Développement et évaluation de traitements 13 octobre … · Adebiotech - Colloque biofilms 13 octobre 2011, Romainville 1 Développement et évaluation de traitements biocides

Adebiotech - Colloque biofilms 13 octobre 2011, Romainville

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Développement et évaluation de traitements biocides actifs contre les biofilms

Vincent THOMAS

STERIS 18 route du Panorama, 92260 Fontenay-aux-RosesFRANCE

[email protected]: +33 1 46 54 85 57


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BIOFILMS : Définitions

> Les surfaces solides sont bénéfiques au développement des bactéries lors de leur conservation dans un milieu nutritif dilué (Zobell)

> Groupes de cellules organisées dans une matrice auto-excrétée

> Présence de polysaccharides

Zobell, C. E. 1943. The Effect of Solid Surfaces upon Bacterial Activity. J Bacteriol 46:39-56.

“Films micro-organiques” décrits dans les années 30


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> Ubiquitaires dans la nature> Des biofilms complexes sont retrouvés dans les réseaux

d’eau associés à différents types d’activités (hôpitaux, industries…)

> Seraient impliqués dans 65% (Center for Diseases Control) à80% (Davies, D. 2003. ) des infections chez l’Homme

BIOFILMS: Importance pour l’Homme

Image : “Center for Biofilm Engineering”, Montana State University, P. Dirckx.


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La plupart des tests d’efficacité des produits de désinfection sont réalisés sur des bactéries planctoniques ou des spores déposées et séchées sur surfaces (+/- substances interférentes):

Bactéries sous forme végétative• Enterobacter cloacae DSMZ 6234, • Enterococcus hirae ATCC 10541,• Escherichia coli ATCC 10536,• Mycobacterium avium ATCC 15769,• Mycobacterium terrae ATCC 15755,• Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442,• Salmonella typhimurium ATCC 13311,• Staphylococcus aureus ATCC 6538,

Spores• Bacillus cereus ATCC12826• Bacillus subtilis ATCC6633• Clostridium sporogenes CIP 79.39

Classification de Spaulding, 1968

BIOFILMS : Résistance aux antimicrobiens


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> Faible diffusion des produits> Inactivation des produits par

des enzymes> Présence de bactéries

persistantes> Adaptation

Résistance des biofilms à la désinfection 100 à 1000 fois plus importante que pour les bactéries planctoniques

BIOFILMS : Résistance aux antimicrobiens

BIOFILMS


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Evaluation de traitements biocides actifs contre les biofilms: quels modèles?


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BIOFILMS : quels modèles?

• Mise à part le modèle décrit dans la norme NF EN ISO 15883-4 “Exigences et essais pour les laveurs désinfecteurs destinés à la désinfection chimique des endoscopes thermolabiles”, il n’existe pas de modèle standard pour le test de l’efficacité biocide

• Nombreux dispositifs expérimentaux permettant de développer des biofilms bactériens

Quel modèle choisir ?


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Principe : immerger une surface en présence de bactéries afin de permettre le développement du biofilm et son prélèvement pour analyse


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Coenye, T., and H. J. Nelis. 2010. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 83:89-105.


A choisir en fonction des situations et des applications :


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BIOFILMS : Modèles expérimentaux

Méthodes décrites par l’ American society for testing and material(ASTM, société américaine pour les essais et les mat ériaux)

Biofilm statique> ASTM E2799-11

Biofilm dynamique/vitesse d’écoulement & forces de cisaillement faibles> ASTM E2647-08

Biofilm dynamique/vitesse d’écoulement & forces de cisaillement élevées> ASTM E2562-07> ASTM E2196-07


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1: ASTM E2799-11

http://www.innovotech.ca/

> Développement en microplaque

> Pas de force de cisaillement> Haut débit> Simpicité d’utilisation> Screening de l’activité antibiofilm des molécules à usage thérapeutique et des biocides

Calgary Biofilm Device


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> Ecoulement lent> Faible force de cisaillement> Flux continu> Utilisé essentiellement pour

les applications médicales� Biofilms buccaux-dentaires� Cathéters� Mucoviscidose

> Biofilm formé à proximité de l’interface air-liquide


2: ASTM E2647-08

Goeres, D. M., M. A. Hamilton, N. A. Beck, K. Bucki ngham-Meyer, J. D. Hilyard, L. R. Loetterle, L. A. Lorenz, D. K. Walker, and P. S. St ewart. 2009. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature protocols 4:783-8.


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> Forces de cisaillement importantes

> Flux continu> Conçu initialement pour l’étude

des légionelles> Vitesse de rotation réglable

> Flux turbulent ou laminaire> 24 coupons, possibilité

d’utiliser différents matériaux> Etudes de désinfection


3: ASTM E2562-07

X 8OUT

IN

X 8OUT

IN

Goeres, D. M., L. R. Loetterle, M. A. Hamilton, R. Murga, D. W. Kirby, and R. M. Donlan.2005. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology 151:757-62


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Williams, D. L., K. L. Woodbury, B. S. Haymond, A. E. Parker, and R. D. Bloebaum. 2011. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology 62:1657-63.


polyether ether ketone, polymère utilisé pour la fabrication d’implants


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> Forces de cisaillement importantes> Flux continu> 6 à 18 coupons, matériaux au choix> Conçu initialement pour l’étude des

biofilms formés sur les sanitaires> Force de cisaillement moins

importante que pour le réacteur CDC

> Etude de l’efficacité des biocides, de la dispersion des biofilms, des performances des matériaux anti-fouling


4: ASTM E2196-07

http://www.jysco.com/

Image “Center for Biofilm Engineering”, Montana State University


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“Robbins device” et dérivés

> Séries de coupons insérés dans une chambre dans laquelle circule le liquide contenant les bactéries

> Conçu initialement pour être branché en dérivation sur des canalisations d’eau afin de permettre d’évaluer l’effet des traitements, mais il existe de nombreux modèles de laboratoire

> Les coupons peuvent être récupérés un-à-un pour analyse du biofilm

Coenye, T., and H. J. Nelis. 2010. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 83:89-105.&Taylor Research Inc


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Olson, M. E et al.2010. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 65:2164-71.

Weiss Nielsen, M., C. Sternberg, S. Molin, and B. R egenberg.2011. Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiaeBiofilm in Flow Cells. J Vis Exp:e2383.


Flow cell

> Cellule transparente dans laquelle circule le milieu

> Observation en temps réel d’un biofilm cultivéen mode dynamique

> Analyse en microscopie confocale> Nombreux systèmes disponibles dans le

commerce> Nombreux protocoles publiés et validés> Méthode de référence pour de nombreuses

applications> Technicité & coût matériel élevés> Relativement peu d’échantillons passés

simultanément


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Benoit MR, Conant CG, Ionescu-Zanetti C, Schwartz M & Matin A (2010) New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl Environ Microbiol 76: 4136-4142.


Exemple d’un modèle microfluidique permettant l’étude de biofilms “dynamiques”en microplaques : système “BioFlux” de Fluxion Biosciences

> Possibilité de haut débit si couplé avec microscopie confocale & analyse d’images

> Technicité & coût élevés, peu de publications et de retours d’expérience pour le moment


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Evaluation de l’efficacité des traitements :

> Dénombrements en milieu nutritif : simple mais fastidieux, état « viable mais non cultivable »

> Marquage fluorescent (perméabilité membranaire, activité enzymatique) associé à la microscopie (confocale essentiellement) : très informatif, possibilité de haut débit, mais technicité et coûts associés importants nécessité de faire appel à des plateformes d’expertise


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Développement de traitements biocides actifs contre les biofilms :

quelles cibles ?


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Principal mécanisme de résistance des biofilms à la désinfection : limitation de la diffusion et de la réactivité des molécules biocides

Image : “Center for Biofilm Engineering”, Montana State University, P. Dirckx.

BIOFILMS : Quelles cibles ?


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• Détergents contenant une ou plusieurs enzymes : protéases, cellulases, polysaccharide dépolymérases, alginate lyase, dispersine B, DNAse…

• Molécules induisant la dispersion des biofilms : surfactants (rhamnolipides), acides gras à courtes chaînes (acide cis-2-decenoic), monoxyde d’azote

• Molécules induisant le déclenchement de l’auto-dispersion des biofilms (mécanisme naturel)

• Phages (ou polysaccharide dépolymérases isolées/purifiées à partir de phages)

• Molécules ciblant des voies métaboliques et/ou de signalisation : voie du di-GMP cyclique, voies d’acquisition du fer, inhibiteurs du quorum-sensing (furanonesbromées, ail, brocolis …)

• Molécules biocides d’origine naturelle : carvacrol, thymoquinone, huile d’eucalyptus, huile de théier…

Optimiser la destruction de la matrice du biofilm pour améliorer l’efficacité des traitements :


Adapté de :Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Resistance of bacterial biofilms to disinfectants: a review. Biofouling – In press


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Retour expérience STERIS dans l’industriepharmaceutique

Les combinaisons de traitements donnent de bons résultats :> Détergent alcalin afin d’attaquer et de détruire

en grande partie le biofilm> Détergent acide pour nettoyage

complémentaire si présence de rouging> Biocide oxydant large spectre & sporicide



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Staphylococcus aureus ATCC 6538Live/Dead staining

Biofilm initial

Traitement alcalin n°1



Control 5min/55°C en eau



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Les biofilms … un monde à explorer !

CONCLUSION


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MERCI !

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Vincent THOMAS

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STERIS 18 route du Panorama92260 Fontenay-aux-RosesFRANCE

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