corrosion pour les BSR par un transfert

d’électrons externes.

La mise en place d’un biofilm passe par la production d’EPS qui regroupent des macromolécules

comme des protéines, polysaccharides, acides nucléiques, ou lipides (3, 5). Les ions métalliques

comme Ca2+, Cu2+, Mg2+ et Fe3+ peuvent être fixés par les EPS avec des groupements anioniques

(carboxyle, phosphate, nitrate, pyruvate) (15). Ces EPS servent alors de navettes et permettent de

nouvelles réactions comme le transfert d’électrons directement depuis le métal, ou l’oxydation de

ces ions en présence d’un accepteur d’électrons comme l’oxygène.

ANOBLISSEMENT DES ACIERS INOXYDABLES

Les aciers inoxydables sont des alliages de fer, carbone et de chrome (minimum de 10,5%), et

parfois de nickel et de molybdène pour améliorer leur résistance à la corrosion (tableau 1). L’acier

inoxydable utilisé dans l’étude est le SuperDuplex 2507.

Un film dit passif se forme spontanément à la surface des aciers inoxydables. La composition de

cette couche est formée d’oxydes et hydroxydes de chrome et de fer. Cette couche est adhérente,

compacte et protective et va créer une barrière entre l’acier et le milieu et va ainsi empêcher la

corrosion uniforme de continuer.

4

L’immersion d’un acier inoxydable en milieu naturel (eau de mer, de rivière) peut conduire à un

phénomène de changement du potentiel électrochimique appelé l’anoblissement et décrit par

Mollica & Trevis en 1976 (16). Le potentiel, aussi appelé Potentiel Libre ou Potentiel de Corrosion

(Ecorr), évolue dans le temps vers des valeurs plus positives jusqu’à atteindre un plateau de

stabilisation, et est entièrement corrélé à la présence de microorganismes formant un biofilm à la

surface du métal (17–20). Avec l'utilisation d'eau de mer stérile, une dérive du potentiel lié à

l’évolution du film passif est observé mais l’anoblissement n’est pas présent (21). Cette

augmentation du potentiel peut être problématique et conduire à de la corrosion localisée sur des

aciers inoxydables (19, 22–24). Pour le moment, aucun mécanisme n’existe pour expliquer l’action

des microorganismes sur ce changement de potentiel. Little et Mansfeld (25) ont divisé les modes

d’actions théoriques en trois catégories : thermodynamique, cinétique, et nature de la réaction de

réduction.

D’après la thermodynamique, une baisse du pH en dessous de 3 ou une augmentation de la pression

partielle en oxygène à la surface du métal peut expliquer une partie du changement de Ecorr.

Cependant, il a été observé que le pH à la surface d’acier inoxydables est très variable : de 2 à 8

(26). C’est un facteur qui peut contribuer à la dépolarisation sans l’expliquer entièrement.

La cinétique de la réaction de réduction d’un oxydant comme l’oxygène est aussi un facteur majeur.

Une augmentation de la vitesse de réduction de l’oxygène peut expliquer une très grande partie de

l’anoblissement (27). Il a aussi été montré qu’une augmentation de la passivité de l’acier inoxydable

par la présence de sidérophores ou chélateurs de fer pourrait avoir le même effet (28, 29).

Tableau 1. Composition de différents aciers inoxydables.

%Cr %Ni Other Ferritique 12 - 30

Martensitique 12 - 30 0.1 - 0.8% C

Austénitique 17 - 19 10 - 14

Austéno- Ferritique (Duplex) 21 - 26 4 - 6

Super-Austénitique 19.5 - 25 16 - 25 3 – 5% Mo, Cu, N, W

Super-Duplex 24 – 27 4.5 - 8 4 – 7% Mo, Cu, N, W - 2507 24 – 26 6 – 8 3 – 5 % Mo, 0.24 – 0.32% N

5

(a)

(b)

Figure 1. Suivi temporel du potentiel électrochimique. (a) Evolution du potentiel au cours du temps. Le changement de potentiel, ou anoblissement observé vers les 2 jours pour une température de 30°C à Brest. L’écart type est présenté par la surface bleu clair. (b) D’après Bardal et al. (21). Evolution du potentiel au cours du temps pour une immersion en eau de mer naturelle (rond plein); eau de mer artificiel autoclavée (carré blanc) et eau de mer naturelle filtrée (losange blanc).

Dupont et al. ainsi que Landoulsi et al. (2008) (30, 31) ont montré qu’en condition stérile, l’ajout de

glucose et glucose oxydase, donc une enzyme qui catalyse la réduction de l’oxygène, suffit à

provoquer l’anoblissement. Mais dans ce cas, il y a aussi une production de peroxyde d’hydrogène

(H2O2) dont les auteurs ont aussi mis en évidence une action sur le potentiel Ecorr. Il s’agit du

troisième mode d’action, un changement dans la nature de la réaction de réduction.

0 1 2 3 4 5 6 7

−0.2

0.0

0.2

0.4

Time [days]

Pote

ntia

l [V/

SCE]

−10

010

2030

Tem

pera

ture

(°C

)Temperature

Ennoblement

6

La dismutation du peroxyde d’hydrogène peut être assurée par des catalases pour une réaction de

type :

2H2O2 ! 2H2O + O2 E°’= 0,26V

Washizu et al. (32) ont montré que l’évolution saisonnière du potentiel Ecorr était liée à la

concentration en peroxyde d’hydrogène dans le biofilm. Sur Brest, Le Bozec (33) a aussi mis en

évidence l’action du peroxyde d’hydrogène sur l’augmentation du potentiel des aciers inoxydables

avec des concentrations de 10-3 M après un mois d’exposition en milieu naturel.

Un autre mécanisme qui change la nature de la réaction de réduction est la présence d’oxyde de

manganèse produit par des bactéries manganèse-oxydantes, en eau douce ou estuarien. Ces

dernières réduisent l’ion Mn2+ en MnO2 avec MnOOH comme intermédiaire. Les deux formes

oxydées se retrouvent sous forme précipitée à la surface du métal, soit en contact électrique direct

avec le métal. Une réaction de réduction de MnO2, avec MnOOH comme intermédiaire, se fait alors

spontanément au contact du métal et provoque un changement du potentiel Ecorr (1, 17, 34, 35).

Un point notable est que l’anoblissement est un phénomène qui n’est plus observé à des

températures approchant et supérieures à 40°C dans les eaux de mer tempérées (36). L’activité et la

structure du biofilms doivent alors être très différentes pour des températures plus élevées.

Ainsi, l’effet des microorganismes sur l’anoblissement des aciers inoxydables présente un grand

intérêt car il peut être responsable de corrosion localisée pour certains d’entre eux, mais surtout

parce que le mécanisme d’action à l’origine de ce phénomène n’est pas encore connu, malgré une

première description en 1976 (16).

OBJECTIFS ET METHODOLOGIE

Les biofilms sont des environnements complexes et structurés par un ensemble de

microorganismes. Cette diversité microbienne va se refléter dans une multitude de métabolismes,

mais aussi par la production de composés intra ou extracellulaires qui pourraient être associés au

phénomène d’anoblissement. C’est donc au sein d’une communauté microbienne incluse dans un

biofilm que l’on se posera les questions suivantes :

• Quels microorganismes sont responsables de l’anoblissement ?

• Par quel(s) mécanisme(s) ?

• Dans quelles conditions ?

7

Pour répondre à ces questions, une approche globale du biofilm est nécessaire : incluant toute la

diversité, sans une focalisation sur un type microbien. Bien qu’une telle approche ne soit pas une

chose nouvelle (37), la singularité de cette étude est l’utilisation de techniques moléculaires

impliquant du séquençage haut-débit pour la compréhension d’une communauté dans son ensemble.

Ce rapport s’inscrit dans la phase exploratoire de l’étude. Ainsi, la question principale est : quels

microorganismes sont présents en fonction du temps et des conditions expérimentales ? Il s’agit de

décrire les biofilms sur aciers inoxydables d’une manière écologique.

Pour ce faire, un protocole d’exposition des aciers inoxydables en eau de mer et de collecte des

biofilms associés a été mis au point. Il s’agit d’un tout nouveau protocole jamais mis en place

auparavant, du moins à Brest. En effet, en avril 2014, l’institut de la corrosion a monté un projet

d'exposition d’aciers inoxydables en conditions naturelles d’eau de mer tropicale à Singapour en

collaboration avec l’Université Nationale de Singapour (NUS) et la Singapore Institute of

Manufacturing Technology (SimTech). Ces derniers ont donc utilisé un protocole similaire pour la

collecte des biofilms et le séquençage et ils ont étudiés le biofilm au cours du temps et donc du

changement de potentiel.

Le projet entre l’Institut de la Corrosion (IC) et le Laboratoire de Microbiologie des

Environnements Extrêmes (LM2E) à, quant à lui, démarré l’été 2014 avec une série de premières

expériences aussi basées sur un suivi au cours du temps du biofilms et de la dépolarisation, ainsi

qu’un comparatif avec une température d’eau de mer pour laquelle l’anoblissement n’est plus

observé.

Les données brutes des deux études de Singapour et Brest, précédent le début du stage, ont été

exploitées durant la période du stage et seront présentées dans ce rapport.

Ainsi, ces premières expériences visent à approfondir la connaissance du développement du biofilm

dans le temps et propose une première approche comparative entre différentes températures qui

permettront de poser des hypothèses de travail nouvelles.

Basés sur ces données brutes, les objectifs du stage sont de proposer de nouvelles expériences

répondant à de nouvelles questions, toujours dans le cadre exploratoire des biofilms sur aciers

inoxydables. C’est ainsi que deux expériences ont été mises en place répondant à la question de la

reproductibilité des biofilms pour la première, et de l’évolution du biofilm avec la température pour

la seconde.

8

MATERIELS ET METHODES

DESIGN EXPERIMENTAL

Le projet avec l’Université Nationale de Singapour (NUS) et la Singapore Institute of

Manufacturing Technology (SimTech) a débouché sur l’étude du biofilm dans le temps, au cours du

changement de potentiel dans une eau de mer naturellement à 30°C. La collecte de biofilms a été

faite après 1 heure, 2 jours et 7 jours d’immersion.

Une première expérience a été réalisée à Brest durant l’été 2014 pour permettre de mettre en place

un protocole nouveau mais standardisé en ce qui concerne l’étude des biofilms sur acier inox et le

suivi du potentiel électrochimique de ces métaux. Il s’agissait d’étudier le biofilm dans le temps et

pendant l’anoblissement pour une eau de mer chauffée à 30°C, et un échantillonnage de biofilm

dans une eau de mer chauffé à 40°C (sans anoblissement). Chaque collecte de biofilms a été faite en

triplicas sur trois plaques d’aciers disposées dans les mêmes conditions à l’eau de mer. Les durées

retenues pour l’étude temporelle à 30°C sont : 1 heure, 2 jours, 7 jours et 14 jours. Une seule durée

a été utilisée pour l’eau de mer chauffée à 40°C : un point comparatif à 7 jours.

Depuis janvier 2015, deux expériences ont été mises en place pour répondre aux questions de (1) la

reproductibilité du biofilm et (2) de son évolution avec la température. 5 bassins d’eau de mer

renouvelés ont été utilisés pour la première expérience avec 5 réplicas par bassins. La collecte de 25

biofilms s’est faite au bout de 14 jours, une fois la montée de potentiel effectuée. En parallèle de

cette collecte des biofilms, 10 litres d’eau de mer par bassin ont été collectés ainsi que 10 litres

directement de la mer.

Pour la seconde expérience, seuls 3 bassins d’eau de mer renouvelées et chauffées étaient

disponibles pour tester 5 températures différentes (30, 33, 36, 38 et 40°C). Les différentes

températures ont donc été testées en deux temps : 30, 33, et 36°C pendant 7 jours ; et 30, 38, 40°C

pendant 7 autres jours. La duplication de l’exposition à 30°C permet d’évaluer les changements de

l’inoculum que représente l’eau de mer étant donné une période d’une semaine de latence entre les

deux expériences.

PREPARATION DES ACIER INOXYDABLE ET COLLECTE DES BIOFILMS

Des coupons originaux de 150mm par 100mm d’acier inoxydable SuperDuplex 2507 (tableau 1) ont

été usinés pour obtenir des coupons de 100mm par 50mm. Les angles ont été polis et un trou de

4mm de diamètre percé dans un coin supérieur de chaque plaque d’acier inox. Ce trou permet de

suspendre les plaques dans l’eau de mer par une tige en titane reliée au système d’acquisition du

9

potentiel électrochimique. Ce dernier est mesuré avec une électrode de référence au chlorure

d’argent placé dans le même bassin que les plaques d’acier inox. L'acquisition du potentiel

électrochimique est effectuée en utilisant un EPC (Embedded Personal Computer) relié à un boîtier

électrique spécialement conçu à partir duquel les tiges de titane et l'électrode de référence sont

également connectées. L'EPC a été programmé pour des mesures toutes les 30min.

Figure 2. Représentation schématique du système d’acquisition du potentiel électrochimique. L’EPC correspond à un system portatif et automatisé programmable. Les mesures de potentiels sont effectuées toute les 30min. Le potentiel électrochimique est mesuré entre une électrode de référence de chlorure d’argent (Ag, AgCl) et les tiges de titanes auxquelles les plaques sont accrochées et donc connecté électriquement. Le boitier électrique permet la connexion des tiges de titanes et l’électrode de référence.

Avant chaque expérience, ces coupons d’acier inox subissent un lavage à l’acide nitrique 20%

pendant 20min dans un bain à ultrason, puis triple rinçage à l’eau désionisée et dernier rinçage à

l’alcool. Cette étape permet d’avoir des surfaces homogènes, et ainsi d’avoir un ensemble de

coupons dans les mêmes conditions physicochimiques. Ils sont ensuite stérilisés par autoclavage en

cycle sec.

Une fois les aciers immergés pour une durée donnée, ils sont extraits de l’eau et le biofilm est tout

de suite collecté dans des conditions stériles dans 100ml d’une solution de Tris Buffer Saline (50

mM Tris-Cl, pH 7.6; 150 mM NaCl) à l’aide d’une spatule stérile. La solution est ensuite conservée

EPC$$

Reference$electrode$

Electrical$box$

10

dans la glace pour le transport. Un coupon d’acier inox stérile sert de contrôle négatif et a été traité

de la même manière que pour la collecte du biofilm.

FILTRATION ET EXTRACTION D’ADN

Le système de filtration mis au point permet de filtrer la solution de Tris Buffer Saline (TBS) sur un

filtre de 25mm de diamètre avec des pores de 0,22µm (Millipore). Le volume total de collecte est

utilisé (100ml) et les filtres sont ensuite conservés à -80°C. Une filtration de solution TBS stérile

permet d’effectuer un contrôle négatif de l’étape de filtration.

Figure 3. Schéma du système de filtration. Seringue luer lock stérile de 60ml (A), adaptateur luer lock femelle (B), support de filtre 25mm (C), Seringue luer lock stérile de 2,5ml (D), bouchon en caoutchouc percé (E), fiole à vide (F).

L’extraction d’ADN a été réalisée à l’aide du MoBio PowerBiofilm DNA extraction kit (Mobio) en

suivant les instructions données par le kit. Seulement la moitié d’un filtre est utilisé, l’autre est

conservé à -80°C. Deux autres contrôles sont effectués avec une extraction contenant la solution

TBS.

11

PCR, PURIFICATION, DOSAGE DE L’ADN ET SEQUENÇAGE

Une PCR a été réalisée en ciblant la région V4-V5 du gène codant pour l’ARNr 16s (gène codant

pour la petite sous unité de l’ARN ribosomique) avec les amorces bactériennes 518F (sens) et 926R

(anti-sens). Une combinaison de 8 barcodes associé avec les amorces sens et 12 indexes avec les

amorces anti-sens sont utilisés pour multiplexer la PCR : ainsi, chaque échantillon est amplifié avec

une combinaison unique de barcodes et d’indexes. Un traitement bioinformatique permettra ensuite

de rapporter chaque séquence à un échantillon. La polymérase utilisée est la Phusion haute-fidélité

(Thermo Scientific). Il s’agit d’une solution contenant l’ADN polymérase, 1.5 mM de tampon

MgCl2 et 400 µM de chaque dNTP. Le mélange réactionnel de la PCR est représenté dans le tableau

2.

Tableau 2. Mélange réactionnel de PCR

Réactifs Concentration initiale Concentration

finale Vol.

unitaire

Eau / / 20

Phusion mix

(Fisher) 2X 1X 25

Amorce sens 10µM 0,3µM 1,5

Amorce anti-sens 10µM 0,3µM 1,5

ADN / / 2

Vol. final / / 50

La réaction a été programmée pour 30 cycles avec 30s à 94°C pour la dénaturation, 45s à 57°C pour

l’hybridation des amorces et 1 min à 72°C pour la polymérisation. En fin de PCR, une dernière

étape d’élongation de 2min à 72°C précède un stockage de ces produits de PCR à 4°C.

L’amplification est confirmée par une migration des produits de PCR dans un gel d’agarose 0,8%.

L’ADN est révélé au bromure d'éthidium (BET). Une plaque magnétique de 96 puits et le kit

AMPure XP (Agencourt) ont été utilisés pour purifier les produits de PCR avec un ratio 5:9

d’échantillons et de solution AMPure XP et selon les recommandations du fabricant. La

quantification, ou dosage de l’ADN a été réalisée avec le kit Quant-iT ™ PicoGreen® ADNdb

(Invitrogen). Le réactif PicoGreen® ADNdb est un marqueur d'acide nucléique fluorescent utilisé

pour quantifier l'ADN double brin. Le dosage a été fait selon les recommandations du fabricant

avec une dilution préalable des produits de PCR au 100ème pour entrer dans la gamme étalon du

dosage.

12

Enfin, tous les produits PCR sont mélangés de manière équimolaire, établi d’après la concentration

la plus faible. La concentration finale est de 9,85 ng/µl d’ADN pour un volume de 308µl, bien au-

dessus des 5 ng/µl et/ou 50 ng minimum pour le séquençage Illumina MiSeq à au Josephine Bay

Paul Center à Woods Hole, Massachusetts, USA. Ce type de séquençage est dit haut-débit et permet

d’obtenir des millions de séquences, représentatives des millions de microorganismes présents dans

un biofilm. Les données seront publiques et accessibles sous le nom de projet LQM_COR_Bv4v5.

En ce qui concerne l’expérience menée à Singapour, la région de l’ADNr 16s qui a été séquencée

est celle de V1-V3, par Mr DNA (USA).

Quant aux expériences menées à Brest lors de l’été 2014, les échantillons ont été directement

envoyés à Fasteris (Suisse) pour un séquençage Illumina MiSeq. Ils ont effectué une PCR

multiplexé au préalable.

BIOINFORMATIQUE

L’ensemble du traitement bioinformatique a été réalisé sur le supercalculateur CAPARMOR

(CAlcul PARallèle Mutualisé pour l’Océanographie et la Recherche) présent à l’Ifremer.

PREPARATION DES DONNEES BRUTES

Des millions de séquences de la région V4-V5 de l’ADNr 16s sont obtenues après le séquençage

Illumina MiSeq. Ces données brutes ont besoins d’être traitées en terme de qualité. Les critères

retenus pour la qualité des séquences sont ceux proposés par Minoche et al. (38) et ont été

appliqués aux séquences avec la suite de script python de Illumina-Utils

(https://github.com/meren/illumina-utils) développé par Murat Eren.

Pour chaque fragment d’ADN, le séquençage a été effectué deux fois : depuis l’amorce sens et

depuis l’amorce anti-sens. Deux séquences d’ADN, avec une région chevauchante, sont donc

obtenues pour un seul fragment. La séquence complète est reconstituée à l’aide d’un autre script

présent dans Illumina-Utils.

ASSIGNATION TAXONOMIQUE

L’ensemble des séquences a été soumis à une assignation taxonomique contre la base de données

Silva NR v119 (137 879 séquences bactériennes, 3 155 archées et 12 273 eucaryotes) (39).

L’assignement est réalisé à l’aide de Qiime-1.9 (40). Il s’agit de comparer chacune des séquences

avec celles présentes dans la base de données. La taxonomie de la séquence la plus proche est

ensuite attribuée, et plusieurs séquences regroupées sous une même assignation. Une matrice

Florian Trigodet

Florian TrigodetWarning: 5ng au total !!

Florian Trigodet

13

d’observation est obtenue, qui contient l’abondance des différentes taxonomies identifiées, pour

chacun des échantillons.

REGROUPEMENT PAR SIMILARITE DE SEQUENCE

L’assignation taxonomique n’est pas toujours le meilleur outil pour comprendre la structure d’un

échantillon, particulièrement pour des environnements très peu étudiés pour lesquels la taxonomie

ne sera pas assez précise. L’étude des jeux de données d’ADNr 16s peut s’affranchir de l’utilisation

d’une base de données de référence en utilisant des algorithmes qui vont regrouper les séquences

par similarité en OTUs (Operational Taxonomic Unit). Dans le cas présent, c’est l’algorithme de

Swarm (41) qui est utilisé au travers de Qiime-1.9. Une assignation taxonomique a aussi été

réalisée, sur les séquences représentatives des OTUs.

La réaction de PCR induit des erreurs comme les séquences chimères. Ce sont des séquences

artificielles qui sont composées d’au moins deux fragments de vraies séquences. Elle sont détectées

et écartées du jeux de données en utilisant Qiime-1.9 et Uchime (42).

Une fois de plus, une matrice est créée avec l’abondance des différents OTUs non-chimériques dans

les différents échantillons.

ANALYSE DE LA DIVERSITE

Les matrices d’abondance des taxonomies, ou des OTUs servent de base à la suite de l’analyse

bioinformatique. Des graphiques en barres sont réalisés avec le langage de programmation R avec

l’extension ggplot2 (43). Il s’agit de montrer les abondances relatives des taxonomies ou OTUs

dans les différents échantillons.

En parallèle, des réseaux ont été réalisés avec le logiciel Gephi (44). Les échantillons et les OTUs

sont représentés sur un plan avec des liens correspondant à l’abondance de ces derniers dans les

premiers. L’algorithme ForceAtlas2 (45) est ensuite utilisé pour la spatialisation de ces données.

14

RESULTATS ET DISCUSSION

Les données de l’expérience de Singapour et celles de l’été 2014 à Brest ont été exploitées pendant

la durée du stage et sont présentées avec les données préliminaires des expériences mises en place

depuis Janvier 2015. En effet, les résultats du séquençage ne sont disponibles que depuis la fin de la

période de stage et leur exploitation n’a pas pu être effectuée pour le moment.

EVOLUTION DU BIOFILM DANS LE TEMPS

SINGAPOUR

L’expérience menée à Singapour a consisté à collecter le biofilm des aciers inoxydables après 1

heure, 2 jours et 7 jours d’immersion. Il s’agit d’un suivi de l’évolution du biofilm dans le temps et

au cours de l’anoblissement: avant le changement de potentiel, pendant celle-ci et une fois le

potentiel stabilisé (figure 4). Un prélèvement d’eau de mer a aussi été réalisé pour comparer

l’inoculum. Huit réplicas ont été utilisés par points dans le temps.

Figure 4. Potentiel électrochimique au cours du temps à Singapour. Les biofilms ont été collectés après 1 heure, 2 et 7 jours d’incubation en eau de mer naturellement à 30°C.

Toutes les manipulations ont été effectuées par l’Université Nationale de Singapour (NUS) et la

Singapore Institute of Manufacturing Technology (SimTech) et les résultats de séquençages ont

aussi été traités en termes de qualité par leur service. C’est donc à partir de données « nettoyées »,

ou filtrées que les analyses bioinformatiques ont été réalisées selon le protocole de bioinformatique

1 heure

2 jours

7 jours

−0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0 2 4 6Jours

Pote

ntie

l [V/

SCE]

15

décrit dans les matériels et méthodes. Le nombre d’échantillons, de séquences ainsi que le nombre

taxonomies différentes assignées et d’OTUs créés sont rassemblés dans le tableau 3.

Une évidente différence avec l’eau de mer (EM) est visible dans la Figure 5 qui représente la

distribution des OTUs d’une part et des Taxons d’autre part, dans les 4 échantillons collectés. Le

réseau (figure 6) confirme une disparité entre les échantillons de biofilm et l’eau de mer. Les niches

écologiques très différentes que représentent un biofilm d’une part, et l’eau de mer d’autre part,

expliquent une sélection des microorganismes adaptés pour une condition où l’autre.

Dans un deuxième temps, il est intéressant de noter la présence d’une communauté complexe dès la

première heure de colonisation. La structure de celle-ci est très identique au bout de deux jours avec

seulement des différences dans les abondances relatives. Il y a aussi une ressemblance avec le

biofilm de sept jours. La communauté microbienne est donc très stable dans le temps à Singapour,

et les premières heures sont déterminantes.

Une troisième observation concernant les différences entre ces échantillons est l’augmentation de la

diversité microbienne dans le temps. Elle peut s’expliquer avec une plus longue exposition à l’eau

de mer, donc une augmentation des rencontres entre les microorganismes du milieu avec le biofilm.

Mais aussi par l’évolution du biofilm lui-même et l’augmentation des interactions entre

microorganismes favorisant une compétition, qui peut être éventuellement responsable de la

diversité observée.

Tableau 3. Caractéristiques des différents jeux de donnés d’ADNr 16s.

Nombre d’échantillons

Nombre de séquences

brutes

Nombre de séquences

filtrées

Nombre de Taxonomies

Nombre d’OTUs

Singapour 32 / 511 773 1 059 319 448

1 heure 8 / 126 496 737 73 138

2 jours 8 / 104 657 650 62 518

7 jours 8 / 118 970 719 66 074

Eau de mer 8 / 161 650 624 92 002

Brest, été 2014 13 6 270 018 3 707 219 1 512 591 128

2 jours 30°C 3 1 437 314 817 414 632 114 270

7 jours 30°C 3 1 031 221 773 822 850 149 695

14 jours 30°C 3 1 646 373 881 078 1037 205 549

7 jours 40°C 3 1 608 410 888 691 516 90 545

Eau de mer 1 546 700 346 214 660 51 943

16

Parmi les microorganismes retrouvés (figure 5), le genre des Salinisphaera est très majoritaire à une

heure, deux jours et est présent à sept jours. Il s’agit d’un genre dont les 6 espèces décrites sont

halophiles modérées (46, 47), mais dont le rôle en milieu marin n’est pas encore défini. Le taxon

majoritaire à sept jours n’est pas identifié au-delà de la classe des Gammaproteobacteria. Une faible

profondeur d’identification est révélateur d’un manque de connaissances dans les bactéries de ce

type d’environnement. Le genre Acidoferrobacter est aussi présent à sept jours. La seule espèce

décrite à ce jour (48) est acidophile, ferro et sulpho-oxydante, et supporte des concentrations

élevées (supérieures ou égale à 200 mM) en ions métaliques (Fe2+, Fe3+, Mn2+, Al3+, Ni2+, Zn2+).

Enfin le genre majoritaire de l’eau de mer est Cadudatus pelagibacter. Un résulat attendu pour une

alphaprotérobacterie marine ubiquiste (49).

(a)

(b)

Bacteria;Proteobacteria;Gammaproteobacteria;Salinisphaerales;Salinisphaeraceae;Salinisphaera

Bacteria;Proteobacteria;Gammaproteobacteria

Bacteria;Proteobacteria;Gammaproteobacteria;Chromatiales;Ectothiorhodospiraceae;Acidiferrobacter

Bacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;SAR11_clade;Surface_1;Candidatus_Pelagibacter Figure 5. Distribution relative des taxonomies et OTUs dans les échantillons de Singapour. Les biofilms ont été collectés après 1 heure, 2 et 7 jours d’incubation en eau de mer. Le dernier échantillon correspond à l’eau de mer. Distribution des taxons (a) et des OTUs (b).

1heure 2jours 7jours EM

OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons1heure 2jours 7jours EM

OTU

Distribution des OTUs parmi les échantillons


OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons 1heure 2jours 7jours EM

OTU



OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons1heure 2jours 7jours EM

OTU



OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons


OTU



OTU



OTU


17

Figure 6. Représentation en réseau des échantillons de Singapour. Les cercles de couleurs correspondent aux différents échantillons : biofilms (1 heure, 2 jours et 7 jours) et eau de mer. Les points représentent les OTUs. Un lien est présent lorsqu’un OTU est présent dans un échantillon, et la taille de ce lien est proportionnelle à l’abondance de l’OTU.

BREST, ETE 2014

Lors de la mise en place de l’expérience à Brest durant l’été 2014, il a été décidé de faire les mêmes

prélèvements que ceux qui ont été faits à Singapour avec un point supplémentaire à 14 jours.

Cependant, la collecte des biofilms après une heure d’immersion n’a donnée aucune trace d’ADN

après extraction, y compris avec une technique de dosage au PicoGreen® (Invitrogen) avec un seuil

de sensibilité de 25 pg/ml d’ADN double brin.

Ainsi, 3 points dans le temps ont été retenus : 2 jours, 7 jours et 14 jours (Fig7). Les conditions

choisies sont une eau de mer chauffée à 30°C, soit la même température que l’eau de mer naturelle

de Singapour. Bien entendu, ce ne sont pas les mêmes microorganismes qui seront présents en

comparaison d’une eau de mer non chauffée (10-11°C), mais dans les deux cas les microorganismes

causant l’anoblissement peuvent être étudiés. De plus, la cinétique de l’anoblissement est plus

rapide à 30°C qu’à 10-11°C. La figure 7 montre que l’anoblissement du potentiel est bien présent

au 2ième jour et stable dans le temps jusqu’au 9ième jour où une chute de ce dernier est observé. Etant

donné que cette diminution concerne toutes les plaques d’acier inoxydable dont le potentiel était

mesuré par une seule électrode de référence. Il est probable que celle-ci soit responsable de la chute

18

de potentiel observé, et qu’aucun changement ne soit intervenu à la surface des coupons

métalliques.

Figure 7. Potentiel électrochimique au cours du temps à 30°C, Brest. L’écart type est représenté par la surface bleu clair. Les biofilms ont été collectés après 2 jours, 7 jours ou 14 jours d’incubation. La chute observée de potentiel au 9ième jour est causée par l’électrode de référence.

Les séquences brutes obtenues de Fasteris (Suisse) ont été traitées en termes de qualité et le nombre

de séquences est reporté dans le tableau 3, ainsi que le nombre d’échantillons, de taxonomies

identifiées et d’OTUs créés. A l’instar de l’expérience de Singapour, trois réplicas ont été effectués

pour chacun des points de prélèvement dans le temps. Aussi, les données de séquençage pour

Singapour et Brest ne sont pas comparables car ce ne sont pas les mêmes régions du gène codant

pour l’ADNr 16s qui ont été séquencées : V4-V5 pour les échantillons de Brest, et V1-V3 pour

Singapour.

Là encore, une différence entre les communautés microbiennes des biofilms et de l’eau de mer est

évidente (figure 8 et 9). Elle s’explique encore par la différence d’environnement que représentent

un biofilm et l’eau de mer.

Bien que les premières heures de colonisation n’aient pas pu être étudiées, une assez grande

différence dans le temps est observable. D’ailleurs, le réseau (figure 9) le montre bien avec une

spatialisation des échantillons selon leur durée d’incubation en eau de mer. La communauté

microbienne est moins constante dans le temps que ce qui pouvait être observé pour les données de

2 jours

7 jours

14 jours

−0.2

0.0

0.2

0.4

0 5 10 15Jours

Pote

ntie

l [V/

SCE]

Evolution du potentiel des aciers inoxydables à 30°C

19

Singapour. Malgré cela l’anoblissement est toujours présent, ce qui suggère que dans tous les cas le

processus qui permet l’élévation du potentiel Ecorr est maintenu.

Les trois assignations taxonomiques principales à 2 jours appartiennent à la famille des

Alteromonadaceae dont certains représentants sont connus pour leur production d’EPS (50).

L’espèce Alteromonas genovensis présent dans cette famille est même associée avec la formation de

biofilms électro-actifs (51). Tout comme pour Singapour, la diversité augmente dans le temps et la

famille des Alteromonadaceae n’est dominante que dans les échantillons de 2 jours. C’est le genre

Oleiphilus qui est majoritaire à 7 jours. La seule espèce du genre décrite (Oleiphilus messinensis),

utilise des composés hydrocarbonés comme seule source de carbone et d’énergie (52). Enfin, la

famille des Rhodobacteraceae est présente dans tous les échantillons y compris l’eau de mer, en

proportions similaires à chaque fois. Cette famille est connue pour sa colonisation des surfaces

inertes, immergées en eau de mer tempérée, et la formation de biofilms (53, 54).

(a)

(b)

Bacteria;Proteobacteria;Gammaproteobacteria;Alteromonadales;Alteromonadaceae;Alteromonas

Bacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;Rhodobacterales;Rhodobacteraceae

Bacteria;Proteobacteria;Gammaproteobacteria;Oceanospirillales;Oleiphilaceae;Oleiphilus

Bacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;SAR11_clade;Surface_2 Figure 8. Distribution relative des taxonomies et OTUs dans les échantillons de Brest. Les biofilms ont été collectés en 3 réplicas après 2, 7 et 14 jours d’incubation en eau de mer chauffée à 30°C. Le dernier échantillon correspond à l’eau de mer. Distribution des taxons (a) et des OTUs (b).

2jours 7jours 14jours EM

OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons2jours 7jours 14jours EM

OTU



OTU



OTU



OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons 2jours 7jours 14jours EM

OTU

Distribution des OTUs parmi les échantillons2jours 7jours 14jours EM

OTU


OTU



OTU


OTU


20

Figure 9. Représentation en réseau des échantillons de Brest. Les cercles de couleurs correspondent aux différents échantillons : biofilms (2, 7 et 14 jours) et eau de mer. Les points représentent les OTUs. Un lien est présent lorsqu’un OTU est présent dans un échantillon, et la taille de ce lien est proportionnelle à l’abondance de l’OTU.

Une étude plus complète avec d’autres points dans le temps, précisément avant l’anoblissement,

permettrait de mieux comprendre le biofilm et son lien avec l’anoblissement. Cependant, beaucoup

de choses ont été mises en évidence au travers de cette première approche, notamment l’évolution

des communautés microbiennes dans le temps et les premières heures de colonisation comme un

élément clé de la diversité du biofilm. La maintenance du potentiel électrochimique dans le temps

malgré des changements dans la population microbienne.

EVOLUTION DU BIOFILM AVEC LA TEMPERATURE

BREST ETE 2014

Le phénomène d’anoblissement du potentiel électrochimique n’est plus observé pour des

températures supérieures à 40°C en eau de mer tempérée (figure 10). Ainsi, en parallèle des

prélèvements de biofilms au cours du temps pour une eau de mer chauffée à 30°C (Brest, été 2014),

un point comparatif dans un bassin d’eau de mer renouvelé et chauffé à 40°C a été réalisé. La

collecte de trois réplicas a été faite après 7 jours d’immersions.

21

(a)

(b)

Figure 10. Potentiel électrochimique au cours du temps à 30 et 40°C, Brest. Température de l’eau de mer dans les bassins : 30°C et 40°C stable dans le temps (a). Moyenne et écart type du potentiel électrochimique à 30°C (bleu) et 40°C (orange) (b). Les biofilms ont été collectés après 7 jours d’incubation pour les deux températures. Le phénomène d’anoblissement (montée du potentiel) n’est plus observé à 40°C.

Les séquences d’ADNr 16s de cet échantillonnage font partis du même jeu de données séquencées

par Fasteris (Suisse) (tableau 3).

Les différences entre les deux communautés microbiennes pour les deux températures sont très

marquées (figure 11 et 12). Une nette baisse de diversité est observée à 40°C, avec la dominance de

deux Taxons et OTUs pour cette température. Ce changement de communauté est donc peut-être

associé à un changement dans le potentiel électrochimique et le phénomène microbien responsable

de l’anoblissement n’est donc plus présent à 40°C. Pour comprendre l’action de la température sur

un ensemble de microorganismes, il faut tout d’abord prendre en compte la sélection que cette

température effectue. En effet, à 30°C ou 40°C, les microorganismes les plus actifs, et donc

compétitifs, sont ceux qui sont adaptés. Une augmentation de température implique un stress pour

les microorganismes dont l’optimum de croissance est plus bas. Ce stress peut induire une baisse de

l’activité de ces bactéries, ou un changement de celui-ci. La compétition s’effectue donc entre des

microorganismes différents, d’où les changements dans les taxons et OTUs dominants.

Le premier taxon dominant à 40°C est une bactérie de la famille des Rhodobacteraceae, avec le

genre Lutimaribacter. L’une des trois espèces caractérisées est capable de dégrader le

cyclohexylacétate, un composé provenant de la dégradation des n-alkyl-cyclo-alcanes qui compose

25

30

35

40

45

Tem

péra

ture

(°C

)

Potentiel des aciers inoxydables à 30°C et 40°C

−0.2

−0.1

0.0

0.1

0.2

0 2 4 6Jours

Pote

ntie

l [V/

SCE]

22

le pétrole (55). Encore une fois, la famille des Rhodobacteraceae est très présente, mais leurs

caractéristiques très variées (53–55) et le manque de précision des bases de données ne permettent

pas une assignation précise au niveau de l’espèce dans ce type d’environnement, ni de comprendre

leur rôle dans ces biofilms. Enfin, le deuxième taxon le plus abondant dans les biofilms à 40°C fait

partie du genre Blastopirellula, de la famille des Planctomycetaceae. Bien qu’il existe que très peu

d’information à propos du rôle écologique des bactéries de ce genre (56, 57), elles représentent une

part importante des biofilms à 40°C et doivent y avoir un rôle important.

(a)

(b)

Bacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;Rhodobacterales;Rhodobacteraceae;Lutimaribacter

Bacteria;Proteobacteria;Alphaproteobacteria;Rhodobacterales;Rhodobacteraceae /

Bacteria;Planctomycetes;Planctomycetacia;Planctomycetales;Planctomycetaceae;Blastopirellula Figure 11. Distribution relative des taxonomies et OTUs pour 30 et 40°C à Brest. Les biofilms ont été collectés en 3 réplicas après 7 jours d’incubation en eau de mer chauffée à 30 et 40°C. Le dernier échantillon correspond à l’eau de mer. Distribution des taxons (a) et des OTUs (b).

7jours 30°C 7jours 40°C EM

OTU

Distribution des Taxons parmi les échantillons7jours 30°C 7jours 40°C EM

OTU



OTU


OTU



OTU


OTU



OTU


23

Figure 12. Représentation en réseau des échantillons à 30 et 40°C, Brest. Les cercles de couleurs correspondent aux différents échantillons : biofilms (2, 7 et 14 jours à 30°C ; 7 jours à 40°C) et eau de mer. Les points représentent les OTUs. Un lien est présent lorsqu’un OTU est présent dans un échantillon, et la taille de ce lien est proportionnelle à l’abondance de l’OTU.

BREST, FEVRIER 2015

Afin d’affiner la compréhension de l’action de la température sur le biofilm, un protocole

expérimental a été mis en place en Février 2014, utilisant 5 températures d’eau de mer différentes

(30, 33, 36, 38, et 40°C). Les biofilms ont été récoltés après une semaine d’incubation et les

résultats bruts de séquençage sont disponibles depuis fin Mai et n’ont pas encore été analysés par

bioinformatique.

La figure 13 montre les potentiels électrochimiques des aciers inoxydables selon les températures.

L’anoblissement est bien présent pour les températures de 30°C à 38°C, mais ne l’est plus à 40°C.

Le changement est très rapide avec la température puisque seul 2 degrés de différence suffisent pour

que le phénomène ne soit plus présent. L’activité microbienne provoquant le changement de

potentiel n’est donc plus présente à partir de 40°C. Le stress qu’impose 2 degrés supplémentaires

provoque donc un changement du comportement du biofilms, dans son activité et / ou sa

composition.

24

Figure 13. Potentiel électrochimique à 30, 33, 36, 38 et 40°C, Brest. Cinq réplicas ont été utilisés pour chaque température. L’écart type est représenté par la surface en vert clair. L’anoblissement est observé pour toutes les températures sauf pour 40°C.

REPRODUCTIBILITE DU BIOFILM

BREST, FEVRIER 2015

Mis en évidence avec l’expérience au cours du temps à Brest durant l’été 2014 (figure 14), une

question peut être posée : la différence entre les biofilms résulte-t-elle d’une évolution temporelle

ou d’une différence dès la colonisation ? Bien que l’expérience ait été réalisée en trois réplicas, la

question est légitime car la colonisation est une étape clé dans le devenir d’un biofilm.

Plus précisément, il s’agit de comprendre la construction du biofilm. Il y a-t-il de l’aléatoire dans la

composition du biofilm sur des aciers inoxydables, ou est-ce un environnement très sélectif ? Pour

répondre à la question, un protocole expérimental a été mis en place en Février 2015 avec

l’utilisation de 5 bassins d’eau de mer renouvelés mais non chauffés, et 5 réplicas par bassin. La

multiplication des réplicas permet d’apprécier le caractère aléatoire et déterministe dans la

formation du biofilm. En effet, il est important de savoir si des biofilms relativement différents

entre eux peuvent provoquer le même phénomène qu’est l’anoblissement. Ou bien s’il existe une

structure commune à tous les biofilms qui se développe sur ce type de surface. Tout comme pour

30°C 33°C 36°C 38°C 40°C

−0.2

0.0

0.2

0 2 4 6 0 2 4 6 0 2 4 6 0 2 4 6 0 2 4 6Jours

Pote

ntie

l [V/

SCE]

25

l’expérience des 5 températures réalisées dans le même temps, l’exploitation des données du

séquençage n’est pas encore disponible.

L’eau de mer n’a pas été chauffée pour cette série d’expérience, et la cinétique de l’anoblissement

n’est pas du tout la même que pour des températures plus élevées comme 30°C. En effet, les

biofilms ont été collectés au bout de 14 jours au lieu de 7, une fois le potentiel stabilisé.

Enfin, des prélèvements d’eau dans chacun des bassins, ainsi que de l’eau directement prélevée en

mer ont aussi été filtrés et envoyés à séquencer. Cela va permettre de connaître la diversité

microbienne de l’eau dans chacun des bassins, qui représente une sous-communauté de l’eau de mer

prélevée directement dans la rade de Brest.

La chute de potentiel observée dans la figure 14 au bout de 10 jours s’explique par l’arrêt de la

pompe principale de l’Ifremer. La mise en route d’une seconde pompe a amené une eau de mer plus

réduite (stagnante dans la tuyauterie de la seconde pompe). Les électrodes de référence plongées

dans l’eau de mer des bassins, et qui servent à la mesure du potentiel, ont donc été biaisées par ce

changement d’eau de mer. Dans tous les cas, toutes les plaques d’aciers inoxydables ont été

confrontées à ce changement bref des conditions de l’eau de mer.

Figure 14. Potentiel électrochimique de 25 réplicas à température ambiante, Brest. Cinq réplicas ont été utilisés dans cinq bassins d’eau de mer renouvelée. L’écart type est représenté par la surface en vert clair. La chute de potentiel après 10 jours est causée par l’arrêt d’une pompe de l’Ifremer et la mise en route d’une seconde avec un apport de dépôts affectant l’électrode de référence.

9

10

11

12

13

Tem

péra

ture

(°C

)

Potentiel d'aciers inoxydables à température ambiante

−0.2

0.0

0.2

0 2 4 6 8 10 12 14Jours

Pote

ntie

l [V/

SCE]

26

CONCLUSIONS ET PROSPECTIVES

Il est important de noter que l’étude de l’anoblissement des aciers inoxydables avec une approche

d’écologie microbienne est quelque chose de complètement nouveau. Il s’agit pour l’instant d’une

phase exploratoire de descriptions des biofilms en fonction du temps, des conditions

environnementales. C’est une étape nécessaire et un prérequis à la mise en place d’hypothèse de

travail pour comprendre le mécanisme microbien sous-jacent.

Ainsi, les conclusions de cette première approche sont que le biofilm évolue bien dans le temps

malgré une maintenance du processus permettant l’anoblissement, que ce soit à Singapour avec une

eau de mer naturellement à 30°C ou à Brest avec une eau de mer chauffée à 30°C. Dans les deux

cas, la composition et structure des biofilms sont très différentes pour une action identique sur le

potentiel des aciers inoxydables. Concernant l’effet de la température et l’absence d’anoblissement

au-delà de 40°C, là encore les communautés microbiennes sont très différentes. Cette différence en

terme d’abondance, et probablement d’activité, peut expliquer l’absence de montée du potentiel

électrochimique.

La métagénomique ou l’étude de l’ensemble des gènes présents dans un échantillon constitue

l’étape suivante pour l’appréhension de l’activité du biofilm et des mécanismes responsables de

l’anoblissement. D’ailleurs, un échantillon d’ADN extrait d’un biofilm collecté après deux jours

d’immersion à 30°C (figure 7) a été envoyé à séquencer pour avoir un premier métagénome.

D’autres métagénomes représentatifs de conditions différentes (dans le temps, avec la température)

permettront d’identifier les différents gènes présents ou absents et éventuellement ceux

responsables du changement de potentiel. L’ensemble des gènes présents permet de comprendre le

potentiel génétique du biofilm, et de poser des hypothèses quant au mécanisme d’action, mais ne

décrit pas l’activité réelle au sein du biofilm. Pour cela il faut s’intéresser à la

métatranscriptomique, ou l’étude des ARNm. Une piste envisagée dans le projet.

Pour le moment, seules les bactéries ont été ciblées lors des PCR pour l’amplification de l’ADNr

16s. L’ADN extrait des mêmes échantillons sera de nouveau amplifié avec des amorces pour

archées, afin d’étudier l’ensemble des microorganismes présents dans ce début de colonisation que

représentent les premiers jours.

Enfin, d’autres conditions environnementales seront testées à l’avenir, notamment la haute pression

hydrostatique représentative des milieux marins profonds. C’est une thématique qui intéresse

fortement les deux laboratoires que sont l’Institut de la Corrosion et le Laboratoire de

Microbiologie des Environnements Extrêmes.

27

REFERENCES

1. Hamilton WA. 2003. Microbially Influenced Corrosion as a Model System for the Study of Metal Microbe Interactions: A Unifying Electron Transfer Hypothesis. Biofouling 19:65–76.

2. Madigan MT, Martinko JM, Bender K, Buckley DP, Stahl DA, Buckley, Brock T. 2014. Brock Biology of Microorganisms. Benjamin-Cummings Publishing Company.

3. Flemming H-C. 2008. Biofilms. eLS. John Wiley & Sons, Ltd.

4. Donlan RM. 2002. Biofilms: Microbial Life on Surfaces. Emerg Infect Dis 8:881–890.

5. Flemming H-C, Neu TR, Wozniak DJ. 2007. The EPS Matrix: The “House of Biofilm Cells.” J Bacteriol 189:7945–7947.

6. Gaines RH. 1910. Bacterial Activity as a Corrosive Influence in the Soil. J Ind Eng Chem 2:128–130.

7. Kühr CAH von W, Vlugt LS van der. 1934. De grafiteering van gietijzer als electro-biochemisch proces in anaerobe gronden.

8. Enning D, Garrelfs J. 2014. Corrosion of Iron by Sulfate-Reducing Bacteria: New Views of an Old Problem. Appl Environ Microbiol 80:1226–1236.

9. Booth GH. 1964. Sulphur Bacteria in Relation to Corrosion. J Appl Bacteriol 27:174–181.

10. Costello J. 1974. Cathodic Depolarization by Sulfate-Reducing Bacteria. South Afr J Sci 70:202–204.

11. Dinh HT, Kuever J, Mußmann M, Hassel AW, Stratmann M, Widdel F. 2004. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature 427:829–832.

12. Valencia-Cantero E, Peña-Cabriales JJ, Martínez-Romero E. 2003. The Corrosion Effects of Sulfate- and Ferric-Reducing Bacterial Consortia on Steel. Geomicrobiol J 20:157–169.

13. Da Silva S, Basséguy R, Bergel A. 2004. Electron transfer between hydrogenase and 316L stainless steel: identification of a hydrogenase-catalyzed cathodic reaction in anaerobic mic. J Electroanal Chem 561:93–102.

14. Heidelberg JF, Seshadri R, Haveman SA, Hemme CL, Paulsen IT, Kolonay JF, Eisen JA, Ward N, Methe B, Brinkac LM, Daugherty SC, Deboy RT, Dodson RJ, Durkin AS, Madupu R, Nelson WC, Sullivan SA, Fouts D, Haft DH, Selengut J, Peterson JD, Davidsen TM, Zafar N, Zhou L, Radune D, Dimitrov G, Hance M, Tran K, Khouri H, Gill J, Utterback TR, Feldblyum TV, Wall JD, Voordouw G, Fraser CM. 2004. The genome sequence of the anaerobic, sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Nat Biotechnol 22:554–559.

15. Beech IB, Sunner J. 2004. Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals. Curr Opin Biotechnol 15:181–186.

16. Mollica A, Trevis A. 1976. Comptes rendus du 4e Congrès International de la Corrosion Marine et des Salissures., p. 351. In . Antibes — Juan-les-Pins, France.

17. Dickinson WH, Caccavo Jr F, Lewandowski Z. 1996. The ennoblement of stainless steel by manganic oxide biofouling. Corros Sci 38:1407–1422.

28

18. Dickinson WH, Lewandowski Z. 1998. Electrochemical concepts and techniques in the study of stainless steel ennoblement. Biodegradation 9:11–21.

19. Hakkarainen TJ. 2003. Microbiologically influenced corrosion of stainless steels – What is required for pitting? Mater Corros 54:503–509.

20. Gümpel P, Arlt N, Telegdi J, Schiller D, Moos O. 2006. Microbiological influence on the electro-chemical potential of stainless steel. Mater Corros 57:715–723.

21. Bardal E, Drugli JM, Gartland PO. 1993. The behaviour of corrosion-resistant steels in seawater: A review. Corros Sci 35:257–267.

22. Landoulsi J, Dagbert C, Richard C, Sabot R, Jeannin M, El Kirat K, Pulvin S. 2009. Enzyme-induced ennoblement of AISI 316L stainless steel: Focus on pitting corrosion behavior. Electrochimica Acta 54:7401–7406.

23. Shi X, Avci R, Geiser M, Lewandowski Z. 2003. Comparative study in chemistry of microbially and electrochemically induced pitting of 316L stainless steel. Corros Sci 45:2577–2595.

24. Geiser M, Avci R, Lewandowski Z. 2002. Microbially initiated pitting on 316L stainless steel. Int Biodeterior Biodegrad 49:235–243.

25. Little BJ, Mansfeld F. 1995. Passivity of stainless steel in natural seawater, p. 42–55. In . The Electrochemical Society.

26. Dexter SC, Chandrasekaran P. 2000. Direct measurement of pH within marine biofilms on passive metals. Biofouling 15:313–325.

27. Dexter SC, Gao GY. 1988. Effect of Seawater Biofilms on Corrosion Potential and Oxygen Reduction of Stainless Steel. Corrosion 44:717–723.

28. Little BJ, Lee JS, Ray RI. 2008. The influence of marine biofilms on corrosion: A concise review. Electrochimica Acta 54:2–7.

29. Eashwar M, Maruthamuthu S, Sathiyanarayanan S, Balakrishnan K. 1995. The ennoblement of stainless alloys by marine biofilms: The neutral pH and passivity enhancement model. Corros Sci 37:1169–1176.

30. Dupont I, Féron D, Novel G. 1998. Effect of glucose oxidase activity on corrosion potential of stainless steels in seawater. Int Biodeterior Biodegrad 41:13–18.

31. Landoulsi J, El Kirat K, Richard C, Sabot R, Jeannin M, Pulvin S. 2008. Glucose oxidase immobilization on stainless steel to mimic the aerobic activities of natural biofilms. Electrochimica Acta 54:133–139.

32. Washizu N, Katada Y, Kodama T. 2004. Role of H2O2 in microbially influenced ennoblement of open circuit potentials for type 316L stainless steel in seawater. Corros Sci 46:1291–1300.

33. Le Bozec N. 2000. Ph.D. thesis. Réaction de réduction de l’oxygène sur les aciers inoxydables en eau de mer naturelle. Influence du biofilm sur les processus de corrosion. Université de Bretagne Occidentale, Brest.

34. Lewandowskiy Z, Dickinsony W, Leey W. 1997. Electrochemical interactions of biofilms with metal surfaces. Water Sci Technol 36:295–302.

29

35. Olesen BH, Avci R, Lewandowski Z. 2000. Manganese dioxide as a potential cathodic reactant in corrosion of stainless steels. Corros Sci 42:211–227.

36. Thierry D, Larche N, Leballeur C, Wijesinghe SL, Zixi T. 2015. Corrosion potential and cathodic reduction efficiency of stainless steel in natural seawater. Mater Corros-Werkst Korros 66:453–458.

37. Messano LVR de, Ignacio BL, Neves MHCB, Coutinho R. 2014. In situ colonization of marine biofilms on UNS S32760 duplex stainless steel coupons in areas with different water qualities: Implications for corrosion potential behavior. J Mar Sci Appl 13:346–353.

38. Minoche AE, Dohm JC, Himmelbauer H. 2011. Evaluation of genomic high-throughput sequencing data generated on Illumina HiSeq and Genome Analyzer systems. Genome Biol 12:112.

39. Yilmaz P, Parfrey LW, Yarza P, Gerken J, Pruesse E, Quast C, Schweer T, Peplies J, Ludwig W, Glöckner FO. 2014. The SILVA and “All-species Living Tree Project (LTP)” taxonomic frameworks. Nucleic Acids Res 42:643-648.

40. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, Fierer N, Peña AG, Goodrich JK, Gordon JI, Huttley GA, Kelley ST, Knights D, Koenig JE, Ley RE, Lozupone CA, McDonald D, Muegge BD, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky JR, Turnbaugh PJ, Walters WA, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods 7:335–336.

41. Mahé F, Rognes T, Quince C, de Vargas C, Dunthorn M. 2014. Swarm: robust and fast clustering method for amplicon-based studies. PeerJ 2:593.

42. Edgar RC, Haas BJ, Clemente JC, Quince C, Knight R. 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27:2194–2200.

43. Wickham H. 2009. ggplot2. Springer New York, New York, NY.

44. Bastian M, Heymann S, Jacomy M. 2009. Gephi: An Open Source Software for Exploring and Manipulating Networks. Third International AAAI Conference on Weblogs and Social Media.

45. Jacomy M, Venturini T, Heymann S, Bastian M. 2014. ForceAtlas2, a continuous graph layout algorithm for handy network visualization designed for the Gephi software. PloS One 9:e98679.

46. Antunes A, Eder W, Fareleira P, Santos H, Huber R. 2003. Salinisphaera shabanensis gen. nov., sp nov., a novel, moderately halophilic bacterium from the brine-seawater interface of the Shaban Deep, Red Sea. Extremophiles 7:29–34.

47. Zhang Y-J, Tang S-K, Shi R, Klenk H-P, Chen C, Yang L-L, Zhou Y, Li W-J. 2012. Salinisphaera halophila sp nov., a moderately halophilic bacterium isolated from brine of a salt well. Int J Syst Evol Microbiol 62:2174–2179.

48. Hallberg KB, Hedrich S, Johnson DB. 2011. Acidiferrobacter thiooxydans, gen. nov. sp. nov.; an acidophilic, thermo-tolerant, facultatively anaerobic iron- and sulfur-oxidizer of the family Ectothiorhodospiraceae. Extremophiles 15:271–279.

49. Rappé MS, Connon SA, Vergin KL, Giovannoni SJ. 2002. Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade. Nature 418:630–633.

30

50. Mata JA, Bejar V, Bressollier P, Tallon R, Urdaci MC, Quesada E, Llamas I. 2008. Characterization of exopolysaccharides produced by three moderately halophilic bacteria belonging to the family Alteromonadaceae. J Appl Microbiol 105:521–528.

51. Vandecandelaere I, Nercessian O, Segaert E, Achouak W, Mollica A, Faimali M, De Vos P, Vandamme P. 2008. Alteromonas genovensis sp nov., isolated from a marine electroactive biofilm and emended description of Alteromonas macleodii Baumann et al 1972 (Approved Lists 1980). Int J Syst Evol Microbiol 58:2589–2596.

52. Golyshin PN, Chernikova TN, Abraham WR, Lunsdorf H, Timmis KN, Yakimov MM. 2002. Oleiphilaceae fam. nov., to include Oleiphilus messinensis gen. nov., sp nov., a novel marine bacterium that obligately utilizes hydrocarbons. Int J Syst Evol Microbiol 52:901–911.

53. Dang H, Li T, Chen M, Huang G. 2008. Cross-Ocean distribution of Rhodobacterales bacteria as primary surface colonizers in temperate coastal marine waters. Appl Environ Microbiol 74:52–60.

54. Elifantz H, Horn G, Ayon M, Cohen Y, Minz D. 2013. Rhodobacteraceae are the key members of the microbial community of the initial biofilm formed in Eastern Mediterranean coastal seawater. FEMS Microbiol Ecol 85:348–357.

55. Iwaki H, Yasukawa N, Fujioka M, Takada K, Hasegawa Y. 2013. Isolation and Characterization of a Marine Cyclohexylacetate-Degrading Bacterium Lutimaribacter litoralis sp nov., and Reclassification of Oceanicola pacificus as Lutimaribacter pacificus comb. nov. Curr Microbiol 66:588–593.

56. Schlesner H, Rensmann C, Tindall BJ, Gade D, Rabus R, Pfeiffer S, Hirsch P. 2004. Taxonomic heterogeneity within the Planctomycetales as derived by DNA–DNA hybridization, description of Rhodopirellula baltica gen. nov., sp. nov., transfer of Pirellula marina to the genus Blastopirellula gen. nov. as Blastopirellula marina comb. nov. and emended description of the genus Pirellula. Int J Syst Evol Microbiol 54:1567–1580.

57. Lee H-W, Roh SW, Shin N-R, Lee J, Whon TW, Jung M-J, Yun J-H, Kim M-S, Hyun D-W, Kim D, Bae J-W. 2013. Blastopirellula cremea sp nov., isolated from a dead ark clam. Int J Syst Evol Microbiol 63:2314–2319.

ABSTRACT: Biofilm formation on stainless steel is responsible for Ennoblement, a shift toward more positive

value of the electrochemical potential. It can trigger microbiologically influenced corrosion (MIC)

of passive alloys such as stainless steel. Since the mechanism through which microorganisms cause

Ennoblement is yet unknown, biofilms formed on stainless steel were investigated using culture

independent technics. High-throughput sequencing using Illumina MiSeq leads to millions of DNA

sequences that were processed using the latest bioinformatic tools and the Ifremer Caparmor super-

calculator. The aim of this approach is to consider the whole diversity within a biofilm that set off

Ennoblement. Biofilms were collected after different times to assess its evolution in time. While

Ennoblement does not occur for a seawater heated to more than 40°C, biofilms were also collected

at temperatures below and at 40°C to assess differences in microbial communities in the presence or

absence of that Ennoblement.

Keywords: Microbiologically Influenced Corrosion (MIC), Ennoblement, Microbial Ecology,

Bioinformatic

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