BIOLOGIE DE L’ALLERGIE - AllergoLyonallergo.lyon.inserm.fr/2014_DESC/TAB_DESC_20-02-2014.pdf · 2 INTERET DU TEST D’ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L’EXPLORATION DE L’ALLERGIE

1

9h -10h15: L'exploration de l'hypersensibilité de type I: des extraits allergéniques aux allergènes moléculaires- F.Bienvenu

10h15 -10h45: Présentation d'un dossier clinique. O. Marchand

10h45 -11h00: Discussion – Pause

11h00 -11h30: Le test d'activation des basophiles: intérêt et limites J.Bienvenu

11h30 -12h00: L'exploration de l'hypersensibilité de type IV: application à l'immunité antituberculeuse- L.Garnier

BIOLOGIE DE L’ALLERGIE

2

INTERET DU TEST D’ACTIVATION DES BASOPHILES

DANS L’EXPLORATION DE L’ALLERGIE MEDICAMENTEUSE

---

J. Bienvenu , S. Viel , P. Rouzaire , L. Garnier , et F. Bienvenu

Laboratoire d’ImmunologieCHU Lyon-Sud

Biologie de l’allergieLyon - 20 Février 2014

3

Introduction

Réactions d’hypersensibilité aux médicaments

Hypersensibilité Non-Allergique(HSNA)

Hypersensibilité Allergique(HSA)

LES REACTIONS D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS…

4

Introduction

Réactions d’hypersensibilité aux médicaments

Hypersensibilité Non-Allergique(HSNA)

Hypersensibilité Allergique(HSA)

Hypersensibilité Retardée (HSR)

24 à 72 heureslymphocytes T

Hypersensibilité Immédiate (HSI)

< 1 heureIgE médiée

Introduction LES REACTIONS D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS

5

Biologie de l’hypersensibilité immédiateDosages de médiateurs solubles au moment de l’accident

Dosages d’IgE spécifiques

Techniques d’activation ex vivo de basophiles

Biologie de l’hypersensibilité retardéeTests de transformation lymphocytaire

Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie

Tests de détection de cytokines ( ELISPOT)

Biologie de l’hypersensibilité aux médicaments

6

Biologie de l’hypersensibilité immédiateDosages de médiateurs solubles au moment de l’accident

Dosages d’IgE spécifiques

Techniques d’activation ex vivo de basophiles

Biologie de l’hypersensibilité retardéeTests de transformation lymphocytaire

Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie

Tests de détection de cytokines ( ELISPOT)

7

Physiopathologie de l’hypersensibilité de type I :

But : activer in vitro des basophiles porteurs d’IgE spécifiques de l’allergène

CD4

Cellule Th2

Cellule B

Phase de sensibilisation Phase de déclenchement

Plasmocyte

Basophile ou mastocyte sensibilisé

DEGRANULATION

+ allergène

IgE

IL-4,IL-5

8

PrincipeApplications

Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile

Pourquoi étudier le basophile ?

Activation des mastocytes et des basophiles à l’origine desréactions d’hypersensibilité immédiate

Accessibilité : Les basophiles sont présents dans le sangcirculant contrairement aux mastocytes dont ils présentent lamajorité des propriétés, en particulier pour détecter unesensibilisation

Les basophiles présentent à leur surface des récepteurs deforte affinité pour les IgE (FcεRI). Après «pontage» de cesrécepteurs par l’allergène, les médiateurs libérés déclenchent lesphénomènes allergiques

9



La signalisation…

Wu LC, J Biol Chem, 2011

10



Concrètement pour nous…

Dosage des médiateurs libérésMesure des modifications phénotypiques en cytométrie

Expression constitutive faible de CD203c à la

surface

1. Incubation des basophiles

sensibilisés avec l’allergène ayant

provoqué la réaction

2. Pontage des récepteurs RcεRI par l’allergène (via les IgE spécifiques de celui-ci)

Expression de CD63 à la surface

Relargage de médiateurs

solubles

Surexpression de CD203c à la surface

3. Libération des médiateurs et

modifications du phénotype du

basophile

11

Cytométrie en Flux / Principes

Laser Photodiode

Suspension cellulaire

Liquide de gaine

PMT 2

PMT 1

Filtres dichroïques

Taille (FSC)

Granulosité (SSC)Filtres

12

Anti-IgE :Première stratégie décrite

Peu spécifique (monocytes, éosinophiles, cellules dendritiques)

Variation interet intra-individuelle de la densité des récepteurs des IgE

CD203c et anti-IgE :CD203c présent uniquement sur les basophiles au niveau du sang

CD123 et HLA-DR :CD123+ : IL3-R

HLA-DR- : exclusion des monocytes

CCR3 et faible SSC :CCR3 présent sur les basophiles, éosinophiles, détectable sur les lymphocytes Th1 et Th2

CRTH2 et CD3 :CRTH2+ : récepteur de la prostaglandine D2 exprimé par les Th2, éosinophiles et basophiles

CD3- : exclusion des lymphocytes Th2



Principales stratégies utilisées :

13



CCR3 - faible SSC :

CRTH2

A

Basophiles

Lymphocytes Th2

Eosinophiles

CRTH2 - faible SSC - CD3 :

14

CD203c et CD63 sont les plus utilisés



CD203c CD63

Nom Ectonucleotide Pyrophosphatase Phospho-diesterase (E-NPP3)

Lysozyme Associated Membrane Protein (LAMP-3)

Exprimé par Basophiles, mastocytes PBMCs, plaquettes

Basophiles quiescents Expression constitutive faible

- Non exprimé à la surface cellulaire- Exprimé à la surface des granules intracytoplasmiques

Basophiles activés Sur-expression Expression à la surface cellulaire

Cinétique Rapide (5-15 min) Plus lente (10-25 min)

Effet de l’IL-3 Non induit par l’IL-3 (ou processus lent, >90min) Induction par l’IL-3

Magnitude de variation Données contradictoires dans la littérature

Fonction Inconnue Associée à la libération des médiateurs

15



Ebo DG, Allergy, 2006

NB : d’autres marqueurs « d’activation » décrits : :• CD63 « like » : CD107a , plus associés à la dégranulation• CD203c « like » : CD13, CD164 , plus associés au « priming » et à l’activation

CD203c et CD63 sont les plus utilisés

16

Protocole de routine au laboratoire :

Témoin négatif Témoin positif Tubes testsPBS 20 µLAnti-IgE 20 µLAllergène dilué 20 µLCRTH2-FITC 10 µL 10 µL 10 µLCD203c-PE 10 µL 10 µL 10 µLCD3-PC5 10 µL 10 µL 10 µLSolution d’activation

100 µL 100 µL 100 µL

Sang (EDTA) 100 µL 100 µL 100 µL

Vortexer et incuber 15 minutes à 37°C.

Ajouter 2mL de solution de lyse

Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante

Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver en PBS

Reprendre avec du PBS / 0,1% PFA

Vortexer 5 secondes et analyser au cytomètre



17

Conditions importantes à respecter :



Réalisation de contrôles: • Contrôle négatif: en présence de tampon seul• Contrôle positif : stimulation par anti-IgE ou anti-récepteur FcεRI

N.B. ≈ 10% de non répondeurs ( ↓ Syk)

Réalisation des dilutions de médicaments:• Au moins 3 dilutions en se basant sur le Prick Test et couvrant 3 log• Utiliser des formes injectables• Vérifier l’absence de toxicité pour les basophiles

Critères d’interprétation des résultats:• Expression en % de basophiles activés et/ou index de stimulation• Seuil de positivité: 10% voire 5%, à définir pour chaque médicament• Activation beaucoup plus faible que pour les allergènes protéiques

18


Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire

Très utile lorsque les tests de détection d’IgE spécifiques ne sont pasdisponibles pour les molécules impliquées : fréquent pour lesmédicaments

Médicaments : haptènes : monovalents le plus souventSous-entend donc la liaison à une protéine porteuse pour pouvoir ponter

deux IgE et induire le signal d’activationBeaucoup plus difficile

Allergènes protéiques : excellente sensibilitéà visée diagnostiquepour le suivi de désensibilisationavant une réintroduction ou un TPO

19

Béta-lactamines :

Pour quelles molécules ?

Ebo DG et al., Expert Review, 2011

Introduction Introduction PrincipeApplications

Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…

20



CRTH2

CD

203c

Contrôle négatif Contrôle positif (anti-IgE) Allergène (Clamoxyl®)

β−lactamines : exemple de résultats


21


Curares :




22


La question des AINS :

Controversé, du fait du mécanisme non-IgE médié d’activation dans la plupart des cas :Déviation de la cascade de l’acide arachidonique vers la production de leucotriènesRésultats positifs chez des sujets sains tolérantsDose dépendant




47%

9%

3%2%

1%

5%

3%

30%

Demande de TAB au laboratoire d’Immunologie du CHLS entre 2012 et 2013 (n=1840)

Curares Clamoxyl RocephineAugmentin Pyostacine Produits de ContrastePlatines Autres

curares

Antibiotiques

25


Les quinolones :

Rouzaire P et al., Int Arch Allerg and Clin Immunol, 2012



34 patients

17 patients 17 patients

negative positive

4 patients13 patients

negative positive

13 patients4 patients

negative positive

challenge test

13x

15 patients with non-allergic

hypersensitivity

challenge test

2x2x contraindicated

13x negative

2x negative

13 patients with high probability of

allergic hypersensitivity

1x

1x positive

1 patient with allergic hypersensitivity

3x contraindicated

BAT

skin test skin test

challenge test

26



Mise au point TAB aux médicaments difficile : médicaments = haptènesmonovalents le plus souvent

Très utile lorsque la détermination des IgE spécifiques n’est pas possible

Intérêt pour la prise de décision de réintroduction d’un médicament

Utilité pour le choix d’une molécule qui ne donne pas de réaction croisée

Sensibilité faible,

Spécificité excellente

Nécessité d’augmenter la sensibilité

Nécessité de standardiser le test

En conclusion :

Documents

BIOLOGIE DE L’ALLERGIE - AllergoLyonallergo.lyon.inserm.fr/2014_DESC/TAB_DESC_20-02-2014.pdf · 2 INTERET DU TEST D’ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L’EXPLORATION DE L’ALLERGIE