Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque et …theses.insa-lyon.fr/publication/2008ISAL0123/these.pdf · 2016. 1. 11. · BMP in cultured macrophages alters the redistribution

N° d’ordre 2008-ISAL-0123 Année 2008

THESE

Présentée devant

L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR

Formation doctorale : Biochimie Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé

Par

Jérôme BOUVIER

Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque et cholestérol :

Relations métaboliques et fonctionnelles dans les macrophages

Soutenance prévue le 18 décembre 2008

JURY

RECORD Michel Directeur de recherche Rapporteur VISIOLI Francesco Professeur Rapporteur BUCHET René Professeur Examinateur DIONISI Fabiola Docteur Examinatrice KOBAYASHI Toshihide Directeur de recherche Examinateur LAGARDE Michel Professeur Directeur de thèse VANDENBROUCKE Isabelle Maître de conférences Co-directrice de thèse

INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales – Quadriennal 2007-2010

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*ScSo : Histoire, Géographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie

RESUME

Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide localisé quasi exclusivement

dans les endosomes tardifs. Il est impliqué dans le transport de macromolécules qui transitent

via ce compartiment cellulaire. Nous montrons qu’un anticorps anti-BMP ainsi que

l’accumulation de BMP dans des macrophages en culture altère les flux du cholestérol issu

des lipoprotéines, depuis les endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le réticulum

endoplasmique. Par ailleurs, le BMP incorpore sélectivement l’acide docosahexaénoïque

(DHA, 22:6n-3) dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme. Notre

étude indique qu’un apport élevé de DHA in vitro ou in vivo stimule la formation de l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette molécule présente une grande sensibilité à la peroxydation,

ce qui lui confère un rôle protecteur vis-à-vis de l’oxydation du cholestérol. Nous proposons

que le 22:6/22:6-BMP puisse agir comme un anti-oxydant local au niveau des endosomes

tardifs.

SUMMARY

Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP) is a unique phospholipid preferentially found in late

endosomes of mammalian cells. BMP is involved in the transport of macromolecules that

transit through this compartment. We show that an anti-BMP antibody or the accumulation of

BMP in cultured macrophages alters the redistribution of lipoprotein-derived cholesterol from

late endosomes to plasma membrane and endoplasmic reticulum. Moreover, BMP selectively

incorporates docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) whose cardiovascular benefits have been

reported in Humans. We here report that high supplementation of DHA both in vitro and in

vivo stimulate the formation of the 22:6/22:6-BMP molecular species. This molecule is very

prone to peroxidation, and as such, is able to protect cholesterol against oxidation. We

therefore propose that 22:6/22:6-BMP could act as a potential anti-oxidant in its immediate

vicinity in endosomal membranes.

AVANT PROPOS Le travail présenté dans ce mémoire a fait l’objet de publications scientifiques et a été présenté par communications orales ou affichées lors de congrès scientifiques. Publications scientifiques avec comité de lecture : BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MAKINO A., MICHAUD S., GELOEN A., MURPHY R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Selective decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in macrophages by high supplementation with docosahexaenoic acid. Journal of Lipid Research, 2007, Sous presse. DELTON-VANDENBROUCKE I., BOUVIER J., MAKINO A., BESSON N., PAGEAUX J. F., LAGARDE M. et KOBAYASHI T. Anti-bis(monoacylglycero)phosphate antibody accumulates acetylated LDL-derived cholesterol in cultured macrophages. Journal of Lipid Research, 2007, vol. 48, n°3, pp. 543-552. Publications scientifiques (abstracts) : BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this phsopholipid. Chemistry and Physics of Lipids, 2007, vol. 149 Supplement, p. S57 BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Chemistry and Physics of Lipids, 2005, vol. 136 Supplement, p. S132 Communications orales: BOUVIER J., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. First evidence for the biocellular significance of very high docosahexaenoic acid enrichment in Bis(Monoacylglycero)Phosphate. Séminaire doctorant 2008-2009 de l’IFR62, novembre 2008, Faculté de Médecine RTH Laennec, Lyon. BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MICHAUD S., MURPHY R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Selective decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in macrophages by high supplementation with docosahexaenoic acid. Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique (GERLI) : 4ème Congrès de Lipidomique, octobre 2007, Toulouse.

Communications affichées : HULLIN-MATSUDA F., BOUVIER J., DELTON-VANDENBROUCKE I. MAKINO A., LAGARDE M., KOBAYASHI T. Cholesterol metabolism and transport are affected by the late endosome lipid, bis(monoacylglycero)phosphate. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology : ASMBM Special Symposio, octobre 2008, Canmore, CANADA. BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this phsopholipid. International Conference on the Bioscience of Lipids : the 48th ICBL, septembre 2007, Turku, FINLANDE. BOUVIER J., PAGEAUX J. F., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Modifications of Bis(Monoacylglycero)Phosphate content in RAW macrophages as a new approach to study its cellular role in cholesterol homeostasis. Institut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides (IMBL) : 7ème journée scientifique, septembre 2006, Lyon.

BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique (GERLI) : 3ème Congrès de Lipidomique, mai 2006, Marseille. BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. International Conference on the Bioscience of Lipids : the 46th ICBL, septembre 2005, Ajaccio.

SOMMAIRE

Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)

7

SOMMAIRE LISTE DES FIGURES ...................................................................................... 13

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................. 16

LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................ 17

INTRODUCTION GENERALE ..................................................................... 18 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................ 21

Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol......................... 22 1.1 Le cholestérol ........................................................................................................ 22

1.1.1 Structure du cholestérol .................................................................................. 22 1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol ............................................................. 23 1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol ....................................................... 23

1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol ................................................................ 25 1.2.1 Biosynthèse du cholestérol ............................................................................. 25 1.2.2 Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol ......................................... 27 1.2.3 Cycle d’hydrolyse et d’estérification du cholestérol ...................................... 28 1.2.4 Oxydation du cholestérol - les oxystérols ....................................................... 29

1.2.4.1 Formation des oxystérols ...................................................................... 30 1.2.4.2 Implication des oxystérols au cours de l’athérogenèse ......................... 31 1.2.4.3 Régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol par les

oxystérols : LXR et OSBP .................................................................... 31 1.3 Le transport intracellulaire du cholestérol ........................................................ 33

1.3.1 Les différents modes de transport intracellulaire du cholestérol .................... 33 1.3.2 Généralités sur les lipoprotéines ..................................................................... 35 1.3.3 Endocytose des LDL par les macrophages ..................................................... 36

1.3.3.1 Les LDL et LDL oxydées ..................................................................... 36 1.3.3.2 Endocytose des LDL : les différents récepteurs et mécanismes ........... 37 1.3.3.3 La voie endocytique .............................................................................. 39

1.3.4 Le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs............................. 40 1.3.5 Le transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique ..................... 41 1.3.6 Le transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique .................. 42 1.3.7 Efflux du cholestérol ...................................................................................... 42

1.3.7.1 Efflux médié par les transporteurs ABCA1, ABCG1 et ABCG4 ......... 43 1.3.7.2 Efflux médié par le récepteur SR-BI .................................................... 45

Chapitre 2 : Généralités sur les acides gras et les phospholipides ................................ 47

2.1 Les acides gras ..................................................................................................... 47 2.2 Les phospholipides : classes, sous-classes et composition en acides gras ....... 52 2.3 Métabolisme des phospholipides ........................................................................ 55

2.3.1 Biosynthèse des phospholipides ..................................................................... 55 2.3.2 Remodelage des phospholipides ..................................................................... 58

2.3.2.1 Les phospholipases ............................................................................... 58 2.3.2.2 Voies de dé-acylation/ré-acylation ....................................................... 60 2.3.2.3 Voies de transacylation ......................................................................... 61

SOMMAIRE


8

Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA) ............................................................ 62 3.1 Généralités sur le DHA ........................................................................................ 62

3.1.1 Origine du DHA ............................................................................................. 62 3.1.2 Distribution du DHA ...................................................................................... 62 3.1.3 Incorporation du DHA dans les phospholipides in vitro et in vivo ................ 63

3.2 Rôle des acides gras oméga-3 dans l’incidence des maladies cardiovasculaires ................................................................................................. 64

3.2.1 Les études épidémiologiques .......................................................................... 65 3.2.2 Les études cliniques ........................................................................................ 65 3.2.3 Les mécanismes physiologiques mis en jeu ................................................... 66

3.3 Rôles cellulaires du DHA ..................................................................................... 67 3.3.1 Structure et dynamique moléculaires du DHA dans les membranes .............. 67 3.3.2 Modification des propriétés membranaires .................................................... 68 3.3.3 DHA et microdomaines membranaires .......................................................... 68 3.3.4 Le DHA comme médiateur lipidique et activateur de gènes .......................... 69 3.3.5 Rôle du DHA dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol .................. 70

Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP) .............................................. 71

4.1 Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP........................ 71 4.1.1 Découverte et distribution du BMP ................................................................ 71 4.1.2 Localisation subcellulaire du BMP ................................................................. 71

4.2 Structure du BMP ................................................................................................ 72 4.2.1 Le squelette glycérophosphate ........................................................................ 72 4.2.2 La position des chaînes acyles ........................................................................ 74 4.2.3 La composition en acides gras ........................................................................ 75

4.3 La voie de biosynthèse du BMP .......................................................................... 75 4.4 Métabolisme du BMP .......................................................................................... 79

4.4.1 Modifications pathologiques et induites du BMP .......................................... 79 4.4.2 Dégradation enzymatique et remodelage des acyles gras du BMP ................ 81

4.5 Le rôle cellulaire du BMP ................................................................................... 82

Chapitre 5 : La peroxydation lipidique ........................................................................... 86 5.1 Les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS) ........................................... 86 5.2 Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique ........................... 86

5.2.1 Les différentes phases ..................................................................................... 87 5.2.2 Les anti-oxydants ............................................................................................ 88

5.3 Les produits d’oxydation des AGPI ................................................................... 89 5.3.1 Oxydation enzymatique des AGPI ................................................................. 89 5.3.2 Oxydation non-enzymatique des AGPI .......................................................... 91

5.3.2.1 Conservation de la structure de l’acide gras ......................................... 91 5.3.2.2 Altération de la structure de l’acide gras .............................................. 92

MATERIELS ET METHODES ...................................................................... 94

1. Produits spécifiques .................................................................................................... 95 1.1 Standards lipidiques ............................................................................................ 95 1.2 Molécules radioactives et consommables ........................................................... 95 1.3 Consommables pour la culture cellulaire .......................................................... 96

SOMMAIRE


9

1.4 Produits spécifiques pour la microscopie à fluorescence ................................. 96 1.5 Produits divers ..................................................................................................... 96

2. Matériels Biologiques ................................................................................................. 97

2.1 La lignée cellulaire RAW 264.7 .......................................................................... 97 2.2 La lignée cellulaire BHK 21 ................................................................................ 97 2.3 Les lipoprotéines .................................................................................................. 98

2.3.1 Préparation des lipoprotéines .......................................................................... 98 2.3.2 Acétylation des LDL ...................................................................................... 98 2.3.3 Marquage des LDL avec du [3H]cholestéryl oléate ou du [3H]cholestérol .... 99

2.4 Animaux et traitements ....................................................................................... 99

3. Préparation des liposomes de phosphatidylglycérol (PG) .................................... 100

4. Traitements des cellules et protocoles expérimentaux .......................................... 101 4.1 Incubation en présence de l’anticorps anti-BMP ............................................ 101 4.2 Incubation en présence de U18666A et de F1394 ............................................ 101 4.3 Incubation en présence de liposomes de PG +/- vitamine E........................... 102 4.4 Incubation en présence de DHA non estérifié +/- vitamine E ........................ 102 4.5 Culture des cellules dans des conditions oxydantes ........................................ 102

5. Etude du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol ................. 103

5.1 Mesure de l’accumulation de cholestérol libre et d’esters de cholestérol ..... 103 5.2 Mesure de la captation des LDL et de l’hydrolyse des esters de

cholestérol ........................................................................................................... 103 5.3 Mesure de l’estérification du cholestérol dérivé de la captation des LDL .... 104

5.3.1 Première méthode : utilisation de [3H]FC-LDL ........................................... 104 5.3.2 Deuxième méthode : utilisation du [3H]oléate ............................................. 104

5.4 Mesure de l’efflux médié par les HDL ou la méthyl-β-cyclodextrine ........... 105 5.5 Traitement des cellules avec la cholestérol oxydase ........................................ 105 5.6 Mesure de la sensibilité des cellules avec l’amphotéricine B ......................... 106

6. Oxydation du BMP et du cholestérol en système acellulaire ................................ 106

7. Analyse des lipides .................................................................................................... 107

7.1 Extraction des lipides totaux ............................................................................. 107 7.1.1 Extraction à partir des cellules RAW 264.7 et BHK 21 ............................... 107 7.1.2 Extraction à partir de foie de souris .............................................................. 108

7.2 Séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides par chromatographie sur couche mince (CCM) .................................................... 109

7.2.1 Séparation des classes de lipides .................................................................. 109 7.2.2 Séparation des classes de phospholipides par CCM en 2 dimensions .......... 109 7.2.3 Traitements des plaques après élution .......................................................... 110

7.3 Purification du BMP et des PE par HPLC ...................................................... 111 7.4 Analyse des acides gras par chromatographie gazeuse (GC) ........................ 112

7.4.1 Préparation des échantillons ......................................................................... 112 7.4.2 Appareillage et conditions d’analyse ............................................................ 112 7.4.3 Identification des acides gras et quantification ............................................. 113

7.5 Quantification du cholestérol libre par GC-MS ............................................. 113

SOMMAIRE


10

7.6 Analyse des espèces moléculaires du BMP par ESI-MS ................................ 114

8. Analyse de la radioactivité ....................................................................................... 115 8.1 L’analyseur de radioactivité linéaire (Berthold) ............................................. 115 8.2 Le compteur à scintillation ................................................................................ 115

9. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA)............................................................... 115

10. Dosage de la vitamine E ........................................................................................... 116

11. Fractionnement cellulaire sur les cellules BHK ..................................................... 117

12. Isolement des radeaux lipidiques riches en cholestérol ......................................... 118

13. Microscopie à fluorescence ...................................................................................... 119

13.1 Localisation du BMP par immuno-détection .................................................. 119 13.2 Localisation de l’anticorps anti-BMP accumulé dans les cellules ................. 120 13.3 Localisation du cholestérol cellulaire ............................................................... 120 13.4 Internalisation des DiI-LDL et DiI-acLDL ...................................................... 120 13.5 Observation de la fluorescence ......................................................................... 121

14. Analyses statistiques ................................................................................................. 121

RESULTATS ................................................................................................... 122

PREMIERE PARTIE...................................................................................................... 123

Introduction ..................................................................................................................... 124

1.1 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution intracellulaire du cholestérol ........................................................................................................... 125

1.2 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre induite par la captation des acLDL ................................................................. 127

1.3 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’estérification du cholestérol .................. 129 1.4 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la captation des acLDL ............................ 132 1.5 Effet de l’anticorps anti-BMP sur le cholestérol libre de la membrane

plasmique ........................................................................................................... 133 1.5.1 Mesure de la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B ............................ 133 1.5.2 Mesure de l’oxydabilité du cholestérol membranaire par la cholestérol

oxydase ......................................................................................................... 135 1.5.3 Mesure de l’extraction du cholestérol cellulaire par la cyclodextrine

(MβCD) ........................................................................................................ 136 1.6 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’efflux du cholestérol stimulé par les

HDL .................................................................................................................... 137 1.7 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la répartition du cholestérol entre les

différents domaines membranaires.................................................................. 138

Discussion ......................................................................................................................... 140

SOMMAIRE


11

DEUXIEME PARTIE ..................................................................................................... 144

Introduction ..................................................................................................................... 145

2.1 Caractérisation et dosage du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ........................................................................... 146

2.1.1 Rappel de la méthode ................................................................................... 146 2.1.2 Quantification des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW

cultivés dans des conditions contrôles ......................................................... 149 2.1.3 Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les

macrophages RAW ...................................................................................... 149 2.2 Effets du 18:1/18:1-PG sur la quantité et la composition en acides gras

du BMP dans les macrophages RAW .............................................................. 151 2.2.1 Augmentation spécifique de la quantité de BMP dans les macrophages

RAW après supplémentation par du 18:1/18:1-PG ...................................... 151 2.2.2 Localisation du BMP dans les macrophages RAW après

supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 156 2.2.3 Fractionnement cellulaire réalisé sur les cellules BHK après

supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 157 2.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur le

trafic intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL ...................................... 158 2.3.1 Colocalisation du BMP et des LDL endocytées ........................................... 159 2.3.2 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la

captation des LDL ........................................................................................ 160 2.3.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur

l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL ................................ 161 2.3.4 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la ré-

estérification du cholestérol libre dérivé de la captation des LDL et des acLDL ........................................................................................................... 164

2.3.5 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD ............................. 165

2.3.6 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la quantité cellulaire d’esters de cholestérol après incubation en présence de acLDL ...................................................................................................... 167

Discussion ......................................................................................................................... 168

TROISIEME PARTIE .................................................................................................... 175

Introduction ..................................................................................................................... 176

3.1 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des liposomes de 22:6/22:6-PG ................................................................................ 177

3.2 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des concentrations croissantes de DHA non estérifié ........................................... 184

3.3 Analyse des espèces moléculaires du BMP ...................................................... 190 3.4 Formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP in vitro et in vivo ........... 193

SOMMAIRE


12

3.4.1 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E ................... 194

3.4.2 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP in vivo dans le foie de souris placées sous un régime alimentaire enrichi en DHA ................................... 195

3.5 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA sous l’action d’un stress oxydant ..................................................................................................... 197

3.5.1 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans les macrophages RAW ............................................................................................................. 198

3.5.2 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans un système acellulaire ..................................................................................................... 199

3.6 Le BMP riche en DHA protège partiellement le cholestérol de l’oxydation dans un système acellulaire .......................................................... 200

Discussion ......................................................................................................................... 203

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES................................... 214

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................... 218

ANNEXES ........................................................................................................ 255

ANNEXE 1 ....................................................................................................................... 257

ANNEXE 2 ....................................................................................................................... 270

ANNEXE 3 ....................................................................................................................... 274

ANNEXE 4 ....................................................................................................................... 276

LISTE DES FIGURES


13

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol. ............................................... 22 Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles. ...................... 25 Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol. ........................................................................ 26 Figure 4 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP. .............................. 28 Figure 5 : Formation des oxystérols. ........................................................................................ 30 Figure 6 : Transport intracellulaire du cholestérol. .................................................................. 33 Figure 7 : Les différents modes de transport du cholestérol. ................................................... 34 Figure 8 : Représentation schématique d’une particule de LDL. ............................................. 36 Figure 9 : Endocytose des LDL, représentation schématique de la voie endocytique. ............ 39 Figure 10 : Représentation schématique de l’efflux du cholestérol médié par SR-BI,

ABCA1, ABCG1 et par diffusion passive. ............................................................ 46 Figure 11 : abréviation symbolique et structure du DHA ........................................................ 48 Figure 12 : Structures et représentations de quelques acides gras. .......................................... 50 Figure 13 : Synthèse des acides gras oméga-6 et oméga-3 à partir de l’acide linoléique

(18:2n-6) et l’acide linolénique (18:3n-3) respectivement. ................................... 51 Figure 14 : Structures et représentations des phospholipides. ................................................. 54 Figure 15 : Biosynthèse des principaux phospholipides. ......................................................... 56 Figure 16 : Sites d’action des différentes phospholipases ........................................................ 60 Figure 17 : Cycle de dé-acylation-ré-acylation (cycle de Lands) ............................................ 61 Figure 18 : Représentation en 3 dimensions du 18:1/18:1-BMP ............................................. 74 Figure 19 : Structures du phosphatidylglycérol et du bis(monoacylglycéro)phosphate. ......... 74 Figure 20 : Voie de biosynthèse du BMP à partir du PG exogène. .......................................... 79 Figure 21 : Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique. ................................ 88 Figure 22 : Les principaux médiateurs lipidiques issus de l’oxydation enzymatique

des acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA. .................................................. 90 Figure 23 : Structures du DHA et de 3 docosanoïdes : le 17S-HydroxyDHA,

la protectine D1 et la résolvine D1. ....................................................................... 90 Figure 24 : Les produits d’oxydation non-enzymatique du DHA. ........................................... 93 Figure 25 : Schéma représentatif du gradient discontinu de sucrose (%) utilisé pour isoler

les endosomes tardifs et les endosomes précoces à partir de cellules BHK. ....... 118 Figure 26 : Schéma représentatif du gradient discontinu de saccharose utilisé pour isoler

les radeaux lipidiques. ......................................................................................... 119 Figure 27 : Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre dans les

macrophages THP-1. ........................................................................................... 126 Figure 28 : Colocalisation de l’anticorps anti-BMP et des DiI-acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 127 Figure 29 : Accumulation du cholestérol libre (FC) stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW.. ............................................................................................ 128 Figure 30 : Accumulation des esters de cholestérol (CE) stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 130 Figure 31 : Estérification du cholestérol stimulée par les acLDL. ......................................... 131 Figure 32 : Mesure de la sensibilité des macrophages RAW à l’amphotéricine B. ............... 135 Figure 33 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par la MβCD dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 137 Figure 34 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par les HDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 138

LISTE DES FIGURES


14

Figure 35 : Séparation sur gradient de saccharose des radeaux lipidiques dans des macrophages RAW. ............................................................................................. 140

Figure 36 : Profil de migration des classes de phospholipides en CCM-2D .......................... 147 Figure 37 : Protocole d’extraction et de purification des PC, des PE et du BMP. ................. 148 Figure 38 : Chromatogrammes HPLC d’un standard commercial de 18:1/18:1-BMP et de

BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. ...... 149 Figure 39 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE après

supplémentation des macrophages RAW avec différentes concentrations de 18:1/18:1-PG. ...................................................................................................... 153

Figure 40 : Profil d’élution des lipides marqués avec le [3H]oléate après la première migration en CCM. .............................................................................................. 153

Figure 41 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG. ...................................................................................... 154

Figure 42 : Chromatogrammes en HPLC des PE et du 18:1/18:1-PG ................................... 154 Figure 43 : Localisation subcellulaire du BMP. ..................................................................... 156 Figure 44 : Analyse de la composition en phospholipides des différentes fractions

isolées à partir de fibroblastes BHK. ................................................................... 158 Figure 45 : Colocalisation du BMP et des LDL endocytées dans les macrophages RAW. ... 159 Figure 46 : Captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW.. ................................. 161 Figure 47 : Effet du F1394 sur l’estérification du cholestérol stimulé par les LDL dans

les macrophages RAW. ....................................................................................... 162 Figure 48 : Variation de la quantité de radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC)

et aux esters de cholestérol ([3H]CO) en présence de [3H]CO-LDL. .................. 163 Figure 49 : Taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé de la captation des [3H]CO-LDL dans

les macrophages RAW. ....................................................................................... 163 Figure 50 : Taux de ré-estérification du cholestérol dérivé des [3H]FC-LDL et des

[3H]FC-acLDL dans les macrophages RAW. ..................................................... 165 Figure 51 : Efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD dans les macrophages

RAW. ................................................................................................................... 166 Figure 52 : Accumulation d’esters de cholestérol stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 168 Figure 53 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE en présence de

22:6/22:6-PG.. ..................................................................................................... 178 Figure 54 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de

macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 182

Figure 55 : Variation des quantités de MDA dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ...................................................................................................... 183

Figure 56 : Variation de la proportion de DHA dans les PC, les PE et le BMP des macrophages RAW en présence de DHA non estérifié....................................... 185

Figure 57 : Variation des quantités cellulaires de BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ........................................................................... 189

Figure 58 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E. ................................................. 190

Figure 59 : Spectres de masse en ESI-MS du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 192

LISTE DES FIGURES


15

Figure 60 : Variation de la quantité de BMP et de la proportion de OA et DHA dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E. ........................................................................................................... 195

Figure 61 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. .................................................................................................. 197

Figure 62 : Variation de la quantité de BMP en fonction de son enrichissement en 18:1 ou 22:6 dans les macrophages RAW soumis à un stress oxydant. .............. 199

Figure 63 : Oxydation du 18:1/18:1-BMP et du 22:6/22:6-BMP dans un système acellulaire. ........................................................................................................... 200

Figure 64 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 202

Figure 65 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 203

Figure 66 : Nombre de décès liés aux maladies cardiaques ischémiques par pays en 1990 (pour 100000 habitants) .............................................................................. 258

Figure 67 : Représentation schématique de la paroi artérielle saine. ..................................... 260 Figure 68 : Schéma du métabolisme des lipoprotéines : le transport du cholestérol

dans l’organisme. ................................................................................................. 266 Figure 69 : Représentation schématique de l’évolution et la constitution d’une plaque

d’athérome de type fibreuse. ............................................................................... 269 Figure 70 : Chromatogrammes des acides gras. ..................................................................... 270 Figure 71 : Localisation subcellulaire du BMP dans les macrophages RAW incubés

dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ..................................................................................................... 274

Figure 72 : Marquage des endosomes tardifs par des LDL et acLDL fluorescentes. ............ 275

LISTE DES TABLEAUX


16

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Caractéristiques et composition des différentes classes de lipoprotéines. ............ 35 Tableau 2 : Classification et nomenclature des principaux acides gras. .................................. 49 Tableau 3 : Composition en acides gras des régimes alimentaires standard (A03) et

enrichi en DHA. .................................................................................................. 100 Tableau 4 : Composition en nutriments des régimes alimentaires ......................................... 100 Tableau 5 : Composition en acides gras des esters de cholestérol cellulaires et associés

aux acLDL. .......................................................................................................... 131 Tableau 6 : Captation des [3H]CO-acLDL par les macrophages RAW et distribution

de la radioactivité cellulaire entre le cholestérol libre (FC) et les esters de cholestérol (CE). .................................................................................................. 132

Tableau 7 : Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. ..................................................... 150

Tableau 8 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans les macrophages RAW cultivés en présence de 18:1/18:1-PG. ..................................................... 155

Tableau 9 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................... 179

Tableau 10 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 180

Tableau 11 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 181

Tableau 12 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 186

Tableau 13 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 187

Tableau 14 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 188

Tableau 15 : Variation de la composition des espèces moléculaires du BMP dans les macrophages RAW en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG. .......................... 193

Tableau 16 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA ............................................................................................................. 196

Tableau 17 : Classification des lésions de l’athérosclérose selon Stary................................. 267

LISTE DES ABBREVIATIONS


17

LISTE DES ABREVIATIONS AA : acide arachidonique ACAT : acyl-CoA cholestérol acyl transférase AG : acide gras AGPI : acides gras polyinsaturés ALA : acide alpha-linolénique BMP : Bis(monoacylglycéro)Phosphate CCM (CCM-2D) : chromatographie sur couche mince (en deux dimension) CE : esters de cholestérol CL : cardiolipines CO : cholestéryl-oléate DHA : acide docosahexaénoïque DMA : diméthylacétals EDTA : acide éthylène-diamine-tétra-acétique EE : « early endosomes », endosomes précoces EPA : acide eicosapentaénoïque FC : « free cholesterol », cholestérol libre FCS : « fœtal calf serum », sérum de veau fœtal GC : chromatographie gazeuse HDL : « high density lipoprotein», lipoprotéine de haute densité HPLC : chromatographie liquide haute performance IDL : « intermediate density lipoprotein », lipoprotéine de densité intermédiare LA : acide linoléique LDL : « low density lipoprotein», lipoprotéine de faible densité LE : « late endosomes », endosomes tardifs LPDS : « lipoprotein deficient serum », sérum déficient en lipoprotéines MDA : dialdéhyde malonique MβCD : méthyl-β-cyclodextrine NPC : Niemann-Pick de type C OA : acide oléique PA : acide phosphatidique PBS : « Phosphate-buffered saline », tampon phosphate PC : phosphatidylcholines PE : phosphatidyléthanolamines PG : phosphatidylglycérols PI : les phosphatidylinositols PL/GPL : phospholipides/glycérophospholipides PLA / PLC / PLD : phospholipase A / phospholipase C / phospholipase D PM : membrane plasmique PS : phosphatidylsérines RE : réticulum endoplasmique Rf : référence frontale ROS : espèces réactives dérivées de l’oxygène SM : sphingomyélines TAG/TG : Triacylglycérols VLDL : « very low density lipoprotein », lipoprotéine de très faible densité

INTRODUCTION GENERALE


18


L’athérosclérose est une pathologie majeure en santé publique. Dans le monde, et

plus particulièrement dans les pays industrialisés, les deux premières causes de mortalité sont

des complications de l'athérosclérose : les ischémies cardiaques et les accidents vasculaires

cérébraux. L’athérosclérose est définie par l’Organisation Mondiale de la Santé comme « une

association de remaniements de l’intima des artères de gros et moyen calibre consistant en

une accumulation focale de lipides, de glucides complexes, de sang et de dépôts calcaires

avec remaniement de la média » (Toussaint et al., 2003). Elle se caractérise notamment par

une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol au niveau du plasma sanguin et des cellules

vasculaires. Les monocytes du sang périphérique peuvent traverser l’endothélium et se

différencier en macrophages résidents dans l’espace sous endothélial. Au cours de

l’athérogenèse et en présence de lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées les

macrophages résidents accumulent de grandes quantités de cholestérol et d’esters de

cholestérol. Ceci conduit à la formation de cellules spumeuses qui constituent les premiers

dépôts lipidiques dans l’intima des artères et participent ainsi à l’apparition et au

développement de la plaque d’athérome (Vainio et Ikonen, 2003).

L’accumulation de cholestérol dans les macrophages spumeux résulte d’une

perturbation du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol. Les macrophages

acquièrent du cholestérol principalement par endocytose des LDL. Après avoir été captées, les

LDL suivent la voie endocytique et aboutissent aux endosomes tardifs où les esters de

cholestérol qu’elles contiennent sont hydrolysés. Les endosomes tardifs constituent alors le

point de départ du transport intracellulaire du cholestérol et assurent sa redistribution vers les

autres compartiments cellulaires, principalement vers le réticulum endoplasmique où le

cholestérol est ré-estérifié, et vers la membrane plasmique dans laquelle le cholestérol est

incorporé et à partir de laquelle il peut être exporté hors de la cellules par différents

mécanismes d’efflux stimulés par des accepteurs extracellulaires comme les lipoprotéines de

haute densité (HDL) (Simons et Ikonen, 2000 ; Soccio et Breslow, 2004).

Les endosomes tardifs sont des compartiments multi-vésiculaires et multi-

lamellaires jouant un rôle de stockage et de redistribution de différentes molécules. Les

membranes internes des endosomes tardifs contiennent une forte proportion du phospholipide

bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP), parfois appelé acide lyso-bis-phosphatidique



19

(LBPA). Le BMP est un isomère structural du phosphatidylglycérol (PG) qui constitue par

ailleurs le précurseur principal dans la voie de biosynthèse du BMP (Amidon et al., 1995). Le

BMP représente généralement une faible proportion des phospholipides cellulaires mais est

localisé presque exclusivement dans les endosomes tardifs/lysosomes où il forme des

microdomaines spécialisés (Kobayashi et al., 2001a ; Kobayashi et al., 2002).

Le BMP présente des caractéristiques originales sur le plan structural et

métabolique (Huterer et Wherrett, 1979 ; Joutti et Renkonen, 1979a ). En particulier,

d’anciennes études ont montré que le BMP possède une forte propension à incorporer l’acide

docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3), un acide gras polyinsaturé à longue chaîne de la série n-

3 (Huterer et Wherrett, 1986). Le DHA est un constituant majeur des huiles de poissons dont

le rôle cardio-protecteur a été rapporté par de nombreuses études épidémiologiques et

cliniques (Lee et al., 2008 ; von Schacky et Harris, 2007). A ce titre le DHA a fait l’objet de

nombreux travaux dans notre unité (Delton-Vandenbroucke et al., 2001 ; Lagarde et al.,

2003) et c’est dans ce cadre que nous avons commencé à nous intéresser au BMP notamment

d’un point de vue structural (Luquain et al., 2000 ; Luquain et al., 2001) et métabolique

(Besson et al., 2006).

Les premières données sur la fonction du BMP proviennent de travaux réalisés par

le Dr. Toshihide Kobayashi grâce à un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le

BMP. Des études réalisées sur des fibroblastes et des cellules endothéliales ont montré que

l’anticorps anti-BMP, après internalisation par endocytose, modifie l’organisation des

membranes internes des endosomes tardifs et entraîne une accumulation de cholestérol dans

ces structures (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999). Dans le cadre des maladies

cardiovasculaires qui constituent le contexte physiopathologique de notre projet de recherche

et grâce à une collaboration entreprise avec l’institut RIKEN au Japon, nous nous sommes

également intéressés au rôle cellulaire du BMP dans les macrophages. Dans un premier temps

nous avons cherché à étudier en détail les conséquences sur le métabolisme et le transport

intracellulaire du cholestérol d’une perturbation de la fonction du BMP induite par

l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les endosomes tardifs des macrophages THP-1

et RAW. Les résultats obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Delton-

Vandenbroucke et al., 2007), sont présentés dans la première partie des résultats.

Afin de mieux comprendre le rôle des microdomaines à BMP dans le métabolisme

et le transport intracellulaire du cholestérol dans les macrophages nous avons ensuite cherché



20

à étudier les conséquences d’une augmentation spécifique de la quantité cellulaire de BMP.

Pour cela notre stratégie a consisté à incuber les cellules en présence de liposomes

reconstitués avec du di-oléoyl-phosphoglycérol (18:1/18:1-PG) qui est efficacement converti

en BMP par les macrophages RAW (Amidon et al., 1995). Nous avons montré qu’il était

possible de cette manière d’augmenter la quantité de BMP dans les macrophages RAW d’un

facteur 4, puis nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette accumulation de

BMP sur le transport intracellulaire du cholestérol. Nos résultats, encore préliminaires, sont

présentés dans la deuxième partie des résultats.

L’une des priorités de notre projet de recherche consistait également à déterminer

la signification biologique de l’enrichissement du BMP en DHA. En nous appuyant sur

l’approche développée avec le précurseur 18:1/18:1-PG nous avons supplémenté les

macrophages RAW avec du di-docosahexaénoyl-phosphoglycérol (22:6/22:6-PG). Nous

avons ainsi pu mettre en évidence la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP qui

présente une très grande sensibilité à la peroxydation lipidique. Nos résultats indiquent

également que dans un modèle membranaire in vitro, l’espèce 22:6/22:6-BMP qui constitue

une cible privilégiée des espèces radicalaires dérivées de l’oxygène, protège partiellement le

cholestérol de l’oxydation. Ainsi pour la première fois nous avons mis en évidence une

conséquence fonctionnelle de l’avidité du BMP pour le DHA et nous proposons que l’espèce

22:6/22:6-BMP pourrait jouer un rôle anti-oxydant spécifiquement dans les endosomes

tardifs, notamment vis-à-vis du cholestérol dérivé des LDL. Le BMP enrichi en DHA pourrait

ainsi prévenir la formation intracellulaire d’oxystérols qui participent à l’évolution des

macrophages en cellules spumeuses (Brown et Jessup, 1999 ; Clare et al., 1995). Les résultats

obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Bouvier et al., 2008), sont présentés

dans la troisième partie des résultats.

La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques

comportant cinq chapitres. Le premier concerne le transport intracellulaire du cholestérol puis,

après un chapitre de généralités sur les différentes classes de lipides, nous présentons plus en

détail les données de la littérature sur le BMP et le DHA. Enfin le dernier chapitre traite de la

peroxydation lipidique. Nous présentons ensuite une partie de Matériels et Méthodes puis

l’ensemble des résultats expérimentaux obtenus au cours de cette étude. Ce mémoire se

termine par une conclusion générale et par l’exposé des perspectives qui découlent de notre

étude.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES


21

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol


22

Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol

1.1 Le cholestérol

1.1.1 Structure du cholestérol

Le cholestérol fut identifié pour la première fois, sous sa forme solide, dans des

calculs biliaires par François Poulletier de la Salle en 1769. Toutefois sa découverte est

généralement attribuée au chimiste français Eugène Chevreul en 1815 qui lui donna le nom de

cholestérine. Sa formule empirique (C27H46O) ne fut établie qu’en 1888 par Reinitzer. Enfin

sa structure correcte, formulée par Wieland et Dane, fut rapportée en 1932 (Vance et Van den

Bosch, 2000).

Le cholestérol est un lipide de la famille des stéroïdes. Sa structure est caractérisée

par quatre cycles notés A, B, C et D et une chaîne hydrocarbonée branchée. Les atomes de

carbone sont numérotés de 1 à 27. Le cholestérol possède également une double liaison entre

les carbones 5 et 6 (cycle B), et un groupement hydroxyle (alcool secondaire) sur le carbone 3

en position β (au dessus du plan du cycle A) (Figure 1).

Au niveau cellulaire le cholestérol existe de manière stable principalement sous

deux formes : une forme libre et une forme estérifiée où la fonction hydroxyle est estérifiée

par un acide gras (Figure 1). Le cholestérol libre est un constituant majeur des membranes

cellulaires et intervient dans différentes voies de signalisation, alors que le cholestérol

estérifié est davantage une forme de stockage pour la cellule.

cholestérollinoléoyl-cholestérol (18:2n-6-cholestérol)

Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol.



23

1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol

Les différents compartiments des cellules de mammifères présentent des

compositions lipidiques et protéiques distinctes. Ceci est particulièrement vrai pour le

cholestérol. En effet sa concentration est très faible dans le réticulum endoplasmique (RE)

mais augmente progressivement dans l’appareil de Golgi, du cis- au trans-Golgi, pour

atteindre son niveau le plus élevé dans la membrane plasmique. Ainsi, la membrane

plasmique contient environ 70% du cholestérol cellulaire total (Maxfield et Wustner, 2002).

La concentration en cholestérol varie également beaucoup entre les différents compartiments

de la voie endocytique (Kobayashi et al., 1998a). Les endosomes de recyclage et les vésicules

internes des endosomes précoces apparaissent relativement riches en cholestérol

contrairement aux endosomes tardifs/lysosomes (Mobius et al., 2003).

De plus, les feuillets internes et externes des membranes biologiques présentent

aussi des compositions lipidiques différentes. Toutefois, concernant le cholestérol, sa

répartition entre les deux feuillets est encore mal connue. Plusieurs études ont pour le moment

fourni des résultats divergents (Maxfield et Wustner, 2002).

Enfin, les membranes biologiques présentent une grande hétérogénéité latérale.

Contrairement au modèle de la mosaïque fluide proposée par Singer et Nicholson en 1972, il

se forme dans les membranes biologiques des microdomaines membranaires appelés

« radeaux lipidiques » ou « rafts » qui se distinguent du reste de la membrane par leur

composition et leurs propriétés.

1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol

Notre vision de la membrane plasmique des cellules a beaucoup évoluée ces vingt

dernières années. D’abord considérée comme un assemblage homogène de lipides et de

protéines en libre diffusion, la membrane plasmique est aujourd’hui décrite comme une

mosaïque de microdomaines qui présentent différentes compositions en lipides et en protéines

(Maxfield, 2002 ; Mishra et Joshi, 2007 ; Schmitz et Grandl, 2008 ). Certains microdomaines

ont des structures très particulières et spécifiques comme les puits recouverts de clathrine ou

les cavéoles en forme d’invagination (Figure 2) (Conner et Schmid, 2003). Les radeaux



24

lipidiques constituent un autre type de microdomaines dont l’assemblage met en jeu de fortes

interactions lipides-lipides et lipides-protéines. En effet ils sont riches en cholestérol,

sphingolipides, glycosphingolipides et en phospholipides contenant des acyles gras saturés à

longues chaînes. Cet environnement lipidique spécifique génère une région localement plus

ordonnée et plus compacte (phase liquide ordonnée ou Lo) que les membranes environnantes

(phase liquide désordonnée ou Ld), et attire certaines protéines notamment celles possédant

une ancre GPI ou des groupements palmitoyles comme les Src-kinases (Figure 2). Les

radeaux lipidiques représentent cependant un groupe hétérogènes de microdomaines (Pike,

2004). De plus, leur composition peut être modifiée dans certaines conditions physiologiques

(de Mello Coelho et al., 2004) ou après la liaison de ligands sur leurs récepteurs (Magee et

al., 2002). La caractérisation des radeaux lipidiques a très souvent été basée sur leur résistance

à la solubilisation dans les détergents comme le triton (Babiychuk et Draeger, 2006). Bien que

cette technique biochimique soit controversée (Lichtenberg et al., 2005 ; Ostrom et Liu,

2007), l’analyse des membranes résistantes aux détergents (DRM) reste un outil très utile en

particulier pour des études comparatives. La membrane plasmique n’est pas la seule à être

constituée de microdomaines, les membranes internes notamment celles du réticulum

endoplasmique (Browman et al., 2006), de l’appareil de Golgi (Eberle et al., 2002) et des

endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo et al., 2007 ) sont constituées de

microdomaines spécifiques.

Les microdomaines membranaires sont impliqués dans certaines voies de

signalisation (Magee et al., 2002), et mécanismes d’endocytose (Parton et Richards, 2003)

ainsi que dans le transport intracellulaire du cholestérol. En effet la plupart des protéines

jouant un rôle de transporteurs du cholestérol sont associées à des microdomaines (Orlowski

et al., 2007). Les cavéoles en particulier jouent un rôle important dans le transport

intracellulaire du cholestérol (Ikonen et al., 2004), notamment dans l’efflux du cholestérol

aux HDL (Chao et al., 2003) et dans le transport du cholestérol à partir du réticulum

endoplasmique vers la membrane plasmique (Smart et al., 1996). De plus les cavéoles sont

associés à une protéine membranaire, la cavéoline, qui possède des sites de liaison au

cholestérol. D’autres protéines impliquées dans le transport du cholestérol sont associées aux

microdomaines riches en cholestérol. Il s’agit entre autres du récepteur « scavenger » SR-BI,

impliqué dans la captation des LDL oxydées par les macrophages (Rhainds et al., 2004), et du

transporteur ABCG1 impliqué dans l’efflux du cholestérol aux HDL (Vaughan et Oram,

2006).



25

1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol

1.2.1 Biosynthèse du cholestérol

Les cellules de mammifères possèdent toutes les enzymes nécessaires à la

synthèse de novo du cholestérol. Le foie et l’intestin sont les lieux principaux de la synthèse

du cholestérol mais les cellules périphériques, notamment les macrophages, synthétisent

également une partie de leur cholestérol.

Le cholestérol est synthétisé dans le réticulum endoplasmique à partir d’acétate et

via une série d’environ 30 réactions enzymatiques successives (Figure 3). Une étape

importante en raison de son ciblage pharmacologique par les statines fait intervenir l’enzyme

hydroxyméthylglutaryl CoA réductase (HMG-CoA réductase) qui génère du mévalonate.

L’HMG-CoA réductase est l’enzyme limitante dans la voie de biosynthèse du cholestérol. A

partir du mévalonate la cellule synthétise de l’isopentényl pyrophosphate puis du farnésyl

pyrophosphate et enfin du squalène. La première molécule de stérol produite dans cette voie

Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles. Modifié à partir de Chang et al. (2006)

protéine àancre GPI

protéine palmitoylée

radeau lipidique cavéole

cavéoline

cholestérol

SM PC PS phospholipide insaturé

GSL PE PI phospholipide saturé

feuillet externe

feuillet interne



26

de biosynthèse est le lanostérol, formé à partir du squalène par l’enzyme squalène cyclase. Le

lanostérol est ensuite converti en cholestérol lors d’un processus complexe composé de 19

étapes au cours desquelles les doubles liaisons sont réduites, leurs positions modifiées et les

groupements méthyles supprimés (Berg et al., 2002).

Acétate

Mévalonate

Farnésyl pyrophosphate

Squalène

Lanostérol

Cholestérol

Isopentényl pyrophosphate

Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol.



27

1.2.2 Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol

Le facteur de transcription SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein)

est l’élément principal du mécanisme homéostatique par lequel le cholestérol cellulaire exerce

un rétrocontrôle négatif sur sa propre synthèse (Bengoechea-Alonso et Ericsson, 2007 ;

Eberle et al., 2004 ; Yang et al., 2002). La protéine SREBP est présente sous forme inactive

dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), associée aux protéines SCAP (SREBP

Cleavage Activating Protein) et Insig. La protéine SCAP possède un domaine particulier

appelé « Sterol Sensing Domain » (SSD) lui permettant d’évaluer la quantité de cholestérol

présente dans le RE. Lorsque celle-ci est importante, le complexe SREBP-SCAP reste associé

à Insig dans le RE. Mais dès que la quantité de cholestérol diminue, cela induit une

modification conformationnelle du SSD de SCAP permettant au complexe SREBP-SCAP de

se dissocier de Insig et de rejoindre le Golgi. Deux protéases (S1P et S2P) présentes dans le

Golgi clivent SREBP et libèrent sa partie active N-terminale qui migre vers le noyau de la

cellule. Le facteur de transcription SREBP se lie alors à une séquence d’ADN spécifique, le

SRE (Sterol Regulatory Element), et active la transcription de gènes cibles. Parmi ces gènes

cible se trouvent ceux codant l’enzyme HMG-CoA réductase et le récepteur au LDL. Ainsi,

lorsque la quantité de cholestérol diminue, SREBP active la synthèse de ces deux protéines

qui vont respectivement accélérer la synthèse de cholestérol et augmenter la quantité de

cholestérol capté par endocytose des LDL (Figure 4).

La synthèse du cholestérol est également régulée de manière post-

transcriptionnelle. En effet il a été montré que lorsque la quantité de cholestérol dans le RE

diminue, la protéine Insig est rapidement ubiquitinée et dégradée dans le protéasome. De plus,

l’enzyme HMG-CoA réductase possède elle aussi un SSD capable de fixer le lanostérol, un

intermédiaire dans la voie de biosynthèse du cholestérol. Ainsi, dans des cellules appauvries

en cholestérol, la dégradation de l’HMG-CoA réductase est très lente. En revanche, lorsque la

quantité de cholestérol dans le RE est trop élevée, cela induit l’association de l’HMG-CoA

réductase avec la protéine Insig et active sa translocation vers le protéasome pour être

dégradée (Goldstein et al., 2006 ; Sever et al., 2003).



28

1.2.3 Cycle d’hydrolyse et d’estérification du cholestérol

Dans la cellule, la fonction –OH du cholestérol peut être estérifiée par un acide

gras (principalement l’acide oléique) grâce à l’action d’une enzyme appelée acyl-

CoA:cholestérol acyltransférase (ACAT). Chez les macrophages, cette enzyme est localisée

Golgi

Noyau

gènes cibles

Diminution de la quantité de

cholestérol

RE RE

RE

Stabilisation du complexe Insig-SCAP-SREBP

Dissociation de SCAP-SREBP et de InsigTranslocation de SCAP-SREBP vers le Golgi

Activation protéolytique de SREBPMigration de la partie activée de SREBP vers le noyau

Dégradation de HMG-CoA réductaseDiminution de la synthèse de cholestérol

Dégradation de InsigDéstabilisation de Insig-SCAP-SREBP

Grande quantité de cholestérol

Activation de gènes cibles(HMG-CoA réductase, LDL-R)

Figure 4 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP. (Bengoechea-Alonso et Ericsson, 2007).



29

dans le réticulum endoplasmique (Sakashita et al., 2000) où elle catalyse l’estérification du

cholestérol provenant de la membrane plasmique, de la biosynthèse de novo, ou de

l’endocytose des lipoprotéines de faible densité (LDL). L’activité de l’ACAT est régulée de

manière allostérique par le cholestérol, c’est-à-dire que son activité augmente en présence de

grandes quantités de cholestérol libre (Chang et al., 1998). De plus il a été montré que lorsque

la quantité de cholestérol atteint un certain seuil l’activité ACAT augmente dramatiquement,

participant à l’évolution des macrophages en cellules spumeuses (Xu et Tabas, 1991). Ainsi

l’ACAT produit des esters de cholestérol qui sont stockés dans des gouttelettes lipidiques

cytoplasmiques. Ces gouttelettes sont formées par des extensions du RE selon un mécanisme

faisant intervenir la protéine cavéoline-1 (Robenek et al., 2004). Des échanges peuvent

également se produire entre les gouttelettes lipidiques et le RE via des protéines de transport

(Prinz, 2007).

Les esters de cholestérol stockés dans les gouttelettes lipidiques peuvent être

hydrolysés pour former à nouveau du cholestérol libre qui rejoint alors la membrane

plasmique. Cette réaction est catalysée par la cholestéryl ester hydrolase neutre (nCEH)

présente dans le cytoplasme (Ghosh, 2000). Ainsi les gouttelettes lipidiques sont des

compartiments dynamiques dont le cholestérol subit un cycle permanant d’hydrolyses et

d’estérifications. La régulation de ce cycle est essentielle pour le maintien de l’homéostasie

cellulaire du cholestérol (Soccio et Breslow, 2004).

1.2.4 Oxydation du cholestérol - les oxystérols

Les cellules périphériques comme les macrophages ne peuvent pas cataboliser le

cholestérol excédentaire qui doit donc être transporté jusqu’au foie pour être transformé en

acides biliaires et sécrété dans la bile. Le cholestérol peut également être éliminé dans les

selles par l’intestin ou servir de précurseur dans la synthèse des hormones stéroïdes par les

tissus stéroïdogènes. Toutefois, les macrophages peuvent convertir le cholestérol en

oxystérols par différents mécanismes d’oxydation. Ces oxystérols jouent un rôle important

dans la régulation de l’homéostasie cellulaire du cholestérol dans les macrophages et ont été

associés au développement des lésions d’athérosclérose (Brown et Jessup, 1999 ; Gill et al.,

2008 ; Javitt, 2008 ).



30

1.2.4.1 Formation des oxystérols

L’oxydation du cholestérol génère des groupements hydroxy-, céto- ou époxy- à

différents endroits de la molécule de cholestérol (Figure 5). Certains oxystérols sont générés

dans la cellule grâce à des enzymes spécifiques qui appartiennent à la famille du cytochrome

P450 (Russell, 2000). Les macrophages sont capables de convertir le cholestérol en 27-

hydroxycholestérol (27-OHC) grâce à la 27-hydroxylase (CYP27). D’autres oxystérols sont

également produits de manière enzymatique. Il s’agit du 24-OHC que l’on trouve

exclusivement dans le cerveau, du 7α-OHC que l’on retrouve dans le foie et qui sert

d’intermédiaire dans la synthèse des acides biliaires, du 25-OHC et du 24(S),25-époxy-

cholestérol qui sont générés lors de la biosynthèse du cholestérol (Olkkonen et Lehto, 2004).

Des oxystérols peuvent également être générés de manière non-enzymatique, par

un processus radicalaire appelé « auto-oxydation du cholestérol ». Il s’agit principalement du

7-cétocholestérol (7-KC), des 25-, 7α- et 7β-OHC, et du 5,6-époxy-cholestérol. Ces composés

peuvent être générés à l’intérieur de la cellule (Wen et Leake, 2007) ou provenir de la

captation de LDL oxydées. Ils sont également en partie apportés par l’alimentation

(Leonarduzzi et al., 2002).

ROS / Enz

ROSROSROS

EnzEnz

Enzcholestérol

7α–, 7β–OHC

7α–OHC

25–OHC

27–OHC

24,25–époxy-cholestérol

5,6–époxy-cholestérol

7–KC

Figure 5 : Formation des oxystérols. ROS : oxydation radicalaire. Enz : oxydation enzymatique.



31

1.2.4.2 Implication des oxystérols au cours de l’athérogenèse

La plupart des oxystérols, notamment ceux générés de manière non-enzymatique,

sont décrits comme des composés cytotoxiques et proathérogènes. En effet le 7-KC possède

un effet cytotoxique et proapoptotique sur les macrophages en culture, ainsi que sur d’autres

cellules vasculaires comme les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales (Clare

et al., 1995 ; Lemaire-Ewing et al., 2005). Ces résultats restent cependant controversés car il a

été montré qu’un mélange de plusieurs oxystérols annule l’effet cytotoxique du 7-KC seul

(Biasi et al., 2004). L’oxydation des LDL in vitro par action du cuivre (Cu2+) génère de

grandes quantités d’oxystérols, notamment du 7-KC et du 7α-OHC (Brown et al., 1996). Or

l’incubation de macrophages en culture en présence de LDL oxydées induit une forte

accumulation d’oxystérols à l’intérieur des lysosomes et stimule la transformation des

macrophages en cellules spumeuses (Brown et al., 2000 ; Colles et al., 2001 ). De plus, des

quantités importantes d’oxystérols ont été mesurées in vivo chez l’homme dans les lésions

d’athérosclérose et les macrophages spumeux (Carpenter et al., 1995 ; Garcia-Cruset et al.,

2001). L’ensemble de ces observations réalisées in vitro et in vivo suggère donc que les

oxystérols jouent un rôle important au cours de l’athérogenèse et participent au

développement des lésions.

1.2.4.3 Régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol par les

oxystérols : LXR et OSBP

Les récepteurs nucléaires LXR (Liver X Receptors) sont des facteurs de

transcription fortement impliqués dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol. (Millatt et

al., 2003 ; Olkkonen et Lehto, 2004). Alors que le cholestérol n’a pas d’effet sur l’activité des

LXRs certains oxystérols apparaissent comme des ligands et activateurs naturels des LXRs.

Chez les macrophages, notamment, il a été montré que le 27-OHC est un ligand endogène des

LXRs (Fu et al., 2001). En présence de son ligand le récepteur LXR migre à l’intérieur du

noyau et se fixe sur des éléments de réponse LXREs (LXR response elements) présents dans

les promoteurs de gènes cibles. Les LXRs régulent ainsi de nombreux gènes impliqués dans le

métabolisme des lipides. Dans les macrophages, l’activation des LXRs diminue l’expression



32

de gènes impliqués dans la biosynthèse du cholestérol, notamment le gène codant pour

l’enzyme HMG-CoA réductase (Song et al., 2001). L’activation des LXRs dans les

macrophages augmente également l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1 qui

stimulent l’efflux du cholestérol. (Schwartz et al., 2000 ; Zanotti et al., 2008). Enfin, des

études ont montré que l’activité des LXRs in vivo, et notamment dans les macrophages, réduit

le développement des lésions d’athérosclérose (Joseph et al., 2002 ; Tangirala et al., 2002).

De nombreux travaux ont également montré que la protéine OSBP (Oxysterol

Binding Protéine) et les protéines ORPs (OSBP-related proteins) jouent un rôle important

dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol (Fairn et McMaster, 2008 ; Lehto et

Olkkonen, 2003 ; Olkkonen et Lehto, 2004). OSBP est une protéine cytosolique ayant pour

ligands naturels différents oxystérols dont le 25-OHC et le 7-KC. La fixation du 25-OHC sur

le site de liaison de OSBP induit un changement conformationnel de la protéine et stimule sa

translocation vers l’appareil Golgi. Des études fonctionnelles ont montré que la surexpression

de OSBP dans les cellules CHO induit une diminution de l’activité ACAT et une

augmentation de la transcription des gènes codant pour le récepteur aux LDL et pour

l’enzyme HMG-CoA réductase, stimulant ainsi la biosynthèse du cholestérol (Lagace et al.,

1997). La surexpression de ORP2 dans des cellules en culture stimule le transport du

cholestérol à partir du réticulum endoplasmique, diminue l’estérification du cholestérol et

augmente l’efflux du cholestérol sur différents accepteurs extracellulaires (Laitinen et al.,

2002). Il a également été montré que la surexpression de ORP4 perturbe le transport du

cholestérol dérivé de la captation des LDL (Wang et al., 2002). Enfin, la protéine ORP8,

exprimée dans les macrophages, a récemment été identifiée comme un régulateur négatif de

l’expression d’ABCA1 et donc de l’efflux du cholestérol (Yan et al., 2008).

Toutefois, les mécanismes précis par lesquels les ORPs influencent le

métabolisme du cholestérol restent encore très peu connus. Différentes études ont montré que

les ORPs pourraient jouer directement un rôle dans le transport du cholestérol entre les

différents compartiments cellulaires, soit en fonctionnant comme des protéines de transport

(Im et al., 2005), soit en permettant la formation de sites de contact entre les membranes

(Olkkonen et Levine, 2004). OSBP, ORP1 et ORP2 seraient également impliqués dans le

transport vésiculaire du cholestérol, notamment entre le réticulum endoplasmique et l’appareil

de Golgi (Wyles et al., 2002 ; Xu et al., 2001). Enfin, il a été proposé que les ORPs soient



33

simplement des protéines de détection des stérols associées aux différents systèmes de

régulation du métabolisme du cholestérol (Olkkonen et al., 2006).

1.3 Le transport intracellulaire du cholestérol

De nombreuses revues générales sont disponibles dans la litérature sur le transport

intracellulaire du cholestérol (Liscum et Munn, 1999 ; Maxfield et Wustner, 2002 ; Simons et

Ikonen, 2000 ; Soccio et Breslow, 2004 ; Vainio et Ikonen, 2003). Un schéma global des

différentes voies de transport est présenté dans la Figure 6.

1.3.1 Les différents modes de transport intracellulaire du cholestérol

En raison de sa grande hydrophobicité, la diffusion passive du cholestérol dans le

cytoplasme est très lente. Ainsi, le transport du cholestérol d’un compartiment cellulaire à

Figure 6 : Transport intracellulaire du cholestérol. FC : cholestérol libre, CE : esters de cholestérol, LE : endosomes tardifs, EE : endosomes précoces, ER : réticulum endoplasmique.



34

l’autre s’effectue principalement grâce à des mécanismes vésiculaires et des protéines de

transport, ou directement au niveau de sites de contact membranaires (Figure 7) (Maxfield et

Wustner, 2002 ; Soccio et Breslow, 2004).

Les vésicules qui transitent entre les différents compartiments cellulaires

transportent les constituants des membranes à partir desquelles elles se sont formées jusqu’à

celles où elles sont dirigées. L’inclusion du cholestérol dans les vésicules en formation

dépendrait en partie de son affinité pour les microdomaines. Le transport vésiculaire nécessite

également un cytosquelette intact et consomme de l’énergie sous forme d’ATP. Il a toutefois

été montré que le transport intracellulaire du cholestérol n’est pas totalement inhibé lorsqu’on

bloque les mécanismes vésiculaires, mettant en évidence l’existence d’autres mécanismes de

transport non-vésiculaires (Maxfield et Mondal, 2006).

Le transport non-vésiculaire est possible grâce à différentes protéines

cytoplasmiques capables d’extraire le cholestérol des membranes « donneuses », de fixer le

cholestérol à l’intérieur d’un domaine hydrophobe présent dans leur structure

tridimensionnelle, et de le réinsérer dans les membranes cibles (Prinz, 2007). Il existe de

nombreuses protéines pouvant ainsi jouer le rôle de transporteurs du cholestérol. Il s’agit

notamment de la protéine StAR (Steroidogenic Acute Regulatory) et des protéines associées

possédant le même domaine de fixation du cholestérol appelé START (StAR-Related Lipid

Transfer domain), de la protéine NPC2 (Niemann-Pick Type C) impliquée dans le transport

Figure 7 : Les différents modes de transport du cholestérol. Le cholestérol peut transiter d’une membrane I à une membrane II par diffusion passive (A), par des mécanismes vésiculaires (B), grâce à des protéines de transport (C) ou via des contacts membranaires (D). (Maxfield et Wustner, 2002).



35

du cholestérol à partir des endosomes tardifs, de la protéine SCP-2 (Sterol Carrier Protein 2),

de la cavéoline ainsi que de certaines protéines appartenant à la famille des ORPs.

Enfin, il existe dans la cellule des sites de contact membranaire, notamment entre

le RE et les autres compartiments cellulaires, qui peuvent faciliter le transfert de cholestérol

entre les deux membranes, soit par diffusion, soit à l’aide de protéines spécifiques (Levine et

Loewen, 2006).

1.3.2 Généralités sur les lipoprotéines

Les lipoprotéines sont des complexes solubles de haute masse moléculaire

constitués d’un cœur de lipides hydrophobes (triacylglycérol (TG) et esters de cholestérol

(CE)) entourés d’une monocouche de phospholipides (PL) et de cholestérol ainsi que de

différentes apoprotéines. Cette architecture macromoléculaire permet aux lipides très

hydrophobes d’être transportés dans la circulation sanguine. Il existe plusieurs types de

lipoprotéines qui se différencient par leur densité, leur taille, leur composition en lipides et en

protéines, et par leur fonction (Tableau 1).

Le rôle des lipoprotéines est de transporter les lipides exogènes (provenant de

l’alimentation) et endogènes (synthétisés par l’organisme) entre les différents organes et

tissus. Le métabolisme des lipoprotéines au niveau de l’organisme est complexe et dépend de

mécanismes faisant intervenir de nombreux récepteurs et enzymes. On distingue trois voies de

transport très interconnectées : la voie de transport des lipides exogènes (à partir de l’intestin

Diamètre Apolipoprotéine(s)(nm) TG Chol CE PL (APO)

Chylomicrons 75-1200 80-95 1-3 2-4 3-6 B48, E, C

VLDL 30-80 45-65 4-8 16-22 15-20 B100, E, C

IDL 27-35 25-35 4-8 20-30 20-24 B100, E, C

LDL 18-27 4-8 6-8 45-50 18-24 B100

HDL 7-12 2-7 3-5 15-20 26-32 AI, AII, C

préβHDL <7 (disque) - - - - AI

Type de lipoprotéinesComposition lipidique (% massiques)

Tableau 1 : Caractéristiques et composition des différentes classes de lipoprotéines.



36

vers les tissus périphériques), la voie de transport des lipides endogènes du foie vers les tissus

périphériques et la voie de transport retour des lipides endogènes des tissus vers le foie (voir

annexe 1). S’agissant du cholestérol cette dernière voie de transport est appelée « transport

inverse du cholestérol » (Cuchel et Rader, 2006 ; Toussaint et al., 2003).

Les lipoprotéines jouent donc un rôle majeur dans le métabolisme du cholestérol

dans l’organisme. Au niveau des macrophages les LDL provenant du foie constituent une

source exogène de cholestérol et les HDL stimulent l’efflux du cholestérol hors de la cellule

en jouant le rôle d’accepteurs extracellulaires du cholestérol.

1.3.3 Endocytose des LDL par les macrophages

1.3.3.1 Les LDL et LDL oxydées

Les lipoprotéines de faible densité (LDL) sont des particules sphériques de taille

variable (entre 18 et 25 nm de diamètre). Elles sont composées d’un cœur hydrophobe

contenant principalement des esters de cholestérol et présentent à leur surface une

apolipoprotéine B-100 (ApoB-100) (Figure 8). Les LDL en circulation dans le sang

transportent le cholestérol du foie vers les tissus périphériques. En effet, en plus de la

biosynthèse de novo, les cellules peuvent acquérir du cholestérol par endocytose des LDL.

Figure 8 : Représentation schématique d’une particule de LDL. (Berg et al., 2002)



37

Il est admis qu’au cours de l’athérogenèse les LDL natives circulantes traversent

l’endothélium vasculaire puis sont retenues dans l’intima où elles subissent des modifications

oxydatives. Les LDL oxydées sont beaucoup plus athérogènes que les LDL natives car elles

induisent une forte accumulation de cholestérol et d’oxystérols dans les macrophages présents

dans l’espace sous endothélial (Jessup et al., 2002 ; Stocker et Keaney, 2005). Ainsi, les LDL

oxydées jouent un rôle majeur in vivo dans l’évolution des macrophages en cellules

spumeuses et donc dans les premières phases de l’athérogenèse.

De nombreuses études réalisées in vitro on montré que l’oxydation des LDL altère

à la fois leur composition lipidique et la structure de l’apoB-100. Les acides gras poly-

insaturés (AGPI) constituent les premières cibles de la peroxydation lipidique. Cette étape

génère différents aldéhydes, dont le dialdéhyde malonique (MDA) et les hydroxyalkénals, qui

vont alors former des adduits sur l’apoprotéine B-100 en se liant aux groupements aminés. De

plus le cholestérol va également s’oxyder et générer différentes molécules d’oxystérols

(Esterbauer et al., 1992 ; Young et McEneny, 2001).

De nombreux travaux ont permis de mettre en évidence que l’oxydation des LDL

se produit in vivo (Young et McEneny, 2001). En effet des LDL extraites de lésions

d’athérosclérose chez l’Homme ont montré des modifications oxydatives de l’apoB-100 et

des concentrations élevées de produits de peroxydation lipidique comme les oxystérols (Yla-

Herttuala et al., 1989). De plus, il a été montré que l’oxydation des LDL in vivo est stimulée

par les macrophages résidents et s’effectue grâce à différents systèmes oxydants,

enzymatiques ou non (Morel et al., 1984 ; Parthasarathy et al., 1986 ; Parthasarathy et al.,

2008).

1.3.3.2 Endocytose des LDL : les différents récepteurs et mécanismes

Les macrophages internalisent les LDL par un mécanisme d’endocytose

dépendant de la clathrine. L’ApoB-100 des particules de LDL est reconnue par le récepteur

aux LDL (LDL-R) présent à la surface de la cellule au niveau de puits tapissés de clathrine.

La fixation du ligand sur son récepteur provoque l’invagination de la membrane et la

formation d’une vésicule d’endocytose (Brown et Goldstein, 1986 ; Ungewickell et

Hinrichsen, 2007 ). Le complexe LDL-récepteur est ainsi internalisé puis dirigé vers les

endosomes précoces.



38

La transcription du gène codant pour le LDL-R est régulée par la quantité

cellulaire de cholestérol grâce à un mécanisme de rétrocontrôle faisant intervenir le facteur de

transcription SREBP (voir paragraphe 1.2.2). Ainsi, lorsque la quantité de cholestérol

augmente, l’expression du LDL-R diminue ce qui entraîne une diminution de la quantité de

cholestérol captée par la cellule. Ce mécanisme de régulation explique pourquoi les LDL

natives seules n’induisent pas une forte accumulation de cholestérol dans les macrophages

(Brown et Goldstein, 1997).

Lorsque les LDL sont modifiées elles ne sont plus reconnues par le LDL-R.

Toutefois, Goldstein et Brown ont identifié dès 1979 un autre type de récepteur permettant la

captation des LDL modifiées. Ce récepteur a été nommé « scavenger receptor » (SR)

(Goldstein et Brown, 1977 ; Goldstein et al., 1979). Dans ces études, Goldstein et Brown ont

utilisé des LDL acétylées. Ce sont des LDL modifiées in vitro qui ne se forment pas

naturellement dans l’organisme mais qui sont souvent utilisées comme modèle expérimental

pour induire une forte accumulation de cholestérol dans les macrophages en culture. En effet,

contrairement au LDL-R, l’expression des SR n’est pas régulée par la quantité de cholestérol

(Brown et Goldstein, 1983). Il a ensuite été montré que les LDL oxydées sont également des

ligands des SR et qu’elles peuvent être internalisées par cette voie de la même manière que les

LDL acétylées (Steinbrecher et al., 1989).

De nombreux récepteurs « scavenger » contribuant à l’endocytose des LDL

oxydées par les macrophages ont depuis été identifiés (Murphy et al., 2005 ; Steinbrecher,

1999). Il s’agit entre autres des récepteurs SR-AI, SR-AII et CD36 qui jouent un rôle critique

au cours de l’athérogenèse (Kunjathoor et al., 2002) ainsi que des récepteurs SR-BI et SR-

BII. Tous ces récepteurs possèdent de nombreux ligands autres que les LDL modifiées et sont

impliqués dans différents mécanismes cellulaires (Moore et Freeman, 2006). Il a notamment

été montré que SR-BI, en plus d’être un ligand pour les LDL modifiées, possède une affinité

pour les HDL et stimule ainsi le transfert d’esters de cholestérol à l’intérieur de la cellule, ce

qui constitue un autre mécanisme de captation du cholestérol par les macrophages (Rinninger

et al., 1994).

Enfin, il a été montré que dans l’intima des artères les LDL oxydées peuvent

s’agréger pour former de plus gros complexes (Maor et al., 2000). Ces complexes sont alors

internalisés par les macrophages grâce à un mécanisme de phagocytose indépendant des

récepteurs aux LDL (Khoo et al., 1988 ; Kruth, 2002).



39

1.3.3.3 La voie endocytique

La voie endocytique est composée de différents compartiments présentant des

structures, des propriétés physico-chimiques et des compositions en protéines et lipides

distinctes (Gruenberg, 2003 ; Perret et al., 2005). Une fois internalisé, le complexe

LDL/récepteur est dirigé vers les endosomes précoces où le pH légèrement plus acide

provoque la dissociation du récepteur et de la particule de LDL. Le récepteur est alors dirigé

vers les zones tubulaires des endosomes précoces puis vers les endosomes de recyclage avant

d’être réincorporé dans la membrane plasmique où il pourra être réutilisé. La particule de

LDL est dirigée vers les zones vésiculaires des endosomes précoces qui vont former par

invagination des corps multi-vésiculaires également appelés vésicules de transport

endosomales (ECV/MVB). Après s’être formées et détachées des endosomes précoces, ces

vésicules de transport sont dirigées vers les endosomes tardifs avec lesquels elle fusionnent.

Figure 9 : Endocytose des LDL, représentation schématique de la voie endocytique.



40

Les endosomes tardifs sont des corps multi-vésiculaires et multi-lamellaires

constitués d’une membrane limitante et d’un réseau de membranes internes (Russell et al.,

2006). Dans les endosomes tardifs les esters de cholestérol dérivés de la captation des LDL

sont hydrolysés par la cholestérol ester hydrolase acide (CEH acide). Le cholestérol libre ainsi

formé est redistribué vers le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. En

revanche, les protéines et lipides destinés à la dégradation sont dirigés vers les lysosomes,

considérés comme le point final de la voie endocytique (Figure 9). Il a été montré récemment

que l’enzyme CEH acide est également présente dans les endosomes précoces, indiquant que

l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL commence rapidement après

l’internalisation des LDL (Sugii et al., 2003).

1.3.4 Le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs

Les endosomes tardifs possèdent une structure membranaire très dynamique. Il a

été montré que les membranes internes des endosomes tardifs contiennent une forte

proportion du phospholipide bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) qui forme des

microdomaines spécialisés (Kobayashi et al., 2001a ; Kobayashi et al., 2002). Comme nous le

verrons au chapitre 4 des rappels bibliographiques, le BMP joue un rôle important dans la

structuration et la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs ainsi que dans le

transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi

et al., 1999). Deux protéines jouent également un rôle central dans le transport du cholestérol

à partir des endosomes tardifs. Il s’agit de NPC1 et NPC2 qui sont localisées dans les

endosomes tardifs et présentent des domaines de liaison au cholestérol. De nombreuses études

ont montré que l’apparition de mutations sur les gènes codant les protéines NPC1 et NPC2

chez les patients atteints de la maladie neurodégénérative de Niemann-Pick de type C induit

une altération de l’homéostasie cellulaire du cholestérol (Chang et al., 2005 ; Garver et

Heidenreich, 2002 ; Wojtanik et Liscum, 2003).

A partir des endosomes tardifs (LE) le cholestérol dérivé des LDL peut rejoindre

la membrane plasmique (PM) à partir de laquelle il peut soit être efflué hors de la cellule

grâce à différents accepteurs, soit retourner au réticulum endoplasmique (RE) où il pourra être

estérifié par l’ACAT et stocké sous forme d’esters dans des gouttelettes lipidiques (Lange et

al., 1997 ; Lange et al., 1998 ; Neufeld et al., 1996). Il a été montré qu’à partir des LE,



41

environ 70% du cholestérol dérivé des LDL rejoint le RE en transitant par la PM, mais qu’il

peut également être transporté directement des LE vers le RE (Underwood et al., 1998).

Des mécanismes à la fois vésiculaires et non-vésiculaires semblent être impliqués,

voire coopèrent, dans le transport endosomal du cholestérol (Holtta-Vuori et Ikonen, 2006).

En effet il a été montré que le transport du cholestérol des LE vers la PM était dépendant de

l’appareil de Golgi (Neufeld et al., 1996) suggérant un transport vésiculaire le long de la voie

de sécrétion. De plus, des inhibiteurs des GTPases « Rab », qui sont impliquées dans le

transport vésiculaire, induisent une accumulation de cholestérol dans les LE en bloquant sa

redistribution vers les autres organites (Holtta-Vuori et al., 2000) alors que leur surexpression,

au contraire, réduit cette accumulation (Walter et al., 2003). Par ailleurs, différentes protéines

localisées dans les LE et possédant un site de liaison au cholestérol ont été proposées pour

jouer un rôle dans le transport non-vésiculaire du cholestérol à partir des LE. Il s’agit entre

autres des protéines MLN64 (Alpy et al., 2001), ORP1 (Johansson et al., 2003), ABCA1

(Neufeld et al., 2004) et SR-BI (Ahras et al., 2008). Enfin, le rôle précis des protéines NPC1

et NPC2 comme protéines de transport ou comme régulateurs dans le transport vésiculaire du

cholestérol à partir des LE reste encore à préciser (Ko et al., 2001 ; Ko et al., 2003).

1.3.5 Le transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique

Le cholestérol membranaire est continuellement ré-internalisé dans la cellule

notamment vers le RE pour être estérifié par l’ACAT mais aussi pour participer aux

régulations transcriptionnelles contrôlées par SREBP. Certains agents pharmacologiques

connus pour détruire le cytosquelette inhibent le transport du cholestérol de la PM vers le RE

suggérant un mécanisme de transport vésiculaire (Liscum et Munn, 1999). De plus, il a été

montré qu’entre la PM et le RE, le cholestérol peut transiter via les endosomes ou l’appareil

de Golgi (Soccio et Breslow, 2004). Des études récentes semblent indiquer que les

microdomaines riches en cholestérol jouent un rôle important dans la redistribution

intracellulaire du cholestérol à partir de la membrane plasmique (Lange et al., 1999 ; Lange et

Steck, 2008) et que des mécanismes non-vésiculaires sont également impliqués dans cette

voie de transport (Prinz, 2007).



42

1.3.6 Le transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique

Le cholestérol nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplasmique est

rapidement transporté à la membrane plasmique. Plusieurs voies et mécanismes semblent être

impliqués. D’une part, le cholestérol peut être transporté par un processus vésiculaire

classique via l’appareil de Golgi (Kaplan et Simoni, 1985). D’autre part des sites de contact

entre les membranes du RE et des autres compartiments cellulaires, notamment la membrane

plasmique, peuvent faciliter le transfert du cholestérol (Levine et Loewen, 2006). Enfin, des

protéines de transport semblent également être impliquées, notamment les protéines SCP-2, la

cavéoline et ORP2, mais leur rôle exact dans cette voie de transport reste encore mal connu

(Hynynen et al., 2005 ; Prinz, 2007 ; Soccio et Breslow, 2004).

1.3.7 Efflux du cholestérol

Le rôle athéro-protecteur des lipoprotéines de haute densité (HDL) provient entre

autres de leur capacité à capter le cholestérol excédentaire des tissus périphériques,

notamment des macrophages, et de le transporter jusqu’au foie pour être éliminé dans la bile

(Feig et al., 2008 ; Tall, 2008). Ce processus, appelé transport inverse du cholestérol (voir

annexe 1), est initié par l’efflux du cholestérol à partir des cellules. Cet efflux se caractérise

par un transfert du cholestérol libre de la membrane plasmique sur différents accepteurs

extracellulaires (Jessup et al., 2006 ; Jessup et Kritharides, 2008 ; Tall et al., 2002 ; Yancey et

al., 2003).

Malgré sa grande hydrophobicité il a été montré que le cholestérol peut quitter la

membrane plasmique par diffusion aqueuse jusqu’à rencontrer un accepteur dans le plasma

sanguin (Phillips et al., 1987). Toutefois il s’agit d’un phénomène trop lent pour exporter

efficacement le cholestérol hors de la cellule. Ainsi, différentes protéines membranaires

permettent de stimuler l’efflux du cholestérol. Chez les macrophages il s’agit principalement

des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette), notamment ABCA1, ABCG1 et ABCG4,

ainsi que du récepteur « scavenger » SR-BI.



43

1.3.7.1 Efflux médié par les transporteurs ABCA1, ABCG1 et ABCG4

Chez l’Homme, des mutations délétères présentes sur le gène codant pour ABCA1

sont responsables de la maladie de Tangier qui se caractérise par un niveau plasmatique de

HDL très faible, une accumulation de cholestérol dans les macrophages et un développement

rapide des lésions d’athérosclérose (Kolovou et al., 2006). Les modèles animaux fournissent

également de nombreux résultats indiquant que l’absence de ABCA1 et ABCG1, notamment

chez les macrophages, accélère le processus d’athérogenèse (Out et al., 2008 ; Yvan-Charvet

et al., 2007).

ABCA1 est un transporteur composé de deux parties similaires liées de manière

covalente et composées chacune de six domaines transmembranaires, d’une boucle

extracellulaire et d’une partie intracellulaire contenant un domaine ABC. Au contraire,

ABCG1 et ABCG4 sont des « demi » transporteurs (Figure 10) qui fonctionnent

probablement sous la forme d’homo- ou hétéro-dimères (Cserepes et al., 2004 ; Vaughan et

Oram, 2006). ABCA1 permet un transfert unidirectionnel de cholestérol et de phospholipides

de la membrane plasmique vers une apolipoprotéine A-I (apoA-I) délipidée qui évolue ainsi

en HDL « naissante » (Duong et al., 2006). Au contraire, ABCG1 et ABCG4 permettent

uniquement de transférer du cholestérol sur une particule de HDL déjà formée (Wang et al.,

2004). Il a ainsi été proposé que ABCA1 et ABCG1 fonctionnent de manière séquentielle,

ABCA1 générant à partir d’apoA-I une particule de HDL qui va alors stimuler l’efflux du

cholestérol via ABCG1 (Gelissen et al., 2006). ABCA1 et ABCG1 contribueraient ensemble

à la majorité de l’efflux du cholestérol à partir des macrophages (Jessup et Kritharides, 2008).

Différentes études semblent indiquer que ABCA1 interagit directement avec

apoA-I au niveau de ses boucles extracellulaires (Fitzgerald et al., 2002 ; Wang et al., 2000)

et que cette liaison est nécessaire au mécanisme de transfert des lipides (Chroni et al., 2004 ;

Fitzgerald et al., 2004). Il a été montré récemment sur des macrophages en culture que le

transfert de cholestérol et de phospholipides par ABCA1 sur ApoA-I s’effectue

simultanément, par un mécanisme de microsolubilisation, plutôt que de manière séquentielle

comme cela avait été proposé (Gillotte et al., 1998a ; Gillotte et al., 1999 ; Smith et al., 2004 ;

Yancey et al., 2003). Un autre mécanisme a également été proposé selon lequel les apoA-I

pourraient être internalisées par les cellules puis re-sécrétées après lipidation via un

mécanisme de rétroendocytose (Denis et al., 2008 ; Faulkner et al., 2008).



44

Récemment, de nombreux travaux ont mis en lumière le rôle important joué par

les microdomaines membranaires (voir paragraphe 1.1.3 des rappels bibliographiques) dans

l’efflux du cholestérol stimulé par ABCA1 et ABCG1. Cependant, les premières études

indiquaient que apoA-I acquiert plus difficilement du cholestérol à partir des microdomaines

que des membranes plus fluides (Lund-Katz et al., 1988 ; Mendez et al., 2001) et que le

récepteur ABCA1 lui-même ne semble pas associé aux microdomaines insolubles dans le

Triton X-100 (Mendez et al., 2001). D’autres auteurs ont toutefois proposé un modèle

(Yancey et al., 2003) selon lequel ABCA1 modifierait l’organisation des membranes

environnantes en créant autour de lui des domaines lipidiques spécifiques (Drobnik et al.,

2002 ; Wang et al., 2000). ApoA-I interagirait alors avec ces domaines générés par ABCA1

avant de se lier au transporteur (Chambenoit et al., 2001 ; Lin et Oram, 2000). ABCA1 a en

effet été retrouvé associé à des microdomaines insolubles dans le Lubrol qui est un détergent

moins fort que le Triton X-100 (Drobnik et al., 2002). Plus récemment, il a été montré que

ABCA1 désorganise les microdomaines riches en cholestérol, redistribuant le cholestérol dans

des membranes plus fluides pour lesquelles apoA-I possède une plus grande affinité (Landry

et al., 2006). Un mécanisme similaire a également été rapporté pour ABCG1 (Vaughan et

Oram, 2005).

L’équipe de Gaus a proposé un autre modèle selon lequel l’efflux du cholestérol

sur apoA-I s’effectuerait à partir de deux « réservoirs » membranaires distincts, et de manière

séquentielle (Gaus et al., 2001 ; Gaus et al., 2004). Selon ces auteurs, ApoA-I interagirait

d’abord avec les microdomaines qui constituent un réservoir restreint de cholestérol mais avec

lesquels s’opèrent des échanges rapides de cholestérol. Puis, progressivement, apoA-I

acquerrait aussi du cholestérol provenant des domaines fluides de la membrane plasmique qui

constitueraient finalement la principale source de cholestérol.

Enfin, certaines études indiquent que la cavéoline-1, présente dans les

microdomaines appelés cavéoles, est impliquée dans l’efflux du cholestérol stimulé par

ABCA1. Toutefois ces résultats restent encore controversés (Ikonen et al., 2004 ; Lin et al.,

2007 ; Storey et al., 2007).

Il a été montré que l’expression des gènes codant pour les récepteurs ABCA1 et

ABCG1 est faible à l’état basal chez les macrophages mais qu’elle augmente lorsqu’ils

accumulent du cholestérol (Kielar et al., 2001 ; Venkateswaran et al., 2000). Il a également



45

été montré que l’expression de ces gènes est régulée par le facteur de transcription LXR ainsi

qu’indirectement par PPARγ via l’induction de LXR (Schmitz et Langmann, 2005 ; Zhang et

al., 2002). L’excès de cholestérol dans les macrophages entraîne la formation d’oxystérols. Or

ces oxystérols jouent un rôle important dans l’efflux du cholestérol car ils activent les LXR et

stimulent ainsi l’efflux du cholestérol via ABCA1 et ABCG1. De plus, il a récemment été

montré que ABCG1 stimule aussi l’efflux des oxystérols modifiés sur la position 7,

protégeant ainsi les cellules contre l’effet délétère des oxystérols (Engel et al., 2007 ;

Terasaka et al., 2007). Enfin, des mécanismes post-transcriptionnels régulent aussi la stabilité,

le trafic intracellulaire et l’activité de ABCA1 (Oram et Heinecke, 2005).

1.3.7.2 Efflux médié par le récepteur SR-BI

Les récepteurs « scavenger » SR-BI participent également à l’efflux du

cholestérol en stimulant son transport entre la membrane plasmique et les HDL. Il ne s’agit

pas d’un transport actif mais d’une diffusion dont le flux est bidirectionnel. Ainsi l’échange

de cholestérol entre la cellule et l’accepteur s’effectue globalement dans le sens du gradient de

concentration en cholestérol (de La Llera-Moya et al., 2001).

SR-BI est composé d’un large domaine extracellulaire ancré dans la membrane

par deux domaines transmembranaires, ainsi que deux courtes chaînes N- et C- terminales

intracellulaires (Rigotti et al., 1997). De plus il a été montré que SR-BI forme des dimères et

tétramères par homo-oligomérisation (Sahoo et al., 2007). SR-BI stimule le transfert de

cholestérol entre la membrane plasmique et une particule de HDL selon un mécanisme

biphasique (Jessup et al., 2006). Dans un premier temps SR-BI accélère la diffusion du

cholestérol en maintenant l’accepteur à proximité de la membrane grâce à une liaison directe

avec la particule de HDL (Gu et al., 2000 ; Liu et al., 2002). Dans un second temps SR-BI

accélère la diffusion du cholestérol indépendamment de sa liaison avec les HDL mais en

modifiant simplement la distribution et la disponibilité du cholestérol dans les membranes

environnantes (de la Llera-Moya et al., 1999 ; Kellner-Weibel et al., 2000).

SR-BI est exprimé dans de nombreux tissus et organes notamment dans les

macrophages. On le retrouve également exprimé chez l’Homme dans les lésions

d’athérosclérose (Chinetti et al., 2000 ; Hirano et al., 1999). Toutefois il a été montré que son

niveau d’expression dans des macrophages issus de patients atteint d’athérosclérose est



46

identique par rapport à des patients sains (Svensson et al., 2005). De plus, des études réalisées

in vitro indiquent que l’accumulation de cholestérol dans les macrophages diminue

l’expression de SR-BI selon un mécanisme indépendant de LXR et SREBP (Yu et al., 2004)

et que les LDL oxydées tendent également à diminuer l’expression de SR-BI (Han et al.,

2001).

Il a été montré que des souris déficientes en SR-BI développent plus rapidement

des lésions d’athérosclérose (Braun et al., 2002 ; Zhang et al., 2003). Il a été proposé que SR-

BI puisse jouer un rôle antiathérogène (Covey et al., 2003). Cependant des études plus

récentes ont indiqué que SR-BI ne jouerait qu’un rôle mineur dans l’efflux du cholestérol

chez les macrophages in vitro (Adorni et al., 2007) et in vivo (Wang et al., 2007).

SR-BI ABCG1 ABCA1

apoA-1HDL naissante

discoïdaleHDL sphérique

diffusion passive

milieuintracellulaire

milieuextracellulaire

cholestérolphospholipides

Figure 10 : Représentation schématique de l’efflux du cholestérol médié par SR-BI, ABCA1, ABCG1 et par diffusion passive.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides


47

Chapitre 2 : Généralités sur les acides gras et les phospholipides

Depuis quelques années, le projet LIPID MAPS (LIPID Metabolites and

Pathways Strategy ; http://lipidmaps.org) développe un système très complet de classification,

de nomenclature et de représentation chimique des lipides (Fahy et al., 2005 ; Schmelzer et

al., 2007). LIPID MAPS propose de classer les lipides en huit catégories, elles-mêmes

subdivisées en classes et sous-classes : les acides gras (AG), les glycérolipides (GL), les

glycérophospholipides ou phospholipides (GPL ou PL), les sphingolipides (SL), les stérols,

les prénols, les saccharolipides et les polyketides. Le cholestérol, dont nous avons décrit le

métabolisme et le transport intracellulaire dans le chapitre 1, fait partie des stérols. Ce

deuxième chapitre apporte des rensignements généraux sur les acides gras ainsi que sur les

phospholipides.

2.1 Les acides gras

Les acides gras sont des acides carboxyliques formés d’une chaîne

hydrocarbonée. Leur chaînes carbonées linéaires possèdent différentes longueurs et degrés

d'insaturation correspondant au nombre de doubles liaisons carbone-carbone. Leurs atomes de

carbone sont numérotés à partir du groupement carboxyle portant le N°1 et le dernier carbone

étant noté ω (oméga) ou n (Figure 11).

Les acides gras saturés ne possèdent aucune double liaison carbone-carbone alors

que les acides gras mono- et poly-insaturés possèdent respectivement une et plusieurs doubles

liaisons. Chaque double liaison est représentée par le symbole Δ (delta) suivi d'un chiffre

indiquant sa position sur la chaîne. Par exemple Δ9 symbolise la présence d'une double liaison

entre les atomes de carbone 9 et 10. Les positions des doubles liaisons peuvent également être

déterminées à partir du carbone ω. Ainsi, on dit qu'un acide gras appartient à la famille des

oméga-3 (ω-3) ou n-3 lorsque sa dernière double liaison est présente sur la 3ème liaison

carbone-carbone en partant du carbone ω, de même pour les acides gras ω-6 (ou n-6), ω-9 (ou

n-9), etc...

Dans la nature les doubles liaisons des acides gras poly-insaturés possèdent

majoritairement une configuration cis, ce qui induit une courbure de la chaîne carbonée. Les



48

acides gras possédant des doubles liaisons trans sont souvent produits de manière industrielle

et sont associées à des situations pathologiques comme l’athérosclérose (Dalainas et Ioannou,

2008). De plus, les doubles liaisons des acides gras polyinsaturés naturels sont presque

toujours non conjuguées (Figure 12).

Chaque acide gras possède un nom IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemists ; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/) et souvent un nom commun. Par

exemple l'acide gras saturé possédant 18 atomes de carbone est appelé acide octadécanoïque

ou acide stéarique. Enfin, les acides gras sont souvent définis par leur formule ou

l’abréviation de leur nom. Par exemple l’acide docosahexaénoïque est défini plus simplement

par 22:6n-3 ou par DHA (Tableau 2).

22 : 6 n-3 Δ4,7,10,13,16,19

Position des doubles liaisonsPosition de la dernière double liaison (ici Δ19 )

Nombre de doubles liaisonsNombre d’atomes de carbone

22 20 19 17 16 14 13 11 10 8 7 5 4 2

21 18 15 12 9 6 31ω

double liaisonn-3 ou ω-3

Figure 11 : abréviation symbolique et structure du DHA



49

CATEGORIE formule nom commun ou IUPAC abréviation4:0 acide butyrique6:0 acide caproïque8:0 acide caprylique10:0 acide caprique12:0 acide laurique14:0 acide myristique16:0 acide palmitique18:0 acide stéarique20:0 acide arachidique22:0 acide béhénique

16:1n-7 acide 9-cis-hexadecénoïque16:1n-9 acide palmitoléique18:1n-7 acide 11-cis-octadecénoïque18:1n-9 acide oléique OA20:1n-9 acide eicosénoïque18:2n-6 acide linoléique LA18:3n-6 acide γ-linolénique GLA18:3n-3 acide α-linolénique ALA20:2n-6 acide eicosadiénoïque20:3n-6 acide di-homo-gamalinolénique DHLA/DGLA20:4n-6 acide arachidonique AA20:5n-3 acide eicosapentaénoïque EPA22:5n-3 acide docosapentaénoïque DPA n-322:6n-3 acide docosahexaénoïque DHA

SATURÉS

MONO-INSATURÉS

POLY-INSATURÉS

Tableau 2 : Classification et nomenclature des principaux acides gras.



50

Le produit majeur de l’enzyme « fatty acid synthase » est l’acide palmitique

(16:0). Les autres acides gras sont ensuite formés par des réactions d’élongation catalysées

par des élongases et des réactions de désaturation catalysées par des désaturases. Toutefois,

les mammifères ne possèdent pas les enzymes capables d’introduire une double liaison après

le carbone C-9 et ne peuvent donc synthétiser ni l’acide linoléique (18:2n-6, LA), ni l’acide

linolénique (18:3n-3, ALA). Ainsi, ces deux acides gras sont dits essentiels car ils doivent être

apportés par l’alimentation.

Acide palmitique16:0

Acide linoléique18:2n-6

Acide oléique18:1n-9

Acide docosahexaénoïque22:6n-3

Acide arachidonique20:4n-6

Doubles liaisons : cis trans cis - non conjuguées

16:0 18:1n-9 18:2n-6 20:4n-6 22:6n-3

Représentations 3D de différents acides gras

Figure 12 : Structures et représentations de quelques acides gras.



51

L’acide linoléique est le précurseur des acides gras oméga-6 et l’acide linolénique

le précurseur des acides gras oméga-3. En effet, les mammifères ne possèdent pas non plus de

désaturase capable de former un acide gras oméga-3 à partir d’un acide gras oméga-6. Comme

indiqué dans la Figure 13, la synthèse des acides gras oméga-6 et celle des acides gras oméga-

3 utilise les mêmes enzymes. Il existe donc une compétition entre ces deux familles d’acides

gras. La synthèse des acides gras polyinsaturés n-3 à longues chaînes, EPA et DHA, sera

détaillée dans le chapitre 3.

Figure 13 : Synthèse des acides gras oméga-6 et oméga-3 à partir de l’acide linoléique (18:2n-6) et l’acide linolénique (18:3n-3) respectivement.

18:2n-6 (LA) 18:3n-3 (ALA)

18:3n-6 18:4n-3

20:3n-6 20:4n-3

20:4n-6 (AA) 20:5n-3 (EPA)

22:4n-6 22:5n-3

élongase

Δ6 désaturase

Δ5 désaturase

élongase

22:5n-6 22:6n-3 (DHA)

24:5n-3

24:5n-3

élongase

Δ6 désaturase

β-oxydation

Δ4 désaturase

[alimentation]

[alimentation]

[alimentation]

Oméga-6 Oméga-3

rétr

ocon

vers

ion



52

2.2 Les phospholipides : classes, sous-classes et composition en acides gras

Un phospholipide est constitué d’un résidu glycérol dont les carbones sont notés

sn-1, sn-2 et sn-3, de deux résidus d’acides gras (acyles) et d’un groupement phosphate sur

lequel est estérifié une tête polaire. Les chaînes acyles reliées au glycérol au niveau des

positions sn-1 et sn-2 constituent la partie hydrophobe du phospholipide alors que le

phosphate et la tête plaire, estérifiés en position sn-3, constituent la partie hydrophile. Les

phospholipides sont donc des molécules très amphiphiles et des constituants majeurs des

membranes cellulaires (Figure 14). Les phospholipides présentent une très grande diversité de

structure. Ils sont dans un premier temps subdivisés en classes selon la nature de leur tête

polaire puis en sous-classes selon la nature de la liaison chimique entre le glycérol et la chaîne

grasse en position sn-1 (Figure 14). Enfin il existe un grand nombre d’espèces moléculaires

différentes de chaque phospholipide en fonction de la nature des chaînes acyles.

Les principales classes de phospholipides sont les phosphatidylcholines (PC), les

phosphatidyléthanolamines (PE), les phosphatidylsérines (PS), les phosphatidylinositols (PI),

les phosphatidylglycérols (PG) et l’acide phosphatidique (PA). Ce dernier ne possède pas de

groupement alcool estérifié sur le phosphate. Les phosphoinositides sont des dérivés

phosphatés des PI qui sont fortement impliqués dans différentes voies métaboliques et de

signalisation. Il s’agit principalement des phosphatidylinositol-4-phosphate (PIP), -4,5-

diphosphates (PIP2) et -3,4,5-triphosphates (PIP3). Il existe également des poly-glycéro-

phospholipides dont les plus abondants sont les cardiolipines (CL) qui correspondent à des di-

PG. Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide quantitativement mineur

possédant une structure très particulière qui sera décrite plus en détail dans le chapitre 4 des

rappels bibliographiques. Enfin, certains phospholipides sont présents sous forme de lyso-

phospholipides c’est-à-dire ne possédant qu’une seule chaîne acyle.

Les phospholipides représentent environ 80% des lipides membranaires dont les

PC (35 à 50%), les PE (25 à 30%), les PS (10 à 15%) et les PI (5 à 8%). Toutefois il existe

une grande hétérogénéité de distribution des phospholipides entre les différents organes des

mammifères, entre les différents compartiments cellulaires et au sein même des membranes.

Par exemple les cardiolipines sont principalement présentes dans le cœur où elles représentent

jusqu’à 15% des phospholipides totaux (Hatch, 1998). Le PG, qui représente généralement

moins de 1% des phospholipides cellulaires, est très enrichi dans le surfactant pulmonaire



53

(Rooney et al., 1974 ; Sadana et al., 1988). Au niveau cellulaire, les cardiolipines sont

principalement localisées dans les membranes internes des mitochondries (Hatch, 1998) et le

BMP dans les endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2001a). Enfin, alors que les PC sont

davantage localisées dans le feuillet externe de la membrane plasmique, les PE et surtout les

PS sont généralement enrichies dans le feuillet interne (Yamaji-Hasegawa et Tsujimoto,

2006).

Les phospholipides se distinguent également par la nature de la liaison chimique

qui relie la chaîne grasse au résidu glycérol en position sn-1. Il existe trois types de chaînes :

les chaînes acyles (liaisons esters), les chaînes alkyles (liaisons éthers) et les chaînes alkényles

(liaisons vinyl-éthers) (Figure 14). Dans les membranes biologiques, les phospholipides sont

majoritairement présents sous la forme de diacyl-PL. Au niveau de la position sn-2 il s’agit

toujours d’une chaîne acyle. Ainsi les phospholipides sont également présents dans les

cellules sous forme de 1-alkyl-2-acyl-PL et de 1-alkényl-2-acyl-PL, ces derniers étant appelés

plasmalogènes. Les plasmalogènes-PE ont été détectés dans la plupart des organes de

mammifères et types cellulaires, et représentent parfois jusqu’à 50% des PE totales

notamment dans le cerveau, les plaquettes et les macrophages (Diagne et al., 1984 ;

Nakagawa et al., 1985 ; Takamura et al., 1989). Les chaînes alkényles reliées au glycérol en

position sn-1 sont principalement le 16:0, le 18:0 et les 18:1n-7 et 18:1n-9, alors que les

chaînes acyles en position sn-2 des plasmalogènes-PE sont principalement polyinsaturés

comme l’AA, l’EPA et le DHA (Akoh et Chapkin, 1990 ; Kikuchi et al., 1999 ; Zemski Berry

et Murphy, 2004). Des études ont également montré que les plasmalogènes-PE seraient

impliqués dans le métabolisme du DHA (Gaposchkin et Zoeller, 1999) et agiraient comme

des réservoirs d’acides gras polyinsaturés (Nagan et Zoeller, 2001).

Enfin les phospholipides se distinguent par leur composition en acides gras. Il est

connu que les acides gras saturés sont davantage estérifiés en position sn-1 et les acides gras

insaturés, notamment l’AA et le DHA, en position sn-2. La composition en acides gras des

phospholipides varie en fonction des organes et des tissus mais aussi de la sous-classe de

phospholipide considérée. Par exemple, par rapport aux autres organes, les phospholipides du

cerveau et de la rétine sont plus riches en DHA (Breckenridge et al., 1972 ; Wiegand et

Anderson, 1983). De plus, les PC contiennent généralement une plus grande proportion

d’acides gras saturés (16:0 et 18:0) par rapport aux PE et aux PS qui contiennent plus d’acides

gras insaturés (Glomset, 2006).



54

Figure 14 : Structures et représentations des phospholipides.

16:0,18:1 phosphatidylcholine (PC) 16:0 lyso-phosphatidylcholine (LysoPC)

16:0,18:1 phosphatidyléthanolamine (PE) 16:0p,18:1 phosphatidyléthanolamine(Plasmalogène PE)

16:0,18:1 phosphatidylsérine (PS) 16:0,18:1 phosphatidylglycérol (PG)

16:0,18:1 phosphatidylinositol (PI)16:0,18:1 phosphatidylinositol-4,5-diphosphates (PIP2)

acide 16:0,18:1 phosphatidique (PA)

18:2 cardiolipine (CL)

acide gras

acide gras

glycérol phosphate alcool

sn-1

sn-3

sn-2

partie hydrophobe partie hydrophile

di18:1 bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP)

CHAÎNE ACYLE CHAÎNE ALKYLE CHAÎNE ALKENYLE

R = acide gras

Structure générique d’un glycérophospholipidefaisant apparaître le nom des composants initiaux



55

2.3 Métabolisme des phospholipides

2.3.1 Biosynthèse des phospholipides

La biosynthèse des phospholipides a été décrite par Kennedy et Weiss en 1956.

L’acide phosphatidique (PA) est l’intermédiaire commun à la synthèse de tous les

phospholipides (Figure 15). Le PA est formé à partir du glycérol-3-phosphate grâce à une

première acylation qui forme du lysoPA et une deuxième acylation qui aboutit à la formation

de diacyl-PA. Le PA est alors hydrolysé par une PA-phosphohydrolase pour former un DAG

qui est le précurseur commun des PC et des PE. Celles-ci sont formées par condensation du

DAG avec une CDP-choline ou une CDP-éthanolamine. Le PA peut également réagir avec la

cytidine triphosphate (CTP) pour former de la cytidine diphosphate-DAG (CDP-DAG) qui est

le précurseur commun des PI et du PG (Berg et al., 2002 ; Kennedy et Weiss, 1956 ; Kent,

1995 ; Vance et Vance, 1996).

Les PC et les PE sont principalement synthétisées via la voie faisant intervenir

une CDP-choline ou une CDP-éthanolamine mais il existe également des voies alternatives

mineures. Les PC peuvent être formées à partir des PE grâce à trois méthylations successives

de leur groupement amine primaire (Vance et Schneider, 1981) et les PE peuvent être formées

à partir des PS grâce à une réaction de décarboxylation (McMaster et Choy, 1992). Chez les

animaux les PS ne peuvent être formées que par un échange de base avec une PE (Hubscher et

al., 1959 ; Vance et Vance, 1996).

Les PI sont synthétisés directement à partir du CDP-DAG et de l’inositol grâce à

l’enzyme PI-synthase. De même la synthèse du PG s’effectue à partir du CDP-DAG, mais en

deux étapes. Le CDP-DAG réagit d’abord avec un glycérol-3-phosphate pour former du PG-

phosphate qui est alors hydrolysé pour former du PG (Kiyasu et al., 1963). Les cardiolipines

sont formées dans les mitochondries à partir de PG et de CDP-DAG (Hatch, 1998). Cette

réaction est catalysée par l’enzyme cardiolipine-synthase présente dans les mitochondries

(Schlame et Hostetler, 1997). Les cardiolipines peuvent également être converties en PG +

PA par action d’une phospholipase D (Astrachan, 1973). Enfin, la biosynthèse du BMP à

partir du PG sera décrite dans le chapitre 4 des rappels bibliographiques.



56

DAG

PAlysoPAGlycérol-3-phosphate

PC

CDP-Ethanolamine CDP-choline

PE

PS

éthanolamine

sérine

3 S-Adenosylmethionine

3 S-Adenosylhomocystéine

Figure 15 : Biosynthèse des principaux phospholipides.



57

PI

CDP-DAG

PG-phosphatePG

inositol

Glycérol-3-phosphate

CDP-DAG

PA

cardiolipine



58

2.3.2 Remodelage des phospholipides

Les phospholipides qui sont synthétisés de novo possèdent la même composition

en acides gras que les PA ayant servi de précurseurs. Mais une fois formés, les phospholipides

cellulaires subissent un remodelage constant de leurs chaînes acyles. Dès 1963, Lands et

Merkel proposaient un mécanisme de remodelage des phospholipides par un cycle de dé-

acylation/ré-acylation (cycle de Lands) (Lands et Merkl, 1963). Un autre mécanisme de

remodelage des PL implique des réactions de transacylation dépendantes ou indépendantes du

coenzyme A. Ces mécanismes de remodelage des phospholipides font intervenir un grand

nombre d’enzymes dont certaines possèdent des spécificités de substrat pour les acides gras

saturés ou poly-insaturés, ainsi que pour les différentes sous-classes de phospholipides.

2.3.2.1 Les phospholipases

Les phospholipases constituent un groupe d’enzymes capables d’hydrolyser les

phospholipides. Leur classification principale est basée sur leur site d’action sur les

phospholipides. Les phospholipases A hydrolysent les chaînes acyles en position sn-1 (PLA1)

ou en position sn-2 (PLA2). Certaines enzymes, appelées phospholipases B, ont la capacité

d’hydrolyser les deux chaînes acyles. A celles-ci s’ajoutent également des lysophospholipases

qui hydrolysent l’unique acide gras estérifié dans un lysoPL. Les phospholipases C et D sont

des phosphodiestérases. Les PLC hydrolysent la liaison glycérophosphate et génère ainsi un

DAG et la tête polaire du PL. Les PLC sont principalement impliquées dans l’hydrolyse du

phosphatidylinositol-2-phosophate (PIP2) qui libère de l’inositol-triphosphate (IP3) impliqué

dans différentes voies de signalisation (Berridge, 1993). Enfin, les PLD hydrolysent la liaison

entre le phosphate et le résidu alcool de la tête polaire du phospholipide, générant l’acide

phosphatidique (PA) (Figure 16).

Les PLA1 sont principalement présentent dans les lysosomes de foie de rat où

elles participent à la dégradation non spécifique des phospholipides (Franson et al., 1971).

Toutefois des PLA1 spécifiques de certains phospholipides comme les PS, les PI ou le PA ont



59

été décrites (Aoki et al., 2002 ; Sonoda et al., 2002 ; Ueda et al., 1993). Ces PLA1 participent

ainsi au remodelage des acyles gras en position sn-1 des phospholipides.

Les PLA2 constituent un groupe d’enzymes très diversifiées au regard de leur

fonction, localisation, régulation et spécificité de substrat (Kudo et Murakami, 2002). On

distingue selon la classification de Dennis (Dennis, 1994) neuf groupes de PLA2 qui peuvent

être regroupés en trois grandes classes : les PLA2 sécrétées (sPLA2) et les PLA2 cytosoliques

(cPLA2) qui sont toutes les deux calcium-dépendantes, et les PLA2 calcium-indépendantes

(iPLA2).

Les PLA2 sécrétées tirent leur nom du fait qu’elles ont d’abord été découvertes

dans les fluides digestifs du pancréas et de l’estomac ainsi que dans les venins de serpent.

Toutefois, des enzymes associées aux sPLA2 ont été découvertes depuis dans la plupart des

organes de mammifères et types cellulaires. Les sPLA2 ne possèdent pas de forte spécificité

de substrat vis-à-vis de la nature de l’acide gras mais il a été montré que certaines sPLA2

agissent préférentiellement sur les phospholipides anioniques comme les PE, les PS et le PG

par rapport aux phospholipides neutres comme les PC.

Les PLA2 cytosoliques (cPLA2) sont exprimées de manière constitutive dans la

majorité des tissus et cellules de mammifères (Hirabayashi et Shimizu, 2000). Ce sont des

enzymes solubles, présentes dans le cytoplasme des cellules, et qui peuvent être transloquées

vers la membrane plasmique en réponse à une augmentation de la concentration de calcium

(Diez et Mong, 1990). Il a été montré que les cPLA2 libèrent préférentiellement les acyles

gras à longues chaînes et polyinsaturés (Clark et al., 1991 ; Diez et al., 1992). Elles jouent

ainsi un rôle important dans la libération de l’acide arachidonique (AA) et donc dans

l’initiation des voies de signalisations dépendantes des différents composés bioactifs

synthétisés à partir de l’AA comme les prostaglandines, les leukotriènes ou le thromboxane

(Dennis, 1997).

Les PLA2 calcium-indépendantes (iPLA2) sont également présentes dans la

majorité des tissus et cellules de mammifères (Larsson Forsell et al., 1999) et sont impliquées

dans de nombreux mécanismes cellulaires comme la prolifération ou l’apoptose. De plus, les

iPLA2 semblent être les principales phospholipases impliquées dans le remodelage des

phospholipides (Balsinde et al., 1997 ; Ramanadham et al., 1999 ; Winstead et al., 2000). Des

études ont montré que certaines iPLA2 sont spécifiquement associées à la libération du DHA

présent en position sn-2 des phospholipides, notamment dans le cerveau où le DHA joue un



60

rôle métabolique important (Green et al., 2008 ; Strokin et al., 2003). D’autres iPLA2 ont été

décrites comme spécifiques des plasmalogènes (Capper et Marshall, 2001 ; Yang et al.,

1996).

2.3.2.2 Voies de dé-acylation/ré-acylation

Cette voie de remodelage des phospholipides, également appelée cycle de Lands

(Figure 17), nécessite au préalable la libération d’un des deux acyles gras par une PLA1 ou

une PLA2 générant ainsi un lysoPL. L’estérification d’un nouvel acide gras dans ce lysoPL se

déroule alors en deux temps. L’acide gras doit d’abord être activé sous forme d’acyl-CoA.

Cette réaction est catalysée par une acyl-CoA synthétase et nécessite la présence d’ATP et de

Mg2+. Il a été montré que dans la majorité des tissus, l’activité acyl-CoA synthétase est plus

forte pour l’acide arachidonique (AA, 20:4n-6) que pour les autres acides gras (MacDonald et

Sprecher, 1991 ; Reddy et Bazan, 1984a ). Une activité DHA-CoA synthétase a été mesurée

dans des extraits de cerveaux de rats (Reddy et Bazan, 1985) et de rétines (Reddy et Bazan,

1984b). Une autre enzyme, l’acyl-CoA hydrolase, catalyse la dissociation de l’acide gras et du

coenzyme A. La deuxième étape correspond au transfert de l’acide gras activé (acyl-CoA)

vers un lysoPL. Cette étape est catalysée par une acyl-CoA : lysoPL acyltransférase.

L’activité acyl-CoA : 1-acyl-2-lysoPC acyltransférase a été décrite dans les fractions

cytosoliques, microsomales et mitochondriales de nombreux tissus et types cellulaires

(Yamashita et al., 1997). Dans les plaquettes cette activité acyltransférase présente une large

préférence pour les acyl-CoA contenant des AGPI comme le 18:2, le 18:3 ou le 20:4

(McKean et Silver, 1985). En revanche, l’acyl-CoA : 2-acyl-1-lysoPC est plus spécifique des

PLA1

PLA2PLC

PLD

Figure 16 : Sites d’action des différentes phospholipases



61

acides gras saturés (Lands et Hart, 1965). Une activité DHA-CoA : lysoPC acyltransférase a

été mesurée dans des extraits membranaires de photorécepteurs (Guisto et al., 1986) et de

neutrophiles (Tou, 1986).

2.3.2.3 Voies de transacylation

La ré-acylation des lysoPL peut également s’effectuer par un mécanisme de

transacylation utilisant des phospholipides comme donneurs d’acides gras. Cette réaction est

catalysée par différentes enzymes appelées transacylases qui possèdent aussi des spécificités

de substrat vis-à-vis de l’acide gras transféré et vis-à-vis des phospholipides « donneurs » ou

« accepteurs ». Deux processus de transfert on été décrits, l’un étant dépendant du coenzyme

A, l’autre non. La transacylation CoA-dépendante a été mise en évidence la première fois

dans les microsomes de foie de rat et a depuis été retrouvée dans la plupart des tissus et types

cellulaires (Sugiura et al., 1988). Cette activité ne présente pas de forte spécificité de substrat.

En revanche, la transacylation CoA-indépendante, mise en évidence par Kramer et Deykin en

1983, est plus spécifique des acides gras polyinsaturés à longue chaîne comme l’AA, l’EPA et

le DHA (Kramer et Deykin, 1983 ; MacDonald et Sprecher, 1991 ; Robinson et al., 1985). Il a

notamment été montré que dans les macrophages alvéolaires de lapin et le cerveau de rat, les

transacylases CoA-indépendantes transfèrent de manière très sélective le DHA en position sn-

2 des lyso-plasmalogènes-PE (Masuzawa et al., 1989 ; Sugiura et al., 1985).

Figure 17 : Cycle de dé-acylation-ré-acylation (cycle de Lands)

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)


62

Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)

3.1 Généralités sur le DHA

3.1.1 Origine du DHA

Comme nous l’avons vu, le DHA (22:6n-3) est le plus long et le plus insaturé des

acides gras retrouvé en quantité substantielle dans les tissus humains. Il appartient à la famille

des oméga-3 (ω-3 ou n-3) avec, majoritairement, l’ALA (18:3n-3) et l’EPA (20:5n-3). L’ALA

est l’acide gras oméga-3 majoritaire apporté par l’alimentation. On le retrouve en grande

quantité dans les huiles végétales, notamment l’huile de lin, l’huile de colza ou l’huile de soja

ainsi que dans la plupart des produits agricoles (Whelan et Rust, 2006). L’ALA peut être

converti en EPA et DHA après avoir été consommé, grâce à une série d’élongations et de

désaturations (Figure 13). Toutefois, le pourcentage d’ALA converti en DHA dans

l’organisme humain est relativement faible (Brenna, 2002 ; Burdge et Calder, 2005), si bien

que la principale source d’EPA et de DHA reste l’alimentation (Abedin et al., 1999). Ces

acides gras ne sont présents que dans les produits animaux et principalement marins comme

les poissons gras des eaux froides (maquereau, saumon, thon…) ou les algues. Ainsi, les

huiles de poisson sont très riches en EPA et DHA et constituent leur principale forme d’apport

(Whelan et Rust, 2006). Le DHA ne peut pas être synthétisé directement à partir d’EPA,

nécessitant une double élongation de l’EPA en 24:5n-3 qui est désaturé en 24:6n-3 puis β-

oxydé en DHA. Un mécanisme de rétroconversion permet également la synthèse d’EPA à

partir du DHA (Conquer et Holub, 1997 ; Gronn et al., 1991). Une étude réalisée par Astorg a

montré qu’en France les quantités moyennes d’ALA, d’EPA et de DHA consommées par les

hommes adultes sont respectivement de 940 mg/jour, 150 mg/jour et 273 mg/jour (Astorg et

al., 2004).

3.1.2 Distribution du DHA

Chez les mammifères le DHA est retrouvé dans tous les tissus et types cellulaires

mais il représente en général moins de 5% des chaînes acyles des phospholipides. Toutefois, il



63

est très présent dans le cerveau, les spermatozoïdes et la rétine (plus précisément dans les

segments externes des bâtonnets) où il peut représenter jusqu’à 50% des acides gras

(Breckenridge et al., 1972 ; Neill et Masters, 1973 ; Wiegand et Anderson, 1983). Les espèces

moléculaires des phospholipides contenant du DHA sont principalement les 16:0/22:6,

18:0/22:6, 18:1/22:6 et 18:2/22:6 (Hicks et al., 2006). Toutefois, dans les tissus naturellement

riches en DHA, des espèces à di-DHA (22:6/22:6) ont également été détectées,

principalement dans la rétine (Delton-Vandenbroucke et al., 1998 ; Miljanich et al., 1979 ;

Wiegand et Anderson, 1983).

De plus, le DHA n’est pas réparti de manière homogène parmi les différentes

classes de phospholipides. Les PE et notamment les plasmalogènes-PE ainsi que les PS sont

généralement plus riches en DHA que les PC (Anderson et Sperling, 1971 ; Farooqui et

Horrocks, 2001 ; Glomset, 2006). Le DHA exogène s’incorpore également de manière

préférentielle dans ces phospholipides, généralement en position sn-2 et dans le feuillet

interne des membranes biologiques (Knapp et al., 1994 ; Morisaki et al., 1985 ; Zerouga et

al., 1996).

3.1.3 Incorporation du DHA dans les phospholipides in vitro et in vivo

Dans la plupart des cellules en culture, lorsque du DHA sous forme libre est

apporté de manière exogène il s’incorpore très rapidement dans l’ensemble des

phospholipides (Besson et al., 2006 ; Champeil-Potokar et al., 2004 ; Delton-Vandenbroucke

et al., 2001 ; Guillot et al., 2008 ; Wiesenfeld et al., 2001).

De plus, de nombreuses études d’incorporation ont été menées in vivo chez

l’animal et chez l’Homme. Bien que certains auteurs aient utilisé des infusions directes de

DHA, sous forme de microémulsions, dans la circulation sanguine (Yamazaki et al., 1991), en

règle générale, les supplémentations en DHA sont réalisées via le régime alimentaire. Le

DHA peut être apporté sous forme de triglycérides (TAG) dans les huiles de poisson

(EPA+DHA) ou les huiles de DHA pures, ou sous forme d’esters éthyliques. Une fois

consommés, les TAG ou les esters éthyliques subissent une hydrolyse enzymatique. Le DHA

libéré et les 2-MAG (dont ceux contenant le DHA en position sn-2 où il est majoritairement

estérifié) sont alors absorbés au niveau intestinal où ils re-forment rapidemment des TAG.

Ces TAG nouvellement formés sont sécrétés dans la lymphe sous forme de chylomicrons,

puis rejoignent la circulation sanguine. Les chylomicrons sont alors transportés vers les tissus



64

périphériques, notamment le foie et les tissus adipeux, où les TAG qu’ils contiennent sont

hydrolysés par la lipoprotéine lipase (LPL) liée à l’endothélium des capillaires. Les acides

gras libérés sont rapidement captés par les cellules puis ré-estérifiés dans les triglycérides ou

les phospholipides pour servir de forme de stockage d’énergie ou de constituants structurels

des membranes (Banno et al., 2002 ; Kroes et al., 2003 ; Krokan et al., 1993).

Ainsi, il a été montré chez l’animal qu’un régime alimentaire enrichi en DHA

induit une augmentation de la proportion de DHA associé aux phospholipides et aux TAG de

la plupart des organes et types cellulaires (McLennan et al., 1993 ; Robinson et al., 1993 ;

Sierra et al., 2008 ; Tamai et al., 2007). Des études menées chez l’Homme ont également

montré qu’une supplémentation en DHA induit une augmentation de la quantité de DHA dans

les cellules sanguines et le plasma (Katan et al., 1997 ; Milte et al., 2008 ; Thies et al., 2001 ;

Vidgren et al., 1997). En effet le DHA ingéré s’incorpore dans les phospholipides et les esters

de cholestérol qui ultérieurement circulent dans les lipoprotéines (communication personnelle

– projet « docoredox »). Le DHA qui est ainsi incorporé dans les éléments circulants se

retrouve également dans les plaques d’athérosclérose retirées de patients lors

d’endartérectomies (Rapp et al., 1991). Enfin, une étude clinique et chirurgicale menée chez

l’Homme a montré que le DHA ingéré sous forme d’huile de poisson s’incorpore dans les

phospholipides des cellules cardiaques (Metcalf et al., 2007).

3.2 Rôle des acides gras oméga-3 dans l’incidence des maladies cardiovasculaires

Depuis les années 70 le rôle bénéfique des acides gras polyinsaturés (AGPI)

oméga-3 a été rapporté pour un grand nombre de troubles et de pathologies humaines. Il s’agit

pour les principales des maladies cardiovasculaires, du cancer, des troubles de l’immunité et

même de certaines maladies du comportement comme la schizophrénie ou la dépression. Les

acides gras oméga-3 joueraient également un rôle majeur dans l’acuité visuelle et le

développement cérébral ainsi que dans les troubles liés au vieillissement comme la maladie

d’Alzheimer (Stillwell et Wassall, 2003 ; Stillwell, 2008).

De nombreuses revues générales concernant le rôle des acides gras oméga-3, et du

DHA en particulier, sur l’incidence des maladies cardiovasculaires ont été publiées ces



65

dernières années (Breslow, 2006 ; Harris et al., 2008 ; Lee et al., 2008 ; von Schacky et

Harris, 2007).

3.2.1 Les études épidémiologiques

Des études épidémiologiques ont été mené afin d’établir un lien de cause à effet

entre la consommation d’acides gras oméga-3 et l’incidence des maladies cardiovasculaires.

La première de ces études concernait les Eskimos du Groenland possédant un très faible taux

de mortalité due aux maladies cardiovasculaires malgré un régime riche en lipides. Il a alors

été proposé que ceci était dû à la grande quantité d’acides gras oméga-3 à longues chaînes

(EPA+DHA) présents dans leur régime alimentaire constitué presque exclusivement de

poissons (Bang et al., 1976 ; Din et al., 2004 ; Dyerberg et al., 1975).

Depuis, de nombreuses études d’observation et des méta-analyses ont mis en

évidence une corrélation inverse entre la consommation de poissons ou la concentration en

acides gras oméga-3 à longues chaînes dans la circulation sanguine, et le risque de décès lié à

un accident cardiovasculaire (Albert et al., 1998 ; Albert et al., 2002 ; Gillum et al., 2000 ; He

et al., 2004 ; Nagata et al., 2002).

3.2.2 Les études cliniques

Au delà de ces études épidémiologiques, des études cliniques ont cherché à tester

l’hypothèse selon laquelle une supplémentation du régime alimentaire en acides gras oméga-3

pourrait protéger les individus contre les maladies cardiovasculaires. La plupart de ces études

a été réalisée chez des individus ayant connu un premier accident cardiovasculaire non mortel.

On parle alors de prévention secondaire. En règle générale, au cours de ces études, les

individus sont divisés en deux groupes : un groupe contrôle (placebo) et un groupe « traité ».

Ce dernier est composé de patients ayant reçu des conseils diététiques sur leur consommation

de poissons ou ayant été placé sous supplémentation en acides gras oméga-3 à l’aide de

capsules d’huile de poisson. Les doses utilisées vont généralement de 800 mg/jour à 1,8 g/jour

selon les études.

Trois grandes études ont ainsi mis en évidence un rôle bénéfique des acides gras

oméga-3 sur le risque cardiovasculaire. Il s’agit des études DART (the Diet and Reinfarction



66

Trial) (Burr et al., 1989 ; Ness et al., 2002), GISSI-Prevenzione (Gruppo Italiano per lo

Studio della Sopravvivenza nell’Infarto Miocardico Prevenzione) (sans auteur, 1999 ;

Marchioli et al., 2002) et JELIS (Japan EPA Lipid Intervention Study) (Tanaka et al., 2008 ;

Yokoyama et Origasa, 2003). Dans cette dernière étude les auteurs ont étudié uniquement le

rôle de l’EPA, indépendamment du DHA.

Toutefois, d’autres études n’ont pas réussi à mettre en évidence ces mêmes effets

(Burr et al., 2003 ; Nilsen et al., 2001). Les conditions expérimentales de ces études ainsi que

l’analyse et l’interprétation des résultats ont parfois été critiquées. Ainsi, le rôle bénéfique des

acides gras oméga-3 à longues chaîne sur l’incidence des maladies cardiovasculaires restent

encore controversé (He et Song, 2006 ; Hooper et al., 2006 ; von Schacky et Harris, 2007).

3.2.3 Les mécanismes physiologiques mis en jeu

Malgré les nombreuses études suggérant un rôle protecteur des acides gras oméga-

3 contre les maladies cardiovasculaires, les mécanismes d’action par lesquels ils confèrent ces

bénéfices ne sont pas encore très bien compris.

Au niveau clinique il a été montré que les acides gras oméga-3 préviennent la

survenue d’arythmies fatales en diminuant le risque de fibrillation ventriculaire (Anand et al.,

2008 ; Calo et al., 2005), et augmentent la stabilité de la plaque d’athérosclérose en la rendant

moins vulnérable à la rupture (Rapp et al., 1991 ; Thies et al., 2003). De plus, chez des

patients ayant passé une angiographie coronarienne, Von Schacky et al. (1999) ont montré

qu’une supplémentation en EPA+DHA pendant plusieurs mois ralentit la progression de la

plaque.

Les acides gras oméga-3 à longues chaînes (EPA+DHA) affectent favorablement

plusieurs des facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires. Notamment, ils

induisent une diminution du taux de triglycérides plasmatiques (Harris, 1997 ; Milte et al.,

2008), de la pression sanguine (Geleijnse et al., 2002), du rythme cardiaque (Mozaffarian et

al., 2005), de l’agrégation plaquettaire (Din et al., 2008), de l’inflammation (Calder, 2008) et

du stress oxydant (Mori, 2004).



67

Enfin, il a été montré que les LDL enrichies en oméga-3 ont des propriétés

physiques, chimiques et biologiques qui les rendent moins athérogènes (Lada et al., 2003 ;

Lada et Rudel, 2004 ; Parks et Gebre, 1991 ; Wu et al., 2002), notamment leur oxydabilité est

diminuée (communication personnelle – projet « docoredox »). En revanche, un

enrichissement physiologique des HDL en oméga-3 ne modifie pas leur capacité à stimuler

l’efflux du cholestérol des macrophages (Buonacorso et al., 2007 ; Gillotte et al., 1998b).

Bien que le rôle bénéfique des acides gras oméga-3 sur la santé cardiovasculaire

soit largement documenté, la question des doses recommandées pour la prévention des

maladies cardiovasculaires reste encore aujourd’hui un sujet de discussions (Deckelbaum et

Akabas, 2006). Notamment des études ont montré que le DHA a un effet anti-oxydant à

faibles doses mais devient pro-oxydant à des concentrations plus élevées (Vericel et al.,

2003). l’AHA (American Heart Association) a publiée ses recommandations concernant la

consommation d’oméga-3 (Kris-Etherton et al., 2003). Il est conseillé d’apporter une

supplémention en oméga-3 sous forme de capsules d’huiles de poissson uniquement pour les

personnes présentant un risque de maladie cardiovasculaire ou souffrant

d’hypertriglycéridémie.

3.3 Rôles cellulaires du DHA

3.3.1 Structure et dynamique moléculaires du DHA dans les membranes

De nombreux travaux ont été réalisés afin de déterminer la structure et la

conformation du DHA estérifié dans les phospholipides membranaires. Il a ainsi été montré

grâce à la résonnance magnétique nucléaire (RMN), la diffraction à rayon-X et la

modélisation moléculaire que les six doubles liaisons cis non conjuguées confèrent au DHA

une très grande flexibilité par rapport aux acides gras saturés. Le DHA possède donc un grand

nombre de conformères possibles avec une vitesse de transition très élevée entre ces

différentes conformations (Feller, 2008 ; Gawrisch et Soubias, 2008). Il a toutefois été

proposé que dans les membranes, le DHA adopte préférentiellement une forme très recourbée

voire en hélice (Huber et al., 2002).



68

3.3.2 Modification des propriétés membranaires

Le DHA estérifié en position sn-2 des phospholipides induit de fortes

modifications des propriétés membranaires (Stillwell et Wassall, 2003). La présence de six

doubles liaisons modifie le compactage moléculaire des phospholipides membranaires,

induisant une diminution de la température de transition entre les phases gel et cristal liquide

(Niebylski et Salem, 1994). Le DHA augmente également la fluidité (Hashimoto et al., 1999 ;

Kamada et al., 1986) et la perméabilité des membranes vis-à-vis de l’eau, des ions et de

molécules plus grosses comme le glucose, le glycérol ou des substances thérapeutiques

(Brand et al., 1994 ; Burns et Spector, 1990 ; Huster et al., 1997). Il a été montré que le DHA,

ainsi que les autres acides gras polyinsaturés, induisent une courbure de la membrane qui

présente alors une plus forte propension à former des vésicules et à fusionner (Ehringer et al.,

1990 ; Talbot et al., 1997). Enfin, le DHA augmente le « flip-flop », c’est-à-dire qu’il stimule

le mouvement des molécules membranaires entre les deux feuillets de la bicouche de

phospholipides (Armstrong et al., 2003).

3.3.3 DHA et microdomaines membranaires

Les membranes cellulaires des cellules eucaryotes contiennent des domaines

membranaires résistant aux détergents. Ces microdomaines, également appelées radeaux

lipidiques, sont composés principalement de cholestérol, de sphingolipides et de

phospholipides contenant des acides gras saturés, et servent de plateformes pour un certain

nombre de protéines impliquées dans des voies de signalisation (voir chapitre 1 des rappels

bibliographiques).

Récemment, de nombreuses études ont montré que l’incorporation de DHA dans les

membranes modifie l’organisation des microdomaines membranaires et la fonction des

protéines associées (Chapkin et al., 2008 ; Chen et al., 2007 ; Duraisamy et al., 2007 ; Fan et

al., 2003 ; Ma et al., 2004 ; Stillwell et al., 2005).

Il a été montré que le cholestérol possède une plus grande affinité pour les acides

gras saturés et monoinsaturés que pour les acides gras polyinsaturés. En effet, la flexibilité du

DHA gênerait l’association proche avec une molécule de cholestérol beaucoup plus rigide.



69

Ainsi, la présence de DHA réduit considérablement la solubilité du cholestérol dans les

membranes (Brzustowicz et al., 2002a ; Brzustowicz et al., 2002b ; Pitman et al., 2004 ;

Shaikh et al., 2003 ) et affecterait également l’orientation de la molécule de cholestérol au

sein de la bicouche de phospholipides (Harroun et al., 2006 ; Marrink et al., 2008).

Wassal et Stillwell ont émis l’hypothèse que la faible affinité du DHA vis-à-vis du

cholestérol constitue un mécanisme capable de créer des domaines membranaires spécifiques,

riches en DHA et pauvres en cholestérol (Soni et al., 2008 ; Wassall et al., 2004 ; Wassall et

Stillwell, 2008). Contrairement aux microdomaines riches en cholestérol, les domaines riches

en DHA seraient plus larges et hautement désorganisés mais pourraient fournir un

environnement nécessaire à l’activité de certaines protéines membranaires comme la

rhodopsine (Bennett et Mitchell, 2008).

3.3.4 Le DHA comme médiateur lipidique et activateur de gènes

Les acides gras polyinsaturés tels que l’AA, l’EPA et le DHA servent de

précurseurs à la synthèse, par oxydation enzymatique, d’un grand nombre de médiateurs

lipidiques (voir chapitre 5). Le DHA en particulier est utilisé comme précurseur pour la

synthèse de médiateurs bioactifs appelés docosanoïdes (composés de 22 atomes de carbone).

Il s’agit entre autres des résolvines de la série D (RvD) et des protectines de la série D (PD)

également appelées neuroprotectines (Serhan, 2005 ; Serhan et al., 2007). Il a été montré que

ces médiateurs lipidiques issus du DHA jouent un rôle important dans le processus de

terminaison de l’inflammation (Ariel et Serhan, 2007 ; Serhan et al., 2008). La

neuroprotectine D1 est également impliquée dans le maintien de l’intégrité des cellules

neuronales et de la rétine (Bazan, 2005 ; Lukiw et al., 2005).

Le DHA ainsi que d’autres AGPI peuvent également modifier l’expression de

certains gènes en se liant à des récepteurs nucléaires (Jump, 2002 ; Sampath et Ntambi, 2005).

Ainsi, il a été montré in vivo qu’un régime alimentaire enrichi en huile de poisson entraîne des

modifications de l’expression de gènes impliqués dans l’oxydation, la synthèse, le transport et

le métabolisme des lipides. Les récepteurs nucléaires et facteurs de transcriptions impliqués

sont, entre autres, les PPAR, LXR/RXR et SREBP (de Urquiza et al., 2000 ; Kim et al., 1999

; Lee et Hwang, 2002 )



70

3.3.5 Rôle du DHA dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol

Certaines études se sont plus particulièrement intéressées au rôle des AGPI n-3, et

du DHA en particulier, sur le métabolisme cellulaire du cholestérol. Toutefois, des effets

divergents ont souvent été rapportés probablement car les mécanismes de régulation mis en

jeu dépendent des modèles cellulaires, du type d’acides gras utilisé ainsi que des

concentrations.

Il a été montré que l’efflux du cholestérol est augmenté dans des cellules en

culture préalablement enrichies en AGPI n-3 (Dusserre et al., 1995 ; Pal et Davis, 1990). Yu-

Poth et al. (2005) ont montré que le DHA stimule l’expression du gène codant le récepteur

aux LDL indépendamment de l’ACAT et de SREBP-1. Des études plus anciennes réalisées

par l’équipe de Davis avaient indiqué qu’une supplémentation en acides gras oméga-3

diminuait l’activité ACAT par rapport à une supplémentation en acides gras oméga-6 ou

oméga-9 (Davis, 1992 ; Pal et Davis, 1991). Certaines études ont montré, dans des

monocytes/macrophages en culture, que les AGPI n-3 (EPA+DHA) stimulent la transcription

du gène codant pour le récepteur « scavenger » CD36 (Vallve et al., 2002) alors que d’autres

ont mis en évidence un effet opposé (Pietsch et al., 1995).

De plus, les acides gras oméga-3 ou leur dérivés sont des ligands des facteurs de

transcription PPAR (Gani, 2008) et LXR/RXR (de Urquiza et al., 2000) qui régulent

l’expression de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)


71

Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)

4.1 Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP

4.1.1 Découverte et distribution du BMP

Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP), parfois appelé acide lyso-bis-

phosphatidique (LBPA), est un phospholipide quantitativement mineur découvert pour la

première fois dans les macrophages des alvéoles pulmonaires (PAM) de lapin, de rat et de

porcs par Body et Gray en 1967 (Body et Gray, 1967). Il a ensuite été mis en évidence dans

de nombreux tissus de mammifères où il ne représente généralement que 1 à 2 % des

phospholipides totaux (Baxter et al., 1969 ; Rouser et al., 1969 ; Siakotos et al., 1969 ; Simon

et Rouser, 1969). Toutefois, dans les PAM, le BMP représente plus de 15% des

phospholipides totaux (Huterer et Wherrett, 1979 ; Mason et al., 1972).

Le BMP a également été détecté dans de nombreuses cellules en cultures comme

les fibroblastes BHK (Brotherus et Renkonen, 1974), les cellules PC12 (Holbrook et al.,

1992), les cellules CHO (Hullin-Matsuda et al., 2007), les cellules utérines stromales UIII

(Luquain et al., 2000) et les macrophages RAW et THP-1 (Besson et al., 2006 ; Waite et al.,

1990).

4.1.2 Localisation subcellulaire du BMP

Des études anciennes, utilisant différentes techniques de fractionnement cellulaire,

ont mis en évidence que le BMP était très concentré dans les fractions lysosomales extraites

de foie de rat sains (Bleistein et al., 1980 ; Kamrath et al., 1984 ; Wherrett et Huterer, 1972)

et de cellules BHK (Brotherus et Renkonen, 1977a, b). Le BMP a également été retrouvé

enrichi dans les vésicules d’endocytose des macrophages alvéolaires (Mason et al., 1972).

Plus récemment l’équipe de Gruenberg et Kobayashi a produit et utilisé un

anticorps monoclonal (6C4) anti-BMP pour étudier en immunofluorescence la localisation

subcellulaire du BMP. Il s’agit d’un anticorps monoclonal obtenu par la technique des

hybridomes. Après injection chez des souris de fractions membranaires d’endosomes isolées



72

de cellules BHK, des plasmocytes ont été isolés à partir de la rate des souris et fusionnés avec

des myélomes. Ces cellules hybrides, appelées hybridomes, après sélection et multiplication

dans un milieu de culture approprié, produisent des anticorps monoclonaux. Les travaux du

Dr Toshihide Kobayashi ont par la suite permis d’isoler un anticorps particulier nommé 6C4

dont l’antigène reconnu spécifiquement est le BMP (Kobayashi et al., 1998b). Ainsi, des

études d’immunofluorescence réalisées avec cet anticorps anti-BMP sur des cellules BHK ont

révélé une distribution ponctuée et périnucléaire du BMP, et colocalisée avec les protéines

rab7 et lgp120 qui sont des marqueurs des endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1998b). Des

résultats similaires ont été obtenus sur des fibroblastes de peau (Kobayashi et al., 1999) et sur

des macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). Le BMP est maintenant considéré comme un

marqueur des endosomes tardifs (Schmid et Cullis, 1998).

Enfin, une technique de fractionnement cellulaire utilisée sur des BHK a

également permis de montrer que le BMP est localisé quasi-exclusivement dans les

endosomes tardifs où il représente environ 15% des phospholipides (Kobayashi et al., 1998b).

Des études plus précises de fractionnement cellulaire ont montré que le BMP est localisé

uniquement dans les membranes internes des endosomes tardifs et qu’il forme des

microdomaines spécifiques où il représente environ 80% des phospholipides (Kobayashi et

al., 2001a ; Kobayashi et al., 2001b ; Kobayashi et al., 2002). Ces domaines riches en BMP se

distinguent d’un autre type de domaine également présent dans les membranes internes des

endosomes tardifs mais qui présente au contraire un enrichissement en PC (Kobayashi et al.,

2002).

4.2 Structure du BMP

4.2.1 Le squelette glycérophosphate

Le BMP est un isomère structural du phosphatidylglycérol (PG). Ces deux

phospholipides sont constitués de deux résidus glycérols reliés par un groupement phosphate

et de deux chaînes acyles. Les deux chaînes acyles du PG sont estérifiées sur le même

glycérol qui est appelé glycérol primaire, en opposition au glycérol secondaire constituant la

partie hydrophile du phospholipide. Au contraire, pour le BMP, une seule chaîne acyle est

estérifiée au glycérol primaire, l’autre étant estérifiée au glycérol secondaire (Figure 19).



73

D’un point de vue structural, ceci confère au BMP une symétrie et une forme conique. De

plus, la partie hydrophile du BMP n’est alors composée que du groupement phosphate, ce qui

explique que le BMP soit l’un des phospholipides les plus hydrophobe (Figure 18).

La singularité du BMP réside toutefois dans la stéréoconfiguration de son

squelette glycérophosphate. Comme pour tous les phospholipides, les carbones du glycérol

primaire du PG et du BMP sont notés sn-1, sn-2 et sn-3 alors que les carbones du glycérol

secondaire sont numérotés sn-1’, sn-2’ et sn-3’. Les carbones sn-2 et sn-2’ sont asymétriques.

Tous les phospholipides naturels synthétisés in vivo à partir du glycérol-3-phosphate

(principalement les PC, PE, PS, PI et PG) possèdent une configuration R sur le carbone sn-2.

De manière conventionnelle, ceci correspond à une structure où les deux chaînes acyles sont

estérifiées en positions sn-1 et sn-2, et le groupement phosphate en position sn-3. En

revanche, le carbone sn-2’ du glycérol secondaire du PG possède une configuration S. Ceci

correspond donc à une structure où le glycérol secondaire est relié au phosphate au niveau du

carbone sn-1’. La formule exacte du PG naturel qui possède une stéréoconfiguration (R,S) est

donc 1-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-phospho-sn-1’-glycérol ou plus simplement sn-3:sn-1’PG

(Itabashi et Kuksis, 1997).

Contrairement à tous les autres phospholipides, le carbone sn-2 du BMP possède

une configuration S. Ainsi, afin de respecter la convention d’écriture des phospholipides, le

groupement phosphate est relié au carbone sn-1 du glycérol primaire. Comme pour le PG, le

carbone asymétrique sn-2’ possède une configuration S. Le BMP naturel possède donc une

stéréoconfiguration (S,S) et est noté sn-1:sn-1’BMP. Cette stéréoconfiguration (S,S), qui est

unique au BMP, a été décrite pour la première fois par Brotherus en 1974 à partir de BMP

isolé de cellules BHK (Brotherus et al., 1974). Par la suite cette même stéréoconfiguration a

été retrouvée pour du BMP isolé de foie de rat, de poumon de lapin et de porc (Joutti et al.,

1976 ; Joutti et Renkonen, 1979b) ainsi que de la lignée macrophagique RAW 264.7 (Waite et

al., 1990).

Deux autres phospholipides mineurs, beaucoup moins étudiés, possèdent

également une stéréoconfiguration (S,S). Il s’agit de l’acide bisphosphatidique (BPA) et de

l’acide semi-lyso-bisphosphatidique (SLBPA). Ces deux phospholipides possèdent donc le

même squelette glycérophosphate que le BMP mais avec respectivement 4 et 3 chaînes

acyles, ce qui semble mettre en évidence une relation métabolique proche entre ces deux

composés et le BMP (Somerharju et al., 1977).



74

Enfin, l’isomère sn-3:sn-1’ du BMP, correspondant à la configuration (R,S), a

également été détecté dans les cellules BHK grâce à des traceurs radioactifs (Joutti, 1979).

L’existence de cet isomère a ensuite été confirmée dans les macrophages RAW (Amidon et

al., 1996) et les cellules UIII (Luquain et al., 2000). Toutefois, l’ensemble de ces études

indique que seul le sn-1:sn-1’BMP s’accumule dans la cellule, suggérant que l’énantiomère

sn-3:sn-1’ ne serait qu’un intermédiaire dans la voie de biosynthèse du BMP.

4.2.2 La position des chaînes acyles

La question de la position des chaînes acyles sur le BMP est très controversée en

raison des difficultés expérimentales dues à la migration des chaînes acyles au cours de

l’analyse (Pluckthun et Dennis, 1982). En effet, Mason et al. indiquaient en 1972 que les

chaînes acyles du BMP extrait de macrophages alvéolaires étaient estérifiés en position sn-2

et sn-2’ alors que, plus tard, d’autres études ont montré que les chaînes acyles étaient, au

moins en partie, estérifiés en position sn-3 et sn-3’ (Cochran et al., 1987 ; Wherrett et Huterer,

Figure 19 : Structures du phosphatidylglycérol et du bis(monoacylglycéro)phosphate.

Figure 18 : Représentation en 3 dimensions du 18:1/18:1-BMP



75

1973). Toutefois, dans une étude plus récente, Kobayashi et al. (2002) ont montré que la

majorité du BMP in vivo possède ses deux chaînes acyles estérifiées en position sn-2 et sn-2’

bien que cette position soit thermodynamiquement instable. Il est finalement probable que le

BMP endogène soit en réalité un mélange d’isomères possédant différentes

stéréoconfigurations et positions d’acyles gras avec des proportions variables selon les

organes et types cellulaires (Luquain et al., 2000).

4.2.3 La composition en acides gras

La composition en acides gras du BMP est très variable selon les tissus et types

cellulaires. L’acide oléique (OA, 18:1n-9) est l’acide gras majoritaire du BMP dans les

macrophages alvéolaires (Mason et al., 1972), dans les cellules PC12 (Holbrook et al., 1992),

dans les cellules BHK (Kobayashi et al., 2002) et dans les monocytes/macrophages THP-1

(Besson et al., 2006). Dans de nombreux tissus et types cellulaires, le BMP est retrouvé

particulièrement riche en AGPI par rapport aux autres phospholipides. En effet, le DHA

(22:6n-3) est l’acide gras majoritaire dans les cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000) et le

foie de rat et de souris sains (communications personnelles). De grandes proportions de DHA

ont également été retrouvées dans les cellules PC12 (Holbrook et al., 1992) et les

macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). En revanche, ce sont principalement des AGPI de

la série n-6, dont le 18:2n-6 et le 20:4n-6, que l’ont retrouve dans le BMP des macrophages

alvéolaires (Mason et al., 1972) et le BMP extrait de testicules de rats où l’acide gras

majoritaire est le 22:5n-6 (Luquain et al., 2000).

4.3 La voie de biosynthèse du BMP

Le BMP est principalement synthétisé à partir du PG qui joue le rôle de

précurseur dans la voie de biosynthèse du BMP. Les cellules peuvent utiliser soit du PG

endogène qui est produit dans les mitochondries, soit du PG exogène capté à partir du milieu

extracellulaire.

De nombreuses études se sont intéressées à caractériser la voie de biosynthèse du

BMP utilisant du PG exogène comme précurseur. Poorthuis et Hostetler ont montré pour la



76

première fois que le PG pouvait être converti en BMP in vitro par la fraction lysosomale

isolée de foie de rat, et que cette conversion était d’origine enzymatique. Ces résultats

suggèrent que la synthèse in vivo du BMP à partir du PG à lieu dans les lysosomes, à pH

acide. Ces études montrent également que du BMP peut être produit directement à partir du

lyso-PG, et qu’une partie du PG est aussi convertie en acyl-PG. Les auteurs suggèrent que ces

deux composés pourraient être des intermédiaires dans la voie de biosynthèse du BMP qui

nécessiterait donc l’action de phospholipases et de transacylases (Poorthuis et Hostetler, 1975

; Poorthuis et Hostetler, 1976). Les cardiolipines peuvent également être converties en BMP

par la fraction lysosomale isolée de foie de rat, probablement via la formation de lyso-PG qui

est le produit majoritaire de l’hydrolyse des CL par les lysosomes (Poorthuis et Hostetler,

1978). Matsuzawa et al. (1978) ont ensuite isolé, à partir de lysosomes de foie de rat, une

fraction protéique soluble capable de catalyser la conversion du PG en BMP. Il a également

été montré que cette activité nécessite la présence de PI comme donneur d’acyles dans les

réactions de transacylation. Enfin, Joutti et Renkonen ont montré pour la première fois que le

BMP formé à partir du sn-3:sn-1’PG exogène possède bien la stéréoconfiguration unique sn-

1:sn-1’ (Joutti et Renkonen, 1979a) et qu’il se produit donc une inversion de la

stéréoconfiguration du squelette glycérophosphate du PG.

En 1980, Somerharju et Renkonen ont observé la conversion du PG et des CL

exogènes en BMP par des cellules BHK en culture et in vivo dans le foie de rat après injection

de ces deux précurseurs dans la circulation sanguine (Somerharju et Renkonen, 1980). Dans

cette étude, il a également été montré que le BMP nouvellement formé possède

majoritairement une stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ et que ce changement de

stéréoconfiguration met en jeu un mécanisme de réarrangement intramoléculaire du squelette

glycérophosphate du PG (Somerharju et Renkonen, 1980). Frentzen-Bertrams et Debuch ont

montré que lors de la conversion du PG exogène en BMP par la fraction lysosomale isolée de

foie de rat et par des cellules BHK en culture, le squelette glycérophosphate entier du PG est

conservé ainsi qu’une chaîne acyle sur les deux présentes initialement (Frentzen-Bertrams et

Debuch, 1981).

La voie de biosynthèse complète du BMP à partir de PG exogène et les enzymes

associées ont ensuite été largement étudiées par l’équipe de Waite grâce à des macrophages

en culture ou isolés des alvéoles pulmonaires de rat ou de lapin. Les macrophages alvéolaires

de lapin ne synthétisent pas de BMP de novo mais peuvent utiliser du PG exogène comme



77

précurseur. Il a été montré que lors de cette conversion, le squelette glycérophosphate est

conservé et que la coupure de la chaîne acyle en position sn-1 est une étape nécessaire. Ces

résultats suggèrent notamment que la richesse du surfactant pulmonaire en PG (Rooney et al.,

1974 ; Sadana et al., 1988) serait à l’origine de la grande quantité de BMP retrouvée dans les

macrophages alvéolaires in vivo (Waite et al., 1987).

L’utilisation de techniques de fractionnement cellulaire sur des macrophages

RAW 264.7 en culture a permis de montrer que le BMP nouvellement synthétisé à partir du

PG exogène est associé aux fractions cellulaires « légères » contenant la majeure partie du

BMP endogène (Waite et al., 1990). De plus, le BMP nouvellement synthétisé présente bien

la stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ (Thornburg et al., 1991). Il a été montré dans cette étude que

la stéréoconversion du carbone asymétrique sn-2 du PG résulte d’une réorientation directe du

squelette glycérophosphate pendant laquelle le carbone sn-1 du glycérol primaire, initialement

lié à une chaîne acyle, vient se lié au groupement phosphate. Les auteurs ont donc suggéré

l’existence d’une enzyme de réorientation stéréosélective possédant une activité PLA1

(Thornburg et al., 1991).

En 1995, Amidon et al. ont proposé une voie de biosynthèse complète du BMP à

partir du PG faisant intervenir une série complexe de réactions enzymatiques. D’après les

auteurs de cette étude, le PG est d’abord hydrolysé par une PLA2 pour former le 1-acyl-

lysoPG qui est alors ré-acylé sur le glycérol secondaire pour former le sn-3:sn-1’BMP. Cet

énantiomère du BMP, qui ne s’accumule pas dans la cellule, subit rapidement une

stéréoconversion de son squelette glycérophosphate accompagnée d’une perte de l’acide gras

estérifié en position sn-1, comme décrit précédemment (Thornburg et al., 1991). Cette

réaction génère du sn-1:sn-1’ lysoPG avec un acide gras estérifié sur le glycérol secondaire.

Enfin, ce composé est ré-acylé sur le glycérol primaire pour former le sn-1:sn-1’BMP (Figure

20). Différentes études ont ensuite cherché à caractériser les enzymes intervenant dans cette

voie de biosynthèse.

La première et la deuxième étape de cette voie de biosynthèse impliquent

respectivement une PLA2 et une transacylase. Il avait déjà été montré que les macrophages et

le foie de rat contiennent des PLA2 lysosomales (Franson et al., 1971 ; Franson et Waite,

1973) et que le lysoPG peut être ré-acylé par un mécanisme de transacylation faisant

intervenir un autre phospholipide comme donneur d’acyle (Hostetler et al., 1992 ; Huterer et

Wherrett, 1989 ; Huterer et al., 1993 ; Matsuzawa et al., 1978). A partir de macrophages

RAW, Amidon et al. (1996) ont réussi à distinguer par chromatographie les activités



78

phospholipases (PLA1 + PLA2) et transacylases présentes dans la fraction lysosomale.

Indépendamment, ces enzymes partiellement purifiées ne peuvent pas convertir le sn-3:sn-

1’PG en sn-3:sn-1’BMP alors que la recombinaison de leur activité restaure cette synthèse.

Une purification plus poussée de l’activité phospholipase a permis à la même équipe d’isoler

une PLA2 lysosomale Ca2+-indépendante spécifique du PG. Cette PLA2 présente également

une activité PLA1 ce qui la classe dans la famille des phospholipases B. De plus, cette

phospholipase présente une activité hydrolytique plus importante vis-à-vis de l’acide oléique

et de l’acide linoléique par rapport à l’acide arachidonique (Shinozaki et Waite, 1999).

L’activité transacylase, quant à elle, ne présente pas de spécificité vis-à-vis des positions sn-1

ou sn-2 de l’acide gras sur le lysoPG, mais semble catalyser préférentiellement le transfert du

deuxième acide gras en position sn-2’ (Amidon et al., 1996). Plus tard, la même équipe a

montré que l’enzyme qui catalyse la transacylation du lysoPG utilise un deuxième lysoPG

comme donneur d’acyle (Heravi et Waite, 1999).

Les étapes suivantes de la voie de biosynthèse proposée par Amidon et al. (1995)

n’ont jamais été étudiées plus en détail ou sans résultats probants, notamment l’enzyme de

réorientation n’a jamais été clairement identifiée.

En comparaison, la synthèse du BMP à partir de PG endogène (Kiyasu et al.,

1963) n’a été que très peu étudiée. Toutefois, il a été montré que dans la lignée cellulaire

CHO une mutation sur la PGP synthase entraîne une diminution de la synthèse de PG mais

aussi de celle du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007 ; Ohtsuka et al., 1993). De plus, lorsque

ces cellules déficientes sont transfectées avec l’ADNc correspondant au gène codant pour la

PGP synthase, la synthèse du PG ainsi que celle du BMP sont restaurées. Ces résultats

indiquent clairement que le PG endogène est utilisé par les cellules comme précurseur à la

synthèse du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007). Dans les lymphoblastes humains provenant

de patients souffrant du syndrome de Barth (BTHS) la synthèse et le métabolisme des CL sont

altérés (Schlame et Ren, 2006). Or, il a été montré que dans ces cellules la synthèse du BMP

n’est pas modifiée, suggérant que les CL ne sont pas utilisées comme précurseurs endogènes

pour la biosynthèse du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007).



79

4.4 Métabolisme du BMP

4.4.1 Modifications pathologiques et induites du BMP

Très tôt il a été montré que le BMP s’accumule dans le foie et la rate de patients

atteints de phospholipidoses ou de désordres métaboliques d’origine lysosomale comme la

maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) (Harder et al., 1984 ; Rouser et al., 1968 ; Weisz

et al., 1994 ; Yamamoto et al., 1970). Des quantités importantes de BMP ont également été

retrouvées dans différents tissus de souris présentant de tels désordres métaboliques d’origine

lysosomale (Jabs et al., 2008 ; Nakashima et al., 1984). Toutefois, toutes les lipidoses

affectant les lysosomes ne présentent pas d’accumulation significative de BMP (Kahma et al.,

1976). Une étude réalisée sur des fibroblastes en culture issus de patients souffrant de

différents désordres affectant les lysosomes a montré une augmentation de la quantité

Figure 20 : Voie de biosynthèse du BMP à partir du PG exogène.



80

cellulaire de BMP dans certaines pathologies, mais beaucoup moins importante que celle

observée précédemment dans les organes de patients. De plus, dans cette étude, les

fibroblastes NPC en culture ne présentent pas d’accumulation significative de BMP mais

simplement une augmentation de la proportion de l’espèce 18:1/18:1 par rapport à l’espèce

22:6/22:6 (Meikle et al., 2008). Il est connu cependant que les quantités cellulaires de BMP

peuvent évoluer selon les conditions de culture. Par exemple, la déplétion du milieu en sérum

entraine une prolifération des lysosomes et une augmentation de la quantité de BMP

(Brotherus et al., 1977). Il est donc possible que les conditions qui entraînent une

accumulation de BMP in vivo dans les organes de patients soient absentes des fibroblastes en

culture.

Certains agents pharmacologiques, principalement des drogues cationiques

amphiphiles comme la 4,4’-diethylaminoethoxyhexéstérol, la chloroquine, l’amiodarone, la

gentamicine, l’amantadine et le triton, induisent des phospholipidoses chez l’animal qui

miment le phénotype observé au niveau des lysosomes dans les lipidoses humaines d’origine

pathologique. Or il a été montré que ces agents pharmacologiques provoquent une très forte

accumulation de BMP, ainsi que d’autres phospholipides acides, dans les lysosomes de foie

de rats traités (Adachi et al., 1972 ; Huterer et al., 1975 ; Matsuzawa et Hostetler, 1980 ;

Tjiong et Debuch, 1978 ; Yamamoto et al., 1976). De plus, le BMP qui s’accumule lors de ces

lipidoses induites présente un enrichissement important en acides gras polyinsaturés,

notamment en DHA (Harder et Debuch, 1982 ; Ito et al., 2002 ; Tjiong et al., 1978). Ces

mêmes observations ont également été réalisées chez des patients traités au 4,4’-

diethylaminoethoxyhexéstérol (Kasama et al., 1974 ; Yamamoto et al., 1971). Ainsi, il a été

proposé que le BMP, et notamment le 22:6/22:6-BMP, pourrait servir de marqueur pour

certaines lipidoses (Baronas et al., 2007 ; Mortuza et al., 2003).

Les mécanismes mis en jeu dans ces lipidoses induites n’ont pas été clairement

identifiés. Toutefois, il a été montré que les agents pharmacologiques utilisés s’accumulent

dans les lysosomes de foie de rats traités. Certains auteurs ont ainsi proposé que les effets

seraient dus à une inhibition des phospholipases lysosomales via la formation de complexes

entre les phospholipides et les agents pharmacologiques (Harder et al., 1980 ; Harder et al.,

1981 ; Hostetler et Richman, 1982 ; Hostetler et al., 1985 ; Pappu et Hostetler, 1984). De plus,

il a été montré que la fraction lysosomale isolée du foie de rats traités présente un taux de

conversion in vitro du PG en BMP beaucoup plus important que la fraction lysosomale isolée

du foie de rats sains (Frentzen-Bertrams et Debuch, 1981).



81

4.4.2 Dégradation enzymatique et remodelage des acyles gras du BMP

Différentes lipases lysosomales ont été décrites comme catalysant la dégradation

complète des phospholipides (Franson et al., 1971 ; Mellors et Tappel, 1967 ; Stoffel et

Greten, 1967). Toutefois, il a été montré que dans les cas de lipidoses induites chez le rat,

l’accumulation du BMP dans les lysosomes du foie persiste longtemps après l’arrêt du

traitement, suggérant pour la première fois une dégradation beaucoup plus lente du BMP que

des autres phospholipides (Yamamoto et al., 1971).

Différentes études réalisées in vitro ont montré que la fraction lysosomale extraite

de foie de rat contient des enzymes capables de dégrader le BMP. Une activité

phosphodiestérase générant du lysoPA et du monoacylglycérol (MAG) a été mesurée, ainsi

qu’une activité phospholipase A générant du lysoPG et un acide gras (Huterer et Wherrett,

1982 ; Matsuzawa et Hostetler, 1979). Dans ces études, il a cependant été noté que le taux de

dégradation du BMP par rapport aux autres phospholipides est très lent. Il a été suggéré que la

stéréoconfiguration particulière sn-1:sn-1’ du BMP pourrait lui conférer cette résistance vis-à-

vis des enzymes hydrolytiques. De plus, le lysoPG généré lors de l’hydrolyse du BMP

pourrait être rapidement reconverti en BMP (Poorthuis et Hostetler, 1976) résultant en un

cycle futile (Matsuzawa et Hostetler, 1979). Toutefois, en 2002, Ito et al. ont extrait des

testicules de rat une PLA2 capable d’hydrolyser efficacement le BMP à pH acide.

Des études d’incorporation d’acides gras et de phosphate radioactifs dans les

différentes classes de phospholipides cellulaires ont montré que le BMP incorpore rapidement

les acides gras exogènes par rapport aux autres phospholipides, et qu’il possède un

remodelage très rapide de ses acides gras par rapport à celui de son squelette

glycérophosphate (Huterer et Wherrett, 1979). De plus, il a été montré dans les macrophages

alvéolaires que le BMP incorpore plus rapidement et plus efficacement l’acide arachidonique

(AA, 20:4n-6) par rapport à l’acide oléique (OA, 18:1n-9) et à l’acide palmitique (16:0),

suggérant l’importance du BMP dans le métabolisme de cet acide gras et la génération des

différents eicosanoïdes (Cochran et al., 1985 ; Cochran et al., 1987 ; Huterer et Wherrett,

1979). Les auteurs suggèrent également, au vu de la résistance du BMP aux PLA1 et PLA2

classiques, que le remodelage rapide des acyles gras du BMP impliquerait des mécanismes de

transacylation (Cochran et al., 1987 ; Waite et al., 1992).



82

Enfin, il a été montré que le DHA s’incorpore très rapidement et de manière

hautement sélective dans le BMP des macrophages alvéolaires (Huterer et Wherrett, 1986),

des fibroblastes (Huterer et Wherrett, 1986), des cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000),

des cellules BHK et des macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). Il a ainsi été proposé que

cette propriété soit commune à l’ensemble des cellules de mammifère (Besson et al., 2006).

De plus, dans cette dernière étude, il a été montré que l’incorporation du DHA dans le BMP

des macrophages THP-1 est beaucoup plus importante que celle de l’AA ou de l’EPA

suggérant un rôle essentiel du BMP dans le métabolisme du DHA.

4.5 Le rôle cellulaire du BMP

Le rôle cellulaire du BMP n’a été étudié que tardivement. Le premier outil utilisé

pour des études fonctionnelles a été l’anticorps monoclonal anti-BMP. Il a été montré sur des

cellules BHK que l’anticorps anti-BMP ajouté dans le milieu de culture est internalisé dans

les cellules par endocytose et qu’il s’accumule dans les endosomes où il se fixe à son

antigène. Ce traitement altère les propriétés et la structure des endosomes tardifs qui

présentent un réseau de membranes internes plus dense et plus compacte que dans les cellules

non traitées. De plus, la désorganisation des membranes internes par l’anticorps anti-BMP

altère le recyclage normal du récepteur IGF2/MPR (insulin-growth factor 2/mannose-6-

phosphate) lorsqu’il transite via les endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1998b ; Kornfeld,

1992).

Les endosomes tardifs constituent un important compartiment de stockage, de tri

et de redistribution de différentes molécules dont le récepteur IGF2/MPR ainsi que le

cholestérol dérivé de la captation des lipoprotéines de faible densité (voir chapitre 1). Or, il a

également été montré qu’un traitement avec l’anticorps anti-BMP sur des cellules en culture

entraîne une forte accumulation de cholestérol libre dans les endosomes tardifs, comme

observé dans des fibroblastes NPC (Liscum et Klansek, 1998) ou traités avec l’agent

pharmacologique U18666A connu pour altérer le transport intracellulaire du cholestérol

(Kobayashi et al., 1999). L’ensemble de ces résultats indique que les domaines riches en BMP

jouent un rôle majeur dans la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs, et

donc dans le maintien et la régulation des différentes fonctions endosomales dont le transport

intracellulaire du cholestérol.



83

Par ailleurs, une étude utilisant un système acellulaire pour mesurer le transfert du

cholestérol d’une membrane à une autre a permis de montrer que le BMP stimule le transfert

de cholestérol par la protéine endosomale NPC2 (Babalola et al., 2007 ; Cheruku et al., 2006).

Le syndrome antiphospholipide se caractérise par diverses manifestations

cliniques et est associé à la présence, dans la circulation sanguine, d’anticorps humoraux anti-

phospholipides. Les cibles de ces anticorps n’ont pas été clairement identifiées. Il a d’abord

été proposé qu’il s’agisse des cardiolipines ou de complexes phospholipides-protéines (Cines

et McCrae, 1995 ; Rauch et Janoff, 1996 ; Triplett, 2003). Cependant, il a été montré que les

anticorps isolés du plasma de patients souffrant de ce syndrome sont capables de se lier au

BMP et, une fois endocytés dans des cellules en culture, perturbent les membranes des

endosomes tardifs et le métabolisme du cholestérol, comme l’anticorps monoclonal anti-BMP

6C4 (Galve-de Rochemonteix et al., 2000 ; Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999).

Ceci suggère que ce syndrome est associé, au moins en partie, à une altération du

fonctionnement endosomal régulé par les domaines membranaires riches en BMP.

Il a également été montré que l’agent pharmacologique D-threo-1-phenyl-2-

décanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP) s’accumule dans les endosomes tardifs

des cellules BHK en culture et qu’il altère la structure et l’organisation des membranes riches

en BMP, indépendamment de son effet inhibiteur sur la synthèse des glycosphingolipides. De

plus, comme pour l’anticorps anti-BMP, le D-PDMP altère le fonctionnement des membranes

endosomales et l’homéostasie cellulaire du cholestérol. En effet, alors que le BMP stimule

l’activité lipase acide in vitro, l’accumulation de D-PDMP dans les endosomes tardifs inhibe

l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés de la captation des LDL, ce qui entraîne une

accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs (Makino et al., 2006).

Ces différentes études fonctionnelles réalisées sur des cellules en culture ont

toutes nécessité l’utilisation de l’anticorps anti-BMP ou d’agents pharmacologiques modifiant

de manière globale la structure et le fonctionnement des endosomes tardifs. En 2004, Matsuo

et al. ont montré que le BMP possède une capacité intrinsèque à stimuler la formation de

vésicules à l’intérieur de liposomes préparés in vitro et donc à générer des structures

semblables aux régions multi-vésiculaires des endosomes tardifs observées dans les cellules

en culture. De plus, il a été montré que cette capacité à former des vésicules dépend du

gradient de pH entre l’intérieur des liposomes qui doit être acide et l’extérieur qui doit être

neutre, comme c’est le cas pour les endosomes tardifs. Enfin, la présence de l’anticorps anti-



84

BMP inhibe la formation des vésicules internes (Matsuo et al., 2004). Ainsi, ces résultats

suggèrent que le BMP participe à l’évolution des endosomes précoces en corps multi-

vésiculaires et en endosomes tardifs. Toutefois, les mécanismes mis en jeu n’ont pas été

clairement identifiés. Le BMP est un phospholipide chargé négativement avec une tête polaire

très réduite et qui présente une structure spatiale en forme de cône. Il a donc été proposé que

ces propriétés structurales très particulières du BMP pourraient conférer aux microdomaines

riches en BMP la capacité d’induire une asymétrie au sein des membranes et de favoriser ainsi

le processus d’invagination et donc la formation de vésicules internes (Burger, 2000 ; Dikic,

2004 ; Matsuo et al., 2004).

Dans leur étude, Matsuo et al. (2004) ont également isolé une protéine cytosolique

appelée ALIX qui a la propriété d’être recrutée in vitro à l’intérieur des liposomes contenant

du BMP et formant des vésicules internes. Il est intéressant de noter qu’ALIX est associée à

certaines protéines du complexe ESCRT (« Endosomal Sorting Complex Required for

Transport ») impliqué dans l’invagination des membranes endosomales et la formation des

corps multi-vésiculaires (Hurley, 2008 ; Saksena et al., 2007), et que l’homologue d’ALIX

chez la levure, appelé Bro1, participe à la formation des endosomes multi-vésiculaires

(Odorizzi et al., 2003). Il a été montré que lorsque la protéine ALIX est ajoutée en excès, la

formation de vésicules internes dans les liposomes contenant du BMP est inhibée. De plus,

sur des cellules en culture, lorsque l’expression du gène codant pour ALIX est bloquée par

des siRNA, la quantité cellulaire de BMP diminue ainsi que le nombre d’endosomes tardifs et

le nombre de vésicules internes dans les endosomes tardifs. (Matsuo et al., 2004). Ainsi, ces

résultats indiquent que la protéine ALIX participe à la régulation du processus d’invagination

stimulé par le BMP et contrôle l’organisation des endosomes tardifs dans les cellules en

culture. Les auteurs suggèrent également que les membranes internes des endosomes tardifs

interagissent dynamiquement avec la membrane limitante grâce à des mécanismes de

fusion/fission contrôlés par le BMP et ALIX, probablement via une interaction directe avec

des complexes protéiques présents dans le cytosol (Dikic, 2004 ; Matsuo et al., 2004). De

plus, il a été montré que ces mécanismes de fusion membranaire qui impliquent le BMP et la

protéine ALIX à l’intérieur des endosomes tardifs sont essentiels à la libération de la

nucléocapside du VSV (Vesicular Stomatis Virus) dans le cytoplasme, étape qui initie

l’infection (Le Blanc et al., 2005). Dans les cellules où la protéine ALIX est sous-exprimée,

en plus de la diminution de la quantité de BMP, on observe une diminution de la quantité de

cholestérol qui est réversible par supplémentation des cellules avec du BMP exogène



85

(Chevallier et al., 2008). Les auteurs suggèrent dans cette étude que la capacité des

endosomes tardifs à stocker le cholestérol dépend directement de la quantité de BMP.

L’équipe d’Hayakawa a utilisé des membranes reconstituées et des modélisations

moléculaires pour étudier la structure et les propriétés physiques des membranes contenant du

BMP. Il a ainsi été montré que le BMP forme des domaines compacts et irréguliers par

rapport au PG qui forme des domaines plus circulaires. De plus, les propriétés physiques de

ces membranes à BMP, telle la température de transition de phase et l’enthalpie molaire,

suggèrent l’existence de fortes liaisons hydrogène entre les molécules de BMP. En effet, les

groupements hydroxyles (–OH) et phosphate interagissent avec ceux des molécules

adjacentes. Ainsi, les têtes polaires de chaque molécule de BMP s’arrangent de telle façon que

les chaînes acyles soient très proches les unes des autres. (Hayakawa et al., 2006 ; Hayakawa

et al., 2007a). Ces mêmes auteurs ont également observé, à l’aide de membranes

reconstituées, que l’association du BMP avec le ganglioside GM1 génère, à pH acide, des

structures lamellaires très compactées (Hayakawa et al., 2007b).

Enfin, il a été montré que le BMP stimule la dégradation enzymatique des

sphingolipides et glycosphingolipides dans les endosomes tardifs/lysosomes (Kolter et

Sandhoff, 2005 ; Wilkening et al., 2000). Les enzymes impliquées dans cette dégradation sont

des exohydrolases solubles nécessitant la présence de cofacteurs appelés SAPs (sphingolipid

activator proteins) ou saposines. Il a été montré que le BMP interagit directement avec la

saposine C et que cette interaction est impliquée dans le processus de dégradation des

sphingolipides (Chu et al., 2005 ; Linke et al., 2001).

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique


86

Chapitre 5 : La peroxydation lipidique

Le stress oxydant peut être décrit comme un déséquilibre entre la production de

radicaux libres et leur destruction par les systèmes de défenses anti-oxydantes. Le stress

oxydant, lié à une augmentation de la concentration de radicaux libres dans la cellule,

provoque diverses altérations telles que l’oxydation de l’ADN (Cooke et al., 2003) et des

protéines (Davies, 2003), la perturbation de l’homéostasie du calcium intracellulaire (Farber

et al., 1990) ou la peroxydation des lipides. Dans ce dernier cas il faut toutefois distinguer la

peroxydation lipidique enzymatique faisant intervenir entre autre les cyclooxygénases (COX)

et les lipoxygénases (LOX), et conduisant à la formation de divers eicosanoïdes et

docosanoïdes biologiquement actifs, et la peroxydation lipidique non-enzymatique faisant

intervenir les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS) et qui s’avère le plus souvent

néfaste.

5.1 Les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS)

Les radicaux libres sont des atomes ou des molécules contenant un électron non

apparié (identifié par •), ce qui explique leur très grande réactivité. Les ROS incluent tous les

radicaux oxygénés tels que l’anion superoxyde (O2•-), le radical hydroxyle (OH•), les

peroxyles (ROO•), les alkoxyles (RO•) et le monoxyde d’azote (NO•) ainsi que les espèces

non radicalaires dérivés de l’oxygène comme l’oxygène singulet (1O2) ou le peroxyde

d’hydrogène (H2O2). Les ROS se forment dans la cellule par des voies enzymatiques

(NAD(P)H oxydase, xanthine oxydase…) ou non. Les ROS sont des molécules très réactives

capables d’initier la peroxydation lipidique. Les métaux de transition (Fe2+/Fe3+, Cu+/Cu2+)

sont également des activateurs de l’oxydation (Bacot, 2004).

5.2 Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique

Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont des cibles privilégiées des ROS en

raison de leurs hydrogènes bis-allyliques facilement oxydables. Plus l’acide gras est insaturé,

comme l’acide arachidonique (20:4n-6) ou l’acide docosahexaénoïque (22:6n-3), plus il est



87

peroxydable (Cosgrove et al., 1987). Le cycle d’auto-oxydation des AGPI comporte trois

phases : une phase d’initiation, une phase de propagation et une phase de terminaison (Pre,

1991). Les AGPI peuvent être peroxydés lorsqu’ils sont sous forme libre ou estérifiés dans un

phospholipide, un ester de cholestérol ou un triglycéride. Bien qu’il soit beaucoup moins

sensible, le cholestérol peut également être la cible de ROS et former ainsi diverses molécules

de cholestérol oxydé appelés oxystérols (voir chapitre 1).

5.2.1 Les différentes phases

- La phase d’initiation

La peroxydation lipidique est initiée lorsqu’une espèce radicalaire (ROS) arrache un atome

d’hydrogène à un groupement méthylène (–CH2–) d’un AGPI (RH), aboutissant à la

formation d’un radical d’acide gras (R•) stabilisé par un phénomène de résonance (Figure 21).

- La phase de propagation

Dans cette étape d’amplification, le radical d’acide gras (R•) réagit avec l’oxygène (O2) pour

former un radical peroxyle (ROO•). Ce dernier est capable de réagir avec un autre AGPI

(R’H) entrainant la formation d’un hydroperoxyde d’acide gras (ROOH) et d’un nouveau

radical d’acide gras (R’•) qui assure la propagation de la réaction.

- La phase de terminaison

Cette étape conduit à la formation de composés stables soit par association de deux espèces

radicalaires qui se neutralisent, soit par l’intervention de molécules anti-oxydantes qui jouent

le rôle de piégeurs de radicaux.



88

5.2.2 Les anti-oxydants

Pour se protéger contre les processus radicalaires de la peroxydation lipidique, la

cellule dispose d’un puissant système de défense faisant intervenir des enzymes spécifiques

ainsi que des molécules anti-oxydantes produites par la cellule ou apportées par

l’alimentation. Les enzymes anti-oxydantes sont principalement les superoxydes dismutases

(SOD) (Brawn et Fridovich, 1980), les catalases (CAT) (Kirkman et al., 1999) et les

glutathion peroxydases (GPx) (Arthur, 2000).

L’action protectrice de ces enzymes est complétée par des molécules anti-

oxydantes comme l’α-tocophérol (vitamine E), les caroténoïdes, le glutathion, l’acide

ascorbique (vitamine C), l’acide lipoïque et de nombreux flavonoïdes. Ces molécules

bloquent ou ralentissent la propagation de la peroxydation lipidique en réagissant avec les

différents radicaux produits (RO•, ROO•…). Pendant cette réaction les anti-oxydants

s’oxydent et forment des composés beaucoup moins réactifs que les peroxydes lipidiques,

voire des composés stables (Toussaint et al., 2003). La vitamine E, en particulier, possède un

très fort pouvoir anti-oxydant. Elle est capable de réduire les peroxydes lipidiques en alcool

correspondant, tandis qu’elle-même est transformée en radical tocophéryle puis régénérée par

différents mécanismes. De plus c’est une molécule lipophile capable de s’incorporer dans les

membranes cellulaires (Wang et Quinn, 1999).

OH•

H2O

R•

ROO•

O2

R’H

ROOH

Phase d’initiation Phase de propagation

résonnance

R• + R’OO•

ROOR’

R• ROO•

RH ROOH ROH

antioxydant

Phase de terminaison

Figure 21 : Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique. (Pre, 1991)



89

5.3 Les produits d’oxydation des AGPI

5.3.1 Oxydation enzymatique des AGPI

L’oxydation enzymatique des AGPI estérifiés en position sn-2 des phospholipides

s’effectue après leur libération par action d’une PLA2. Les AGPI deviennent alors des

substrats pour les cyclooxygénases (COX), les lipoxygénases (LOX) ainsi que pour les

époxygénases appartenant à la famille du cytochrome P450 (CYP), qui générèrent un ensemble

de composés oxydés bioactifs (Figure 22 etFigure 23).

L’acide arachidonique (AA, 20:4n-6) sert de précurseur à la synthèse de composés

bioactifs appelés eicosanoïdes (composés de 20 atomes de carbone). Il s’agit des

prostaglandines (PGs) et des thromboxanes (TXs) de la série 2 synthétisés par action de la

COX, des leukotriènes (LTs) de la série 4 synthétisés par action de la 5-LOX et des composés

époxylés (EETs) synthétisés par action des CYP (Samuelsson, 1987 ; Vance et Vance, 1996).

Des composés mono-hydroxylés (12-HETE, 15-HETE) sont également produits par action de

la 12-LOX et de la 15-LOX (Spector et al., 1988), ainsi que des lipoxines (LXs) de la série 4

(Romano, 2006).

De la même manière l’acide eicosapentaénoïque (EPA, 20:5n-3) peut servir de

précurseur à la synthèse d’eicosanoïdes. Il s’agit de PGs et de TXs de la série 3, de LTs de la

série 5, de composés mono-hydroxylés comme le 15-HEPE et de lipoxines (LXs) de la série 5

(Grimminger et al., 1997 ; Lam et Wong, 1988 ; Needleman et al., 1979).

Il existe d’autres éicosanoïdes, moins bien décrits, comme les hépoxylines, les

trioxlines, les clavulones et les lévuglandines. Ces dernières sont des céto-aldéhydes non

cycliques, formées par fragmentation et réarrangement des PGH2 et PGH3.

L’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3), quant à lui, sert de précurseur à la

synthèse de docosanoïdes (composés de 22 atomes de carbone). Comme le DHA n’est pas

substrat de la COX il ne se forme pas de docosanoïdes analogues aux prostaglandines. En

revanche des composés mono-hydroxylés comme le 17S-HDHA sont synthétisés par action

des LOX (Sawazaki et al., 1994).



90

Plus récemment, il a été découvert deux nouvelles familles de composés bioactifs

oxygénés synthétisés de manière enzymatique à partir de l’EPA et du DHA et appelées

résolvines et protectines (Serhan et al., 2004 ; Serhan, 2005 ; Serhan et al., 2007). Les

composés tri-hydroxylés synthétisés à partir de l’EPA ont été nommés résolvines de la série E

(RvE) et ceux synthétisés à partir du DHA, résolvines de la série D (RvD). Le DHA peut

également servir de précurseur à la synthèse de composés di-hydroxylés appelé docosatriènes

ou protectines. Le 10R,17S-docosatriène a été nommé neuroprotectine D1 (NPD1) en raison

de sa forte implication in vivo dans le système neuronal (Hong et al., 2003 ; Hong et al.,

2007). Le DHA peut également être oxydé par les CYP en composés hydroxylés ou époxydés

(Ye et al., 2002).

Acide arachidonique(AA, 20:4n-6)

Acide eicosapentaénoïque(EPA, 20:5n-3)

Acide docosahexaénoïque(DHA, 22:6n-3)

Eicosanoïdes

Prostaglandines / Thromboxanes série 2Leucotriènes série 4

Lipoxines série 4HETEs

Eicosanoïdes

Prostaglandines / Thromboxanes série 3Leucotriènes série 5

Lipoxines série 5HEPEs

Résolvines série E

DocosanoïdesRésolvines série DDocosatriènes / Protectines(Neuroprotectine D1)

HDHAs

DHA 17S-HDHA

Résolvine D1Protectine D1

Figure 22 : Les principaux médiateurs lipidiques issus de l’oxydation enzymatique des acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA.

Figure 23 : Structures du DHA et de 3 docosanoïdes : le 17S-HydroxyDHA, la protectine D1 et la résolvine D1.



91

5.3.2 Oxydation non-enzymatique des AGPI

L’oxydation non-enzymatique des AGPI produit un nombre importants de

composés avec soit une préservation (même nombre d’atomes de carbones), soit une

dégradation de la structure de l’acide gras. Comme nous l’avons vu dans les mécanismes,

l’oxydation non-enzymatique des AGPI commence par la formation d’une forme radicalaire

instable de l’acide gras (R•) qui réagit rapidement avec l’oxygène pour former des

hydroperoxydes (ROOH). Contrairement à l’oxydation enzymatique, l’attaque radicalaire

peut toucher un acide gras estérifié sur un phospholipide. Les phospholipides contenant des

acyles gras peroxydés provoquent des modifications structurales des membranes cellulaires et

des lipoprotéines en altérant les interactions hydrophobes lipides/lipides et lipides/protéines

(Bacot, 2004).

5.3.2.1 Conservation de la structure de l’acide gras

Les hydroperoxydes estérifiés sur les phospholipides sont instables. Ils peuvent

induire une cyclisation de l’acide gras qui conserve ainsi sa structure. Cette cyclooxygénation

non-enzymatique produit des composés qui sont des isomères des prostaglandines (générées

enzymatiquement par la COX). Ces composés sont appelés isoprostanes (IsoPs). Des études

menées chez l’Homme ont montré qu’il se forme in vivo, à partir de l’AA, des isoprostanes de

la série 2 (Montuschi et al., 2007 ; Morrow et al., 1990 ; Taber et al., 1997) ainsi que des

isothromboxanes de la série 2 (Morrow et al., 1996). De la même manière la peroxydation

non-enzymatique de l’EPA et du DHA peut conduire respectivement à la formation des

isoprostanes de la série 3 et de la série 4 (Nourooz-Zadeh et al., 1997 ; Nourooz-Zadeh et al.,

1998). Les isoprostanes issus de la peroxydation du DHA sont également appelés

neuroprostanes car il a été montré qu’ils se forment principalement dans le cerveau (Roberts

et al., 1998).

Comme les prostaglandines peuvent générer des lévuglandines par coupure du

cycle, les isoprostanes peuvent de la même façon générer des isolévuglandines. En 1999,

Brame et al. (1999) ont mis en évidence, pour la première fois, la formation in vivo de ces

composés issus de la peroxydation de l’AA, qui ont alors été renommés isokétals. Le même



92

type d’aldéhydes peut être formé à partir de l’EPA et du DHA pour lequel on parle alors de

neuroketals (Bernoud-Hubac et al., 2001).

Plus récemment, il a été montré que les hydroperoxydes pouvaient former, par

cyclisation, une autre famille de composés appelés isofuranes (IsoFs). Comme précédemment,

la peroxydation non-enzymatique de l’AA, de l’EPA et du DHA peut conduire respectivement

à la formation des isofuranes de la série 2, de la série 3 et de la série 4, ces derniers étant

également appelés neurofuranes (Fessel et al., 2002 ; Taber et al., 2004 ; Taber et Jackson

Roberts, 2005).

Une fois formés, ces isoprostanes, isokétals et isofuranes peuvent être libérés

grâce à l’action d’une phospholipase (Morrow et al., 1992).

Enfin, la réduction des hydroperoxydes peut également générer des acides gras

mono- ou di-hydroxylés. Contrairement à la LOX qui génère uniquement des acides gras

hydroxylés avec une stéréoconfiguration S, la peroxydation non-enzymatique génère des

acides gras hydroxylés avec une stéréoconfiguration R ou S.

5.3.2.2 Altération de la structure de l’acide gras

Les hydroperoxydes estérifiés dans les phospholipides peuvent également subir

une dégradation spontanée qui génère différents alcanes et alcènes ainsi que des aldéhydes.

Les principaux aldéhydes stables formés sont le dialdéhyde malonique (MDA) et les 4-

hydroxyalkénals, notamment le 4-hydroxynonénal (4-HNE) provenant de l’oxydation des

AGPI de la série n-6 (Porter et al., 1995) et le 4-hydroxyhexénal (4-HHE) provenant de

l’oxydation des AGPI de la série n-3 (van Kuijk et al., 1986).

Tous ces aldéhydes, ainsi que les isokétals, sont très réactifs et ont une durée de

vie beaucoup plus longue que les radicaux libres. Ils agissent donc comme des seconds

messagers toxiques de la peroxydation lipidique. La toxicité de ces aldéhydes réside

principalement dans le fait qu’ils peuvent former des adduits avec des protéines ou d’autres

macromolécules contenant des amines comme l’ADN, les protéines ainsi que certains

phospholipides (PE et PS). Ces produits d’addition ont été identifiés comme des adduits de

Michael et des bases de Schiff (Ascherio et al., 1995 ; Bacot et al., 2007 ; Bernoud-Hubac et

al., 2004 ; Guichardant et al., 1998 ; Stone et al., 2008 ; Uchida, 2003).



93

Ainsi, lorsqu’un AGPI estérifié en position sn-2 d’un phospholipide subi une

dégradation radicalaire, il génère un certain nombre d’aldéhydes mais laisse également un

phospholipide tronqué contenant différents résidus oxygénés de l’acide gras en position sn-2

(Zhang et Salomon, 2005). Il a été montré que l’oxydation in vitro de PC-DHA génère un

grand nombre de phospholipides tronqués (Gu et al., 2003 ; Gugiu et al., 2006). La même

équipe a ensuite détecté dans la rétine des composés analogues formés par dégradation

radicalaire des PE-DHA.

DHA

Radical DHA

Peroxyl DHA

Alcanes / Alcènes Aldéhydes

MDA

4-HHE

Neuroprostanes

Neuroketals

Neurofuranes Mono/di-hydroxy DHA

O2

17-hydroxy DHA

10, 17-dihydroxy DHA

Conservation de la structureDégradation de la structure

O2•- / H2O2

Figure 24 : Les produits d’oxydation non-enzymatique du DHA.

MATERIELS ET METHODES


94




95

1. Produits spécifiques

1.1 Standards lipidiques

sn-(3-oléoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-3'-(1'-oléoyl-2'-hydroxy)-glycérol (18:1/18:1-

BMP) : Avanti polar lipids

sn-(3-pentadécanoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-1'-(3’-pentadécanoyl-2’-hydroxy)-

glycérol (15:0/15:0-BMP) : Synthétisé par notre équipe selon le protocole décrit

précédemment (Hayakawa et al., 2006)

sn-(3-docosahexaénoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-1'-(3’-docosahexaénoyl-2’-

hydroxy)-glycérol (22:6/22:6-BMP) : Synthétisé par notre équipe selon le protocole

décrit précédemment (Hayakawa et al., 2006)

1,2,3-tri(docosahexaénoyl)glycérol (22:6/22:6/22:6-TAG) : Polaris

1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (18:1/18:1-PG) : Sigma

1,2-didocosahexaénoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (22:6/22:6-PG) : Avanti polar

lipids

Acide Cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3) : Sigma

1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (16:0/16:0-PC) : Sigma

1,2-diheptadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphoethanolamine (17:0/17:0-PE) : Sigma

1,2-diheptadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (17:0/17:0-PC) : Avanti polar lipids

Acides méthyl-heptadécanoïque (17:0-Me) et méthyl-pentadécanoïque (15:0-Me) : Sigma

Stigmastérol, cholestérol et cholestéryl heptadécanoate (17:0-CE) : Sigma

1.2 Molécules radioactives et consommables

[1α,2α -3H]cholestéryl oléate (45 Ci/mmol) : GE Healthcare

[1α,2α-3H]cholestérol (43 Ci/mmol) : GE Healthcare

[9,10-3H]oléate (23 Ci/mmol) : Perkin-Elmer Life Science

Scintillant liquide Pico Fluor 15 : Packard



96

1.3 Consommables pour la culture cellulaire

Milieux nutritifs liquides MEM et DMEM : Eurobio

Pénicilline/streptomycine, L-Glutamine, tampon PBS et tripsine-EDTA : Eurobio

Sérum de veau fœtal (FCS) et sérum de veau fœtal déficient en lipoprotéines : Eurobio

1.4 Produits spécifiques pour la microscopie à fluorescence

Anticorps anti-IgG de souris couplés aux fluorochromes Alexa 488 et 546 : Molecular Probes

Filipine et Mowiol : Sigma

Perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine DiI-LDL et DiI-

acLDL : Molecular Probes

Immunoglobuline de souris (IgG) : Sigma

1.5 Produits divers

Anticorps monoclonal anti-BMP (6C4): Fourni par le Dr. Kobayashi (Supra-Biomolecular

System Research Group, RIKEN Frontier Research System, Saitama, Japon)

U18666A (3-β-[2-(diethylamino)ethoxy]androst-5-en-17-one) : Biomol

F1394 : Fourni par le Pr. Yamashita, Université d’Osaka, Japon

Amphotericine B : Calbiochem

Méthyl-β-cyclodextrine, Cholestérol oxydase, Mévinoline et Mévalonolactone : Sigma

Vitamine E (α-tocophérol) : Sigma

Kit de prolifération cellulaire (MTT) : Roche diagnostics

Kit de dosage des protéines Bradford : Bio-Rad laboratories

Régime alimentaire standard A03 et poudre alipidique : Safe

1,1,3,3-tétraméthoxypropane (TMP) : Fluka

Acide thiobarbiturique (TBA) : Sigma

Tocol : C.I.L. Cluzeau

Acide méthylphosphonique : Alfa Aesar



97

2. Matériels Biologiques

2.1 La lignée cellulaire RAW 264.7

La lignée cellulaire RAW 264.7 est une lignée de macrophages murins établie par

Raschke et al. (1978) à partir d’ascites d’une tumeur induite chez une souris mâle par

injection intrapéritonéale du virus A-MuLV (Abselon Leukaemia Virus). Il s’agit de petites

cellules adhérentes d’environ 25 µm de diamètre.

Les macrophages RAW sont cultivés en routine dans des boîtes de 100 mm de

diamètre en milieu nutritif liquide MEM supplémenté par des acides aminés non essentiels,

10% de sérum de veau fœtal (« fœtal calf serum » ou FCS), 2 mM de L-glutamine, 100

UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37°C

sous atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu de culture est changé tous les deux jours.

Pour effectuer des sous-cultures le milieu nutritif est éliminé puis les cellules sont lavées au

PBS et incubées 5 minutes à 37°C dans une solution de trypsine-EDTA afin de les décoller.

Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 5 minutes à 200 g puis le culot cellulaire est

resuspendu dans un volume approprié de milieu de culture. La viabilité des cellules, estimée

par exclusion de bleu trypan, est d’au moins 95%. Les cellules sont finalement ensemencées

dans de nouvelles boîtes de 100 mm de diamètre (ratio 1:4).

Dans certaines expériences les cellules sont cultivées en routine dans un milieu de

culture supplémenté avec 5 µM de vitamine E. Une quantité adéquate de vitamine E en

solution dans l’éthanol est transférée dans un tube en plastique puis le solvant est évaporé

sous azote. Le résidu sec est alors repris dans un volume de sérum FCS. L’ensemble est

« vortexé » pendant 5 min puis laissé sous agitation douce à 37°C pendant une nuit. Le sérum

supplémenté en vitamine E est alors utilisé pour constituer le milieu nutritif liquide qui est

filtré avant utilisation. Les cellules sont cultivées dans ce milieu supplémenté en vitamine E

pendant au moins une semaine (2 passages) avant le début de l’expérience.

2.2 La lignée cellulaire BHK 21

La lignée cellulaire BHK 21 (« baby hamster kidney ») est une lignée de

fibroblastes établie en 1961 par Macpherson et Stoker à partir de reins de hamsters âgés de 1



98

jour. Ce sont des cellules adhérentes cultivées en routine dans des boîtes de 100 mm de

diamètre en milieu nutritif liquide DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal

(FCS), 10% de bouillon de tryptose phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 UI/mL de

pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37°C sous

atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu de culture est changé tous les deux jours. Les

sous-cultures sont réalisées de la même manière que pour les macrophages RAW.

2.3 Les lipoprotéines

2.3.1 Préparation des lipoprotéines

Les prélèvements sanguins sont effectués sur des donneurs sains par ponction

veineuse (Etablissement Français du Sang de Lyon). Le plasma est obtenu par centrifugation à

900 g pendant 20 min. Les VLDL, LDL et HDL sont isolées du plasma par ultracentrifugation

différentielle. La première étape consiste à isoler les VLDL par ultracentrifugation à 180000 g

pendant 18 h à 10°C. Les VLDL qui flottent et forment un anneau à la surface sont éliminées.

Afin d’isoler les LDL, le plasma dépourvu de VLDL est ajusté à la densité de 1,063 par

addition de bromure de potassium (KBr) (85,7 mg de KBr par mL de plasma) puis centrifugé

à 180000 g pendant 20 h à 4°C. Les LDL sont alors recueillies et dialysées dans un tampon

TRIS (Tris-base 10 mM ; NaCl 150 mM ; pH ajusté à 7,4 par ajout de HCl) contenant 2 mM

d’EDTA. La concentration en protéines-LDL est estimée par la méthode de Bradford et les

LDL sont conservées à -80°C. Les HDL sont préparées de façon similaire à partir du plasma

dépourvu de VLDL et de LDL après ajustement de la densité à 1,21 (237,5 mg de KBr par

mL de plasma) et centrifugation à 180000 g pendant 48 h à 4°C. Les HDL sont recueillies,

dialysées et conservées comme décrit pour les LDL.

2.3.2 Acétylation des LDL

Les LDL acétylées sont préparées extemporanément à l’expérience à partir de

LDL natives conservées à -80°C selon la méthode de Basu et al. (1976). Un volume d’acétate

de sodium saturé est ajouté à un volume de la solution de LDL. une masse d’anhydride



99

acétique égale à 1,5 fois la masse de protéines-LDL est ajoutée, à raison de 1 mg toutes les 10

minutes, à 4°C sous agitation. Avant utilisation les LDL acetylées (acLDL) sont dialysées une

nuit à 4°C dans un tampon TRIS contenant 2 mM d’EDTA.

2.3.3 Marquage des LDL avec du [3H]cholestéryl oléate ou du [3H]cholestérol

Selon l’expérience à réaliser les LDL sont marquées soit avec du [3H]cholestéryl

oléate ([3H]CO-LDL) soit avec du [3H]cholestérol ([3H]FC-LDL). Le [3H]CO est marqué sur

le cholestérol (carbone 1 et 2), ainsi son hydrolyse génère du [3H]FC (« Free Cholesterol »).

La reconstitution des LDL avec l’un de ces deux traceurs radioactifs est effectuée de manière

identique, à raison de 40 µCi par mg de protéines-LDL. Une quantité adéquate du traceur

radioactif en solution dans le toluène est transférée dans un tube en verre. Après évaporation

du solvant sous courant d’azote, le résidu sec est repris dans un volume de diméthylsulfoxyde

(DMSO) tel qu’il soit inférieur à 10% de celui de la solution de LDL et incubé à 40°C

pendant 10 minutes. La solution de LDL est ensuite ajoutée directement à celle du traceur

radioactif dissout dans le DMSO puis l’ensemble est incubé une nuit à 40°C. Les LDL

marquées sont ré-isolées par ultracentrifugation comme décrit précédemment afin d’éliminer

les molécules radioactives qui n’ont pas été incorporées aux particules de LDL puis dialysées

dans un tampon TRIS contenant 2 mM d’EDTA avant utilisation. Des fractions aliquotes sont

également prélevées afin de déterminer la concentration en protéines-LDL par la méthode de

Bradford, et la quantité de radioactivité incorporée grâce au compteur à scintillation. Afin de

préparer des [3H]CO-acLDL l’acétylation des LDL est réalisée après le marquage.

2.4 Animaux et traitements

Toutes les expériences et installations ont été approuvées par le ministère de

l’agriculture français et l’agence vétérinaire départementale du Rhône. Tous les animaux ont

été traités au sein de l’animalerie de l’unité INSERM U870 sur le site de l’INSA de Lyon en

accord avec les réglementations approuvées par l’ECC (« European Communities Council »,

24 Novembre 1986, 86/609/EEC).



100

Des souris mâles âgées de 3 semaines (ICR, Harlan) ont été placées pendant 32

jours sous un régime alimentaire standard A03 disponible dans le commerce (conditions

contrôles) contenant 5% de lipides ou sous un régime alimentaire enrichi en DHA. Le régime

enrichi en DHA est préparé à partir d’une poudre alipidique commerciale à laquelle sont

ajoutés 4,5% d’huile de tournesol (Lesieur) et 0,5% de 1,2,3-tri(docosahexaénoyl)glycérol.

Ces deux régimes sont isocaloriques et leur composition en nutriments sont similaires

(Tableau 4). Les compositions en acides gras des deux régimes sont présentées dans le

Tableau 3. Après 32 jours les souris ont été sacrifiées par injection intrapéritonéale d’une dose

létale de pentobarbital. Les foies ont été immédiatement prélevés, stockés dans de l’azote

liquide et conservés à -80°C jusqu’à analyse.

3. Préparation des liposomes de phosphatidylglycérol (PG)

Une quantité adéquate de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG en solution dans le

chloroforme est transférée dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué, la vitamine E en

solution dans l’éthanol est ajoutée au 22:6/22:6-PG à raison de 1 molécule de vitamine E pour

100 insaturations. Le solvant est ensuite évaporé sous dessiccateur pendant 30 minutes. Le

résidu lipidique sec (+/- vitamine E) est repris dans un volume de PBS tel que la concentration

finale en phospholipides soit de 5 mM, et homogénéisé au vortex pendant 15 minutes à 4°C.

Nutriments

LipidesCarbohydrates (sucres)MinérauxFibresProtéinesHumidité

51,75

Régimes alimentaires

% massiques

12,221,43,95,7

Standard (A03) enrichi en DHAAcides gras

16:0 22 516:1 2 tr18:0 11 318:1 26 3918:2 38 4118:3 tr tr22:6 nd 10

Régimes alimentaires

mol %

Tableau 3 : Composition en acides gras des régimes alimentaires standard (A03) et enrichi en DHA. tr : traces. nd : non détecté

Tableau 4 : Composition en nutriments des régimes alimentaires



101

Cette étape permet de former de larges vésicules multi-lamellaires. Des petits liposomes

unilamellaires sont alors obtenus grâce à un sonicateur (Bioblock Scientific - vibracell 75043,

750 W, 20 kHz) relié à une sonde CV33 (Sonics & Materials Inc.) de 32 mm de diamètre. La

sonication (pulse on : 5 secondes, pulse off : 1 seconde, power : 100%) est réalisée sous

courant d’eau froide pendant 20 minutes.

4. Traitements des cellules et protocoles expérimentaux

4.1 Incubation en présence de l’anticorps anti-BMP

L’anticorps anti-BMP que nous avons utilisé dans ces expériences nous a été

fourni par le Dr. Kobayashi après purification par chromatographie. Le milieu de culture est

directement supplémenté avec l’anticorps anti-BMP à la concentration finale de 50 µg/mL.

Les cellules sont ainsi incubées en présence de l’anticorps pendant 24 heures. Lorsque les

cellules pré-traitées avec l’anticorps sont ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL

l’anticorps est maintenu.

4.2 Incubation en présence de U18666A et de F1394

L’agent pharmacologique U18666A est une amine hydrophobe qui perturbe le

transport intracellulaire du cholestérol en bloquant le cholestérol dérivé de la captation des

LDL dans les endosomes tardifs/lysosomes (Liscum et Faust, 1989 ; White et al., 2006).

L’agent pharmacologique F1394 est un inhibiteur de l’ACAT qui catalyse l’estérification du

cholestérol dans le réticulum endoplasmique. Les cellules sont incubées en présence de

U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 heures. Lorsque les cellules pré-

traitées avec l’un de ces inhibiteurs sont ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL les

inhibiteurs sont maintenus.



102

4.3 Incubation en présence de liposomes de PG +/- vitamine E

La solution de liposomes de PG à 5 mM dans le PBS est préparée

extemporanément à l’expérience en cours puis diluée directement dans un volume adéquat de

milieu de culture afin d’atteindre une concentration en PG connue. Les concentrations

inférieures sont alors obtenues par dilutions successives. Les cellules sont ainsi incubées

pendant 24 heures dans un milieu supplémenté avec des liposomes de 18:1/18:1-PG ou de

22:6/22:6-PG +/- vitamine E. Lorsque les cellules pré-traitées avec des liposomes de PG sont

ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL la présence des liposomes de PG est

conservée.

4.4 Incubation en présence de DHA non estérifié +/- vitamine E

Pour les supplémentations en DHA non estérifié la concentration maximale dans

le milieu de culture a été fixée à 100 µM. Le ratio entre la quantité d’albumine présente dans

le sérum et le DHA est alors inférieure à 2. Une quantité adéquate de DHA en solution dans

l’éthanol est transférée dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué la vitamine E en

solution dans l’éthanol est ajoutée à raison de 1 molécule de vitamine E pour 100

insaturations. Le solvant est évaporé sous azote et le résidu lipidique sec (+/- vitamine E) est

repris dans un volume de sérum. L’ensemble est « vortexé » pendant 5 min puis laissé sous

agitation douce à 37°C pendant une nuit. Le sérum supplémenté en DHA +/- vitamine E est

alors utilisé pour constituer le milieu nutritif liquide comme décrit dans le chapitre 2.1

(concentration finale en DHA de 100 µM). Ce milieu supplémenté est filtré et dilué pour

obtenir les concentrations en DHA de 60, 30, 15 et 5 µM. Les cellules sont ainsi incubées

pendant 24 heures en présence de concentrations croissantes de DHA +/- vitamine E.

4.5 Culture des cellules dans des conditions oxydantes

Des solutions concentrées de cuivre cuivrique (Cu2+) à 10 mM et d’ascorbate à 0,1

M sont respectivement préparées par dissolution dans l’eau d’une masse adéquate de poudre



103

de sulfate de cuivre (CuSO4) ou de poudre d’ascorbate. Une solution concentrée de peroxyde

d’hydrogène (H2O2) à 9 mM est préparée à partir de la solution mère à 9 M. L’incubation des

cellules en conditions oxydantes est alors réalisée dans un milieu de culture sans vitamine E

supplémenté avec 1 mM de H2O2, 0,1 mM de Cu2+ et 1 mM d’ascorbate par dilution des

solutions concentrées ci-dessus.

5. Etude du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol

Les milieux de culture supplémentés avec des lipoprotéines (LDL, acLDL ou

HDL) sont préparés par ajout d’une quantité connue de lipoprotéines en solution dans un

tampon TRIS+EDTA dans un milieu appauvri ou déficient en lipoprotéines contenant

respectivement 1% de sérum FCS ou 5% de sérum déficient en lipoprotéines (LPDS).

5.1 Mesure de l’accumulation de cholestérol libre et d’esters de cholestérol

Les LDL acétylées (acLDL) sont préparées extemporanément à l’expérience et

ajoutées au milieu de culture à raison de 100 µg/mL. Le cholestérol libre (« Free

Cholesterol » ou FC) et les esters de cholestérol (« Cholesterol Esters » ou CE) sont quantifiés

comme décrit dans le chapitre 7 après incubation des cellules pendant des temps variables en

présence de acLDL.

5.2 Mesure de la captation des LDL et de l’hydrolyse des esters de cholestérol

La captation des LDL et l’hydrolyse des esters de cholestérol issus des LDL sont

estimés à l’aide de LDL radio-marquées avec du [3H]cholestéryl oléate ([3H]CO). Les

expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106 cellules par puit).

Les cellules sont incubées pendant des temps variables en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-

LDL ou de [3H]CO-acLDL. A la fin de l’incubation, le milieu est éliminé, les cellules sont

rincées 3 fois au PBS puis récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le culot sec

est conservé à -20°C jusqu'à l’analyse.



104

Les cellules sont décongelées et homogénéisées dans de l’eau contenant 0,1% de

triton. Pour chaque échantillon la quantité de protéines est déterminée sur des fractions

aliquotes par la méthode de Bradford. La quantité de radioactivité est mesurée sur des

fractions aliquotes grâce au compteur à scintillation. Le taux de captation des LDL est

exprimé en µCi/mg de protéines ou en µg-LDL/mg de protéines connaissant la quantité de

radioactivité contenue dans les LDL (µCi/µg-LDL).

Les lipides cellulaires sont ensuite analysés comme décrit dans le paragraphe 7.

Brièvement les classes de lipides sont séparées par CCM et la radioactivité associée au

cholestérol libre (FC) et aux esters de cholestérol (CE) est mesurée au compteur à

scintillation. L’hydrolyse des CE issus des LDL est estimée en mesurant la conversion du

[3H]CO en [3H]FC dans les cellules. Elle est exprimée en pourcentage de la radioactivité

associée au FC par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE).

5.3 Mesure de l’estérification du cholestérol dérivé de la captation des LDL

5.3.1 Première méthode : utilisation de [3H]FC-LDL

L’estérification du cholestérol issu des LDL est estimée à l’aide de LDL radio-

marquées avec du [3H]cholestérol ([3H]FC). Les expériences sont réalisées sur des puits de 35

mm (ensemencement : 106 cellules par puit). L’incubation des cellules en présence de

[3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL et l’analyse des lipides sont réalisées comme décrit dans le

paragraphe 5.2. L’estérification est estimée en mesurant la conversion du [3H]FC en [3H]CE

dans les cellules. Elle est exprimée en pourcentage de la radioactivité associée aux CE par

rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE).

5.3.2 Deuxième méthode : utilisation du [3H]oléate

L’estérification du cholestérol issu des LDL est dans ce cas estimée en mesurant

la synthèse des esters de cholestérol qui est stimulée suite à l’endocytose des LDL acétylées.

Les cellules sont incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL et de 0,5 µCi/mL de

[3H]oléate (22 nM). Le traceur radioactif est ajouté dans le milieu de culture à partir d’une



105

solution éthanolique avec une concentration finale en éthanol inférieure à 0,1%. Les lipides

cellulaires sont analysés comme décrit dans le paragraphe 7. Les lipides marqués sont ceux

qui ont incorporés le [3H]oléate. Il s’agit principalement des PL, des DAG et des TAG ainsi

que des CE. Le taux d’estérification du cholestérol est exprimé en pourcentage de la

radioactivité associée aux CE par rapport à la radioactivité totale.

5.4 Mesure de l’efflux médié par les HDL ou la méthyl-β-cyclodextrine

Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106

cellules par puit). Les cellules sont dans un premier temps incubées pendant 8 heures en

présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL ou de [3H]CO-acLDL. A l’issue de cette incubation,

le milieu est éliminé, les cellules sont rincées 3 fois au PBS et incubées pendant des temps

variables en présence de HDL (100 µg/mL) ou de MβCD (5 mM ou 10 mM) pour stimuler

l’efflux de cholestérol dans le milieu de culture. Ce dernier est ensuite récolté et centrifugé 10

min à 300 g pour éliminer les débris cellulaires. Les cellules sont rincées 3 fois au PBS puis

récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le culot sec est conservé à -20°C

jusqu'à l’analyse.

La radioactivité est mesurée dans le milieu et dans les cellules grâce au compteur

à scintillation. L’efflux du cholestérol est exprimée en pourcentage de la radioactivité dans le

milieu de culture par rapport à la radioactivité totale (radioactivité dans le milieu +

radioactivité dans les cellules). La radioactivité totale mesurée dans les cellules correspond à

la somme du [3H]FC et des [3H]CE. La radioactivité totale mesurée dans le milieu est associée

à plus de 95% au cholestérol libre, excluant une contamination par des débris cellulaires.

5.5 Traitement des cellules avec la cholestérol oxydase

Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106

cellules par puit). Les cellules sont dans un premier temps incubées pendant 8 heures en

présence de 50 µg/mL de [3H-CO]acLDL. A l’issue de cette incubation, le milieu est éliminé

et les cellules sont rincées 3 fois au PBS. Les cellules sont ensuite fixées avec 1% (v/v) de

glutaraldéhyde dans le PBS (10 min à température ambiante) puis rincées au PBS. Enfin les



106

cellules sont incubées pendant 30 min dans un milieu MEM contenant 2 U/mL de cholestérol

oxydase qui catalyse la transformation du [3H]cholestérol dérivé des acLDL et présent dans la

membrane plasmique en [3H]cholesténone. Après cette période d’incubation le milieu est

retiré, les cellules sont rincées 3 fois au PBS puis récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5

minutes. Le culot sec est conservé à -20°C. Les lipides cellulaires sont extraits grâce à un

mélange : hexane/alcool isopropylique (3:2 ; v/v) et le [3H]cholestérol est séparé du

[3H]cholesténone par CCM en utilisant un mélange : hexane/éther éthylique/acide acétique

(65:15:1 ; v/v/v) comme solvant d’élution. La radioactivité associée au cholestérol (Rf = 0,10)

et à la cholesténone (Rf = 0,23) est mesurée au compteur à scintillation. La formation de

[3H]cholesténone est exprimée en pourcentage de la radioactivité totale ([3H]cholestérol +

[3H]cholesténone).

5.6 Mesure de la sensibilité des cellules avec l’amphotéricine B

Les expériences sont réalisées sur des plaques 96 puits (ensemencement : 10000

cellules par puit). Les cellules sont incubées pendant 24 heures en présence de 100 µg/mL de

acLDL. A l’issue de cette incubation, le milieu est éliminé puis les cellules sont rincées 3 fois

au PBS et incubées pendant 3 heures dans un milieu supplémenté avec 1% de FCS et

contenant 25 ou 50 µg/mL d’amphotéricine B. La viabilité des cellules est ensuite évaluée

grâce à un test colorimétrique commercial au MTT (Cell Proliferation kit I MTT, Roche). Ce

test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan violet

uniquement par les cellules métaboliquement actives. Les cristaux de formazan ainsi formés

sont solubilisés et l’absorption de la solution colorée obtenue est quantifiée par

spectrophotométrie. La viabilité cellulaire, qui est proportionnelle à la différence des densités

optiques mesurées à 550 et 690 nm (DO550nm-DO690nm), est exprimée en pourcentage de la

viabilité maximale mesurée sur des cellules non traitées à l’amphotéricine B.

6. Oxydation du BMP et du cholestérol en système acellulaire

Des liposomes de PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) sont préparés en

transférant 75 µg de 16:0/16:0-PC, 15 µg de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP, et 2 µg de



107

cholestérol dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué, 0,9 µg de vitamine E ou une dose

traceuse de [3H]cholestérol (0,5 µCi) sont également ajoutés. Le solvant est ensuite évaporé

sous dessiccateur pendant 30 minutes. Le résidu lipidique est repris dans 400 µL de PBS et

homogénéisé au vortex pendant 10 minutes à 4°C. L’oxydation est réalisée par incubation à

37°C en présence de CuSO4 (2 mM final) et H2O2 (70 mM final) pendant des temps

croissants. La réaction est stoppée en plongeant les tubes dans la glace et par addition de 200

µM de BHT. Les lipides sont alors immédiatement extraits par la méthode de Bligh et Dyer.

Pour analyser la quantité de BMP présente dans l’échantillon après oxydation, les

lipides sont séparés par CCM sur des plaques HPTLC en utilisant un mélange de solvants :

chloroforme/méthanol/acétone/acide acétique/eau (50:10:20:12,5:5 ; v/v/v/v/v). Le BMP est

ensuite visualisé par pulvérisation d’acide et chauffage.

Pour suivre l’oxydation du [3H]cholestérol et la formation des [3H]oxystérols, les

lipides sont séparés par CCM sur des plaques TLC en utilisant un mélange : hexane/éther

éthylique/méthanol/acide acétique (50:50:5:1 ; v/v/v/v) comme solvant d’élution. Le profil

d’élution des différents composés radio-marqués est visualisé grâce au lecteur de radioactivité

linéaire Berthold. La radioactivité associée au cholestérol (Rf = 0,6) et aux oxystérols (Rf

= 0,47) est mesurée au compteur à scintillation. La formation des [3H]oxystérols est exprimée

en pourcentage de la radioactivité associée aux oxystérols par rapport à la radioactivité totale

([3H]cholestérol + [3H]oxystérols).

7. Analyse des lipides

7.1 Extraction des lipides totaux

7.1.1 Extraction à partir des cellules RAW 264.7 et BHK 21

Les lipides totaux sont extraits des cellules selon la méthode de Bligh et Dyer

(Bligh et Dyer, 1959). Les culots cellulaires conservés à sec à -20°C sont décongelés à 4°C et

homogénéisés dans un 1,5 mL d’eau contenant 0,1% de triton. La concentration en protéines

de l’homogénat cellulaire est déterminée sur des fractions aliquotes par la méthode de

Bradford. Un volume connu de l’homogénat cellulaire est transféré dans un tube à vis en verre

puis des quantités précises des différents standards internes nécessaires aux dosages effectués



108

sont ajoutées à chaque échantillon. Afin de quantifier le BMP, les PC, les PE, le cholestérol

libre et les esters de cholestérol, les standards internes utilisés sont respectivement le

15:0/15:0-BMP, le 17:0/17:0-PC, le 17:0/17:0-PE, le stigmastérol et le 17:0-CE. Du méthanol

et du chloroforme sont alors ajoutés de façon à obtenir un rapport : eau/méthanol/chloroforme

de 0,8:2:1 (v/v/v). Un volume de BHT en solution dans l’éthanol est également ajouté dans

chaque échantillon en tant qu’anti-oxydant à la concentration finale de 60 µM. L’échantillon

est homogénéisé et conservé à 4°C pendant au moins 10 min puis de l’eau et du chloroforme

sont à nouveau ajoutés pour atteindre le rapport final : eau/méthanol/chloroforme de

1,8:2:2 (v/v/v). La solution est « vortexée » puis centrifugée à 800 g pendant 10 min à 4°C. La

phase organique inférieure est prélevée, transférée dans un tube en verre et la phase aqueuse

est extraite à nouveau par un volume de chloroforme. Après centrifugation les phases

organiques sont regroupées et le solvant est évaporé sous courant d’azote. Les lipides

cellulaires totaux sont remis en solution dans un volume connu de chloroforme/méthanol

(2:1 ; v/v) et conservés sous azote à -20°C.

7.1.2 Extraction à partir de foie de souris

L’extraction des lipides totaux est réalisée à partir de 250 mg de foie de souris

conservé à -80°C puis décongelé à 4°C et homogénéisé au Potter dans 2 mL d’eau à 4°C.

Environ 10 allers-retours sont effectués jusqu’à l’homogénéisation complète des tissus.

L’homogénat est alors transféré dans un Erlen Meyer puis complété à 5 mL avec de l’eau. Du

méthanol et du chloroforme sont ajoutés à l’homogénat de façon à obtenir le rapport :

eau/méthanol/chloroforme de 0,8:2:1 (v/v/v). Un volume de BHT en solution dans l’éthanol

est également ajouté dans chaque échantillon en tant qu’anti-oxydant à la concentration

finale de 60 µM. La solution est gardée une nuit sous agitation magnétique à 4°C puis filtrée

et transférée dans un tube à vis en verre. De l’eau et du chloroforme sont à nouveau ajoutés

pour atteindre le rapport final : eau/méthanol/chloroforme de 1,8:2:2 (v/v/v). Les lipides

totaux sont ensuite récupérés dans la phase organique après centrifugation et conservés

comme indiqué dans le paragraphe précédent.



109

7.2 Séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides par

chromatographie sur couche mince (CCM)

La séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides est réalisée

par chromatographie sur couche mince (CCM). Selon les expériences réalisées, deux sortes de

plaques sont utilisées : des petites plaques en verre à haute performance (HPTLC Silica gel

60, 10x10, Merck) et des grandes plaques en verre (TLC Silica gel 60, 200x200, Merck) ayant

un pouvoir séparateur moins important mais sur lesquelles il est possible d’éluer une plus

grande quantité de lipides.

7.2.1 Séparation des classes de lipides

Les extraits lipidiques totaux sont déposés à 2 cm ou 1,5 cm du bord inférieur des

plaques TLC ou HPTLC respectivement. La migration est effectuée dans le mélange :

hexane/éther éthylique/acide acétique (80:20:1 ; v/v/v) qui permet de séparer les principales

classes de lipides. Les plaques sont retirées des cuves lorsque le front de solvant se trouve à 2

cm du bord supérieur de la plaque. Les phospholipides qui sont parmi les lipides les plus

polaires restent à l’origine (Rf=0). Les références frontales des différents lipides sont les

suivantes, diacylglycérols : Rf=0,09, cholestérol : Rf=0,14, acides gras libres : Rf=0,25,

triacylglycérols : Rf=0,56 et esters de cholestérol : Rf=0,94.

7.2.2 Séparation des classes de phospholipides par CCM en 2 dimensions

Les extraits lipidiques totaux sont déposés dans le coin inférieur gauche à 2,5 cm

ou 1,5 cm des bords des plaques TLC ou HPTLC respectivement. La première migration

s’effectue dans un mélange basique : chloroforme/méthanol/ammoniaque à 28% dans l’eau

(65:35:5 ; v/v/v). Les plaques sont retirées de la cuve lorsque le front de solvant se trouve à 2

cm du bord supérieur puis elles sont séchées sous dessiccateur pendant 3 heures. La deuxième

migration s’effectue perpendiculairement à la première dans le mélange acide :



110

chloroforme/méthanol/acétone/acide acétique/eau (50:10:20:12,5:5 ; v/v/v/v/v). Les plaques

sont retirées de la cuve lorsque le front de solvant se trouve à 2 cm du bord supérieur.

7.2.3 Traitements des plaques après élution

Afin de ne visualiser que le profil d’élution des différents lipides, les plaques sont

pulvérisées avec une solution aqueuse d’acétate de cuivre à 3% et d’acide phosphorique à 8%

puis chauffées dans un four à 180°C pendant 10 minutes. Cependant, ce procédé détruit la

structure des lipides. Ainsi, afin de pouvoir récupérer et analyser les différents lipides

d’intérêt les plaques sont pulvérisées avec une solution de primuline à 0,1% dans le méthanol

puis observées sous UV à 365 nm. Les différentes classes de lipides sont identifiées grâce à

leur référence frontale (Rf) par rapport à des standards. Après identification des zones de

migration des lipides d’intérêts, différents protocoles sont utilisés en fonction du type

d’analyse à réaliser :

- Comptage de la radioactivité associé à un lipide :

Le gel de silice correspondant à la zone de migration du lipide d’intérêt est récupéré puis

transféré dans un pot de comptage de 10 mL. La radioactivité est alors mesurée au compteur à

scintillation comme décrit dans le paragraphe 8.2.

- Analyse de la composition en acides gras d’un lipide (PL ou CE) :

Le gel de silice correspondant à la zone de migration du lipide d’intérêt est récupéré et

transféré dans un tube à vis en verre. L’hydrolyse et la méthylation des acyles gras des

phospholipides (PL) ou des esters de cholestérol (CE) sont réalisées directement sur le gel de

silice comme décrit dans le paragraphe 7.4.

- Purification du BMP et des PE en HPLC :

Le gel de silice correspondant aux zones de migration du BMP et des PE est récupéré et

transféré dans un tube à vis en verre. Les phospholipides sont ensuite extraits de la silice par

le mélange de solvants : chloroforme/méthanol/eau (5:5:1 ; v/v/v). Après agitation les tubes

sont centrifugés pendant 10 minutes à 800 g et le surnageant est récupéré. De l’eau est ajoutée

pour atteindre un rapport : chloroforme/méthanol/eau de 2:2:1,8 (v/v/v). Après agitation et



111

centrifugation 10 minutes à 800 g, la phase chloroformique inférieure est récupérée et

évaporée sous azote.

- Quantification du cholestérol en GC-MS

Le gel de silice correspondant à la zone de migration du cholestérol est récupéré et transféré

dans un tube à vis en verre. Le cholestérol est extrait du gel de silice par le mélange de

solvants : chloroforme/méthanol (2:1 ; v/v). Après agitation et centrifugation 10 minutes à

800 g, le surnageant est récupéré et évaporé sous azote.

7.3 Purification du BMP et des PE par HPLC

Après l’élution en CCM-2D et extraction du gel de silice, le BMP peut encore être

contaminé par des traces de CL, et les PE ne sont pas séparées du PG. Le BMP et les PE sont

donc purifiés dans une seconde étape par un système HPLC. La méthode utilisée est adaptée

de celle décrite par (Luquain et al., 2001). Le système consiste en une pompe quaternaire (HP

1100), un injecteur manuel et une colonne de silice-NH2 (Nucléosil 5NH2, 250x4.6 mm).

L’élution est réalisée par le mélange de solvants acétonitrile/méthanol/eau (730:250:15)

contenant également 0,3 mL d’acide méthylphosphonique à 50% dans l’eau. Le pH est ajusté

à 6,3 par ajout d’ammoniaque à 28%. Le débit est fixé à 1,0 mL/min. La densité optique de

l’éluât est enregistrée en continu à 205 nm par un détecteur UV à barrette de diodes HP 1100.

Les temps de rétention des phospholipides d’intérêt sont déterminés à l’aide de standards.

Dans ce système le BMP est élué en trois pics dont les temps de rétention sont compris entre

10 et 15 minutes. Les CL ne sont pas éluées à ces temps de rétention. Les PE qui sont éluées

en 21 minutes sont bien séparées du PG qui est élué en 31 minutes.

Les phospholipides en solution dans le chloroforme sont injectés manuellement

puis récoltés en sortie de colonne. Le solvant d’élution est ensuite évaporé à sec sous azote.

Le BMP et les PE sont ré-extraits selon la méthode de Bligh et Dyer afin d’éliminer les sels

d’acide méthylphosphonique contenus dans le solvant d’élution.



112

7.4 Analyse des acides gras par chromatographie gazeuse (GC)

7.4.1 Préparation des échantillons

La composition en acides gras des phospholipides et des esters de cholestérol est

analysée par séparation en chromatographie gazeuse de leurs chaînes grasses sous forme

d’esters méthyliques obtenus par une réaction de transméthylation (hydrolyse + méthylation).

Celle-ci est réalisée par ajout, sur l’extrait lipidique sec ou directement sur le gel de silice

contenant le lipide séparé par CCM, de 1 mL de méthanol contenant 5% d’acide sulfurique

concentré. Les tubes sont ensuite fermés sous azote et placés 90 minutes dans un bain sec à

90°C. La réaction est arrêtée en laissant les tubes 5 minutes dans la glace et par ajout de 2 mL

de carbonate de potassium à 5% dans l’eau. Les esters méthyliques d’acide gras (« fatty acid

methyl esters » ou FAME) ainsi que les diméthylacétals (DMA) formés respectivement par

transméthylation des chaînes acyles et alkényles sont extraits par 3 mL d’isooctane. Après

agitation et centrifugation à 800 g pendant 10 minutes la phase organique supérieure est

prélevée et évaporée sous azote. Des standards d’esters méthyliques d’acides gras sont

également ajoutés à chaque échantillon juste avant l’injection (du 15:0-Me pour les PC, les PE

et les CE, et du 17:0-Me pour le BMP). Le résidu sec est repris dans un volume connu

d’isooctane et injecté en chromatographie gazeuse.

7.4.2 Appareillage et conditions d’analyse

Les FAME et les DMA sont analysés par chromatographie gazeuse en utilisant un

système Hewlett Packard (HP6890 G1530) et une colonne capillaire SGE BPX 70 (60m x

0,22mm). Les composés sont injectés dans la colonne grâce à un injecteur automatique

(T=230°C) et sont entraînés dans la colonne par le gaz vecteur (Hélium). La température du

four augmente selon un gradient programmé (1,5°C/min) de 80°C à 245°C. Les différents

acides gras sont séparés en fonction du nombre d’atomes de carbone et de doubles liaisons

ainsi que de la position des doubles liaisons. Les composés sont détectés en sortie de colonne

par un détecteur à ionisation de flamme (FID) alimenté par un mélange d’air et d’hydrogène.



113

7.4.3 Identification des acides gras et quantification

Les FAME et les DMA sont identifiés sur les chromatogrammes par comparaison

de leur temps de rétention à ceux de standards connus. La surface de chaque pic est

proportionnelle à la masse de l’acide gras présent dans l’échantillon. Ainsi le pourcentage

molaire (mol%) de chaque acide gras est calculé par rapport à sa masse molaire et à la somme

des surfaces de tous les acides gras identifiés. Le rapport des aires entre le pic correspondant

au premier étalon interne (issu de la transméthylation du standard interne ajouté à

l’homogénat cellulaire avant la première extraction lipidique) et le pic correspondant au

deuxième étalon interne (15:0-Me ou 17:0-Me) ajouté juste avant l’injection permet de

calculer le rendement total de toutes les étapes d’extraction, purification et réactions

chimiques réalisées. La quantité de chaque acide gras présent dans l’échantillon est calculée

par rapport au premier standard interne. La quantité totale d’acides gras permet ainsi de

déterminer la quantité de phospholipides ou d’esters de cholestérol sachant que pour un

phospholipide chaque molécule possède deux résidus d’acides gras et un seul pour les esters

de cholestérol. Les résultats sont exprimés en nmol/mg de protéines ou en µg/mg de protéines.

7.5 Quantification du cholestérol libre par GC-MS

L’analyse du cholestérol est réalisée par chromatographie gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse (GC-MS). Le stigmastérol est utilisé comme standard interne. Après

purification par CCM et extraction du gel de silice comme décrit dans le paragraphe 7.2, le

résidu lipidique sec est repris par 100 µL de bis(triméthylsilyl)trifluoro-acetamide (BSTFA)

afin de dériver les groupements hydroxylés du cholestérol et du stigmastérol en éthers

triméthylsilylés. Cette dérivation s’effectue à 37°C pendant 20 minutes. Les échantillons sont

alors dilués dans un volume adéquat d’hexane avant injection.

Les stérols sont analysés par chromatographie gazeuse en utilisant un système

Hewlett Packard (HP-6890) et une colonne capillaire J&W 122-4762 (60m x 0,25mm). Les

composés sont injectés dans la colonne grâce à un injecteur automatique (T=260°C) en mode

« Pulsed Splitless » et sont entraînés dans la colonne par le gaz vecteur (Hélium). La

température du four est maintenue à 57°C pendant 5 min puis augmente jusqu’à 200°C à

raison de 40°C/min. Elle augmente ensuite jusqu’à 310°C à raison de 10°C/min puis est



114

maintenue à cette température pendant 20 min. Les composés élués sont détectés en sortie de

colonne par un spectromètre de masse (Hewlett Packard MS-5973). L’ionisation chimique est

réalisée en mode positif avec du méthane comme gaz réactant. Les ions m/z 369 et 395

correspondant respectivement au cholestérol et au stigmastérol après la perte du groupement

TMS-OH [M-90]+ sont mesurés en mode SIM (« selected ion monitoring »).

Les stérols sont identifiés sur les chromatogrammes par comparaison de leur

temps de rétention à ceux de standard connus. Dans ces conditions le cholestérol présente un

temps de rétention de 26,20 min et le stigmastérol de 28,35 min. La masse de cholestérol est

calculée grâce au rapport des surfaces des deux pics et à la masse de stigmastérol connue

ajoutée à l’échantillon, et grâce à un facteur de réponse déterminé en traçant une gamme

d’étalonnage.

7.6 Analyse des espèces moléculaires du BMP par ESI-MS

Le BMP est extrait à partir de cellules RAW et purifié comme décrit

précédemment par CCM-2D et HPLC. Les espèces moléculaires du BMP ont été analysées

par spectrométrie de masse par l’équipe du professeur Robert C. Murphy au département de

pharmacologie de l’Université du Colorado. L’échantillon de BMP en solution à 100 nM dans

un mélange : méthanol/dichlorométhane (1:1 ; v/v) est injecté par infusion en mode

« nanoelectrospray » grâce à un robot automatique NanoMate 100 (Advion BioSciences,

Ithaca, NY) avec un débit de 200 nL/min. Le spectromètre de masse utilisé possède un

analyseur hybride API 4000 Q TRAP constitué d’un triple quadripôle et d’une trappe d’ions

linéaire montés en série (PE Sciex, Toronto, Canada). Au niveau de la buse d’injection on

applique à l’échantillon une pression d’azote de 0,15 psi et une tension de nébulisation de

-1,32 kV. Lorsque l’acquisition spectrale est réalisée en mode balayage (« full scan ») ou en

mode « Enhanced Product Ion » (EPI) un potentiel de « declustering » de -80V est appliqué

entre le cône d’échantillonnage et le « skimmer ». Dans les expériences réalisées en EPI avec

un mode d’ionisation négatif, la dissociation activée par collision (« Collision-Activated

Dissociation » ou CAD) est effectuée avec une énergie de collision de 40V et sous une forte

pression de gaz. Les pourcentages molaires (mol%) des différentes espèces moléculaires du

BMP sont calculés en fonction de l’abondance relative de chaque ion moléculaire et après



115

correction effectuée en tenant compte des isotopes naturellement présents dans l’échantillon

(Roberts et al., 2005).

8. Analyse de la radioactivité

8.1 L’analyseur de radioactivité linéaire (Berthold)

Après séparation des classes de lipides ou de phospholipides par CCM, le profil

d’élution des différentes espèces radio-marquées peut être obtenu grâce à un analyseur de

radioactivité linéaire (Berthold LB 2820-1) couplé à un radio-imageur/intégrateur (Berthold-

LB511). Ce dispositif permet donc de déterminer, en pourcentage, la distribution de la

radioactivité entre les différents lipides radioactifs.

8.2 Le compteur à scintillation

La quantité de radioactivité contenue dans un échantillon peut être déterminée sur

une fraction aliquote grâce à un compteur à scintillation bêta (Packard Tricarb 460) qui

permet, après étalonnage, de déterminer directement l’activité de l’échantillon en dpm

(désintégrations par minutes). Une fraction aliquote des solutions aqueuses (milieux de

culture et homogénats cellulaires) ou le gel de silice correspondant à la zone de migration

d’un lipide radioactif d’intérêt sont transférés dans des pots de comptage puis 5 mL de

scintillant sont ajoutés. Pour chaque échantillon le temps de comptage est de 3 minutes.

9. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA)

Le MDA est un aldéhyde issu de la peroxydation des acides gras polyinsaturés. La

méthode de quantification est basée sur la réaction du MDA avec deux molécules d’acide

thiobarbiturique (TBA). Le complexe MDA-TBA ainsi formé est alors quantifié en HPLC en

phase inverse selon la méthode décrite par Therasse et Lemonnier (1987). Les cellules sont



116

homogénéisées dans un volume d’eau ultra-pure puis la quantité de protéines est déterminée

sur des fractions aliquotes par la méthode de Bradford. Un volume d’homogénat cellulaire

correspondant à 150 µg de protéines est transféré dans un tube en verre. Une gamme étalon

est réalisée en parallèle avec des quantités croissantes (0-100 pmol) de 1,1,3,3-

tétraméthoxypropane (TMP). Chaque tube (gamme et échantillons) est complété à 400 µL

avec de l’eau puis sont ajoutés 40 µL de BHT à 5 mM dans l’éthanol, 100 µL d’acide acétique

16,5 N et 200 µL de TBA en solution à 10 mM dans un tampon phosphate (0,1 M ; pH 3). Les

tubes sont alors fermés sous azote, « vortexés » et placés dans un bain sec à 100°C pendant 1

heure. La réaction est stoppée en plongeant les tubes dans la glace pendant 5 min. Le milieu

réactionnel est acidifié par 10 µL d’HCl 6 N. Le complexe MDA-TBA est alors extrait par 2

mL d’acétate d’éthyle. Après agitation et centrifugation 10 min à 800 g la phase supérieure est

récupérée puis évaporée sous courant d’azote. L’extrait est alors repris par 250 µL d’un

mélange : eau/méthanol (1:1 ; v/v). La quantification du complexe MDA-TBA est réalisée par

un système HPLC en phase inverse composé d’une colonne Nucléosil greffée C18 (250 mm x

4,6 mm ; granulométrie 5 µm) et d’un détecteur fluorimétrique (λ excitation = 515 nm ; λ

émission = 553 nm). L’élution est réalisée par un mélange : eau/méthanol (80:20 ; v/v) dont le

débit est fixé à 0,8 mL/min. Pour chaque échantillon le volume d’injection est fixé à 100 µL.

Dans ces conditions le temps de rétention du complexe MDA-TBA est de 4,5 minutes. La

droite étalon obtenue permet de calculer à partir de la surface de chaque pic la quantité de

MDA présente dans chaque échantillon. Les résultats sont alors exprimés en pmoles de

MDA/mg de protéines.

10. Dosage de la vitamine E

La vitamine E est un anti-oxydant liposoluble majeur piégeant les radicaux libres

alkoxyles et peroxyles des chaînes de peroxydation lipidiques. La quantification d’un des

isomères de la vitamine E, l’α-tocophérol, est réalisée par HPLC en phase inverse (Vericel et

al., 2003). Les cellules sont homogénéisées dans un volume d’eau ultra-pure puis la quantité

de protéines est déterminée sur des fractions aliquotes par la méthode de Bradford. Un volume

connu d’homogénat est transféré dans un tube en verre et 200 pmoles de tocol sont ajoutées

pour la standardisation interne. Chaque échantillon est complété à 500 µL avec de l’eau et la

vitamine E est extraite par ajout de 500 µL d’éthanol et 2 mL d’hexane. Après agitation et



117

centrifugation 10 min à 800 g la phase organique supérieure est récupérée et évaporée sous

courant d’azote. L’extrait est alors repris par 300 µL d’un mélange : méthanol/eau (85:15 ;

v/v). La quantification de l’α-tocophérol est réalisée par un système HPLC en phase inverse

composé d’une colonne Nucléosil greffée C18 (150 mm x 4,6 mm ; granulométrie 5 µm) et

d’un détecteur fluorimétrique (λ excitation = 295 nm ; λ émission = 340 nm). L’élution est

réalisée par un mélange : méthanol/eau (95:5 ; v/v) dont le débit est fixé à 1 mL/min. Pour

chaque échantillon le volume d’injection est fixé à 100 µL. Dans ces conditions les temps de

rétention sont de 6,2 min pour le tocol et de 10,2 min pour l’α-tocophérol. La quantité d’α-

tocophérol présente dans chaque échantillon est calculée par rapport à la quantité connue de

standard interne. Les résultats sont exprimés en pmoles d’α-tocophérol/mg de protéines.

11. Fractionnement cellulaire sur les cellules BHK

Le fractionnement cellulaire est réalisé sur des cellules à confluence à partir

d’environ 100 millions de cellules suivant le protocole décrit par Kobayashi et al. (1998b).

Après avoir éliminé le milieu de culture, les cellules sont rincées 3 fois au PBS et décollées

doucement par grattage. Les cellules sont collectées dans un tube de 15 mL et centrifugées

pendant 5 minutes à 200 g à 4°C. Le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues

lentement dans 2,5 mL d’un tampon d’homogénéisation (HB ; 250 mM de sucrose dans un

tampon imidazole-HCl à 3 mM, pH 7,4). Les cellules sont alors centrifugées pendant 10

minutes à 900 g à 4°C. Le surnageant est éliminé et les cellules sont reprises dans 1,4 mL de

tampon HB par aspiration-refoulement avec à une seringue 22G ce qui provoque la lyse des

cellules (moins de 20% de cellules restent intactes). La suspension est alors centrifugée

pendant 8 minutes à 900 g à 4°C. Le surnageant post-nucléaire (« post nuclear supernatant »

ou PNS) est collecté puis ajusté à 42% de sucrose, 3 mM imidazole-HCl, pH 7,4. Cette

fraction est alors transférée dans un tube à centrifugation (SW41, Beckman) de 12 mL puis

recouvert d’un gradient discontinu de sucrose. Le gradient est réalisé par dépôts successifs

(2,7 mL) de solutions à 35% et 25% de sucrose, 3 mM imidazole-HCl, pH 7,4 puis de tampon

HB. Le gradient est alors centrifugé 1 heure à 200000 g avec un rotor à godets oscillant (type

SW41 Kontron). Les endosomes tardifs sont collectés à l’interface des fractions HB et 25% et

les endosomes précoces à l’interface des fractions 25% et 35% (Figure 25). A l’interface des



118

fractions 35% et 42% se trouvent les membranes dites «lourdes» (réticulum, golgi,

mitochondries…). Ces 3 fractions sont dialysées dans un tampon PBS avant analyse.

La quantité de protéines dans chaque fraction est déterminée grâce au kit de

dosage commercial BCA (Thermo Scientifique). Les lipides de chaque fraction sont ensuite

extraits par la méthode de Bligh et Dyer pour analyse.

12. Isolement des radeaux lipidiques riches en cholestérol

Le protocole utilisé est celui décrit pour la préparation des microdomaines de

lymphocytes par Diaz et al. (2002). On utilise l’insolubilité des microdomaines dans les

détergents non ioniques (ici le triton X100) à 4°C et leur propriété de flottaison sur un

gradient de densité conférée par leur enrichissement lipidique.

Environ 20-25 millions de macrophages RAW sont homogénéisés au potter verre-

verre dans un tampon Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,6, contenant un

mélange d’inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma). L’homogénat est ensuite

centrifugé à 900 g pendant 5 min à 4°C. Le surnagent post-nucléaire (PNS) est récupéré et la

concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford. Un volume connu du

PNS est incubé avec du triton X-100 (1% final) pendant 1 heure à 4°C sous agitation douce

dans un volume final de 1,5 mL. Un même volume de solution de saccharose à 2,6 M est

ensuite ajouté afin d’obtenir une concentration finale de 1,3 M de saccharose. Le gradient

discontinu de saccharose est réalisé par dépôts successifs de solutions de saccharose de

concentrations croissantes (0,2 à 0,9 M). Chaque fraction de 1 mL est déposée au fond du tube

Endosomes tardifs

Endosomes précoces

Membranes lourdes

HB

25%

35%

42%

Figure 25 : Schéma représentatif du gradient discontinu de sucrose (%) utilisé pour isoler les endosomes tardifs et les endosomes précoces à partir de cellules BHK. HB : tampon d’homogénéisation.



119

(tubes SW41, Beckmann) à l’aide d’une aiguille. Les 3 mL de l’homogénat sont déposés en

dernier (Figure 26). L’ultracentrifugation est réalisée à 200000 g pendant 16 heures à 4°C

avec un rotor à godets oscillants (type SW41 Kontron). A l’issue de l’ultracentrifugation, des

fractions de 1 mL sont collectées à partir du fond du tube (fractions 1 à 11).

Le pourcentage de saccharose de chacune des fractions est déterminé à l’aide d’un

réfractomètre portable et 250 µL de chaque fraction sont prélevés pour le dosage du

cholestérol libre. Une quantité connue de stigmastérol est ajouté comme étalon interne puis

0,9 mL de méthanol et 1,3 mL d’hexane. Après agitation et centrifugation à 800 g pendant 10

minutes, le cholestérol et le stigmastérol sont récupérés dans la phase organique supérieure.

Le cholestérol est quantifié selon la méthode décrite au paragraphe 7.5.

13. Microscopie à fluorescence

13.1 Localisation du BMP par immuno-détection

Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm contenant au fond une

lamelle de verre (ensemencement : 500000 cellules par puit). Toutes les étapes suivantes sont

réalisées à température ambiante. Les cellules sont fixées par une solution de

paraformaldéhyde à 3% dans le PBS pendant 20 min, incubées en présence de 50 mM de

NH4Cl pendant 10 minutes, puis dans une solution de BSA à 0,1% dans le PBS pendant 20

Fraction n° 1110987654321

0,2 M de saccharose

0,4 M0,3 M

0,5 M0,6 M0,7 M0,8 M0,9 M

1,33 M(PNS)

radeauxlipidiques

Figure 26 : Schéma représentatif du gradient discontinu de saccharose utilisé pour isoler les radeaux lipidiques.



120

min. Elles sont ensuite perméabilisées par une solution de saponine à 50 µg/mL dans le PBS

pendant 5 minutes. Les cellules sont alors incubées pendant 30 minutes en présence de

l’anticorps anti-BMP (dilution 1/10). Après rinçage au PBS, elles sont incubées pendant 30

minutes en présence d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome

Alexa 488 (dilution 1/1000) puis rincées au PBS.

13.2 Localisation de l’anticorps anti-BMP accumulé dans les cellules

Les cellules sont fixées et imperméabilisées comme décrit ci-dessus. Elles sont

ensuite incubées pendant 1 heure, à température ambiante, en présence d’un anticorps anti-

IgG de souris couplé soit à un fluorochrome Alexa 546 (dilution 1/1000), soit à un

fluorochrome Alexa 488 (dilution 1/1000). Les cellules sont ensuite lavées au PBS.

13.3 Localisation du cholestérol cellulaire

Les cellules sont fixées et imperméabilisées comme décrit ci-dessus. Elles sont

ensuite incubées pendant 30 min, à température ambiante, en présence de 50 µg/mL de

filipine dans le PBS, puis lavées au PBS.

13.4 Internalisation des DiI-LDL et DiI-acLDL

Nous avons également utilisé des LDL et des LDL acétylées couplées à un

fluorochrome (DiI-LDL et DiI-acLDL). Afin de cibler les endosomes tardifs les macrophages

RAW ont été incubés dans un milieu contenant 10 µg/mL de DiI-LDL ou de DiI-acLDL

pendant 1 heure. Ensuite les cellules sont rincées au PBS et incubées pendant 2 heures en

absence de LDL fluorescentes (« pulse/chase »). La localisation de la fluorescence peut alors

être directement observée au microscope optique à fluorescence. Les cellules peuvent

également être fixées et imperméabilisées comme décrit précédemment afin de réaliser un

double marquage. La distribution de la fluorescence est alors observée au microscope

confocal.



121

13.5 Observation de la fluorescence

Les lamelles de verres sont récupérées et montées sur des lames de verre avec un

liquide de montage (mowiol à 13% et glycérol à 3% dans un tampon Tris 0,2 M pH 8,5). La

distribution de la fluorescence est observée soit grâce à un microscope optique à fluorescence

Olympus BX60 équipé d’un objectif UPIanFi 100x, soit grâce à un microscope confocal Zeiss

LSM 510 équipé d’un objectif C-Apochromat 63XW Korr (ouverture numérique 1,2). La

longueur d’onde d’excitation pour les DiI-LDL et Di-acLDL est 543 nm. La distribution de la

filipine est observée en UV (bleu).

14. Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel JMP 5.0.1.2

(SAS Institute, Inc). Les comparaisons multiples ont été réalisées grâce à des ANOVA à 1 ou

2 facteurs. Chaque facteur peut prendre plusieurs modalités. Lorsque cela est indiqué les

moyennes de chaque paire de modalités sont comparées entre elles par un test de Tukey-

Kramer HSD basé sur l’ANOVA avec un risque α=0,05. Les modalités significativement

différentes sont indiquées sur les figures par des lettres capitales différentes. Les moyennes

expérimentales exprimées en pourcentage des valeurs contrôles sont comparées à la valeur

théorique du contrôle (100%) par un test de Student à 1 échantillon. Les différences

significatives avec p≤0,05 ou p≤0,01 sont respectivement indiquées par * ou **. Les

comparaisons de deux moyennes expérimentales entre elles ont été réalisées par un test de

Student à 2 échantillons. Les différences significatives avec p≤0,05 sont indiquées par a, b, #

ou † selon les figures.

RESULTATS


122

RESULTATS

RESULTATS PREMIERE PARTIE


123

PREMIERE PARTIE

Etude des effets d’un anticorps anti-BMP sur le métabolisme

intracellulaire du cholestérol dans des macrophages en culture



124

Introduction

Au cours de l’athérogenèse, les macrophages présents dans l’espace sous

endothélial captent de grandes quantités de LDL modifiées, notamment des LDL oxydées.

Ceci peut provoquer une forte accumulation intracellulaire d’esters de cholestérol et de

cholestérol libre induisant la formation de cellules spumeuses qui jouent un rôle important

dans l’apparition et l’évolution des lésions d’athérosclérose.

Après endocytose par les macrophages, les LDL natives et modifiées suivent la

voie endocytique jusqu’aux endosomes tardifs où les esters de cholestérol sont hydrolysés. Le

cholestérol libre est alors redistribué dans les différents compartiments cellulaires notamment

le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Lorsque les fonctions endosomales

sont altérées comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) ou après un

traitement avec des agents pharmacologiques qui miment le phénotype NPC, on observe une

accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs.

Les endosomes tardifs sont des corps multi-vésiculaires et multi-lamellaires dont

les membranes internes sont très riches en BMP. L’équipe du Dr. Jean Gruenberg a produit un

anticorps monoclonal qui reconnait spécifiquement le BMP. Il a été montré que cet anticorps

anti-BMP peut être internalisé par des fibroblastes et qu’il s’accumule dans les endosomes

tardifs où il se fixe à son antigène. L’accumulation de l’anticorps anti-BMP modifie

l’organisation des membranes internes des endosomes tardifs et altère le trafic des molécules

qui transitent via les endosomes tardifs, notamment le cholestérol dérivé des LDL qui

s’accumule alors dans ces structures (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999). Ces

résultats suggèrent que le réseau de membranes internes des endosomes tardifs, riche en BMP,

participe à la régulation du transport intracellulaire du cholestérol.

Dans cette première partie nous avons cherché à étudier plus en détail l’effet de

l’anticorps anti-BMP sur le métabolisme et les différentes voies du transport intracellulaire du

cholestérol dérivé des LDL dans les macrophages.



125

1.1 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution intracellulaire du cholestérol

Dans un premier temps nous avons cherché à vérifier que l’anticorps anti-BMP

est capté par les macrophages en culture et qu’il s’accumule dans les endosomes tardifs. Les

expériences ont été réalisées sur les macrophages murins RAW ainsi que sur les macrophages

issus de la lignée monocytique humaine THP-1 (Besson et al., 2006). Les cellules sont

cultivées en présence de l’anticorps anti-BMP pendant 48 heures puis la localisation

intracellulaire de l’anticorps est déterminée par immunofluorescence.

Dans les macrophages THP-1 la distribution de la fluorescence est ponctuelle et

périnucléaire, similaire à celle du BMP (Besson et al., 2006), suggérant bien une

accumulation endosomale de l’anticorps (Figure 27). Toutefois le degré d’accumulation de

l’anticorps anti-BMP est très hétérogène, certaines cellules accumulant de grandes quantités

d’anticorps et d’autres non. Les cellules ayant le plus accumulé l’anticorps présentent

également une forte accumulation de cholestérol libre révélée par la filipine. De plus, cette

accumulation de cholestérol libre est colocalisée avec l’anticorps.

Dans les macrophages RAW, on observe une distribution similaire de la

fluorescence mais contrairement aux macrophages THP-1 la majorité des cellules accumulent

l’anticorps anti-BMP. Toutefois, nous n’avons pas pu observer de différence de marquage

avec la filipine après le traitement avec l’anticorps, probablement en raison d’un marquage

déjà trop fort dans les cellules contrôles (résultats non montrés).

Ces observations indiquent que l’anticorps anti-BMP est capté par les

macrophages en culture et que son accumulation dans les endosomes tardifs entraîne une

accumulation de cholestérol dans ces mêmes structures. En revanche les quantités cellulaires

totales de cholestérol et d’esters de cholestérol ne sont pas modifiées (résultats non montrés).

Cette observation avait déjà été rapportée sur des fibroblastes par Kobayashi et al. (1999). Les

auteurs avaient alors postulé que l’accumulation de cholestérol révélée par la filipine se

produit très localement dans les endosomes tardifs et ne représente qu’une faible proportion

du cholestérol cellulaire total.



126

A la suite de ces observations nous avons cherché à identifier quelles voies de

transport du cholestérol pouvaient être altérées après traitement avec l’anticorps. Comme nous

nous intéressons en particulier au transport depuis les endosomes tardifs où est localisé le

BMP, nous avons focalisé nos études sur le devenir du cholestérol issu des LDL. Dans les

conditions de culture en routine telles qu’utilisées dans les expériences présentées ci-dessus,

les cellules sont incubées dans un milieu supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal

(FCS) qui fournit une quantité relativement faible de LDL (8,6 µg/mL de LDL). Dans les

expériences suivantes, les cellules ont été incubées en présence de LDL acétylées (acLDL,

entre 50 et 100 µg/mL) connues pour induire une forte accumulation de cholestérol libre (FC)

mais aussi d’esters de cholestérol (CE) dans les macrophages (Kritharides et al., 1998).

L’incubation est réalisée dans un milieu à 1% de FCS, afin d’apporter une quantité

négligeable de LDL comparativement aux acLDL. De plus, l’apport en HDL est aussi

appauvri (1,6 µg/mL), de telle sorte que l’efflux de cholestérol est mineur.

La plupart des expériences a été réalisée à la fois sur les macrophages THP-1 et

les macrophages RAW. Toutefois, par souci de simplification, nous ne présenterons que les

résultats obtenus avec les macrophages RAW. Par ailleurs, comme ces macrophages

accumulent l’anticorps de façon beaucoup plus homogène comparativement aux THP-1, les

effets de l’anticorps ont souvent été plus faciles à observer sur ces cellules.

Figure 27 : Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre dans les macrophages THP-1. Les cellules sont cultivées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 48 heures puis fixées et marquées avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome afin de visualiser l’anticorps anti-BMP internalisé, et avec la filipine pour révéler le cholestérol libre.



127

1.2 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre induite par

la captation des acLDL

Dans un premier temps, nous avons vérifié que les acLDL captées et internalisées

par les macrophages sont bien transportées vers les endosomes tardifs où s’accumule

l’anticorps anti-BMP. Nous avons ainsi comparé la distribution de l’anticorps anti-BMP et de

acLDL fluorescentes (DiI-acLDL).

Une proportion importante de la fluorescence correspondant aux DiI-acLDL est

détectée dans des structures ayant également accumulé l’anticorps anti-BMP (Figure 28). On

remarque cependant que certains compartiments qui ont accumulé l’anticorps ne contiennent

pas de DiI-acLDL, probablement en raison de l’hétérogénéité des endosomes tardifs (White et

al., 2006) ou de la dégradation des acLDL dans ces compartiments. Ces résultats suggèrent

que, au moins en partie, les acLDL et l’anticorps suivent la même voie endocytique et

atteignent les mêmes compartiments.

Nous avons ensuite quantifié le cholestérol libre qui s’accumule suite à

l’incubation avec les acLDL dans des cellules contrôles ou traitées avec l’anticorps anti-BMP.

Les résultats montrent qu’en présence de acLDL (100 µg/mL), la quantité cellulaire de

cholestérol libre augmente en fonction du temps (Figure 29B). Cette augmentation est

d’environ 40% après 8 heures d’incubation et 120% après 24 heures dans les cellules

Figure 28 : Colocalisation de l’anticorps anti-BMP et des DiI-acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 heures. Les cellules sont cultivées en présence de 10 µg/mL de DiI-acLDL pendant 1 h puis rincées et cultivées dans des conditions contrôles pendant 2 h. Les cellules sont alors fixées et marquées avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome afin de visualiser l’anticorps anti-BMP internalisé. Barre : 10 µm.



128

contrôles. A tous les temps d’incubation on remarque que la quantité de cholestérol libre est

d’autant plus augmentée, d’environ 30%, dans les cellules pré-traitées avec l’anticorps anti-

BMP. Le traitement des cellules avec des IgG de souris purifiées à partir de sérum n’a en

revanche aucun effet (Figure 29A) indiquant que les effets observés précédemment sont dû à

la spécificité de l’anticorps envers le BMP. L’agent pharmacologique U18666A est connu

pour inhiber presque complètement le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs

vers la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique (Liscum et al., 2002 ; Underwood

et al., 1996). Nous avons donc utilisé le U18666A pour pouvoir comparer ses effets avec ceux

observés dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP. Lorsque les cellules ont été pré-

traitées avec le U18666A l’accumulation de cholestérol libre stimulée par les acLDL est

augmentée de 90% par rapport aux cellules non traitées (contre 30% dans les cellules traitées

avec l’anticorps anti-BMP).

Ces résultats indiquent que l’anticorps anti-BMP, en s’accumulant dans les

endosomes tardifs, induit une augmentation de l’accumulation de cholestérol libre stimulée

par les LDL acétylées.

Figure 29 : Accumulation du cholestérol libre (FC) stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP, de 3 µg/mL de U18666A ou de 50 µg/mL d’IgG de souris pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h (A, moyennes ± SD, n=3) ou pendant des temps croissants (B, moyennes de 3 puits, n=1). Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Le cholestérol libre (FC) est quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en µg/mg de protéines ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).



129

1.3 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’estérification du cholestérol

Nous avons ensuite quantifié, dans les mêmes conditions d’incubation, les esters

de cholestérol. Lorsque les macrophages RAW sont incubés en présence de 100 µg/mL de

acLDL pendant 8 heures, la quantité cellulaire d’esters de cholestérol (CE) est multipliée par

4 (Figure 30). Contrairement au cholestérol libre nous n’observons pas de modification

significative de la quantité cellulaire de CE dans les cellules pré-traitées avec l’anticorps anti-

BMP. En revanche l’incubation des cellules en présence de U18666A inhibe presque

totalement l’accumulation de CE stimulée par les acLDL.

La quantification des esters de cholestérol totaux ne permet pas de distinguer les

esters de cholestérol issu de la ré-estérification du cholestérol issu des acLDL et les esters de

cholestérol apportés par les acLDL et non hydrolysés. Afin de s’assurer que l’accumulation

des CE mesurée dans les cellules reflète principalement la ré-estérification du cholestérol,

nous avons analysé la composition en acides gras des CE. En effet, il est connu que les CE

des LDL contiennent surtout de l’acide linolénique (18:2) alors que les CE cellulaires

s’enrichissent en acide oléique (18:1) en raison de la spécificité de substrat que présente

l’enzyme ACAT vis-à-vis des acides gras (Seo et al., 2001). Le Tableau 5 indique la

composition en acides gras des CE extraits de macrophages RAW ainsi que celle des acLDL.

On retrouve bien une majorité de 18:2 dans les CE isolés des acLDL. Dans les cellules

incubées en présence de acLDL, les proportions d’acide oléique (18:1) et d’acide

arachidonique (20:4) sont significativement augmentées, au contraire du 18:2, ce qui suggère

que les CE qui s’accumulent dans ces cellules proviennent de la ré-estérification par l’ACAT

du cholestérol libre dérivé des acLDL. Ceci est aussi le cas pour les CE qui s’accumulent dans

les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP.

Afin d’étudier plus précisément la ré-estérification par l’ACAT du cholestérol

libre dérivé des acLDL, les cellules ont été traitées comme précédemment mais en présence

également de [3H]oléate pendant la période d’incubation avec les acLDL. L’incorporation

totale du [3H]oléate est identique dans les cellules contrôles et les cellules traitées avec

l’anticorps anti-BMP (résultats non montrés). Ainsi, l’incorporation du [3H]oléate dans les

CE, exprimée en pourcentage de la radioactivité totale, représente le taux d’estérification du

cholestérol libre. Dans les cellules incubées en absence de acLDL seules des traces de



130

radioactivité associée aux CE ont été détectées, indiquant un taux d’estérification basal très

faible (Figure 31). Dans les cellules contrôles incubées en présence de acLDL l’incorporation

du [3H]oléate dans les CE est très fortement augmentée et représente donc principalement la

ré-estérification du cholestérol libre dérivé des acLDL. L’estérification du cholestérol en

présence de acLDL est stimulée de façon identique dans les cellules pré-traitées avec

l’anticorps. En revanche, en présence de U18666A l’estérification du cholestérol est presque

complètement inhibée. Ceci est cohérent avec le rôle connu de cet agent pharmacologique qui

bloque le transport du cholestérol des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où

est localisée l’ACAT. L’ensemble de ces résultats montre que l’anticorps anti-BMP ne

modifie pas la ré-estérification du cholestérol dérivé des acLDL et donc que le transport du

cholestérol dérivé des LDL vers le réticulum endoplasmique n’est pas altéré.

Figure 30 : Accumulation des esters de cholestérol (CE) stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP, de 3 µg/mL de U18666A ou de 50 µg/mL d’IgG de souris pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les CE sont quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en µg/mg de protéines (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).



131

Figure 31 : Estérification du cholestérol stimulée par les acLDL. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP ou de 3 µg/mL de U18666A pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL et de 0,5 µCi/mL de [3H]oléate pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. La radioactivité associée aux CE est mesurée comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en % de la radioactivité cellulaire totale (moyennes ± SD, 4 puits sur n=2) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).

Tableau 5 : Composition en acides gras des esters de cholestérol (CE) cellulaires et associés aux acLDL. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les CE sont isolés des cellules et des acLDL puis leur composition en acides gras est analysée comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en mol% (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales (test de Student à 2 échantillons).

Acides gras Basal AcLDL AcLDL + anti-BMP CE associés aux acLDL

14:0 6,70 ± 1,55 5,39 ± 1,27 5,49 ± 1,48 0,43 ± 0,116:0 41,71 ± 4,31 25,30 ± 2,44a 25,25 ± 1,72a 11,8 ± 0,518:0 8,42 ± 2,53 7,97 ± 2,22 8,25 ± 1,29 0,6 ± 0,118:1 19,90 ± 2,86 37,52 ± 3,64a 36,68 ± 3,65a 20,9 ± 0,218:2 25,91 ± 5,56 19,88 ± 4,29 20,99 ± 5,02 55,2 ± 0,920:4 1,20 ± 0,50 3,94 ± 1,39a 3,33 ± 1,43a 7,4 ± 0,1

mol%

esters de cholestérol (CE) cellulaires



132

1.4 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la captation des acLDL

L’augmentation de l’accumulation de cholestérol libre dans les cellules traitées

avec l’anticorps anti-BMP pourrait être due à une augmentation de la quantité de acLDL

captée par les cellules. Afin de mesurer la captation des acLDL, les cellules ont été incubées

pendant 24 heures en présence de acLDL reconstituées avec du cholestéryl oléate tritié

([3H]CO-acLDL). A la fin de cette période d’incubation la radioactivité cellulaire totale est

mesurée ce qui nous permet de calculer la quantité de acLDL qui a été captée par les cellules.

Comme indiqué dans le Tableau 6, la captation des acLDL n’est pas modifiée par

l’anticorps anti-BMP. De plus, la répartition de la radioactivité entre le cholestérol libre (FC)

et les esters de cholestérol (CE) n’est pas modifiée. La radioactivité associée aux CE est

constituée à la fois de [3H]CO contenu dans les acLDL et non hydrolysé ainsi que des [3H]CE

issus de la ré-estérification du [3H]FC formé par hydrolyse du [3H]CO. Comme nous avons

montré précédemment que l’estérification du cholestérol dérivé des acLDL n’est pas modifiée

par l’anticorps anti-BMP, ces résultats suggèrent également que l’hydrolyse des esters de

cholestérol associés aux acLDL n’est pas modifiée.

Tableau 6 : Captation des [3H]CO-acLDL par les macrophages RAW et distribution de la radioactivité cellulaire entre le cholestérol libre (FC) et les esters de cholestérol (CE). Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. La quantité de acLDL captée est déterminée en mesurant la radioactivité cellulaire totale et est exprimée en µg de acLDL/mg de protéines cellulaires (moyennes ± SD, n=3). La radioactivité associée au FC et aux CE est mesurée comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en % de la radioactivité totale ([3H]FC+[3H]CE).

Contrôle anti-BMP

Captation (µg acLDL/mg protéine) 9,2 ± 0,9 9,9 ± 1,7Radioactivité (% du total) FC 34,8 ± 2,8 33,6 ± 6,0 CE 65,2 ± 2,8 66,4 ± 6,0



133

1.5 Effet de l’anticorps anti-BMP sur le cholestérol libre de la membrane plasmique

Nous avons montré que l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les

endosomes tardifs ne modifie pas l’estérification du cholestérol dérivé des acLDL, suggérant

que le transport du cholestérol vers le réticulum endoplasmique n’est pas altéré. Il est admis

que la majorité du cholestérol issu des LDL transite par la membrane plasmique avant

d’atteindre le réticulum endoplasmique, bien qu’une voie directe, mais mineure, ait aussi été

décrite. Nous avons donc voulu déterminer si l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les

endosomes tardifs altère le transport du cholestérol dérivé des acLDL vers la membrane

plasmique. La quantité ou la proportion de cholestérol associé à la membrane plasmique a été

estimée selon 3 méthodes différentes : la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B,

l’oxydation du cholestérol membranaire par la cholestérol oxydase et l’extraction du

cholestérol membranaire par la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD). Ces méthodes de

quantification indirectes ont été utilisées comme alternative à une quantification directe du

cholestérol dans la membrane plasmique, dans la mesure où nous n’avons pas réussi à isoler

ces membranes de façon satisfaisante.

1.5.1 Mesure de la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B

L’amphotéricine B est un antifongique de la famille des polyènes qui se fixe aux

régions membranaires riches en cholestérol et forme des pores causant la mort cellulaire. La

sensibilité des cellules à l’amphotéricine B, qui peut être mesurée par un test de viabilité

cellulaire, représente donc une mesure semi-quantitative de la quantité de cholestérol associée

à la membrane plasmique. Des travaux antérieurs ont montré que la sensibilité à

l’amphotéricine B est augmentée dans des cellules incubées avec des LDL, en conséquence de

l’accumulation de cholestérol dans la membrane plasmique (Liscum et al., 2002).

Dans nos expériences, la viabilité des cellules est mesurée avec un test MTT

commercial et les résultats sont exprimés en pourcentage de la viabilité maximale mesurée

dans les groupes de référence respectifs (traitements des cellules identiques mais en absence

d’amphotéricine B). La viabilité maximale est identique pour les cellules contrôles et les

cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP, dans les deux conditions analysées (absence ou



134

présence de acLDL, résultats non montrés). Dans des conditions basales, l’amphotéricine B

aux concentrations 25 et 50 µg/mL induit une diminution de la viabilité de 25% et 40%

respectivement (Figure 32A). Après incubation avec les acLDL, le pouvoir cytolytique de

l’amphotéricine B est significativement augmenté, en accord avec une augmentation du

cholestérol membranaire rendant les cellules plus sensibles à la toxine. Dans les cellules

traitées avec l’anticorps, cette augmentation de sensibilité est encore plus forte, suggèrant une

quantité de cholestérol membranaire plus importante que dans les cellules non traitées avec

l’anticorps.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si cette apparente accumulation de

cholestérol membranaire dans les cellules traitées avec l’anticorps reflète une augmentation de

la synthèse de novo de cholestérol. Pour cela la même série d’expériences a été menée sur des

cellules traitées avec un inhibiteur de la synthèse de cholestérol (mévinoline 20 µM +

mévalonate 0,5 mM). Les cellules sont alors presque deux fois plus résistantes à

l’amphotéricine B (+mev) que les cellules contrôles (-mev) (Figure 32B). Ce résultat était

attendu puisque l’inhibition de la synthèse de cholestérol entraîne une diminution de la

quantité cellulaire totale de cholestérol et notamment membranaire. Dans la condition où la

synthèse de cholestérol est inhibée (+mev) on observe que suite à l’incubation avec les

acLDL, les cellules traitées avec l’anticorps sont toujours plus sensibles à l’amphotéricine B

que les cellules non traitées. Ces résultats suggèrent que le cholestérol qui s’accumule dans la

membrane plasmique des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP provient effectivement

des acLDL.



135

1.5.2 Mesure de l’oxydabilité du cholestérol membranaire par la cholestérol oxydase

La cholestérol oxydase est une enzyme qui oxyde le cholestérol en cholesténone.

Lorsque les cellules sont fixées et incubées en présence de cholestérol oxydase, seul le

cholestérol présent dans la membrane plasmique est accessible à l’enzyme (Lange et Ramos,

1983). Ainsi, la proportion du cholestérol issu des acLDL retrouvée dans la membrane

plasmique peut être estimée en utilisant des acLDL radiomarquées et en déterminant le

pourcentage de cholestérol cellulaire converti en cholesténone. Nous avons ainsi comparé

l’oxydation du cholestérol membranaire par la cholestérol oxidase dans des cellules contrôles

et des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP suite à une incubation en présence de

[3H]CO-acLDL.

Dans les cellules contrôles, 56 ± 1 % du [3H]cholestérol dérivé des acLDL est

converti en [3H]cholesténone. Ce pourcentage augmente jusqu’à 64 ± 1,5 % dans les cellules

traitées avec l’anticorps anti-BMP (p≤0,01, n=3). Ce résultat indique que l’anticorps anti-

Figure 32 : Mesure de la sensibilité des macrophages RAW à l’amphotéricine B. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant une nuit. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les cellules sont ensuite traitées avec l’amphotéricine B comme décrit dans Matériels et Méthodes. A : La viabilité cellulaire est mesurée par un test au MTT après un traitement avec 25 ou 50 µg/mL d’amphotéricine B. B : La viabilité cellulaire est mesurée par un test au MTT après un traitement avec 50 µg/mL d’amphotéricine B en absence ou en présence d’un inhibiteur de la synthèse de cholestérol (mev). Les résultats sont exprimés en % de la viabilité maximale mesurée dans des groupes de référence traités de manière identique mais en absence d’amphotéricine B (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).



136

BMP induit une augmentation de la proportion du cholestérol dérivé des acLDL et associé à la

membrane plasmique par rapport au cholestérol présent dans les différents compartiments

intracellulaires.

1.5.3 Mesure de l’extraction du cholestérol cellulaire par la cyclodextrine (MβCD)

La méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est une « molécule-cage » possédant une très

forte affinité pour le cholestérol. Il a été montré que l’incubation de cellules en culture en

présence de MβCD pendant des temps courts et à des concentrations de l’ordre du milli-

molaire permet d’extraire le cholestérol de la membrane plasmique sans mobiliser les

réservoirs internes de cholestérol. La proportion du cholestérol issu des acLDL retrouvée dans

la membrane plasmique peut donc être estimée avec la MβCD en utilisant des acLDL

radiomarquées.

Après incubation en présence [3H]CO-acLDL, les cellules ont été incubées en

présence de 5 et 10 mM de MβCD pendant 5 et 10 minutes, puis la quantité de radioactivité

présente dans le milieu de culture et dans les cellules a été mesurée. L’efflux de cholestérol

est exprimé en pourcentage de la radioactivité associée à la MβCD (dans le milieu de culture)

par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu). Ce paramètre représente indirectement

la proportion de [3H]cholestérol associé à la membrane plasmique par rapport au

[3H]cholestérol intracellulaire.

La MβCD stimule l’efflux du [3H]cholestérol à la fois en fonction de la

concentration et du temps d’incubation (Figure 33). Pour tous les temps et toutes les

concentrations utilisés on remarque que le pourcentage de [3H]cholestérol capté par la MβCD

est augmenté dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP. Ce résultat est cohérent

avec une augmentation de la proportion du cholestérol dérivé des acLDL asssocié à la

membrane plasmique par rapport au cholestérol présent dans les différents compartiments

intracellulaires.



137

L’ensemble de ces résultats indique qu’une quantité importante de cholestérol issu

des acLDL se retrouve associée à la membrane plasmique (plus de la moitié selon les

expériences avec la cholestérol oxidase). De plus, cet enrichissement de la membrane

plasmique en cholestérol est accentué de façon significative dans les cellules traitées avec

l’anticorps anti-BMP.

1.6 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL

Nous avons aussi cherché à déterminer si l’anticorps anti-BMP altère l’efflux du

cholestérol stimulé par les HDL. Après incubation en présence de [3H]CO-acLDL, les cellules

ont été incubées en présence de HDL puis la quantité de radioactivité présente dans le milieu

de culture et dans les cellules a été mesurée. Comme précedemment, l’efflux de cholestérol

est exprimé en pourcentage de la radioactivité associée aux HDL (dans le milieu de culture)

par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu).

Figure 33 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par la MβCD dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. L’efflux du cholestérol est ensuite stimulé par incubation des cellules en présence de 5 ou 10 mM de MβCD pendant 5 ou 10 min. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité mesurée dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu) (moyennes ± SD, n=3). a : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons).



138

La Figure 34 montre que l’efflux de cholestérol augmente en fonction du temps

d’incubation avec les HDL. Après 24 heures les HDL ont capté environ 20% du

[3H]cholestérol cellulaire. Pour tous les temps analysés, l’efflux de cholestérol est diminué

dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP (réduction de 15% par rapport aux

contrôles à 24 heures).

1.7 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la répartition du cholestérol entre les différents

domaines membranaires

Nous avons montré que dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP, la

quantité de cholestérol dérivé des acLDL est augmentée dans la membrane plasmique mais

que l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL est diminué. Des études ont montré que le

cholestérol n’est pas réparti de manière homogène dans la membrane plasmique. Il existe en

effet de nombreux domaines, plus ou moins riches en cholestérol et possédant des propriétés

différentes (voir chapitre 1 des rappels bibliographiques). Il a été montré notamment que

Figure 34 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par les HDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. L’efflux du cholestérol est ensuite stimulé par incubation des cellules en présence de 100 µg/mL de HDL pendant des temps croissants. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité mesurée dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu) (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons).



139

l’efflux est modifié selon la répartition du cholestérol entre ces différents domaines de la

membrane plasmique et que le transporteur ABCG1 redistribue le cholestérol vers des

domaines accessibles aux HDL (Vaughan et Oram, 2005). Nous avons donc cherché à

déterminer si le traitement des macrophages RAW avec l’anticorps anti-BMP modifie la

répartition du cholestérol entre les différents domaines de la membrane plasmique.

Après traitement des cellules en présence de acLDL, les différentes fractions de la

membrane plasmique ont été isolées par ultracentrifugation sur gradient de saccharose après

homogénéisation des cellules en présence d’un détergent (triton X-100). Cette technique

utilise l’insolubilité des radeaux lipidiques dans les détergents et leur propriété de flottaison

sur gradient de saccharose en fonction de leur densité. Après la centrifugation on récupère des

fractions de 1 mL numérotées de 1 à 11 à partir du fond du tube. Les pourcentages de

saccharose mesurés dans chacune de ces fractions sont reportés dans la Figure 35A. La

fraction 1, la plus dense, contient 37,5% de saccharose, puis ce pourcentage diminue

progressivement jusqu'à la fraction 11 contenant 10% de saccharose. Les pourcentages de

saccharose dans les différentes fractions sont identiques pour les trois conditions testées,

assurant ainsi la reproductibilité de la séparation. Le cholestérol libre (FC) est ensuite

quantifié dans chaque fraction.

Le cholestérol des cellules cultivées dans des conditions basales (sans traitement

avec l’anticorps et sans acLDL) se répartit en deux populations distinctes (Figure 35B) de

manière similaire à ce qui a été rapporté dans les macrophages THP-1 (Gaus et al., 2005). Sur

la base du pourcentage de saccharose (Figure 35A) et de la distribution du GM1 (résultats non

montrés), la fraction « lourde » (fractions 2 et 3) est définie comme correspondant aux

domaines fluides de la membrane plasmique et la fraction « légère » (fractions 8 et 9) comme

correspondant aux radeaux lipidiques riches en cholestérol et résistants au triton (Diaz et al.,

2002). Dans les cellules incubées en présence de acLDL, la quantité de cholestérol augmente

dans toutes les fractions par rapport aux conditions basales. On observe notamment une

augmentation importante de la quantité de cholestérol dans les fractions de densité

intermédiaire (fractions 5, 6 et 7). Dans les macrophages pré-traités avec l’anticorps anti-BMP

on remarque que la répartition du cholestérol dans les différentes fractions est légèrement

modifiée. En effet la quantité de cholestérol est augmentée dans les fractions 5 et 6, et

diminué dans les fractions 7 et 8 par rapport aux cellules non traitées. Ces résultats suggèrent

que l’anticorps anti-BMP modifie la répartition du cholestérol issu des acLDL entre les

différents domaines de la membrane plasmique.



140

Discussion

Les premières études fonctionnelles concernant le BMP ont été réalisées sur une

lignée cellulaire de fibroblastes à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-BMP. Il a été montré

que cet anticorps s’accumule dans les endosomes tardifs des cellules en se fixant au BMP et

qu’il altère l’organisation, la dynamique et la fonction des membranes endosomales

contrôlées par les domaines riches en BMP (Kobayashi et al., 1998b). Il a notamment été

montré que l’anticorps anti-BMP induit une accumulation de cholestérol libre dans les

endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1999). Toutefois, l’effet de l’anticorps anti-BMP sur les

différentes voies métaboliques et le transport du cholestérol dérivé des LDL n’a jamais été

précisément étudié.

Figure 35 : Séparation sur gradient de saccharose des radeaux lipidiques dans des macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 12 h. Les cellules sont récoltées et homogénéisées en présence de triton X-100. Les différentes fractions membranaires sont isolées par ultracentrifugation sur gradient discontinu de saccharose comme décrit dans Matériels et Méthodes. A : Le pourcentage de saccharose est déterminé pour chaque fraction à l’aide d’un réfractomètre portable. B : Le cholestérol libre (FC) est quantifié dans chaque fraction et les résultats sont exprimés en µg/mg protéines (moyennes de 2 déterminations sur n=1).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

% s

acch

aros

e

N° fraction

basalacLDLacLDL + anti-BMP

A

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

FC (µ

g/m

g pr

otéi

ne)

N° fraction

basalacLDLacLDL + anti-BMP

B



141

Dans cette étude nous avons dans un premier temps montré que l’anticorps anti-

BMP s’accumule dans deux lignées de macrophages en culture, les THP-1 et les RAW, et que

ceci altère la distribution intracellulaire du cholestérol. Nous nous sommes ensuite intéressés

aux effets de l’anticorps anti-BMP sur le métabolisme et le transport intracellulaires du

cholestérol dérivé des LDL.

Sur des cellules cultivées dans un milieu contenant 10% de FCS qui apporte une

quantité faible de LDL, l’anticorps anti-BMP ne modifie pas la quantité cellulaire totale de

cholestérol. Au contraire, lorsque les cellules sont supplémentées en acLDL, le cholestérol

libre s’accumule davantage dans les cellules traitées avec l’anticorps que dans les cellules

contrôles.

De nombreuses études ont montré que l’agent pharmacologique U18666A bloque

le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le

réticulum endoplasmique, induisant une inhibition presque totale de l’estérification du

cholestérol dérivé des LDL et une accumulation de cholestérol libre dans les endosomes

tardifs (Liscum et al., 2002 ; Underwood et al., 1996). Nous avons confirmé ces effets de

l’U18666A dans les macrophages RAW (et THP-1, non montré). Contrairement à

l’U18666A, l’anticorps anti-BMP n’altère pas la ré-estérification du cholestérol dérivé des

acLDL. Ceci suggère que le cholestérol n’est pas totalement retenu dans les endosomes tardifs

ou qu’il peut rejoindre le réticulum endoplasmique par une voie indépendante des endosomes

tardifs où s’accumule l’anticorps anti-BMP. A ce titre Sugii et al. (2003) ont montré qu’une

partie des esters de cholestérol contenus dans les LDL est hydrolysée dans un compartiment

différent des endosomes tardifs. Il est donc possible que le cholestérol libre ainsi formé puisse

rejoindre le réticulum endoplasmique ou la membrane plasmique sans transiter par les

endosomes tardifs.

Nous nous sommes ensuite intéressés à la voie de transport du cholestérol des

endosomes tardifs vers la membrane plasmique. Nous avons montré que l’anticorps anti-BMP

induit une augmentation de la quantité cellulaire de cholestérol libre dans la membrane

plasmique après incubation des cellules en présence de acLDL. Cet enrichissement de la

membrane plasmique en cholestérol ne provient ni d’une augmentation de la synthèse de

novo, ni d’une hydrolyse des esters de cholestérol formés dans le réticulum endoplasmique

car la quantité d’esters de cholestérol accumulée dans les cellules n’est pas modifiée par

l’anticorps anti-BMP.



142

Récemment il a été montré que l’agent pharmacologique D-PDMP s’accumule

dans les endosomes tardifs, modifiant fortement la structure des domaines riches en BMP et

inhibant l’activité de la lipase acide responsable de l’hydrolyse des esters de cholestérol

dérivé des LDL (Makino et al., 2006). Les résultats présentés dans notre étude indiquent que

contrairement au D-PDMP, l’anticorps anti-BMP ne modifie pas l’hydrolyse des esters de

cholestérol contenus dans les acLDL.

Une autre conséquence de l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les

endosomes tardifs est la diminution de l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL, malgré

une augmentation de la quantité de cholestérol libre dans la membrane plasmique. L’équipe

de Tabas a montré qu’une accumulation massive de cholestérol libre dans des macrophages

péritonéaux de souris induit une diminution modérée de l’efflux du cholestérol stimulé par les

HDL (Feng et al., 2003 ; Shiratori et al., 1994). Dans ces études, l’augmentation du

cholestérol libre obtenue en supplémentant les cellules avec des acLDL en présence d’un

inhibiteur de l’ACAT est environ d’un facteur 6 et s’accompagne d’une induction de la mort

cellulaire (Tabas, 2002). Dans nos conditions expérimentales, l’augmentation de cholestérol

libre induite par l’anticorps anti-BMP en présence de acLDL est beaucoup plus faible et

n’induit pas de diminution significative de la viabilité cellulaire. Il parait donc peu probable

que la diminution de l’efflux de cholestérol soit une conséquence de l’accumulation de

cholestérol libre.

La MβCD possède une très forte affinité pour le cholestérol et capte de manière

non spécifique le cholestérol présent dans la membrane plasmique. Ainsi, l’efflux de

cholestérol stimulé par la MβCD est étroitement corrélé à la quantité de cholestérol présent

dans la membrane plasmique. L’augmentation d’efflux à la MβCD observée dans les cellules

traitées avec l’anticorps suggère donc un enrichissement du cholestérol dans la membrane

plasmique de ces cellules. A l’inverse, l’efflux de cholestérol vers les HDL est diminué après

traitement avec l’anticorps. Toutefois, la littérature indique que l’efflux vers les HDL est

régulé de façon plus complexe car il dépend en outre de l’activité du transporteur

membranaire ABCG1 et du récepteur SR-BI (Drobnik et al., 2002 ; Vaughan et Oram, 2005).

De plus, des études récentes ont mis en évidence l’existence de domaines riches en cholestérol

dans la membrane plasmique qui sont différemment régulés selon les mécanismes mis en jeu



143

dans l’efflux de cholestérol, HDL- ou apoA1-dépendant. Les résultats de nos études sur les

microdomaines membranaires, bien que préliminaires, suggèrent que l’anticorps anti-BMP

modifie la répartition du cholestérol entre des domaines membranaires possédant des densités

différentes. Ainsi, l’anticorps anti-BMP pourrait modifier spécifiquement le transport du

cholestérol dérivé des acLDL vers certains types de microdomaines utilisés comme réservoirs

par ABCG1 ou SR-BI et réduire de cette manière l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL.

A ce titre, il serait aussi intéressant d’évaluer les conséquences de l’accumulation de

l’anticorps sur l’expression/activité du transporteur ABCG1.

En conclusion, les résultats de cette étude confirment que le BMP est impliqué

dans la régulation du transport endosomal du cholestérol dérivé de la captation des LDL. De

plus nous montrons que le BMP semble contribuer à la régulation de l’homéostasie cellulaire

du cholestérol, bien qu’il soit localisé de manière très spécifique dans les endosomes tardifs.

En effet, dans des conditions où l’acccumulation de cholestérol est stimulée, le BMP semble

contrôler la quantité de cholestérol dans la membrane plasmique ainsi que l’efflux du

cholestérol par les HDL. Ainsi, le BMP pourrait jouer un rôle important lors des phases

précoces de l’athérogenèse, notamment pour prévenir l’accumulation de cholestérol libre dans

les macrophages qui est considérée comme la première étape dans la formation des cellules

spumeuses et l’évolution des plaques d’athérome (Tabas, 2002).

RESULTATS DEUXIEME PARTIE


144

DEUXIEME PARTIE

Etude des effets d’une accumulation du BMP sur le transport et le

métabolisme intracellulaire du cholestérol dans les macrophages



145

Introduction

L’étude présentée dans la première partie ainsi que celles réalisées par le Dr.

Kobayashi (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999) indiquent que le BMP participe

à l’organisation des membranes internes des endosomes tardifs et à la régulation du transport

intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL. Ces études ont reposé sur l’utilisation de

l’anticorps anti-BMP qui a été l’un des premiers outils utilisé pour des études fonctionnelles.

Des études en microscopie ont indiqué que l’anticorps anti-BMP altère la structure des

endosomes qui devient plus compacte (Kobayashi et al., 1998b). On ignore cependant si

l’anticorps qui s’accumule dans les endosomes tardifs reconnait directement le BMP ou un

environnement membranaire spécifique des membranes internes des endosomes tardifs riches

en BMP. Afin de mieux comprendre le rôle cellulaire du BMP et les mécanismes mis en jeu

nous nous sommes intéressés à définir qu’elles sont les propriétés du BMP (structure,

quantité, composition en acides gras…) importantes pour sa fonction au sein des membranes

des endosomes tardifs. Le métabolisme cellulaire du BMP (synthèse, remodelage des acides

gras, dégradation…), et en particulier les enzymes spécifiquement impliquées, ne sont que

partiellement connues, ce qui limite les possibilités et les outils de biologie cellulaire

permettant de modifier le BMP.

Bien qu’il reste de nombreuses interrogations sur les voies de synthèse du BMP, il

a été clairement établi que le PG exogène peut être utilisé comme précurseur par les cellules

en culture et notamment par les macrophages RAW (Amidon et al., 1995 ; Waite et al., 1990).

A partir de cette observation, nous avons envisagé d’induire une augmentation de la quantité

de BMP dans les macrophages en supplémentant les cellules avec du PG exogène, et d’en

mesurer les conséquences sur l’homéostasie du cholestérol intracellulaire.



146

2.1 Caractérisation et dosage du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des

conditions contrôles

2.1.1 Rappel de la méthode

Les différentes étapes d’extraction et de purification des phospholipides d’intérêt

(BMP, PC et PE) sont schématisées dans la Figure 37. Dans notre étude nous avions besoin

pour chaque échantillon de déterminer à la fois la quantité de BMP et sa composition en

acides gras. Nous avons donc choisi de quantifier le BMP par le dosage de ses acyles gras en

chromatographie gazeuse (GC) grâce à un standard interne synthétisé par notre équipe. Ce

standard interne est une molécule de BMP dont les deux chaînes acyles sont du

pentadécanoate (15:0/15:0-BMP). Cet acide gras n’existe pas naturellement dans les cellules

et il est possible de le séparer des autres acides gras en GC. De plus nous avons vérifié que le

15:0/15:0-BMP est co-extrait et co-purifié avec le BMP endogène lors de toutes les étapes de

séparation. Afin de quantifier de la même façon les phosphatidylcholines (PC) et les

phosphatidyléthanolamines (PE) nous avons utilisé deux autres standards internes disponibles

dans le commerce, le 17:0/17:0-PC et le 17:0/17:0-PE.

Après extraction de l’ensemble des lipides cellulaires, la première étape de

purification des PC, des PE et du BMP consiste en une chromatographie sur couche mince en

deux dimensions (CCM-2D) au cours de laquelle les PC sont bien séparées des autres classes

de phospholipides. Un profil d’élution en CCM-2D est présenté dans la Figure 36. Le gel de

silice correspondant à la zone de migration des PC est récupéré puis leur composition en

acides gras est analysée par GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. En revanche les

PE co-migrent avec le PG et nécessitent donc une étape supplémentaire de purification

réalisée par HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes. De même, le BMP migre très

proche des cardiolipines (CL). Afin d’éviter tout risque de contamination, le BMP est donc

également purifié par HPLC.

En HPLC les PE et PG sont élués respectivement en 21 et 31 minutes. En accord

avec les données de la littérature, les macrophages RAW cultivés dans des conditions

contrôles contiennent une quantité très faible de PG, inférieure au seuil de détection dans nos

conditions d’analyses en HPLC. Ainsi, sur les chromatogrammes seul le pic correspondant



147

aux PE est observé (Figure 42A). Dans notre système HPLC, un standard commercial de

18:1/18:1-BMP est élué en 3 pics dont les temps de rétention sont compris entre 10 et 15

minutes. Le BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles est

également élué en trois pics distincts aux mêmes temps de rétention (Figure 38). Luquain et

al. (2000) ont montré que les trois pics correspondent tous à du BMP mais qu’ils diffèrent par

la composition en acides gras, la position des acyles gras sur les résidus glycérols ainsi que

par la stéréoconfiguration du squelette glycérophosphate.

Les PE et le BMP sont récoltés en sortie de colonne puis extraits du solvant

d’élution et leur composition en acides gras est analysée en GC comme décrit dans Matériels

et Méthodes. Afin de pouvoir calculer pour chaque échantillon le rendement d’extraction, une

quantité connue d’un deuxième standard interne est ajoutée juste avant l’injection en GC. Il

s’agit d’un ester méthylique d’acide gras à 17 atomes de carbones (17:0-Me) pour le BMP et

d’un ester méthylique d’acide gras à 15 atomes de carbones (15:0-Me) pour les PC et les PE.

En moyenne, les rendements d’extraction des PC sont d’environ 75-80%. En raison d’une

étape supplémentaire de purification en HPLC le rendement d’extraction des PE et du BMP

sont d’environ 60-65%. Sur les chromatogrammes, chaque pic correspondant à un acide gras

est identifié en fonction de son temps de rétention. Les quantités et les compositions en acides

gras des différents phospholipides sont calculées comme décrit dans Matériels et Méthodes.

Des exemples de chromatogrammes des acides gras sont présentés dans l’annexe 2.

Figure 36 : Profil de migration des classes de phospholipides en CCM-2D. O : origine ; PI : phosphatidylinositols ; PS : phosphatidylsérines ; SM : sphingomyélines ; PC : phosphatidylcholines ; PE : phosphatidyléthanolamines ; CL : cardiolipines ; BMP : bis(monoacylgycérophosphate ; AG : acides gras non estérifiés ; LN : lipides neutres

1. b

asiq

ue

2. acide

PI / PS / SM

PE

PC

BMP

CL

LN

AG

O



148

Figure 37 : Protocole d’extraction et de purification des PC, des PE et du BMP.

Culot cellulaireEnv. 100 x 106 cellules8 mg de prot.

1) Ajout des premiers standards internes80 µg de 17:0/17:0-PC25 µg de 17:0/17:0-PE7 µg de 15:0/15:0-BMP

2) Extraction lipidique

Lipides totaux

Séparation des classes de phospholipides

par CCM-2D

PC PE/PG BMP

Le gel de silice est gratté et

transféré dans un tube en verre

Purification par HPLC

BMP purifié

Transméthylation Transméthylation

Esters méthyliques d’acides gras

+ 35 µg de15:0-Me

+ 15 µg de15:0-Me

+ 5 µg de17:0-Me

Ajout du 2ème standard interne

Homogénéisation dans 1,5 ml d’eau + triton 0,1%

Dosage des protéines sur une fraction aliquote

Analyse en chromatographie gazeuseVolume d’injection : 1 µl

Dilution dans un volume d’isooctane

1100 µl 400 µl 100 µl

PE purifiées



149

2.1.2 Quantification des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés

dans des conditions contrôles

Dans des conditions contrôles les macrophages RAW contiennent 51,3 ± 6,9

nmol/mg-prot de PC, 27,8 ± 4,5 nmol/mg-prot de PE et 3,2 ± 0,9 nmol/mg-prot de BMP. Il est

possible de quantifier en parallèle les phospholipides totaux sur une fraction aliquote de

l’extrait lipidique total. Ainsi nous avons déterminé que les PC, les PE et le BMP représentent

respectivement 49%, 26% et 3% des phospholipides totaux. Dans la plupart des tissus et types

cellulaires le BMP représente moins de 1% des phospholipides totaux. Ainsi, en comparaison,

il apparait que les macrophages RAW contiennent une proportion relativement importante de

BMP.

2.1.3 Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW

L’acide oléique (OA, 18:1n-9) est l’acide gras majoritaire dans les trois

phospholipides étudiés, notamment dans le BMP où il représente plus de 50% du total des

chaînes grasses (Tableau 7). Les PC contiennent une grande proportion d’acides gras saturés

(40%) alors que les PE sont plus riches en acides gras polyinsaturés (AGPI). Le BMP est

Figure 38 : Chromatogrammes HPLC d’un standard commercial de 18:1/18:1-BMP et de BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles.



150

composé de 14% d’acides gras saturés et de 12 % d’AGPI. Contrairement aux PE qui

contiennent davantage d’AGPI de la série n-6 dont l’acide arachidonique (AA, 20:4n-6), le

BMP contient davantage d’AGPI de la série n-3. Le DHA représente 7% des chaînes acyles

du BMP et constitue l’AGPI majoritaire.

Tableau 7 : Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. Les PC, les PE et le BMP sont extraits et purifiés par CCM/HPLC à partir de cellules cultivées dans des conditions contrôles. Leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=6). tr : traces. nd : non détecté. AG : acides gras. DMA : dimethylacétals.

Acides gras BMP PC PE

14:0 0,5 ± 0,2 3,1 ± 0,4 0,3 ± 0,1

16:0 7,7 ± 1,4 28,0 ± 1,8 7,3 ± 1,0

18:0 5,9 ± 0,8 8,0 ± 0,4 14,6 ± 1,0

Total des AG saturés 14,1 ± 2,4 39,1 ± 2,6 22,2 ± 2,116:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 10,2 ± 0,7 3,9 ± 0,7

18:1n-9 51,2 ± 3,0 35,0 ± 2,1 25,4 ± 1,9

18:1n-7 16,8 ± 2,9 11,5 ± 1,1 6,3 ± 0,9

Total des AG mononinsaturés 72,4 ± 6,7 56,7 ± 3,9 35,6 ± 3,518:2n-6 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2

20:2n-6 tr tr 4,3 ± 0,7

20:3n-6 tr tr 1,3 ± 0,2

20:4n-6 0,7 ± 0,1 1,0 ± 0,1 9,5 ± 1,4

Total des AG polyinsaturés n-6 1,9 ± 0,3 2,2 ± 0,3 16,5 ± 2,520:5n-3 tr tr 1,1 ± 0,2

22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,4 ± 0,1 3,7 ± 0,6

22:6n-3 7,4 ± 2,7 0,6 ± 0,1 3,9 ± 0,6

Total des AG polyinsaturés n-3 9,5 ± 3,3 1,0 ± 0,2 8,7 ± 1,4 Total des AG polyinsaturés 11,4 ± 3,6 3,2 ± 0,5 25,2 ± 3,916:0-DMA nd nd 10,5 ± 1,5

18:0-DMA nd nd 5,6 ± 0,6

18:1-DMA nd nd 3,1 ± 0,5

Total des DMA nd nd 19,2 ± 2,6

mol %



151

Les DMA sont obtenus par dérivation des chaînes alkényles en position sn-1 des

plasmalogènes. Nous n’avons pas pu détecter de plasmalogènes-PC, ni d’ailleurs de

plasmalogènes-BMP qui n’ont jamais été décrits. Les macrophages RAW contiennent

uniquement des plasmalogènes-PE en quantités significatives. Les DMA détectés dans les PE

sont le 16:0-DMA, le 18:0-DMA et le 18:1-DMA (18:1n-9-DMA + 18:1n-7-DMA). Les

DMA représentent près de 20% du total des chaînes grasses analysées, ce qui indique que les

espèces alkényl-acyl-PE (plasmalogènes-PE) représentent environ 40% des PE totales.

2.2 Effets du 18:1/18:1-PG sur la quantité et la composition en acides gras du BMP

dans les macrophages RAW

Les précédentes études sur la conversion du PG en BMP ont été réalisées à l’aide

de doses traceuses de PG radioactif. Ainsi, il n’a jamais été clairement établi que la

supplémentation des cellules avec de fortes concentrations de PG exogène pouvaient

augmenter spécifiquement la quantité cellulaire de BMP. Les études de cinétique réalisées par

Waite et al. (1990) indiquent que la conversion du PG en BMP par les macrophages RAW

atteint un plateau à partir de 24 h d’incubation. Nous avons donc fixé nos temps d’incubation

à 24 h. Afin de favoriser l’endocytose et le transport du PG exogène vers les endosomes

tardifs où la synthèse du BMP a lieu (Waite et al., 1990) nous avons apporté le PG sous forme

de petits liposomes unilamellaires. Il a été montré que de tels liposomes sont endocytés par les

cellules et transportés vers des structures possédant un pH acide et présentant une organisation

multi-vésiculaire et multi-lamellaire caractéristique des endosomes tardifs (Daleke et al., 1990

; Muller et al., 1995 ; Poelma et al., 2004).

2.2.1 Augmentation spécifique de la quantité de BMP dans les macrophages RAW

après supplémentation par du 18:1/18:1-PG

Après incubation des cellules en présence de liposomes de 18:1/18:1-PG pendant

24 h, la quantité cellulaire de BMP augmente de manière dose-dépendante jusqu’à la plus

forte concentration testée (Figure 39). Par rapport au contrôle (valeur théorique de 100%) la



152

quantité de BMP est doublée en présence de 5 µM de 18:1/18:1-PG et multipliée par un

facteur 4 à 60 µM. Toutefois, au-delà de 30 µM de 18:1/18:1-PG on remarque que la quantité

cellulaire de BMP tend vers une saturation. Pour la suite de notre étude nous avons donc

choisi de n’utiliser que la concentration de 30 µM.

Cette augmentation de la quantité de BMP peut être visualisée après la première

élution en CCM lorsque les cellules sont marquées avec 0,2 µCi/mL de [3H]oléate. En effet,

lorsqu’on réalise une lecture linéaire de la distribution de la radioactivité on remarque que la

proportion de [3H]BMP est augmentée par rapport aux autres phospholipides radioactifs dans

les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG (Figure 40). Toutefois cette mesure n’est

pas directement proportionnelle à la quantité de BMP.

Au niveau des chromatogrammes HPLC on remarque également que dans les

cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG les 3 pics caractéristiques du BMP sont

augmentés dans les mêmes proportions. Ceci suggère que les propriétés structurales du BMP

ne sont pas profondément modifiées dans les cellules enrichies (Figure 41).

Nos résultats indiquent également que cette augmentation est spécifique du BMP

par le fait que nous n’observons aucune différence significative entre les cellules contrôles et

les cellules traitées concernant les quantités cellulaires de PC et de PE, même aux plus fortes

concentrations. Nous avons également vérifié qu’en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG la

quantité de cardiolipines n’est pas modifiée (résultats non montrés).

Enfin nous avons montré que le 18:1/18:1-PG ne s’accumule pas dans les cellules

traitées. En effet, comme dans les cellules contrôles, aucun pic correspondant au PG n’a été

détecté en HPLC lors de l’étape de purification des PE en HPLC (Figure 42). Une troisième

condition a été utilisée comme contrôle afin de s’assurer que le 18:1/18:1-PG est détectable

dans nos conditions d’analyse. Pour cela des cellules ont été cultivées dans des conditions

contrôles puis 100 µg de 18:1/18:1-PG ont été ajoutés directement sur le culot cellulaire avant

la première extraction lipidique. Dans ces conditions nous observons un pic correspondant au

18:1/18:1-PG indiquant que celui-ci est bien co-extrait et co-élué en CCM-2D avant d’être

séparé des PE en HPLC. L’ensemble de ces résultats indique qu’après internalisation des

liposomes, le 18:1/18:1-PG est rapidement et exclusivement converti en BMP.



153

Figure 40 : Profil d’élution des lipides marqués avec le [3H]oléate après la première migration en CCM. Les macrophages RAW sont cultivés en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ainsi qu’en présence de 0,2 µCi/mL de [3H]oléate pendant 24 h. La distribution de la radioactivité est analysée grâce au lecteur linéaire après la 1ère migration dans le système en CCM-2D comme décrit dans Matériels et Méthodes.

Figure 39 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE après supplémentation des macrophages RAW avec différentes concentrations de 18:1/18:1-PG. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les PL (PC, PE et BMP) sont extraits, purifiés en CCM/HPLC et quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de PL sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B, C, D : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * : p≤0,05 et ** : p≤0,01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60

quan

tités

de

PL (%

des

con

trôl

es)

18:1/18:1-PG (µM)

BMP

PC

PE**

**

*

*A

DC

B

Contrôle 18:1/18:1-PG (30µM)

PC PCPE PEPI/PS/SM

PI/PS/SMCL/AG

CL/AG

BMP

BMP

LNLN

dépôt dépôtfront front



154

Concernant la composition en acides gras des différents phospholipides nous

avons observé, en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG, une augmentation de la proportion

d’acide oléique (18:1n-9) dans l’ensemble des phospholipides et notamment dans le BMP où

le pourcentage passe de 51,2 % à 73,8% (Tableau 8). L’augmentation du pourcentage d’acide

Figure 41 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG.

Figure 42 : Chromatogrammes en HPLC des PE et du 18:1/18:1-PG. Les PE/PG sont extraits et purifiés par CCM-2D à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles (A), en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h (B), ou dans des conditions contrôles avec ajout de 18:1/18:1-PG sur le culot cellulaire juste avant analyse (C). Les PE/PG sont ensuite injectés en HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes.



155

oléique dans le BMP est compensée par une diminution du pourcentage de l’ensemble des

autres acides gras. De plus, la conversion du pourcentage d’acide oléique en quantité d’acide

oléique associée au BMP suggère qu’à partir du 18:1/18:1-PG les cellules synthétisent

principalement du 18:1/18:1-BMP (résultats non montrés) et donc que les chaînes acyles sont

majoritairement préservées lors de la conversion du PG en BMP. La proportion d’acide

oléique augmente également dans les PC et PE mais cette augmentation est surtout compensée

par une diminution du pourcentage du 18:1n-7 et du 16:1. Ceci suggère que l’acide oléique

apporté via le 18:1/18:1-PG s’incorpore dans ces deux phospholipides par des mécanismes de

dé-acylation/ré-acylation ou des mécanismes de transacylation.

Tableau 8 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans les macrophages RAW cultivés en présence de 18:1/18:1-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés en CCM/HPLC et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3 au minimum). † : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 18:1n-9. tr : traces. nd : non détecté. DMA : dimethylacétals.

Contrôle 18:1/18:1-PG Contrôle 18:1/18:1-PG Contrôle 18:1/18:1-PG

Acides gras (30µM) (30µM) (30µM)

14:0 0,5 ± 0,2 0,2 ± 0,1 3,1 ± 0,4 3,3 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1

16:0 7,7 ± 1,4 2,7 ± 0,8 28,0 ± 1,8 26,2 ± 1,9 7,3 ± 1,0 6,1 ± 0,6

18:0 5,9 ± 0,8 2,6 ± 0,5 8,0 ± 0,4 6,4 ± 1,0 14,6 ± 1,0 15,3 ± 2,0

16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 2,3 ± 0,4 10,2 ± 0,7 7,7 ± 1,0 3,9 ± 0,7 2,4 ± 0,3

18:1n-9 51,2 ± 3,0 73,8 ± 0,4 † 35,0 ± 2,1 47,1 ± 2,8 † 25,4 ± 1,9 31,9 ± 4,8 †

18:1n-7 16,8 ± 2,9 5,8 ± 1,7 11,5 ± 1,1 6,9 ± 1,0 6,3 ± 0,9 4,2 ± 0,1

18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,0 ± 0,5 1,2 ± 0,2 0,7 ± 0,1 1,4 ± 0,2 1,0 ± 0,1

20:2n-6 tr tr tr tr 4,3 ± 0,7 7,3 ± 2,4

20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,2 9,5 ± 1,4 8,7 ± 0,3

20:5n-3 tr tr tr tr 1,1 ± 0,2 0,8 ± 0,1

22:5n-3 2,1 ± 0,6 1,9 ± 0,9 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,04 3,7 ± 0,6 2,8 ± 0,1

22:6n-3 7,4 ± 2,7 4,7 ± 1,7 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,0 3,9 ± 0,6 2,8 ± 0,1

16:0-DMA nd nd nd nd 10,5 ± 1,5 9,1 ± 1,0

18:0-DMA nd nd nd nd 5,6 ± 0,6 4,6 ± 0,7

18:1-DMA nd nd nd nd 3,1 ± 0,5 3,9 ± 0,8

PEPCBMP

mol %



156

2.2.2 Localisation du BMP dans les macrophages RAW après supplémentation avec

du 18:1/18:1-PG

Nous avons ensuite cherché à déterminer la localisation subcellulaire du BMP

dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ainsi qu’en présence de

18:1/18:1-PG. Pour cela nous avons utilisé l’anticorps anti-BMP et un anticorps secondaire

couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes.

Le profil de distribution du BMP est identique dans les cellules incubées en

présence de 18:1/18:1-PG par rapport aux cellules contrôles. En effet, la fluorescence est

distribuée de manière ponctuée et périnucléaire (Figure 43) ce qui est caractéristique des

endosomes tardifs/lysosomes (Kobayashi et al., 1998b). Ainsi ces résultats suggèrent que le

18:1/18:1-PG ne modifie pas la distribution intracellulaire du BMP et que le BMP

nouvellement synthétisé est bien localisé dans les endosomes tardifs où a lieu la conversion

du PG en BMP. Toutefois nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l’anticorps anti-

BMP ne reconnaisse que le BMP endogène et pas le BMP nouvellement synthétisé à partir du

PG. De plus, il est très difficile, par cette méthode, de juger de l’intensité de la fluorescence

comme indicateur de la quantité cellulaire de BMP car pour une même condition il existe une

variabilité importante de l’intensité de fluorescence entre les cellules.

Figure 43 : Localisation subcellulaire du BMP. Les macrophages RAW sont cultivés en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence de l’anticorps anti-BMP et d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes. La distribution de la fluorescence est observée au microscope confocal.

contrôle 18:1/18:1-PG (30µM)



157

2.2.3 Fractionnement cellulaire réalisé sur les cellules BHK après supplémentation

avec du 18:1/18:1-PG

Kobayashi et al. (1998b) ont mis au point et publié un protocole de

fractionnement cellulaire sur les cellules BHK permettant d’isoler par ultracentrifugation sur

gradient de sucrose les endosomes tardifs et les endosomes précoces des autres compartiments

cellulaires désignés alors comme des « membranes lourdes » (voir Matériels et Méthodes,

paragraphe 11). Nous avons donc utilisé cette lignée dans notre étude pour confirmer que le

BMP nouvellement synthétisé à partir du 18:1/18:1-PG s’accumule dans les mêmes

compartiments que le BMP endogène, les endosomes tardifs.

Dans un premier temps nous avons montré que dans les cellules BHK incubées en

présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG la quantité cellulaire de BMP est doublée (résultats non

montrés). Ensuite nous avons réalisé un fractionnement cellulaire sur des cellules contrôles et

des cellules supplémentées puis nous avons récupéré les fractions correspondant aux

endosomes tardifs, aux endosomes précoces et aux membranes lourdes. Sur chacune de ces

trois fractions, les phospholipides ont été séparés par CCM-2D sur des plaques HPTLC puis

révélés par pulvérisation d’acide et chauffage.

Conformément à la littérature, dans les cellules contrôles le BMP est retrouvé en

très grande majorité dans la fraction correspondant aux endosomes tardifs (Figure 44). On

retrouve également dans cette fraction la plupart des phospholipides majeurs comme les PC,

PE, PI, PS ainsi que des sphingomyélines (SM). En revanche, les endosomes tardifs et

précoces ne contiennent pas de cardiolipines (CL) qui ne sont présentes que dans les

membranes « lourdes » probablement en raison de la présence des mitochondries où sont

principalement localisées les CL. Dans les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG la

quantité de BMP associée aux endosomes tardifs augmente de manière très claire alors que la

quantité de protéines n’est pas modifiée (résultats non montrés). De plus on ne retrouve du

BMP qu’à l’état de traces dans les endosomes précoces et les membranes « lourdes ». Ces

résultats indiquent que dans les cellules BHK le BMP nouvellement synthétisé à partir du PG

exogène est bien localisé, comme le BMP endogène, au niveau des endosomes tardifs.



158

2.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur le trafic

intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL

Dans cette partie nous avons étudié les conséquences de l’accumulation de BMP

suite à l’incubation des macrophages RAW en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG sur le

métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL. Lorsque cela est

indiqué nous avons utilisé deux agents pharmacologiques dont les effets sont connus afin de

pouvoir les comparer avec ceux observés dans les cellules ayant accumulé du BMP. Il s’agit

du U18666A qui bloque presque totalement le transport du cholestérol à partir des endosomes

tardifs et le F1394 qui inhibe presque totalement l’activité ACAT (>98%, Figure 47)

responsable de la ré-estérification du cholestérol libre dans le réticulum endoplasmique.

Figure 44 : Analyse de la composition en phospholipides des différentes fractions isolées à partir de fibroblastes BHK. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les 3 fractions (endosomes tardifs, endosomes précoces et « membranes lourdes ») sont isolées sur gradient de sucrose par ultracentrifugation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les phospholipides sont extraits et séparés par CCM-2D puis révélés par pulvérisation d’acides et chauffage.

contrôle

endosomestardifs

endosomesprécoces

membranes« lourdes »

BMP

PE

PC

PSPI

SM

BMP

PE

PC

PSPI

SM

BMP

PE

PC

PS

PI

SM

BMP

PE

PC

PS

PI

SM

BMP

PE

PC

PS

PI

SM

CL

BMP

PE

PC

PS

PI

SM

CL18:1/18:1-PG(30µM)



159

2.3.1 Colocalisation du BMP et des LDL endocytées

Dans un premier temps nous avons vérifié qu’après endocytose les LDL

rejoignent bien les endosomes tardifs où le BMP est localisé. Pour cela des cellules contrôles

ont été incubées pendant 1 heure (« pulse ») en présence de LDL fluorescentes (DiI-LDL),

puis pendant 2 heures (« chase ») en absence de DiI-LDL. La localisation du BMP est

déterminée avec l’anticorps anti-BMP. Malgré une variabilité entre les cellules selon les

champs d’observation au microscope, on observe pour la majorité une colocalisation entre les

LDL fluorescentes et le BMP (Figure 45). Ceci indique que les LDL captées par les

macrophages RAW suivent la voie endocytique et aboutissent dans les endosomes

tardifs/lysosomes où est localisé le BMP.

Figure 45 : Colocalisation du BMP et des LDL endocytées dans les macrophages RAW. Les cellules sont incubées pendant 1 h en présence de 10 µg/mL de DiI-LDL (« pulse »), rincées puis incubées pendant 2 h en absence de DiI-LDL (« chase »). Les cellules sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence de l’anticorps anti-BMP et d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes. La distribution de la fluorescence est observée au microscope confocal. « Merge » : association de la fluorescence des DiI-LDL et du BMP.

DiI-LDL BMP

merge



160

2.3.2 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la captation

des LDL

Dans une première expérience les macrophages RAW ont été pré-incubés dans

des conditions contrôles ou en présence des agents pharmacologiques U18666A ou F1394.

Les cellules sont ensuite incubées pendant 12 heures en présence de LDL reconstituées avec

du cholestéryl oléate radiomarqué ([3H]CO-LDL) afin de mesurer le taux de captation des

LDL comme décrit dans Matériels et Méthodes. La quantité de LDL radioactives captée par

les cellules est estimée en DPM/mg de protéines.

On remarque que la quantité de [3H]CO-LDL captée est augmentée dans les

cellules pré-incubées en présence de U18666A et diminuée dans les cellules pré-incubées en

présence de F1394 par rapport aux contrôles (Figure 46A). Ces deux résultats peuvent

s’expliquer en fonction des effets connus de ces deux agents pharmacologiques. Le U18666A

bloque le transport intracellulaire du cholestérol à partir des endosomes tardifs. Ainsi la

quantité de cholestérol diminue dans le réticulum endoplasmique ce qui induit une

augmentation de la synthèse des récepteurs aux LDL par le mécanisme de rétrocontrôle

dépendant du complexe SREBP (voir chapitre 1 des rappels bibliographiques) et donc une

augmentation de la captation des [3H]CO-LDL. Au contraire le F1394 est un inhibiteur de

l’enzyme ACAT responsable de l’estérification du cholestérol dans le réticulum

endoplasmique. Ainsi la quantité de cholestérol libre augmente dans le réticulum

endoplasmique ce qui induit, toujours grâce au rétrocontrôle exercé par SREBP, une

diminution de la synthèse des récepteurs aux LDL et donc une diminution de la captation des

[3H]CO-LDL.

Dans une deuxième expérience, les macrophages RAW ont été pré-incubés dans

des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG. Les cellules ont ensuite

été incubées pendant des temps croissants en présence de [3H]CO-LDL. On remarque que la

quantité de LDL captées par les cellules augmente en fonction du temps jusqu’à 18 heures

d’incubation. En revanche il n’y a pas de différence entre les cellules contrôles et les cellules

pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG. Ces résultats indiquent que l’accumulation de

BMP ne modifie pas la captation des LDL.



161

2.3.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’hydrolyse

des esters de cholestérol dérivés des LDL

Afin de mesurer l’hydrolyse des esters de cholestérol (CE) contenus dans les

LDL, les cellules sont incubées pendant des temps croissants en présence de [3H]CO-LDL.

Après endocytose des LDL marquées, le [3H]CO est hydrolysé dans les endosomes tardifs

pour former du cholestérol libre radiomarqué ([3H]FC). Après extraction des lipides totaux, le

cholestérol libre et les esters de cholestérol sont séparés par CCM. La radioactivité associée

est mesurée et le taux d’hydrolyse est exprimé en pourcentage de [3H]FC par rapport à la

radioactivité totale. Toutefois le [3H]FC formé par hydrolyse du [3H]CO peut être ré-estérifié

dans le réticulum endoplasmique et former ainsi des esters de cholestérol radiomarqués

([3H]CE). Dans nos conditions de séparation en CCM, les [3H]CE nouvellement formés ne

peuvent être distingués du [3H]CO qui n’a pas encore été hydrolysé. C’est pourquoi nous

Figure 46 : Captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW. A : Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h, puis incubées en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1). B : Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h, puis incubées en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL pendant des temps croissants (moyennes ± SD, n=3). Après rinçage, la radioactivité associée aux cellules est mesurée au compteur à scintillations comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en DPM / mg de protéines.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

contrôle U18666A F1394

DPM

/ m

g pr

otéi

nes

A

0

500

1000

1500

2000

2500

6 h 12 h 18 hD

PM /

mg

prot

éine

sTemps (heures)

contrôle

18:1/18:1-PG

B



162

avons utilisé un inhibiteur de l’ACAT, le F1394, pour bloquer la ré-estérification du [3H]FC.

Ainsi la radioactivité associée aux CE que nous mesurons correspond uniquement au [3H]CO

initialement contenu dans les [3H]CO-LDL et qui n’a pas encore été hydrolysé.

Dans un premier temps nous avons voulu nous assurer que le F1394 induit bien

une inhibition totale ou presque de la ré-estérification du FC dans les macrophages RAW. Les

cellules ont été incubées en présence de LDL non marquées et de [3H]oléate qui est utilisé par

l’ACAT pour former du cholestéryl-[3H]oléate. Les lipides totaux sont extraits des cellules et

séparés par CCM. La distribution de la radioactivité entre les différentes classes de lipides est

alors déterminée grâce au lecteur de radioactivité linéaire. Comme indiqué dans la Figure 47

les phospholipides (PL) constituent la classe de lipides la plus fortement radiomarquée par le

[3H]oléate. On distingue également des diacyl- et des triacyl-glycérols, du [3H]oléate non

estérifié et des esters de cholestérol. On remarque que dans les cellules traitées avec le F1394

l’estérification du cholestérol est presque totalement inhibée (>98%).

Nous avons donc mesuré le taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé des LDL

radiomarquées en présence de F1394 dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en

BMP. A tous les temps d’incubation la quantité totale de radioactivité présente dans les

cellules n’est pas modifiée (résultats non montrés), confirmant que l’accumulation de BMP ne

modifie pas la captation des [3H]CO-LDL. Après extraction et séparation par CCM la

Figure 47 : Effet du F1394 sur l’estérification du cholestérol stimulé par les LDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence ou en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h puis incubées en présence de LDL (50 µg/mL) et de [3H]oléate (0,5 µCi/mL) pendant 12 h. Les classes de lipides sont séparées par CCM et le profil d’élution des lipides radio-marqués est observé au lecteur de plaques Berthold. PL : phospholipides, DAG : diacyl-glycérosl, TG : triacyl-glycérols, AG : acides gras non estérifiés, CE : esters de cholestérol.

PL

DAG AG TG

CE

PL

DAG AG TG CE

- F1394 + F1394



163

radioactivité associée au FC et aux CE est mesurée. Dans les cellules contrôles, on remarque

que le [3H]CO est très rapidement hydrolysé après internalisation des LDL car le [3H]FC

devient majoritaire dès 2 heures d’incubation (Figure 48). A partir de 3 heures seule la

radioactivité associée au FC augmente, devenant largement majoritaire. Les mêmes

observations ont été faites dans les cellules enrichies en BMP (résultats non montrés).

Pour chaque temps d’incubation le pourcentage de [3H]FC par rapport à la

radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CO) représente le taux d’hydrolyse du [3H]CO. Comme

indiqué dans la Figure 49, l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW ne modifie

pas l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL.

Figure 49 : Taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé de la captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ainsi qu’en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées en présence de [3H]CO-LDL (50 µg/mL) pendant des temps croissants. Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]FC par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CO) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 2 4 6 8 10 12

DPM

/ m

g pr

otéi

nes

Temps (heures)

[3H]FC

[3H]CO

Figure 48 : Variation de la quantité de radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) en présence de [3H]CO-LDL. Les macrophages RAW sont pré-incubés en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h puis incubées en présence de [3H]CO-LDL (50 µg/mL) pendant des temps croissants. Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en DPM/mg de protéines (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12

% [3

H]F

C

Temps (heures)

contrôle

18:1/18:1-PG (30µM)



164

2.3.4 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la ré-

estérification du cholestérol libre dérivé de la captation des LDL et des acLDL

Nous avons ensuite cherché à mesurer le taux de ré-estérification du cholestérol

libre dérivé des LDL dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en BMP. Pour cela

nous avons utilisé des LDL et des acLDL reconstituées avec du [3H]FC ([3H]FC-LDL et

[3H]FC-acLDL). Au même titre que le cholestérol libre issu de l’hydrolyse des esters de

cholestérol, le [3H]FC présent dans les LDL captées par les cellules peut rejoindre le

réticulum endoplasmique à partir des endosomes tardifs et être ré-estérifié en [3H]CE. Après

incubation des cellules en présence de [3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL, le [3H]FC et les

[3H]CE cellulaires sont extraits et séparés par CCM. Le pourcentage de [3H]CE par rapport à

la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE) permet d’estimer le taux de ré-estérification du FC.

Nous avons également mesuré l’effet du U18666A et du F1394 dans des cellules contrôles.

On retrouve comme attendu une inhibition presque totale de l’estérification du

[3H]FC par le F1394 qui est un inhibiteur de l’ACAT et par le U18666A qui bloque le

transport du FC des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où se trouve l’ACAT

(Figure 50). De plus, on observe une diminution d’environ 15% de l’estérification du [3H]FC

dérivé des LDL et des acLDL dans les cellules pré-incubées en présence de 30 µM de

18:1/18:1-PG. Ces résultats suggèrent que l’accumulation de BMP dans les cellules induit un

blocage partiel du transport du [3H]FC des endosomes tardifs vers le réticulum

endoplasmique.



165

2.3.5 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’efflux du

cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD

L’efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD)

a ensuite été mesuré dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en BMP. Nous avons

utilisé ici le même protocole que celui décrit dans les paragraphes 1.5.3 et 1.6 de la première

partie des résultats.

Le pourcentage de [3H]FC capté par les HDL augmente en fonction du temps

jusqu’à 8 heures d’incubation (Figure 51A). A tous les temps d’incubation on remarque que

dans les cellules pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG le pourcentage d’efflux est

significativement diminué par rapport aux cellules contrôles. Après 8 heures d’incubation

cette diminution est d’environ 30%.

Figure 50 : Taux de ré-estérification du cholestérol dérivé des [3H]FC-LDL et des [3H]FC-acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Des cellules contrôles sont également pré-incubées en présence de U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées pendant12 heures en présence de [3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL (50 µg/mL). Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CE) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]CE par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de deux déterminations indépendantes).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[3H]FC-LDL [3H]FC-acLDL [3H]FC-LDL + U18666A

[3H]FC-LDL + F1394

% [3

H]C

Econtrôle

18:1/18:1-PG (30µM)



166

Dans nos conditions expérimentales la MβCD stimule rapidement l’efflux du

cholestérol. En effet, en absence de MβCD le pourcentage d’efflux est inférieur à 2% mais

passe à 15% après 5 minutes d’incubation en présence de 5 mM de MβCD et à 20% en

présence de 10 mM de MβCD (Figure 51B). Les résultats indiquent qu’en présence de

18:1/18:1-PG l’efflux du cholestérol stimulé par la MβCD est diminué d’environ 15% par

rapport aux contrôles.

L’ensemble de ces résultats suggère que l’accumulation de BMP dans les cellules

bloque partiellement le transport du cholestérol libre dérivé des LDL vers la membrane

plasmique à partir de laquelle il peut être efflué hors de la cellule grâce aux accepteurs que

sont les HDL et la MβCD.

Figure 51 : Efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées pendant 8 heures en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL. Après rinçage l’efflux du [3H]FC est stimulé par incubation des cellules en présence de 100 µg/mL de HDL pendant des temps croissants (A, moyennes ± SD, n=3) ou en présence de 5 ou 10 mM de MβCD pendant 5 min. (B, moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de deux détermination indépendantes). Après la période d’efflux la radioactivité est comptée dans le milieu de culture et dans les cellules. L’efflux est exprimé en pourcentage de la radioactivité présente dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (milieu + cellules). * p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons).

0

5

10

15

20

25

0 mM 5 mM 10 mM

% E

fflux

(mβC

D)

[MβCD]

contrôle

18:1/18:1-PG (30µM)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8

% E

fflux

(HD

L)

Temps (heures)

contrôle

18:1/18:1-PG (30µM)

*

*

**

A B



167

2.3.6 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la quantité

cellulaire d’esters de cholestérol après incubation en présence de acLDL

Nous avons montré que l’accumulation de BMP ne modifie pas la captation des

LDL ni l’hydrolyse des esters de cholestérol mais altère la redistribution du cholestérol vers le

réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Nous avons donc cherché à déterminer

si ces effets observés avec des traceurs radioactifs ont des conséquences sur les quantités de

cholestérol libre (FC) et d’esters de cholestérol (CE) qui s’accumulent dans les cellules

incubées en présence de LDL acétylées (acLDL).

Comme indiqué précédemment dans la première partie des résultats, la quantité

cellulaire de CE augmente en fonction du temps d’incubation des cellules en présence de

acLDL (Figure 52). Le cholestérol libre s’accumule également dans les cellules mais dans une

moindre mesure (résultats non montrés). On observe dans la Figure 52 une diminution

significative de la quantité d’esters de cholestérol dans les cellules pré-incubées en présence

de 18:1/18:1-PG. Ces résultats sont cohérents avec la diminution de l’estérification observée

précédemment et semble confirmer que l’accumulation de BMP dans les cellules altère le

transport du cholestérol dérivé des LDL vers le réticulum endoplasmique où il est ré-estérifié.

En revanche, les quantités cellulaires de FC ne sont pas modifiées dans les cellules enrichies

en BMP par rapport aux contrôles (résultats non montrés).

Après 12 heures d’incubation en présence de 100 µg/mL de acLDL, les CE

extraits des cellules contrôles contiennent 48% d’acide oléique (18:1) contre 58% dans les CE

extraits des cellules pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG (résultats non montrés). Cette

différence significative indique que l’oléate provenant du 18:1/18:1-PG est utilisé lors de

l’estérification du FC en CE par l’ACAT.



168

Discussion

Nous avons montré que dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions

contrôles le BMP constitue un phospholipide mineur notamment par rapport aux PC et aux

PE. Le BMP représente en effet 3% des phospholipides totaux ce qui est toutefois supérieur à

ce qui a été décrit pour d’autres types cellulaires comme les BHK (Brotherus et Renkonen,

1974) ou les macrophages THP-1 (Besson et al., 2006) et la plupart des tissus animaux

(Rouser et al., 1969 ; Simon et Rouser, 1969), mais inférieur aux macrophages des alvéoles

pulmonaires où le BMP représente plus de 15% des phospholipides totaux (Mason et al.,

1972). La composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW est similaire à

celle observée dans les BHK (Kobayashi et al., 2002) et les macrophages THP-1 (Besson et

al., 2006) avec une grande proportion d’acide oléique (18:1n-9). De plus, comme pour les

macrophages THP-1 (Besson et al., 2006) et les cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000), le

DHA est l’acide gras polyinsaturé majoritaire dans le BMP. Enfin nous avons montré à l’aide

de l’anticorps anti-BMP que dans les macrophages RAW le BMP est localisé dans des

structures intracellulaires péri-nucléaires et ponctuées caractéristiques des endosomes

Figure 52 : Accumulation d’esters de cholestérol stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant des temps croissants. Les esters de cholestérol (CE) sont extraits, séparées des autres classes de lipides par CCM et quantifiés en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés nmol / mg de protéines (moyennes ± SD, n=3). * p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8

CE

(nm

ol/m

g pr

otéi

nes)

Temps (heures)

contrôle

18:1/18:1-PG (30µM)

*

*

*



169

tardifs/lysosomes comme cela a été montré dans d’autres types cellulaires (Besson et al., 2006

; Kobayashi et al., 1998b).

Il a été clairement établi dans de nombreuses études menées par l’équipe de Waite

que le PG exogène peut être converti en BMP notamment par les macrophages RAW. Nous

avons montré qu’une supplémentation des cellules avec 30 µM de 18:1/18:1-PG sous forme

de liposomes entraîne une augmentation d’un facteur 4 de la quantité cellulaire de BMP. De

plus, Amidon et al. (1995) ont montré à l’aide de PG radiomarqué que les seules espèces qui

se forment sont le lyso-PG, l’acyl-PG et le BMP qui est le seul à s’accumuler dans les

cellules, les autres espèces étant des intermédiaires dans la conversion du PG en BMP. Nos

observations semblent confirmer ces résultats car les quantités de PC et de PE ne sont pas

modifiées en présence de 18:1/18:1-PG et ce dernier ne s’accumule pas dans les cellules.

De plus nous avons montré qu’à partir du 18:1/18:1-PG les cellules synthétisent

principalement du 18:1/18:1-BMP suggérant que les chaînes acyles sont conservées lors de la

conversion du PG exogène en BMP. Dans ses études sur la voie de biosynthèse du BMP à

partir du PG exogène l’équipe de Waite a proposé que la première étape mette en jeu une

PLA2 qui hydrolyse le résidu acyle estérifié en position sn-2 du PG (Amidon et al., 1995 ;

Amidon et al., 1996). Une PLA2 lysosomale spécifique du PG a été purifiée à partir de

macrophages RAW et caractérisée (Shinozaki et Waite, 1999). Cette PLA2 possède une

grande affinité vis-à-vis de l’oléate. Ceci pourrait expliquer l’efficacité de la synthèse de BMP

à partir du 18:1/18:1-PG avec une augmentation d’un facteur 2 de la quantité de BMP à

seulement 5 µM de 18:1/18:1-PG. Il a également été postulé que la deuxième étape dans la

voie de biosynthèse du BMP nécessite la ré-acylation du produit intermédiaire, le lyso-PG,

par une réaction de transacylation impliquant d’autres phospholipides comme donneurs

d’acyles (Huterer et Wherrett, 1989 ; Matsuzawa et al., 1978 ; Waite et al., 1987). Il avait été

initialement proposé une voie de biosynthèse dans laquelle le squelette glycérophosphate du

PG était conservé mais pas les chaînes acyles. Toutefois, la même équipe a par la suite décrit

dans les macrophages RAW une transacylase qui utilise deux molécules de lyso-PG pour

former du BMP, une comme donneuse d’acyle, l’autre comme accepteuse (Heravi et Waite,

1999). Cette activité est cohérente avec nos résultats qui semblent indiquer que le PG exogène

fournit à la fois le squelette glycérophosphate et les chaînes acyles pour la synthèse du BMP.



170

Le PG a aussi été décrit comme un précurseur des cardiolipines (CL) (Ohtsuka et

al., 1993 ; Schlame et Hostetler, 1997). Dans notre étude nous n’avons pas observé de

modification de la quantité de CL dans les macrophages RAW cultivés en présence de

18:1/18:1-PG (résultats non montrés). Ceci est toutefois cohérent avec les résultats de

plusieurs études qui ont mis en évidence une régulation complexe de la synthèse des CL qui

ne dépend pas seulement de la quantité de précurseur disponible. En effet il a été montré

qu’une très forte augmentation de la quantité de PG dans les cellules CHO n’induit pas

d’accumulation de CL (Esko et Raetz, 1980). Plus récemment il a été observé dans les cellules

CHO que l’augmentation de la synthèse de PG par surexpression de la PGP synthase n’est pas

associée à une augmentation de la synthèse de CL (Hullin-Matsuda et al., 2007).

Dans cette étude, notre objectif de départ consistait à réaliser des études

fonctionnelles sur le métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dans des

cellules enrichies en BMP afin de mieux comprendre son rôle dans les fonctions endosomales.

Il était donc important que dans les cellules enrichies le BMP nouvellement synthétisé

présente la stéréoconfiguration particulière sn-1:sn-1’ (Matsuo et al., 2004). Or il a été montré

que lors de la conversion du sn-3:sn-1’ PG en BMP la stéréoconfiguration du carbone

asymétrique présent dans le glycérol primaire est inversée et que le BMP qui s’accumule

possède donc la stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ (Thornburg et al., 1991). De plus, l’utilisation

du 18:1/18:1-PG comme précurseur permet de ne pas trop modifier la composition en acide

gras du BMP par rapport aux cellules contrôles. En effet, dans les cellules supplémentées

l’acide gras majoritaire du BMP reste l’acide oléique. Enfin, il était également nécessaire de

vérifier que le BMP nouvellement synthétisé est bien localisé dans les mêmes structures que

le BMP endogène. Nous avons ainsi montré à l’aide de l’anticorps anti-BMP que dans les

macrophages RAW supplémentés avec le 18:1/18:1-PG la distribution intracellulaire du BMP

n’est pas modifiée par rapport aux cellules contrôles. De plus, dans les cellules BHK où la

présence de 18:1/18:1-PG induit également une augmentation de la quantité de BMP nous

avons montré par fractionnement cellulaire que le BMP reste associé presque exclusivement à

la fraction correspondant aux endosomes tardifs. Ces résultats peuvent s’expliquer par le fait

que la synthèse du BMP à partir du 18:1/18:1-PG a lieu dans les endosomes tardifs/lysosomes

et utilise les enzymes présentes dans les cellules. Le BMP nouvellement synthétisé se retrouve

ainsi associé aux membranes contenant le BMP endogène.



171

Dans cette partie nous avons également présenté nos résultats préliminaires

concernant l’étude des conséquences de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW

sur le métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL.

L’enrichissement des cellules en BMP ne modifie pas la captation des LDL ni l’hydrolyse des

esters de cholestérol (CE) de ces LDL. En revanche, la ré-estérification du cholestérol libre

dérivé des LDL est diminuée d’environ 15%. Nous avons également observé une diminution,

de 15 à 20%, de l’efflux du cholestérol libre dérivé des LDL stimulé par les HDL ou la

MβCD. Contrairement aux LDL natives, les LDL acétylées (acLDL) permettent d’induire une

forte accumulation de cholestérol dans les cellules, principalement sous forme estérifiée. Nous

avons montré que la quantité d’esters de cholestérol qui s’accumule dans les cellules enrichies

en BMP est inférieure à celle qui s’accumule dans les cellules contrôles en présence de

acLDL, en accord avec une diminution de la ré-estérification du cholestérol. Ainsi, l’ensemble

de ces résultats suggère que l’accumulation de BMP dans les macrophages altère à la fois la

redistribution du cholestérol libre des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où il

peut être ré-estérifié, et vers la membrane plasmique où il peut être efflué hors de la cellule

grâce aux accepteurs HDL et MβCD. Une partie du cholestérol dérivé des LDL resterait donc

bloqué dans les endosomes tardifs des cellules ayant accumulé du BMP. Chevallier et al.

(2008) ont très récemment décrit des effets similaires avec une approche différente. En effet

dans cette étude les auteurs ont montré qu’une diminution de la quantité de BMP induite par

la sous-expression de la protéine ALIX induit également une diminution de la quantité de

cholestérol dans les endosomes tardifs. De plus cette diminution est réversible par

supplémentation des cellules avec du BMP exogène. Ces résultats suggèrent que la quantité

de BMP joue un rôle direct dans la capacité des endosomes tardifs à stocker le cholestérol.

Une augmentation de la quantité de BMP dans les endosomes tardifs augmenterait alors leur

capacité à stocker et à retenir le cholestérol dérivé des LDL, ce qui est en accord avec nos

observations.

A ce stade de l’étude il est important de noter que certains des résultats présentés

ci-dessus sont des résultats préliminaires (n=1) que nous devrons confirmer et consolider par

différents contrôles. Nous devrons notamment nous assurer que les effets observés dans les

cellules supplémentées en 18:1/18:1-PG résultent de l’accumulation de BMP et non de la

présence de liposomes dans le milieu ou de l’apport accru en oléate. A ce titre, des études ont

montré que l’oléate peut modifier l’activité ACAT, ce qui pourrait expliquer les effets sur



172

l’estérification du cholestérol dans les cellules supplémentées avec le 18:1/18:1-PG.

Toutefois, les auteurs rapportent plutôt une augmentation de l’estérification du cholestérol en

présence d’oléate (McCloskey et al., 1988 ; Rumsey et al., 1995) alors que nous observons un

effet inverse en présence de 18:1/18:1-PG. Pour confirmer que le transport du cholestérol vers

la membrane plasmique est altéré dans les cellules ayant accumulé du BMP, il serait

intéressant d’utiliser les techniques décrites dans la première partie qui utilisent

l’amphotéricine B et la cholestérol oxydase pour évaluer la quantité de cholestérol présente

dans la membrane plasmique.

La mesure du cholestérol cellulaire total n’a pas permis de montrer

d’accumulation de cholestérol libre (FC) dans les cellules enrichies en BMP. Toutefois, cela

n’exclut pas la possibilité que la quantité de FC soit effectivement augmentée dans les

endosomes tardifs, cette augmentation pouvant être masquée du fait que la fraction de FC

libre contenue dans les endosomes tardifs est certainement mineure par rapport au FC total. Il

serait donc intéressant de pouvoir observer directement une augmentation de la quantité de

cholestérol libre dans les endosomes tardifs des cellules supplémentées par rapport aux

cellules contrôles. La méthode de marquage du cholestérol intracellulaire avec la filipine est

difficile à envisager car la fluorescence est déjà très forte dans les cellules contrôles (non

montré), ne permettant probablement pas de distinguer une augmentation dans les cellules

enrichies en BMP. En revanche il serait possible de mettre au point un protocole de

fractionnement cellulaire sur les macrophages RAW permettant d’isoler des fractions

enrichies en BMP voire d’isoler une fraction pure d’endosomes tardifs. Nous pourrions alors

vérifier, soit par dosage du cholestérol libre en GC-MS soit en étudiant la répartition entre les

différentes fractions du [3H]FC dérivé de LDL marquées, si le cholestérol reste en partie

bloqué dans les endosomes tardifs des cellules ayant accumulé du BMP.

Si l’accumulation de BMP perturbe l’organisation et la dynamique des

membranes internes des endosomes tardifs, il pourrait être intéressant de déterminer si le

recyclage du récepteur au mannose-6-phosphate (M6P) via les endosomes tardifs est aussi

altéré, comme cela a été montré dans des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP

(Kobayashi et al., 1998b). De plus il a été montré sur des fibroblastes en culture que la perte

de récepteur au M6P induit une accumulation de BMP dans les endosomes tardifs et la

formation de structures membranaires aberrantes (Reaves et al., 2000).

Enfin, nous pourrions envisager d’augmenter la quantité cellulaire de BMP par un

autre moyen que le 18:1/18:1-PG et de vérifier que si induit les mêmes effets sur le transport



173

du cholestérol à partir des endosomes tardifs. Une possibilité serait de surexprimer la PGP

synthase dans les macrophages RAW pour augmenter la synthèse de PG endogène et donc

celle de BMP comme cela a été montré sur les cellules CHO (Hullin-Matsuda et al., 2007).

Selon une étude réalisée sur des liposomes, le BMP semble jouer un rôle

important dans la structuration multi-vésiculaire des endosomes tardifs (Matsuo et al., 2004).

De plus les études réalisées avec l’anticorps anti-BMP ont suggéré que le BMP est essentiel à

la redistribution du cholestérol dérivé des LDL à partir des endosomes tardifs. Les présents

résultats semblent indiquer qu’une augmentation de la quantité cellulaire de BMP altère

également la sortie du cholestérol depuis les endosomes tardifs vers le réticulum

endoplasmique et la membrane plasmique. Dans le cas de l’anticorps, des altérations

structurales des endosomes tardifs ont été observées (Kobayashi et al., 1999). Bien que nous

ne disposions pas de données à ce sujet, il est possible qu’une accumulation excessive de

BMP dans les endosomes tardifs modifie également l’organisation des membranes

endosomales. On peut ainsi avancer l’hypothèse que la fonction du BMP dans l’organisation

et la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs dépend du maintien de la

proportion de BMP dans ces membranes.

Si on s’intéresse plus précisément aux effets induits par l’accumulation de BMP,

on peut se demander si une augmentation non contrôlée du BMP dans les endosomes tardifs

des macrophages présents dans l’espace sous-endothélial pourrait contribuer aux processus

d’athérosclérose en limitant l’efflux de cholestérol. Bien que cette perspective soit prématurée

au stade de nos observations, il serait intéressant de comparer les quantités de BMP présentes

dans des macrophages spumeux isolés de plaques d’athéromes à différents stades d’évolution.

Il existe par ailleurs des pathologies pour lesquelles il a été décrit une forte

accumulation de BMP. Il s’agit de certaines phospholipidoses caractérisées par des désordres

métaboliques d’origine lysosomale comme la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC)

(Harder et al., 1984 ; Nakashima et al., 1984 ; Rouser et al., 1968). En plus de l’accumulation

de BMP, le syndrome NPC se caractérise par une altération du transport du cholestérol à

partir des endosomes tardifs et par une accumulation de cholestérol libre (Vance, 2006). Ce

syndrome est causée par des mutations sur les protéines NPC1 et NPC2 présentes dans les

endosomes tardifs et qui participent au transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs



174

(Cheruku et al., 2006 ; Garver et Heidenreich, 2002 ; Ko et al., 2001). Nos résultats suggèrent

que l’accumulation de BMP observée chez des patients atteints de la maladie NPC pourrait

également participer à la dérégulation du transport intracellulaire du cholestérol et accentuer

l’accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs. Alternativement l’équipe du Dr.

Jean Gruenberg à récemment proposé un mécanisme opposé (Chevallier et al., 2008). En effet

il a été montré que la supplémentation avec du BMP exogène de fibroblastes NPC présentant

une accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs, facilite l’efflux du cholestérol à

partir des endosomes tardifs. Les auteurs proposent que le BMP soit un facteur limitant dans

la maladie de Niemann-Pick de type C et que l’augmentation du BMP associée au phénotype

NPC soit due à un mécanisme compensatoire, mais insuffisant, visant à faciliter le stockage

du cholestérol retenu dans les endosomes tardifs en raison des mutations des protéines NPC1

et NPC2.

RESULTATS TROISIEME PARTIE


175

TROISIEME PARTIE

Dégradation sélective du BMP en présence de fortes

concentrations de DHA

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES


176

Introduction

Il a été montré dans de nombreux types cellulaires en culture que le DHA

s’incorpore très rapidement et de manière hautement sélective dans le BMP par rapport aux

autres phospholipides. Il a ainsi été proposé que cette propriété soit commune à l’ensemble

des cellules de mammifères. Le BMP présente un métabolisme rapide de ses chaînes acyles

mais il a également été montré que l’incorporation du DHA dans le BMP est beaucoup plus

rapide et plus forte que celle de l’AA (20:4n-6) ou de l’EPA (22:6n-3) suggérant un rôle

essentiel du BMP dans le métabolisme du DHA (voir chapitre 4 des rappels

bibliographiques). Toutefois, ni les mécanismes ni les conséquences fonctionnelles de

l’avidité du BMP pour le DHA n’ont été précisément étudiés.

Dans un tout autre contexte, de nombreuses études menées chez l’Homme ont

rapporté le rôle bénéfique des acides gras oméga-3 et du DHA en particulier dans la

prévention des pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose (voir chapitre 3 des

rappels bibliographiques). Cependant les bases cellulaires de cet effet protecteur du DHA,

notamment dans les macrophages, ne sont pas encore bien comprises.

Les résultats présentés dans les deux parties précédentes indiquent que le BMP est

impliqué dans la régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL et

qui transite via les endosomes tardifs. Nous nous sommes donc intéressés à mettre en

évidence un éventuel lien, au niveau cellulaire, entre le BMP, son avidité pour le DHA, et le

métabolisme du cholestérol.

Lorsque le DHA est apporté sous forme non estérifiée aux cellules il s’incorpore

dans l’ensemble des phospholipides. En nous appuyant sur les résultats obtenus avec le

18:1/18:1-PG, nous avons envisagé qu’un apport en DHA sous forme de liposomes de PG

possédant deux résidus DHA (22:6/22:6-PG) pourraient favoriser un enrichissement

spécifique du BMP en DHA. Notre hypothèse était que les cellules pourraient ainsi

synthétiser et accumuler du BMP riche en DHA. Contrairement à cette hypothèse nous avons

d’abord remarqué qu’en présence de 22:6/22:6-PG l’enrichissement en DHA n’était pas

spécifique du BMP car l’ensemble des phospholipides incorporait du DHA de manière non

négligeable. De plus, nous avons observé qu’en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG la

quantité cellulaire de BMP était diminuée par rapport aux cellules contrôles. Ce résultat très

inattendu nous a amené à nous intéresser plus précisément à ce phénomène qui a également



177

été observé en présence de fortes concentrations de DHA non estérifié et qui est apparu

réversible par addition de vitamine E comme anti-oxydant. L’ensemble des résultats de cette

étude nous a conduit à proposer un rôle anti-oxydant du BMP riche en DHA spécifiquement

dans les endosomes tardifs notamment vis-à-vis du cholestérol.

3.1 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des liposomes de

22:6/22:6-PG

Les macrophages RAW ont été incubés en présence 10 et 30 µM de 22:6/22:6-PG

sous forme de liposomes. A 10 µM le 22:6/22:6-PG induit seulement une faible augmentation

de la quantité cellulaire de BMP. Contrairement aux résultats obtenus avec le 18:1/18:1-PG

nous avons observé qu’à la concentration de 30 µM, le 22:6/22:6-PG induit une forte

diminution (environ 50%) de la quantité cellulaire de BMP (Figure 53). Nous avons vérifié

que dans ces conditions la viabilité cellulaire n’est pas affectée (98 ± 4 % par rapport aux

cellules contrôles, évalué avec un test au MTT, n=3) suggérant qu’à la concentration de 30

µM le 22:6/22:6-PG ne présente pas d’effet toxique sur les cellules.

Par rapport à l’acide oléique (18:1n-9) qui ne contient qu’une seule insaturation, le

DHA est décrit pour être hautement sensible à la peroxydation lipidique (Cosgrove et al.,

1987) (voir chapitre 5 des rappels bibliographiques). Nous avons donc incubé les cellules en

présence de 22:6/22:6-PG (30 µM) et de vitamine E (α-tocophérol) comme anti-oxydant. La

vitamine E est incorporée dans les liposomes à raison de 1 molécule pour 100 insaturations.

Comme indiqué dans la Figure 53 on observe que la vitamine E prévient la diminution de la

quantité cellulaire de BMP et induit une augmentation d’un facteur 3, proche de celle

observée précédement avec le 18:1/18:1-PG.

En revanche les quantités cellulaires de PC et de PE ne sont pas fortement

modifiées en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.



178

Ces variations de la quantité de BMP sont également associées à des variations de

sa composition en acides gras. L’incubation des cellules en présence de 10 µM de 22:6/22:6-

PG induit une augmentation modérée, d’un facteur 2, du pourcentage de DHA dans le BMP

(résultats non montrés). En revanche, dans les cellules incubées en présence de 30 µM de

22:6/22:6-PG le pourcentage de DHA dans le BMP atteint 50%, malgré la diminution de la

quantité de BMP (Tableau 9). L’augmentation du pourcentage de DHA dans le BMP est

principalement compensée par une diminution du pourcentage d’acide oléique. En effet, le

pourcentage des acides gras saturés (principalement 16:0 et 18:0) n’est pas modifié voire

légèrement augmenté. La présence de vitamine E induit une augmentation encore plus

importante de la proportion de DHA dans le BMP. Celui-ci représente alors 85% de

l’ensemble des acides gras.

Comme indiqué dans les Tableau 10 Tableau 11, l’incubation des cellules en

présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG induit également une augmentation du pourcentage de

Figure 53 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de 10 ou 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de phospholipides sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B, C : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * p≤0,05 et ** p≤0,01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

BMP PC PE

quan

tités

de

PL (%

des

con

trôl

es)

22:6/22:6-PG (10µM)

22:6/22:6-PG (30µM)

22:6/22:6-PG (30µM) + vitamine E

B

C

**

**

*A

* *



179

DHA dans les PE et les PC, mais dans une moindre mesure. En effet celui-ci atteint 26 %

dans les PE et 7 % dans les PC. De plus, la présence de vitamine E n’induit pas de

modification significative de la composition en acides gras de ces deux phospholipides.

L’augmentation du pourcentage de DHA est compensée dans les PC et les PE par une

diminution de l’acide oléique ainsi que des autres acides gras polyinsaturés comme l’acide

arachidonique (20:4n-6).

Tableau 9 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et sa composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.

Acides gras- vitamine E + vitamine E

14:0 0,5 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,2 ± 0,1

16:0 7,7 ± 1,4 8,9 ± 1,4 1,7 ± 0,4

18:0 5,9 ± 0,8 6,8 ± 1,1 1,1 ± 0,3

16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 1,9 ± 0,5 0,7 ± 0,1

18:1n-9 51,2 ± 3,0 23,0 ± 4,2 5,8 ± 0,8

18:1n-7 16,8 ± 2,9 7,4 ± 2,3 1,4 ± 0,3

18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,6 ± 0,8 0,5 ± 0,2

20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1

22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,9 ± 0,6 1,7 ± 0,8

22:6n-3 7,4 ± 2,7 48,5 ± 7,1 † 84,7 ± 4,7 †, #

22:6/22:6-PGContrôle

mol %

BMP



180

Tableau 10 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PE sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. tr : traces. DMA : dimethylacétals.


14:0 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1

16:0 7,3 ± 1,0 6,5 ± 0,8 6,1 ± 0,9

18:0 14,6 ± 1,0 17,9 ± 1,4 17,6 ± 2,3

16:1n-9/n-7 3,9 ± 0,7 2,3 ± 0,5 1,8 ± 0,1

18:1n-9 25,4 ± 1,9 13,3 ± 1,5 13,3 ± 1,6

18:1n-7 6,3 ± 0,9 4,0 ± 0,5 3,8 ± 0,3

18:2n-6 1,4 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,8 ± 0,0

20:2n-6 4,3 ± 0,7 tr tr

20:4n-6 9,5 ± 1,4 6,0 ± 0,7 6,1 ± 0,7

20:5n-3 1,1 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1

22:5n-3 3,7 ± 0,6 2,0 ± 0,2 2,1 ± 0,3

22:6n-3 3,9 ± 0,6 26,3 ± 1,4 † 25,7 ± 0,9 †, ns

16:0-DMA 10,5 ± 1,5 9,8 ± 1,4 11,2 ± 1,3

18:0-DMA 5,6 ± 0,6 5,7 ± 0,7 5,9 ± 0,5

18:1-DMA 3,1 ± 0,5 3,4 ± 0,8 2,6 ± 0,3

mol %

Contrôle22:6/22:6-PG

PE



181

Dans notre système HPLC la détection du BMP est réalisée par une lecture de

l’absorption en UV à 205 nm. L’intensité du signal dépend donc à la fois de la quantité de

BMP et du nombre de doubles liaisons de ces chaînes acyles. Ainsi une augmentation du

pourcentage de DHA dans le BMP induit une augmentation du signal même en l’absence

d’une d’augmentation de la quantité de BMP. On remarque que dans les cellules incubées en

présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG, le BMP migre toujours en 3 pics avec une intensité de

signal légèrement plus importante (Figure 54). Dans les cellules incubées en présence de 30

µM de 22:6/22:6-PG + vitamine E, le BMP migre en 3 pics mais avec une intensité du signal

Tableau 11 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.


14:0 3,1 ± 0,4 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,3

16:0 28,0 ± 1,8 36,1 ± 2,1 37,1 ± 2,6

18:0 8,0 ± 0,4 8,1 ± 0,3 8,1 ± 0,5

16:1n-9/n-7 10,2 ± 0,7 7,1 ± 0,0 6,8 ± 0,6

18:1n-9 35,0 ± 2,1 22,4 ± 2,9 22,9 ± 3,1

18:1n-7 11,5 ± 1,1 9,1 ± 0,9 8,6 ± 0,8

18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2 4,4 ± 0,1

20:4n-6 1,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 2,0 ± 0,2

22:5n-3 0,4 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,6 ± 0,1

22:6n-3 0,6 ± 0,1 6,9 ± 1,7 † 8,0 ± 1,6 †, ns

mol %


PC



182

très fortement augmentée, ce qui est cohérent avec à la fois une augmentation de la quantité

de BMP et un très fort enrichissement en DHA. Les 3 pics caractéristiques du BMP sont

augmentés de manière quasi proportionnelle entre les cellules contrôles et les cellules traitées.

Ceci suggère que la structure du BMP n’est pas profondément modifiée en présence de

22:6/22:6-PG et que les 3 pics sont composés d’espèces moléculaires du BMP contenant du

DHA.

L’effet protecteur de la vitamine E qui est un puissant anti-oxydant suggère que la

diminution de la quantité de BMP en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG est due à un

mécanisme de peroxydation lipidique. Le dialdéhyde malonique (MDA) peut être considéré

comme un marqueur global de la peroxydation lipidique (Vericel et al., 2003). Nous avons

Figure 54 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.



183

montré que dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG la quantité cellulaire de

MDA est augmentée d’un facteur 1,6 par rapport aux cellules contrôles (Figure 55). En

comparaison, dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E on

retrouve une quantité cellulaire de MDA correspondant au niveau basal. Ces résultats

supportent notre hypothèse que l’effet protecteur de la vitamine E sur la diminution de la

quantité de BMP est dû à son action anti-oxydante plutôt qu’à d’autres effets décrits (Azzi et

Stocker, 2000).

Les plasmalogènes-PE, en raison de la chaîne alkényle en position sn-1, sont

décrits comme des phospholipides particulièrement sensibles à la peroxydation lipidique.

Notre méthode de quantification des PE par dosage de ses acyles gras nous permet de

déterminer la quantité de plasmalogènes-PE en ne tenant compte dans nos calculs que des

Figure 55 : Variation des quantités de MDA dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les quantités cellulaires de MDA sont déterminées par HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/mg de protéines (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de 3 déterminations indépendantes). A, B : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05).

0

50

100

150

200

contrôle - vitamine E + vitamine E

MD

A (p

mol

/mg

prot

éine

s)

B

A

A

22:6/22:6-PG (30 µM)



184

DMA identifiés sur les chromatogrammes obtenus en GC. Les quantités cellulaires de

plasmalogènes-PE ne sont pas significativement modifiées lorsque les cellules sont incubées

en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG (13,4 ± 3,1 nmol/mg-prot) ou en présence de 30 µM

de 22:6/22:6-PG + vitamine E (14,2 ± 2,3 nmol/mg-prot) par rapport aux cellules contrôles

(10,7 ± 2,2 nmol/mg-prot). Ces résultats indiquent que les différents traitements n’induisent

pas de peroxydation des plasmalogènes-PE.

3.2 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des concentrations

croissantes de DHA non estérifié

Lorsque les cellules sont supplémentées avec 30 µM de 22:6/22:6-PG en présence

de vitamine E elles accumulent du BMP riche en DHA. Au contraire, en absence de vitamine

E on observe une diminution de la quantité de BMP, mais également associée à un

enrichissement en DHA. Nous avons donc cherché à déterminer si cette diminution de la

quantité cellulaire de BMP était due à un fort enrichissement du BMP en DHA ou si cet effet

était lié à l’apport très particulier du DHA via le 22:6/22:6-PG sous forme de liposomes. En

effet, d’après la littérature, ces liposomes sont supposés être captés par les cellules et suivre la

voie endocytique jusqu’aux endosomes tardifs/lysosomes où le PG peut être converti en BMP.

Les cellules ont donc été incubées en présence de concentrations croissantes de

DHA non estérifié, de 5 à 100 µM. Celui-ci est apporté sous forme liée à l’albumine présente

dans le sérum de veau fœtal utilisé pour supplémenter le milieu de culture des cellules.

Dans ces conditions, on observe une augmentation dose-dépendante du pourcentage de DHA

dans l’ensemble des phospholipides étudiés (Figure 56). Dans les PC où le DHA représente

moins de 1% de l’ensemble des acides gras à l’état basal, le pourcentage de DHA augmente

de manière quasi linéaire pour atteindre 25% à la plus forte concentration (Figure 56 et

Tableau 14). Dans les PE, le pourcentage de DHA augmente plus rapidement mais atteint un

plateau autour de 60 µM où le DHA représente alors 40% de l’ensemble des acides gras

(Figure 56 et Tableau 13). On observe cependant que le DHA s’incorpore beaucoup plus

efficacement et fortement dans le BMP. En effet le pourcentage de DHA dans le BMP

dépasse 50% à seulement 15 µM (Figure 56 et Tableau 12). La forte incorporation du DHA

dans le BMP avait déjà été rapportée dans différents modèles de cellules en culture dont les



185

macrophages THP-1 (Besson et al., 2006 ; Huterer et Wherrett, 1986). Très rapidement à

partir de 30 µM et jusqu'à la plus forte concentration (100 µM) le pourcentage de DHA dans

le BMP atteint un plateau à 60%. En présence de vitamine E (1 molécule de vitamine E pour

100 insaturations) on observe également un plateau mais le pourcentage de DHA dans le

BMP est alors augmenté jusqu’à 75% du total des acides gras. Aux concentrations inférieures

à 30 µM la vitamine E n’a pas d’effet sur l’incorporation du DHA dans le BMP. La vitamine

E ne modifie pas non plus l’incorporation du DHA dans les PC et PE même aux plus fortes

concentrations.

Figure 56 : Variation de la proportion de DHA dans les PC, les PE et le BMP des macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et la proportion de DHA qu’ils contiennent est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3 au minimum). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons).

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

DH

A (m

ol%

)

DHA (µM)

BMP

- vitamine E

+ vitamine E

# # #

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

DH

A (m

ol%

)

DHA (µM)

PE

- vitamine E

+ vitamine E

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

DH

A (m

ol%

)

DHA (µM)

PC

- vitamine E

+ vitamine E



186

Tableau 12 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et sa composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.


14:0 0,5 ± 0,2 0,7 ± 0,3 0,5 ± 0,1

16:0 7,7 ± 1,4 8,4 ± 1,3 4,9 ± 1,2

18:0 5,9 ± 0,8 5,5 ± 0,7 4,5 ± 1,9

16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 1,5 ± 0,7 1,1 ± 0,1

18:1n-9 51,2 ± 3,0 16,7 ± 2,4 11,1 ± 3,9

18:1n-7 16,8 ± 2,9 3,1 ± 0,4 3,3 ± 1,6

18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,3 0,7 ± 0,1

20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1

22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,9 ± 0,3 2,0 ± 1,3

22:6n-3 7,4 ± 2,7 59,4 ± 3,8 † 71,1 ± 3,1 †, #

mol%

ContrôleDHA non estérifié

BMP



187

Tableau 13 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PE sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. DMA : dimethylacétals.


14:0 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1

16:0 7,3 ± 1,0 6,9 ± 0,4 6,9 ± 1,1

18:0 14,6 ± 1,0 17,4 ± 1,5 17,9 ± 2,8

16:1n-9/n-7 3,9 ± 0,7 1,8 ± 0,3 1,4 ± 0,4

18:1n-9 25,4 ± 1,9 14,3 ± 2,2 13,9 ± 2,7

18:1n-7 6,3 ± 0,9 3,6 ± 0,6 3,3 ± 0,6

18:2n-6 1,4 ± 0,2 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1

20:2n-6 4,3 ± 0,7 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,2

20:4n-6 9,5 ± 1,4 5,7 ± 1,4 6,3 ± 1,4

20:5n-3 1,1 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,5 ± 0,2

22:5n-3 3,7 ± 0,6 1,9 ± 0,3 1,8 ± 0,5

22:6n-3 3,9 ± 0,6 30,1 ± 2,6 † 28,9 ± 5,2 †, ns

16:0-DMA 10,5 ± 1,5 9,3 ± 1,5 8,6 ± 0,6

18:0-DMA 5,6 ± 0,6 4,7 ± 0,1 4,8 ± 0,3

18:1-DMA 3,1 ± 0,5 2,6 ± 0,4 2,2 ± 0,3

mol %


PE



188

En présence de 5 et 15 µM de DHA, la quantité de BMP dans les macrophages

n’est pas modifiée mais on observe une diminution significative à partir de 30 µM (Figure

57). Comme dans les expériences avec le 22:6/22:6-PG, l’addition de vitamine E prévient la

diminution de la quantité cellulaire de BMP. Des exemples des chromatogrammes obtenus en

HPLC sont présentés à la Figure 58.

Tableau 14 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.


14:0 3,1 ± 0,4 4,0 ± 0,7 4,1 ± 0,8

16:0 28,0 ± 1,8 38,4 ± 2,6 33,1 ± 2,7

18:0 8,0 ± 0,4 8,8 ± 0,9 9,8 ± 1,0

16:1n-9/n-7 10,2 ± 0,7 6,2 ± 0,4 5,3 ± 1,1

18:1n-9 35,0 ± 2,1 18,9 ± 1,4 21,4 ± 3,1

18:1n-7 11,5 ± 1,1 5,9 ± 0,7 6,7 ± 1,7

18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2 1,6 ± 0,1

20:4n-6 1,0 ± 0,1 2,0 ± 0,4 2,3 ± 0,6

22:5n-3 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1 1,1 ± 0,2

22:6n-3 0,6 ± 0,1 11,8 ± 3,3 † 13,5 ± 3,3 †, ns


mol %

PC



189

En comparaison, les quantités cellulaires de PC et PE ne sont pas modifiées pas la

supplémentation en DHA ni en absence, ni en présence de vitamine E (résultats non montrés).

Comme indiqué dans le Tableau 13, en présence de 30 µM de DHA non estérifié les

pourcentages de DMA dans les PE ne sont pas modifiés même en présence de vitamine E,

indiquant qu’à cette concentration il n’y a pas de peroxydation des plasmalogènes-PE.

Ces résultats ainsi que ceux obtenus avec le 22:6/22:6-PG semblent indiquer que

le BMP est spécifiquement dégradé dans les macrophages RAW lors d’une supplémentation

avec des concentrations en DHA supérieures à 30 µM, probablement comme une

conséquence de la très forte incorporation de DHA dans ce phospholipide. De plus la

réversibilité de ce phénomène par la vitamine E suggère qu’il s’agit d’un mécanisme lié à la

peroxydation lipidique.

Figure 57 : Variation des quantités cellulaires de BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de BMP sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * : p≤0,05 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

5 15 30 60 100

quan

tités

de

BM

P (%

des

con

trôl

es)

DHA (µM)

- vitamine E

+ vitamine E

B BB

A A

* **

#

##



190

3.3 Analyse des espèces moléculaires du BMP

Lorsque les macrophages RAW sont supplémentés avec 30 µM de 22:6/22:6-PG

en absence de vitamine E le pourcentage de DHA dans le BMP ne dépasse pas 50%. Au

contraire, en présence de vitamine E, le BMP accumule près de 85% de DHA (Tableau 9)

indiquant la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP. Nous avons donc étudié la

possibilité d’une relation directe entre la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP en

Figure 58 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E.



191

présence de fortes concentration de DHA et la diminution de la quantité de BMP observée en

absence de vitamine E. Les espèces moléculaires du BMP ont été analysées par spectrométrie

de masse par l’équipe du Professeur Robert C. Murphy au département de pharmacologie de

l’Université du Colorado. Les spectres de masses obtenus sont présentés à la Figure 59.

Dans les cellules contrôles l’espèce majoritaire est le 18:1/18:1-BMP ce qui est

cohérent avec nos résultats obtenus en chromatographie gazeuse indiquant que le 18:1 est

l’acide gras majoritaire du BMP (Tableau 15). Le DHA est principalement retrouvé dans

l’espèce moléculaire 18:1/22:6-BMP qui représente 10% de l’ensemble des espèces

moléculaires. L’espèce 22:6/22:6-BMP n’est présente qu’à l’état de traces dans les cellules

contrôles mais représente l’espèce majoritaire dans les cellules supplémentées avec 30 µM de

22:6/22:6-PG en absence et en présence de vitamine E. Dans ces deux conditions les

pourcentages des espèces 18:1/22:6-BMP et 22:5/22:6-BMP sont également augmentés par

rapport au contrôle. Lorsqu’on compare les résultats obtenus pour les cellules supplémentées

avec le 22:6/22:6-PG en absence et en présence de vitamine E on remarque que la proportion

de l’espèce 22:6/22:6-BMP est fortement augmentée en présence de vitamine E ainsi que,

dans une moindre mesure, l’espèce 22:5/22:6-BMP. En revanche, le pourcentage de l’espèce

18:1/22:6-BMP n’est pas modifié par la présence de vitamine E.

La conversion des pourcentages en quantités de chaque espèce moléculaire du

BMP indique que l’addition de vitamine E en présence de 22:6/22:6-PG induit une très forte

accumulation de l’espèce 22:6/22:6-BMP (+4,4 nmol/mg-prot par rapport au traitement avec

le 22:6/22:6-PG sans vitamine E) par rapport aux espèces 22:5/22:6-BMP (+1,4 nmol/mg-

prot) et 18:1/22:6-BMP (+2,0 nmol/mg-prot).

Ces résultats suggèrent que la vitamine E protège spécifiquement l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP. La diminution de la quantité cellulaire de BMP observée en

absence de vitamine E pourrait ainsi être due à la dégradation par un processus de

peroxydation lipidique de l’espèce 22:6/22:6-BMP formée en grande quantité par les

macrophages RAW cultivés en présence de 22:6/22:6-PG.



192

Figure 59 : Spectres de masse en ESI-MS du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.

700 800 900 1000 1100m/z, amu

9.0e4

1.8e5

773.618:1/18:1-BMP

819.618:1/22:6-BMP

865.622:6/22:6-BMP

700 800 900 1000 1100m/z, amu

6.00e5

1.20e6In

tens

ity, c

ps773.6

18:1/18:1-BMP

819.618:1/22:6-BMP

745.616:0/18:0-BMP

799.618:1/20:2-BMP

700 800 900 1000 1100m/z, amu

1.1e6

2.2e6

773.618:1/18:1-BMP

819.618:1/22:6-BMP

865.622:6/22:6-BMP

Inte

nsity

, cps

Inte

nsity

, cps

Contrôle

22:6/22:6-PG (30µM)

22:6/22:6-PG (30µM)+ vitamine E



193

3.4 Formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP in vitro et in vivo

A ce stade de l’étude il est important de vérifier que la formation de l’espèce

22:6/22:6-BMP n’est pas limitée à nos conditions particulières de supplémentation. Dans un

premier temps nous avons utilisé des macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu

supplémenté en vitamine E puis nous nous sommes intéressés à la formation du 22:6/22:6-

BMP in vivo, dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire enrichi en DHA.

Tableau 15 : Variation de la composition des espèces moléculaires du BMP dans les macrophages RAW en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et la proportion de chaque espèce moléculaire est déterminée par ESI-MS comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires et sont représentatifs de deux déterminations indépendantes.

BMP - espèces moléculaires - vitamine E + vitamine E

16:1/18:1 5,2 1,8 0,016:0/18:1 4,4 1,5 0,018:1/18:2 6,0 1,8 0,618:1/18:1 32,8 10,3 4,018:0/18:1 8,0 3,1 1,016:1/22:6 1,2 2,0 1,618:0/22:6 et 18:1/22:5 1,7 2,6 2,018:1/20:4 et 16:0/22:5 2,7 1,7 0,718:1/20:3 4,0 1,5 0,018:1/20:2 6,1 1,9 0,718:1/20:1 4,5 1,8 0,018:1/22:6 10,0 22,5 21,318:1/22:5 6,6 6,6 6,518:1/22:4 3,0 1,7 0,922:6/22:6 1,5 29,2 44,822:5/22:6 1,3 8,0 14,022:5/22:5 et 22:4/22:6 1,2 2,0 2,1


mol%



194

3.4.1 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages RAW cultivés en

routine dans un milieu supplémenté en vitamine E

Par rapport aux conditions retrouvées in vivo, les cellules en culture in vitro sont

souvent déficientes en vitamine E et sont donc plus sensibles aux stress oxydant (Kelley et al.,

1995). Nous avons donc cultivé des macrophages RAW pendant plusieurs jours (au moins

deux passages) dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E, ce qui constitue un

apport efficace et physiologique de vitamine E aux cellules (Baoutina et al., 1998).

La vitamine E est quantifiée dans les cellules par HPLC en phase inverse couplée

à un détecteur de fluorescence. Dans les macrophages RAW non supplémentés la quantité

cellulaire de vitamine E est inférieure au seuil de détection. Nous pouvons évaluer que ces

cellules contiennent alors moins de 1 pmole de vitamine E par mg de protéines. Après une

semaine de supplémentation la quantité cellulaire de vitamine E est fortement augmentée et se

stabilise à 34 ± 4 pmoles/mg-prot (n=4). Dans les cellules ainsi supplémentées la quantité et la

composition en acides gras du BMP ne sont pas modifiées indiquant que la vitamine E seule

ne suffit pas à générer une quantité significative de BMP riche en DHA. Les PC et les PE ne

sont pas non plus modifiées (résultats non montrés).

Lorsque ces cellules supplémentées en vitamine E sont incubées en présence de

liposomes de 22:6/22:6-PG on observe une augmentation de la quantité de BMP et un

enrichissement en DHA similaire à celui observé précédemment lorsque la vitamine E était

incorporée directement dans les liposomes (Figure 60). En outre, lorsque les cellules

supplémentées en vitamine E sont incubées en présence de liposomes de 18:1/18:1-PG on

retrouve une augmentation de la quantité de BMP et un enrichissement en acide oléique

(18:1n-9) similaires à ce que nous avions observé en absence de vitamine E (voir deuxième

partie des résultats). Ceci suggère que la vitamine E permet de protéger spécifiquement le

BMP riche en DHA de la dégradation oxydative.



195

3.4.2 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP in vivo dans le foie de souris placées

sous un régime alimentaire enrichi en DHA

De nombreuses études ont montré qu’une supplémentation du régime alimentaire

en DHA chez l’animal induisait un enrichissement en DHA dans les phospholipides de la

plupart des organes. Toutefois aucune donnée n’a été rapportée spécifiquement pour le BMP.

Nous avons donc voulu déterminer si le fort enrichissement du BMP en DHA observé sur des

cellules en culture se produit également in vivo et si il peut conduire à la formation de l’espèce

0

100

200

300

400

500

600

contrôle 22:6/22:6-PG 18:1/18:1-PG

quan

tités

de

BM

P (%

du

cont

rôle

)

18:1n-9 (OA) 52% 8% 72%

22:6n-3 (DHA) 9% 77% 6%

Figure 60 : Variation de la quantité de BMP et de la proportion de OA et DHA dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E. Les cellules cultivées en routine dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E sont incubées en absence ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et quantifiés par analyse de leur composition en acides gras comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de phospholipides sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles. Les proportions d’acide oléique (OA) et de DHA sont exprimées en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3).* : p≤0,05 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).

* *



196

22:6/22:6-BMP. Des souris ont été nourries pendant 32 jours avec un régime alimentaire

standard (condition contrôle) ou enrichi en DHA grâce à une huile composée de tri-DHA-TG.

Ni le poids des souris ni le poids du foie n’est modifié par le régime alimentaire. Les

compositions en acides gras des PC, des PE et du BMP extraits du foie ont été analysées.

Comme indiqué dans le Tableau 16, le DHA est l’acide gras majoritaire du BMP

dans le groupe contrôle où il représente 32% de l’ensemble des acides gras. L’acide

arachidonique (20:4n-6) est l’acide gras majoritaire des PE (26%) et l’acide palmitique (16:0)

Tableau 16 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. Des souries ont été nourries pendant 32 jours avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. Les PC, les PE et le BMP sont extraits à partir des foies de souris, purifiés et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. nd : non détecté. DMA : dimethylacétals.

Acides grascontrôle DHA contrôle DHA contrôle DHA

14:0 0,5 ± 0,01 0,2 ± 0,1 tr tr 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

16:0 15,2 ± 2,6 6,6 ± 1,8 17,4 ± 0,5 20,4 ± 0,6 28,8 ± 1,4 32,9 ± 0,9

18:0 8,2 ± 1,0 3,3 ± 1,0 17,1 ± 2,5 16,5 ± 1,6 11,9 ± 2,2 9,6 ± 0,6

16:1n-9 1,6 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1

18:1n-9 12,5 ± 1,3 7,7 ± 1,2 7,8 ± 0,9 6,6 ± 0,5 5,5 ± 0,6 7,3 ± 0,7

18:1n-7 1,4 ± 0,3 0,8 ± 0,3 1,4 ± 0,3 0,9 ± 0,3 1,9 ± 0,4 1,1 ± 0,2

18:2n-6 14,9 ± 1,7 5,1 ± 1,4 6,5 ± 0,9 5,3 ± 0,7 19,1 ± 1,9 20,7 ± 1,7

20:3n-6 1,3 ± 0,2 0,6 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,1 1,8 ± 0,3 3,0 ± 0,2

20:4n-6 10,3 ± 2,0 2,0 ± 0,5 25,7 ± 0,6 12,6 ± 0,3 21,3 ± 2,0 8,5 ± 2,5

20:5n-3 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,8 ± 0,5 0,1 ± 0,1 0,9 ± 0,2

22:5n-3 0,8 ± 0,3 1,2 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1

22:6n-3 31,9 ± 3,4 70,7 ± 4,2 † 19,5 ± 0,5 32,3 ± 0,5 † 7,5 ± 0,4 14,3 ± 0,6 †

16:0-DMA nd nd 0,3 ± 0,1 0,3 ± 0,1 nd nd

18:0-DMA nd nd 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 nd nd

18:1-DMA nd nd 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 nd nd

BMP PE PC

mol %



197

est l’acide gras majoritaire des PC (29%). On remarque que le DHA s’incorpore dans les 3

phospholipides étudiés. Il passe de 20 à 32% dans les PE et de 7,5 à 14% dans les PC. Comme

pour les cellules en culture, c’est dans le BMP qu’il s’incorpore le plus fortement. En effet, il

représente alors 71% de l’ensemble des acides gras. Ce pourcentage largement supérieur à

50% indique la formation et l’accumulation in vivo de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP.

Des exemples des chromatogrammes obtenus en HPLC sont présentés dans la Figure 61. De

plus, des résultats similaires ont été retrouvés dans le foie de souris nourries seulement 4 jours

avec le régime enrichi en DHA (résultats non montrés), indiquant une incorporation rapide du

DHA dans le BMP. Dans les autres organes étudiés (cerveau, rate et cœur) nous n’avons pas

réussi à déterminer avec suffisamment de précision la composition en acides gras du BMP en

raison d’une trop faible quantité du phospholipide.

3.5 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA sous l’action d’un stress

oxydant

Nos résultats suggèrent que la capacité du BMP à accumuler de grandes quantités

de DHA peut induire, in vitro et in vivo, la formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP. Cette

espèce moléculaire, supposée être particulièrement sensible à la peroxydation lipidique en

raison de son nombre élevé d’insaturations, pourrait constituer une cible privilégiée du stress

oxydant. Ceci pourrait expliquer ainsi la diminution de la quantité cellulaire de BMP observée

Figure 61 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA.



198

dans les macrophages RAW non supplémentés en vitamine E et cultivés en présence de fortes

concentrations de DHA ou en présence de 22:6/22:6-PG. Nous avons donc cherché à évaluer

directement la sensibilité à la peroxydation lipidique du BMP riche en DHA par rapport au

BMP riche en acide oléique, dans les macrophages RAW d’une part et dans un système

acellulaire d’autre part grâce à des liposomes reconstitués avec un standard de 22:6/22:6-BMP

synthétisé chimiquement.

3.5.1 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans les macrophages RAW

Des macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté avec 5

µM de vitamine E ont été incubés pendant 24 heures en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG

ou de 22:6/22:6-PG puis rincés et incubés dans des conditions contrôles ou pro-oxydantes (1

mM de H202, 0,1 mM de CuSO4 et 1 mM d’ascorbate pendant 4 heures).

Conformément aux expériences précédentes, la quantité cellulaire de BMP est

augmentée d’environ 4 fois dans les cellules supplémentées en 18:1/18:1-PG ou 22:6/22:6-PG

(Figure 62, conditions contrôles), et le BMP contient alors respectivement 72% d’acide

oléique et 80% de DHA. Lorsque les cellules pré-incubées avec le 22:6/22:6-PG sont

soumises à des conditions pro-oxydantes, la quantité de BMP diminue significativement

jusqu’à la valeur basale de 100% (Figure 62, conditions pro-oxydantes). Le DHA ne

représente alors plus que 50% de l’ensemble des acyles gras du BMP. Au contraire, les

conditions pro-oxydantes ne modifient ni la quantité, ni la composition en acides gras du

BMP dans les cellules pré-incubées avec le 18:1/18:1-PG. Ces résultats suggèrent que le BMP

riche en DHA est beaucoup plus sensible au stress oxydant que le BMP riche en acide oléique

et qu’il peut être spécifiquement dégradé par un mécanisme de peroxydation lipidique non-

enzymatique.



199

3.5.2 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans un système acellulaire

Nous avons également étudié la sensibilité du BMP au stress oxydant dans un

système acellulaire en constituant des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5,

mol%). Nous avons utilisé soit du 18:1/18:1-BMP, soit du 22:6/22:6-BMP en absence ou en

présence de vitamine E. Ces liposomes ont alors été soumis à des conditions pro-oxydantes

(10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C) pendant des temps variables. Le BMP est

extrait et séparé par CCM puis révélé par chauffage.

Au temps t=0 tous les échantillons contiennent 15 µg de 18:1/18:1-BMP ou de

22:6/22:6-BMP. Dans nos conditions d’oxydation nous n’observons pas de dégradation

importante du 18:1/18:1-BMP même après 6 heures d’incubation (Figure 63). Il faut attendre

Figure 62 : Variation de la quantité de BMP en fonction de son enrichissement en 18:1 ou 22:6 dans les macrophages RAW soumis à un stress oxydant. Les cellules cultivées en routine dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E sont incubées en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG pendant 24 h puis incubées pendant 4 h dans des conditions contrôles ou pro-oxydantes (1 mM de H202, 0,1 mM de CuSO4 et 1 mM d’ascorbate). Le BMP est extrait, purifié et quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de BMP sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3). **: p≤0.01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon). # : p≤0.05 par rapport à la condition équivalente dans des cellules non stressées (test de Student à 2 échantillons).

0

100

200

300

400

500

22:6/22:6-PG (30µM) 18:1/18:1-PG (30µM)

quan

tités

de

BM

P (%

du

cont

rôle

s)

conditions contrôles

conditions pro-oxydantes

**

#

****



200

24 heures d’incubation pour commencer à distinguer une diminution (résultats non montrés).

En revanche on remarque une diminution importante de la quantité de 22:6/22:6-BMP dès 2

heures d’incubation et presque complète après 6 heures. De plus, l’ajout de vitamine E dans

les liposomes ralentit la dégradation du 22:6/22:6-BMP. Ces résultats, bien qu’attendus,

indiquent clairement que dans des conditions pro-oxydantes le 22:6/22:6-BMP est dégradé

beaucoup plus rapidement que le 18:1/18:1-BMP et que la vitamine E protège efficacement le

22:6/22:6-BMP de l’oxydation.

3.6 Le BMP riche en DHA protège partiellement le cholestérol de l’oxydation dans

un système acellulaire

Les molécules anti-oxydantes comme la vitamine E protègent les membranes en

terminant le processus de propagation de la peroxydation lipidique (voir chapitre 5 des rappels

bibliographiques). Pour cela elles réagissent avec les espèces radicalaires en devenant elles-

mêmes oxydées. Ainsi, il est admis que c’est en constituant les premières cibles de la

peroxydation lipidique que les molécules anti-oxydantes agissent comme des

Figure 63 : Oxydation du 18:1/18:1-BMP et du 22:6/22:6-BMP dans un système acellulaire. Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) contenant soit du 18:1/18:1-BMP, soit du 22:6/22:6-BMP +/- vitamine E (1 molécule pour 100 insaturations) sont soumis à des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C) pendant des temps variables. Suite à la période d’oxydation, la réaction est stoppée par ajout d’un anti-oxydant. Le BMP est extrait, séparé des autres classes de lipides par CCM et visualisé par pulvérisation d’acides et chauffage comme décrit dans Matériels et Méthodes. L’intensité des taches est proportionnelle à la quantité de BMP présente dans l’échantillon.

18:1/18:1-BMP

22:6/22:6-BMP+ vitamine E

temps d’incubation 0 h 2 h 4 h 6 h

22:6/22:6-BMP



201

« paratonnerres » et protègent les lipides à proximité. Toute molécule préférentiellement

oxydée pourrait de cette manière jouer un rôle anti-oxydant comme cela a été proposé pour les

plasmalogènes-PE. Ces derniers sont connus pour être plus sensibles au stress oxydant que les

diacyl-PE en raison de la présence de la liaison vinyl-éther de la chaîne alkényle en sn-1

(Engelmann, 2004 ; Hahnel et al., 1999 ; Reiss et al., 1997).

Une hypothèse intéressante serait que le BMP riche en DHA, en étant une cible

privilégiée de la peroxydation lipidique, agisse comme un anti-oxydant local et protège ainsi

les molécules avoisinantes dans les endosomes tardifs. Dans le cadre de notre étude nous nous

sommes particulièrement intéressés au cholestérol qui est associé à ce compartiment au cours

de l’endocytose des LDL ou s’y accumule dans certaines conditions pathologiques. Pour

tester cette hypothèse nous avons réalisé une série d’expériences dans un système acellulaire

visant à comparer le niveau d’oxydation du cholestérol en présence de 18:1/18:1-BMP ou de

22:6/22:6-BMP dans des liposomes reconstitués comme précédemment (16:0/16:0-PC / BMP

/ cholestérol) avec également une dose traceuse de [3H]cholestérol (5 µCi). L’oxydation du

cholestérol est estimée en mesurant la conversion du [3H]cholestérol en [3H]oxystérols. Les

liposomes sont soumis à des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4

à 37°C) pendant des temps variables. Après la période d’oxydation, les oxystérols sont

séparés du cholestérol par CCM (Figure 64A). Le niveau d’oxydation du cholestérol est

déterminé comme le pourcentage de la radioactivité associée aux oxystérols par rapport à la

radioactivité totale ([3H]oxystérols + [3H]cholestérol).

. Comme attendu, au temps t=0 (en absence d’oxydation) on ne détecte que du

[3H]cholestérol (Figure 64B). En revanche, au cours de l’incubation des liposomes dans des

conditions pro-oxydantes le [3H]cholestérol est oxydé en [3H]oxystérols qui sont détectés

comme deux pics très rapprochés. La référence frontale du pic principal correspond à celle du

7-KC (Figure 64B). Après 6 heures d’incubation environ 15% du [3H]cholestérol est converti

en [3H]oxystérols (Figure 64B etFigure 65). Dans les liposomes reconstitués avec du

22:6/22:6-BMP l’oxydation du cholestérol est significativement ralentie par rapport à celle

observée dans les liposomes reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP (Figure 65). Ces résultats

indiquent que dans un système acellulaire, le 22:6/22:6-BMP qui constitue une cible

privilégiée du stress oxydant protège partiellement le cholestérol présent dans les liposomes

de la peroxydation lipidique.



202

Figure 64 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. A : Profil de migration du cholestérol (chol), du 25-hydroxycholestérol (25-OHC) et du 7-céto-cholestérol (7-KC) en CCM avec le mélange de solvant hexane/éther/méthanol/acide acétique (50 :50 :5 :1 ; v/v/v/v). B : Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) sont reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP ou du 22:6/22:6-BMP ainsi que 0,5 µCi de [3H]cholestérol. La moitié des échantillons est récupérée pour analyse (t=0), l’autre moitié est incubée pendant 6 h dans des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C). Les composés radio-marqués sont extraits, séparés par CCM avec le mélange de solvant indiqué ci-dessus et visualisés au lecteur de radioactivité linéaire.

18:1

/18:

1-B

MP

22:6

/22:

6-B

MP

t = 0 t = 6 heures

[3H]cholestérol

[3H]oxystérols

25-OHC 7-KC chol

A B



203

Discussion

Comme observé précédemment dans les macrophages THP-1 (Besson et al.,

2006) et d’autres types cellulaires (Huterer et Wherrett, 1986 ; Luquain et al., 2000), nous

avons montré que dans les macrophages RAW, le DHA apporté de manière exogène

s’incorpore plus rapidement et en plus grande quantité dans le BMP que dans les PC et les PE.

Nous avons également montré pour la première fois que cette avidité du BMP pour le DHA se

retrouve aussi in vivo dans le foie de souris placées sous un régime alimentaire enrichi en

DHA. Grâce à des analyses en spectrométrie de masse nous avons pu mettre en évidence la

formation et l’accumulation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP dans les macrophages

Figure 65 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP ou du 22:6/22:6-BMP ainsi que 0,5 µCi de [3H]cholestérol sont incubés pendant des temps croissants dans des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C). Les composés radio-marqués sont extraits et séparés par CCM comme décrit dans Matériels et Méthodes. La radioactivité associée au cholestérol et aux oxystérols est quantifiée au compteur à scintillations et les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]oxystérols par rapport à la radioactivité totale ([3H]cholestérol + [3H]oxystérols) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de trois déterminations indépendantes). *: p≤0.05 par rapport au temps d’incubation respectif pour les liposomes reconstitués avec du 22:6/22:6-BMP (test de Student à 2 échantillons).

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6

[3H

] oxy

ster

ols

(% d

e la

radi

oact

ivité

tota

le)

Temps (h)

18:1/18:1-BMP

22:6/22:6-BMP ##



204

RAW supplémentés en DHA. Cette espèce moléculaire se forme aussi dans le foie de souris.

Cette caractéristique semble être propre au BMP car même dans les tissus naturellement très

riches en DHA ou qui accumulent cet acide gras lors de supplémentations, comme la rétine,

les espèces 22:6/22:6-PC, 22:6/22:6-PE et 22:6/22:6-PS ne sont retrouvées qu’en très faible

proportion (Delton-Vandenbroucke et al., 1998 ; Miljanich et al., 1979 ; Wiegand et

Anderson, 1983).

Les mécanismes responsables de la forte accumulation de DHA dans le BMP et

conduisant à la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP n’ont pas encore été

déterminés. Il est toutefois possible que ce phénomène soit lié à la structure très particulière

du BMP. En effet, contrairement aux autres phospholipides, les deux résidus acyles du BMP

sont estérifiés sur des groupements glycérols différents, en positions sn-2 et sn-2’. Or le DHA

est un acide gras long et très recourbé possédant un encombrement stérique important. Il est

donc possible que deux résidus DHA soient plus facilement estérifiés en même temps sur les

positions sn-2 et sn-2’ du BMP que sur les positions sn-1 et sn-2 des autres phospholipides.

De nombreuses enzymes impliquées dans le remodelage des acyles gras des phospholipides

présentent une spécificité vis-à-vis de la nature des chaînes acyles. Il est donc également

possible que des enzymes impliquées dans le remodelage des chaînes acyles du BMP soient

hautement spécifiques du DHA comme cela a été montré pour certaines phospholipases A

(Green et al., 2008 ; Strokin et al., 2003), acyl-CoA synthétases (Reddy et Bazan, 1984b,

1985), acyl-CoA : lyso-PL acyltransférases (Guisto et al., 1986 ; Tou, 1986) ainsi que pour

certaines transacylases (Masuzawa et al., 1989 ; Sugiura et al., 1985). De plus, il a été montré

que certaines enzymes spécifiques des AGPI présentent également une spécificité vis-à-vis de

la position sn-2 (MacDonald et Sprecher, 1991). Ces spécificités d’enzymes pourraient

expliquer, au moins en partie, le faible taux de formation des espèces à di-DHA des

phospholipides, à l’exception du BMP où les deux chaînes acyles sont estérifiées sur les

positions sn-2 et sn-2’ qui sont équivalentes du fait de la symétrie de structure de la molécule

de BMP.

Il a été montré que le BMP s’accumule dans les organes et les cellules de patients

atteints de désordres métaboliques des lysosomes, ou chez l’animal traité avec des agents

pharmacologiques induisant des phospholipidoses (Harder et al., 1984 ; Jabs et al., 2008 ;

Mortuza et al., 2003). D’anciennes études avaient indiqué que le BMP qui s’accumule dans

ces pathologies est particulièrement enrichi en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA



205

(Nakashima et al., 1984). Plus récemment il a été montré en particulier que l’espèce

22:6/22:6-BMP s’accumule dans ces lipidoses pathologiques ou induites (Kakela et al., 2003 ;

Meikle et al., 2008 ) dont elle pourrait constituer un marqueur (Baronas et al., 2007).

Indépendamment de nos résultats, ces études mettent en lumière l’importance de l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP pour les fonctions endosomales dans le contexte pathologique

des phospholipidoses.

Les résultats présentés dans le chapitre précédent indiquent qu’en présence de 30

µM de 18:1/18:1-PG les macrophages RAW accumulent du BMP enrichi en acide oléique

(18:1). De manière inattendue nous avons observé qu’en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG

la quantité cellulaire de BMP est diminuée de moitié. Cette diminution a également été

retrouvée en présence de DHA non estérifié à des concentrations supérieures à 30 µM. Dans

ces deux conditions, la composition en acides gras du BMP a révélé une très forte proportion

de DHA (environ 50%). En ajoutant de la vitamine E dans les liposomes de 22:6/22:6-PG la

quantité de BMP n’est plus diminuée mais au contraire augmentée d’environ 4 fois, comme

dans le cas de la supplémentation en 18:1/18:1-PG, et le pourcentage de DHA s’élève à 85%.

La vitamine E prévient également la diminution de BMP en présence de fortes concentrations

de DHA non estérifié et favorise son enrichissement en DHA. En présence de 22:6/22:6-PG

sans vitamine E, la quantité cellulaire de MDA, un marqueur global de la peroxydation

lipidique, est augmentée et retrouve une valeur basale lorsque la vitamine E est ajoutée. Ainsi,

les effets de la vitamine E suggèrent que la diminution de la quantité cellulaire de BMP qui

accompagne son enrichissement en DHA est due à un processus de peroxydation lipidique. A

ce titre nous avons confirmé dans les macrophages RAW et dans un système acellulaire que le

BMP riche en DHA (22:6/22:6-BMP) est beaucoup plus sensible à la péroxydation lipidique

que le BMP riche en oléate (18:1/18:1-BMP).

Ces modifications observées en présence de DHA semblent être spécifiques du

BMP car celles-ci n’ont pas été observées pour les PC et les PE malgré l’incorporation du

DHA dans ces deux phospholipides majoritaires des macrophages RAW. La sous-classe des

plasmalogènes-PE présente un intérêt particulier car ces derniers sont décrits comme des

cibles privilégiées de la peroxydation lipidique (Engelmann, 2004). La quantité de DMA (les

DMA dérivent des chaînes grasses alkényles lors de la réaction de transméthylation des PE)

reflète directement la quantité de plasmalogènes-PE. Nous avons ainsi pu montrer que la



206

quantité de plasmalogènes-PE n’est pas modifiée en présence de 30 µM de DHA, indiquant

l’absence de peroxydation de cette sous-classe de PE. En revanche nous n’avons pas analysé

les autres phospholipides cellulaires tels les PI et les PS. A ce titre, plusieurs travaux de

l’équipe du Dr. Kim ont montré que les PS constituent un réservoir de DHA et que leur

biosynthèse est régulée par le DHA (Kim et al., 2004 ; Garcia et al., 1998). Toutefois cette

propriété semble être spécifique des cellules neuronales (Guo et al., 2007 ; Hamilton et al.,

2000). De plus, des études d’incorporation de DHA radiomarqué réalisées notamment sur des

macrophages THP-1 en culture ont mis en évidence une incorporation du DHA beaucoup

moins importante dans les PS que dans le BMP (Besson et al., 2006 ; Huterer et Wherrett,

1986).

L’hypothèse originale qui découle de l’ensemble de ces résultats est qu’en

présence de concentrations élevées de DHA, contrairement aux autres phospholipides, la forte

propension du BMP à incorporer le DHA génère des quantités significatives de l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette espèce moléculaire est formée encore plus efficacement

lorsque les cellules sont incubées en présence du précurseur 22:6/22:6-PG à partir duquel elles

peuvent directement synthétiser du 22:6/22:6-BMP. Toutefois, en raison de sa très grande

sensibilité à la peroxydation lipidique, le 22:6/22:6-BMP formé dans les macrophages RAW

est rapidement dégradé. Ainsi, la quantité cellulaire de BMP diminue au fur et à mesure qu’il

incorpore le DHA exogène. Au contraire, en présence de vitamine E le 22:6/22:6-BMP est

protégé et peut donc s’accumuler.

Il est généralement admis que la sensibilité des acides gras à l’oxydation est

directement proportionnelle à leur degré d’insaturation. Ainsi, l’augmentation de la proportion

de DHA dans les lipides augmenterait leur vulnérabilité vis-à-vis de la peroxydation lipidique

(Alexander-North et al., 1994 ; Song et Miyazawa, 2001; Esterbauer et al., 1992). Toutefois,

d’autres études semblent indiquer que la relation entre le degré d’insaturation d’un acide gras

et sa sensibilité à l’oxydation n’est pas toujours aussi directe. Visioli et al. (1998) ont montré

qu’en soumettant différents acides gras à un stress oxydant in vitro, la génération de produits

de peroxydation ne reflète pas directement leur degré d’insaturation. Des études chez

l’Homme réalisées par Higdon et al. (2000) et Mori (2004) indiquent également qu’une

supplémentation du régime alimentaire avec des acides gras oméga-3 (EPA et DHA) issus

d’huile de poisson n’est pas associée à une augmentation de la peroxydation lipidique.

Dans nos conditions de supplémentation, la dégradation du BMP semble

spécifique de l’espèce 22:6/22:6-BMP. Or il a été montré que la présence de DHA à toutes les



207

positions des TAG ou des PC augmente leur oxydabilité par rapport aux espèces ne possédant

qu’un résidu DHA (Lyberg et al., 2005) et que dans les membranes des photorécepteurs de

rats, les phospholipides possédant deux résidus DHA sont sélectivement dégradés par un

stress oxydant généré par la lumière (Wiegand et al., 1995). Ainsi, l’hypothèse d’une

dégradation peroxydative du 22:6/22:6-BMP est en accord avec ces observations.

Par ailleurs, il est probable que le précurseur 22:6/22:6-PG soit également plus

sensible au stress oxydant que le précurseur 18:1/18:1-PG. Il n’est donc pas exclu qu’en

absence de vitamine E le 22:6/22:6-PG soit lui-même dégradé et devienne de cette manière

moins disponible pour la synthèse de BMP, ce qui pourrait expliquer les différences observées

sur les quantités de BMP en absence et en présence de vitamine E. Toutefois cette hypothèse

ne peut expliquer la diminution de la quantité de BMP que nous avons par ailleurs également

observée dans les cellules supplémentées avec du DHA non estérifié. De plus, si le précurseur

22:6/22:6-PG était significativement dégradé en absence de vitamine E on pourrait s’attendre

à observer également une incorporation moins importante de DHA dans les PC et les PE par

rapport à celle mesurée dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E,

ce qui n’est pas le cas.

Une autre hypothèse serait que le BMP estérifié avec du DHA soit spécifiquement

dégradé par une enzyme hydrolytique et non pas par un processus de peroxydation lipidique.

A ce titre il a été montré qu’une PLA2 lysosomale possède une activité hydrolytique sur le

BMP et notamment sur le BMP contenant du DHA (Ito et al., 2002). Toutefois, le rôle

protecteur de la vitamine E serait alors plus difficile à expliquer à moins de suggérer que cette

enzyme soit activée dans des conditions pro-oxydantes. Mais à ce stade de l’étude, ceci reste

purement spéculatif et peu probable car nous avons par ailleurs montré que dans des

conditions pro-oxydantes le BMP cellulaire riche en acide oléique n’est pas dégradé et aucune

lipase strictement spécifique du BMP estérifié avec du DHA n’a encore été identifiée.

Dans cette étude nous n’avons pas cherché à décrire plus précisément le

mécanisme ni à caractériser les produits potentiels de peroxydation spécifiques du BMP riche

en DHA, bien que cela soit d’un grand intérêt notamment pour valider notre hypothèse que la

diminution de la quantité de BMP est bien due à la peroxydation de l’espèce 22:6/22:6-BMP.

L’équipe de Salomon a décrit en détail les produits de peroxydation des PC et PE contenant

du DHA en position sn-2 (Gu et al., 2003 ; Gugiu et al., 2006). Les auteurs ont observé la



208

formation de nombreux phospholipides tronqués possédant en position sn-2 des résidus

oxydés du DHA de différentes longueurs avec des fonctions aldéhydes, carboxyle, hydroxyle

ou époxyde. La formation de ces composés a d’abord été étudiée dans un système acellulaire

à partir de standards puis confirmée in vivo dans la rétine. Ainsi, il est probable que la

peroxydation du BMP riche en DHA génère dans un premier temps du BMP estérifié avec un

ou deux DHA hydroxylés puis, dans un second temps, un mélange complexe de différentes

molécules de BMP tronquées de manière similaire à ce qui a été décrit précédemment pour les

PC-DHA et les PE-DHA.

Afin de vérifier expérimentalement cette hypothèse nous pourrions commencer

par identifier les produits de dégradation du 22:6/22:6-BMP générés dans un système

acellulaire et pouvant être considérés comme spécifiques du 22:6/22:6-BMP. Ensuite nous

devrions vérifier si ces molécules de BMP tronquées sont formées dans les macrophages

RAW incubés en présence de 22:6/22:6-PG sans vitamine E et que leur production est

diminuée en présence de vitamine E au profit d’une molécule de 22:6/22:6-BMP intacte.

Toutefois, il est évident qu’il s’agit là d’une étude analytique longue et difficile. Une autre

approche consisterait à synthétiser du 22:6/22:6-PG radioactif et d’identifier l’ensemble des

molécules radioactives formées après incubation sur des macrophages RAW.

La vitamine E est un puissant anti-oxydant lipophile. De nombreuses études ont

mis en évidence une corrélation entre le taux de vitamine E et le statut redox des cellules

(Wagner et al., 1996). Dans les monocytes, il a été montré que la vitamine E diminue la

production d’espèces radicalaires dérivées de l’oxygène (ROS) ainsi que la peroxydation

lipidique (Singh et al., 2005). Par rapport aux conditions observées in vivo, les cellules en

culture sont généralement déficientes en vitamine E ce qui induit une augmentation de la

sensibilité des lipides membranaires à la peroxydation (Kelley et al., 1995). Nous avons

effectivement retrouvé une quantité très faible de vitamine E dans les macrophages RAW

cultivés dans des conditions contrôles. Cette déficience apparaît, au moins en partie,

responsable de la dégradation du BMP riche en DHA dans les cellules non supplémentées en

vitamine E. Lorsque les macrophages RAW sont cultivés en routine dans un milieu

supplémenté avec 5 µM de vitamine E, la quantité cellulaire de vitamine E retrouve un niveau

physiologique en comparaison des quantités observées dans les monocytes et macrophages

isolés directement à partir de souris (Baoutina et al., 1998). La normalisation du contenu

cellulaire en vitamine E permet une accumulation de BMP riche en DHA lorsque ces cellules



209

sont supplémentées avec du 22:6/22:6-PG. Nous avons également montré par une approche

nutritionnelle chez la souris que le BMP peut présenter un très fort enrichissement en DHA

sans diminution de masse associée. Or le foie de souris contient des niveaux élevés de

vitamine E, particulièrement dans les endosomes tardifs/lysosomes (Azzi et Stocker, 2000).

Ces résultats suggèrent que les protections anti-oxydantes présentes in vivo sont suffisantes

pour permettre la formation et l’accumulation de BMP riche en DHA, et de l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP en particulier, malgré sa grande vulnérabilité au stress oxydant.

Il est important de discuter la pertinence de ces observations en relation avec la

quantité apportée de DHA. La formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages en

culture nécessite la présence de concentrations en DHA non estérifié supérieures à 30 µM. Il

existe dans la littérature de nombreuses études de supplémentation de cellules en culture avec

du DHA à des concentrations variant de 5 µM à parfois plus de 200 µM. La définition de

faibles versus fortes concentrations n’est donc pas clairement établie. Afin d’être au plus

proche des conditions physiologiques, le DHA est d’abord lié à l’albumine avant d’être

apporté aux cellules. On admet qu’un apport en acides gras n’est pas trop élevé lorsque le

rapport entre la quantité d’acides gras et la quantité d’albumine reste inférieur à 2. Compte

tenu de la quantité connue d’albumine présente dans le sérum de veau fœtal représentant 10%

du milieu de culture, la concentration en DHA de 30 µM représente un rapport largement

inférieur à 2 (≈0,6). D’autre part, bien que la quantité cellulaire de BMP ne soit pas modifiée

aux concentrations en DHA inférieures à 30 µM, il est probable que l’espèce 22:6/22:6-BMP

se forme, en particulier à la concentration de 15 µM pour laquelle le DHA atteint près de 40%

de l’ensemble des acides gras.

Il est plus difficile de discuter de la pertinence nutritionnelle de résultats

obtenus sur un modèle de cellules en culture. Pour la prévention cardiovasculaire, la dose de

DHA recommandée est comprise entre 0,5 et 1 g/jour (Din et al., 2004). Alors que la

consommation habituelle dans les pays industrialisés se situe plutôt autour de 200 mg/jour, un

apport supplémentaire en DHA peut être obtenu par une consommation plus importante de

poisson ou par des compléments alimentaires. Chez des adultes hyperlipidémiques

supplémentés avec 1 g/jour de DHA, le pourcentage de DHA dans les PL totaux des globules

rouges passe de 4% à 8% après 4 mois de supplémentation (Arterburn et al., 2006). Chez des

adultes sains supplémentés avec des doses croissantes de DHA (200 mg, 400 mg, 800 mg puis

1600 mg sur des périodes successives de 2 semaines, étude docoredox) le pourcentage de



210

DHA dans les PL totaux des monocytes et des plaquettes passe respectivement de 3,25% à

5,5% (Mebarek et al., 2008) et de 3% à 6% (communication personnelle). Dans les

macrophages RAW cultivés en présence de 30 µM de DHA non estérifié le pourcentage de

DHA dans les PL totaux passe de 3% à 15% (résultats non montrés), ce qui est donc supérieur

à ce qui est observé in vivo dans des conditions de supplémentation nutritionnelle. L’étude de

supplémentation nutritionnelle chez la souris apporte dans ce contexte des informations

importantes. En effet nous avons montré que l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP se forme

dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire riche en DHA respectant les

recommandations selon lesquelles le DHA peut représenter jusqu’à 10% de l’apport

énergétique dû aux lipides (Gebauer et al., 2006). A ce stade de l’étude il serait intéressant de

vérifier, dans le cadre de supplémentations nutritionnelles en DHA, si l’espèce moléculaire

22:6/22:6-BMP se forme chez l’Homme dans les cellules sanguines.

Dans des conditions pathologiques où le stress oxydant est augmenté le BMP

riche en DHA pourrait constituer une cible priviliée de la peroxydation lipidique. Notre étude

suggère que la sensibilité particulière du BMP riche en DHA à la peroxydation lipidique

pourrait avoir dans ce contexte un rôle bénéfique pour la cellule. En effet, en constituant une

cible privilégiée pour les espèces radicalaires, le BMP riche en DHA pourrait protéger les

autres lipides à proximité. Les résultats expérimentaux obtenus dans un système acellulaire

nous ont permis de montrer que la présence de 22:6/22:6-BMP ralentit l’oxydation du

cholestérol et donc la génération d’oxystérols. Il serait intéressant de rechercher si le

cholestérol dérivé des LDL est davantage protégé de l’oxydation dans des macrophages RAW

enrichis en 22:6/22:6-BMP. En effet, après avoir été captés par les cellules, les esters de

cholestérol contenus dans les LDL sont hydrolysés dans les endosomes tardifs et le

cholestérol libre se trouve ainsi associé avec le BMP. Or, Wen et Leake (2007) ont montré

que le cholestérol dérivé des LDL peut être oxydé à l’intérieur des lysosomes de

macrophages.

Indépendamment de son incorporation dans le BMP, de nombreuses études ont été

réalisées pour évaluer l’impact des acides gras polyinsaturés oméga-3 et du DHA en

particulier sur le status redox des cellules. Vericel et al. (2003) ont décrit un phénomène

biphasique dans les plaquettes avec un effet anti-oxydant du DHA à faible concentration et

pro-oxydant à forte concentration. De plus, il a été montré sur des cellules en culture qu’une



211

supplémentation avec des acides gras polyinsaturés oméga-3 réduit la production de ROS et

RNS (espèces radiacalaires dérivées de l’azote) par des cellules endothéliales d’aorte humaine

(Richard et al. 2008) et que le DHA en particulier réduit la peroxydation lipidique généré par

H2O2 dans les lymphocytes humains (Bechoua et al., 1999). In vivo, un traitement à base

d’huile de poisson réduit la production de l’anion superoxyde dans le myocarde et les artères

coronaires chez le singe (Supari et al., 1995) mais n’induit pas d’effet détectable sur la

production de l’anion superoxyde dans l’aorte de rat (Lopez et al., 2001). Enfin des études

chez l’Homme ont montré une réduction de la peroxydation lipidique après une

supplémentation en acides gras oméga-3, notamment en DHA (Mori et al., 2003 ; Mori et al.,

2000).

D’un point de vue mécanistique, en plus d’agir comme un « piégeur » des ROS, il

a été montré par Massaro et al. (2006) que le DHA inhibe l’activité de l’enzyme NADP(H)

oxydase dans les cellules endothéliales en diminuant la translocation de la sous-unité p47phox à

la membrane plasmique, et réduit ainsi la production intracellulaire de ROS. Les ROS ainsi

générés par les macrophages entretiennent la propagation de la peroxydation lipidique dans

les cellules et participent aux processus biochimiques de l’inflammation. De plus, les ROS

sécrétés par les macrophages participent à l’oxydation des LDL qui constituent alors une

source supplémentaire d’oxystérols pour les macrophages. Les travaux récents de Meikle et

al. (2008) ainsi que des expériences préliminaires de notre équipe (non communiqué) ont mis

en évidence la présence de BMP dans les LDL. L’enrichissement des LDL en acides gras

oméga-3 (EPA et DHA) diminue leur sensibilité à l’oxydation (Wander et al., 1998). Il serait

ainsi intéressant de mesurer in vivo l’enrichissement du BMP en DHA dans les LDL, et

d’évaluer l’effet antioxydant du BMP riche en DHA sur le cholestérol des LDL.

Sur le modèle des études fonctionnelles présentées dans la deuxième partie des

résultats il serait également intéressant d’étudier les conséquences de l’accumulation de

l’espèce 22:6/22:6-BMP sur le métabolisme du cholestérol qui transite via les endosomes

tardifs. Nous avons réalisé des expériences préliminaires d’immunofluorescence à l’aide de

l’anticorps anti-BMP sur des cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.

Les images obtenues sont présentées dans l’annexe 3. Lorsque les cellules sont marquées avec

l’anticorps anti-BMP et un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, le profil de

distribution de la fluorescence n’est pas modifié dans les cellules incubées en présence de

22:6/22:6-PG seul. En effet, on retrouve une distribution du BMP ponctuée et périnuclaire



212

caractéristique des endosomes tardifs, comme dans les cellules contrôles. En revanche, dans

les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E nous n’observons aucun

signal de fluorescence, ce qui indique que les cellules ne sont pas marquées par l’anticorps

anti-BMP. Ce résultat est reproductible mais difficilement explicable car le ou les antigènes

reconnus par l’anticorps n’ont jamais été précisément caractérisés. De plus la vitamine E seule

n’induit pas cet effet. Nous pouvons supposer que l’anticorps ne reconnait pas le BMP lorsque

celui-ci est trop enrichi en DHA ou que l’accumulation de 22:6/22:6-BMP modifie la

structure des endosomes tardifs et rend les domaines riches en BMP inaccessibles à

l’anticorps dans ces conditions de marquage.

Une autre série d’expériences a été menée en utilisant des LDL et des LDL

acétylées fluorescentes (DiI-LDL et DiI-acLDL) afin de marquer les endosomes tardifs et

observer éventuellement une modification de leur structure. Les images obtenues sont

également présentées dans l’annexe 3. Les résultats ne sont pas faciles à analyser en raison

d’une variabilité importante entre les cellules. Toutefois il semble que dans les cellules

incubées en présence de 22:6/22:6-PG sans vitamine E les compartiments marqués par les

LDL fluorescentes sont plus larges par rapport aux cellules contrôles. Dans les cellules

incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E on observe des compartiments en forme

de petits filaments péri-nucléaires. Ces résultats très préliminaires suggèrent que

l’accumulation de l’espèce 22:6/22:6-BMP pourrait entraîner des modifications de tailles

et/ou de structures des endosomes tardifs.

Enfin nous avons mené des études préliminaires visant à évaluer les conséquences

de l’accumulation de 22:6/22:6-BMP sur le métabolisme du cholestérol dérivé de la captation

des LDL. Sur des cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E, nous avons

observé, comme dans les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG, une diminution de

l’estérification et de l’efflux. Cependant les résultats sont plus difficiles à interpréter en raison

des effets induits par le DHA lui-même sur le métabolisme du cholestérol. En effet, en

présence de 22:6/22:6-PG, le DHA s’incorpore de façon non négligeable dans les autres

phospholipides cellulaires et il est connu que le DHA modifie la captation des LDL (Seo et

al., 2002 ; Shichiri et al., 1993) ainsi que l’estérification (Davis, 1992 ; Pal et Davis, 1991) et

l’efflux du cholestérol (Dusserre et al., 1995 ; Pal et Davis, 1990). Il semble donc difficile,

d’un point de vue expérimental, de s’affranchir des effets du DHA pour ne mesurer que les

effets de l’accumulation du 22:6/22:6-BMP. C’est la raison pour laquelle nous n’avons pas

poursuivi l’étude en ce sens.



213

Des études fonctionnelles sur le BMP ont été récemment réalisées in vitro.

L’équipe d’Hayakawa a étudié les propriétés biophysiques de membranes reconstituées avec

du BMP et a également réalisé des modélisations moléculaires de bicouches membranaires

constituées de BMP (Hayakawa et al., 2006 ; Hayakawa et al., 2007a). Toutefois les auteurs

ont utilisé dans ces études du 14:0/14:0-BMP et du 16:0/16:0-BMP qui ne semblent pas se

former en grande quantité in vivo. Matsuo et al. (2004) ont montré sur des liposomes

reconstitués que la présence de BMP induit la formation de liposomes multi-vésiculaires. Pour

cela les auteurs ont utilisé du 18:1/18:1-BMP qui est l’espèce moléculaire majoritaire dans

plusieurs types cellulaires. Dans le cadre de notre projet il serait intéressant de réaliser le

même type d’expériences avec le standard de 22:6/22:6-BMP. Ceci pourrait nous permettre de

mieux comprendre les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de BMP riche en DHA

sur l’organisation et la dynamique des membranes des endosomes tardifs.



214


Le contexte physiopathologique de notre projet de recherche concerne les

maladies cardiovasculaires et notamment l’athérosclérose. L’une des premières étapes de

l’athérogenèse est l’évolution des macrophages résidents dans l’intima des artères en cellules

spumeuses suite à une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol dans ces cellules. Dans ce

contexte nous avons étudié les relations métaboliques et fonctionnelles entre le BMP, le DHA

et le cholestérol dans des macrophages en culture.

Notre premier objectif était de mieux comprendre le rôle cellulaire du BMP sur le

métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dans les macrophages. Nous nous

sommes tout d’abord inspiré des travaux réalisé par le Dr. Kobayashi qui a utilisé un anticorps

anti-BMP pour altérer spécifiquement la fonction du BMP. Comme rapporté précédemment

dans ses travaux sur des fibroblastes en culture (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al.,

1999), nous avons montré que l’anticorps anti-BMP s’accumule dans les endosomes tardifs

des macrophages et induit une accumulation de cholestérol dans ces mêmes structures. Nous

avons par ailleurs montré que l’anticorps altère spécifiquement le transport et la distribution

du cholestérol issu des LDL dans la membrane plasmique ainsi que l’efflux de cholestérol

vers les HDL.

Nous avons ensuite développé une approche expérimentale permettant

d’augmenter spécifiquement et jusqu’à 4 fois la quantité cellulaire du BMP dans les

macrophages RAW, ceci afin d’en évaluer les conséquences sur l’homéostasie du cholestérol.

Cette approche consiste à stimuler la synthèse et l’accumulation de BMP en incubant les

cellules avec le précurseur phosphatidylglycérol (18:1/18:1-PG). Nos résultats, bien que

préliminaires, semblent indiquer que l’accumulation de BMP dans les cellules bloque

partiellement la redistribution du cholestérol dérivé des LDL depuis les endosomes tardifs

vers les autres compartiments cellulaires. Ainsi, le BMP accumulé dans les endosomes tardifs

retiendrait le cholestérol dans ce compartiment.

L’accumulation de l’anticorps et l’accumulation de BMP dans les endosomes

tardifs semblent conduire à des effets similaires, caractérisés par une modification de la

répartition du cholestérol dérivé des LDL et notamment par une accumulation de cholestérol



215

dans les endosomes tardifs. Il est possible que dans ces deux conditions expérimentales

l’organisation des microdomaines riches en BMP (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo et al., 2007)

soit altérée, ce qui perturberait l’organisation et la dynamique des membranes internes des

endosomes tardifs. La relation fonctionnelle entre le BMP et l’homéostasie du cholestérol

serait alors directement dépendante de l’intégrité des microdomaines riches en BMP.

Il est également intéressant de remarquer qu’une étude récente, réalisée par

l’équipe du Dr. Gruenberg, a mis en avant l’importance de l’équilibre entre la quantité de

cholestérol et la quantité de BMP dans le transport endosomal du cholestérol, cet équilibre

étant lui-même régulé par la protéine Alix (Chevallier et al., 2008). Cette étude montre qu’un

déficit en BMP diminue la capacité des endosomes tardifs à stocker le cholestérol ce qui est

cohérent avec nos propres observations. Toutefois cette même étude indique que dans des

conditions pathologiques comme la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) où le

cholestérol est accumulé de façon massive dans les endosomes tardifs, un apport exogène de

BMP permet d’améliorer la redistribution du cholestérol notamment vers la membrane

plasmique. Le rôle précis du BMP dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol semble

donc complexe et pourrait dépendre de nombreux facteurs comme ceux qui sont affectés dans

les syndromes métaboliques qui entraînent une accumulation endosomale/lysosomale de

cholestérol (Frolov et al., 2001 ; Puri et al., 1999). Il serait donc particulièrement intéressant

d’étudier plus en détail le rôle du BMP dans le cadre précis de ces pathologies, et l’approche

que nous avons développée avec du PG pour modifier spécifiquement la quantité cellulaire de

BMP pourrait s’avérer un outil très utile. L’identification des enzymes métaboliques du BMP

pourrait alors fournir de nouvelles stratégies biomédicales pour lutter contre ces lipidoses

affectant les lysosomes.

Un autre aspect particulier du BMP est sa très forte propension à incorporer le

DHA (Besson et al., 2006 ; Luquain et al., 2000), un acide gras polyinsaturé d’intérêt

nutritionnel dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme (Lee et al.,

2008). Les mécanismes de cette incorporation sélective et la signification biologique de

l’avidité du BMP pour le DHA restent toutefois inconnus. Nous avons montré que

l’incorporation massive du DHA dans le BMP peut induire, in vitro et in vivo, la formation et

l’accumulation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP. La présence de DHA dans les

phospholipides modifie fortement les propriétés membranaires (Stillwell et Wassall, 2003)

notamment dans les processus de formation des microdomaines (Chapkin et al., 2008).



216

Comme nous l’avons vu, le BMP est lui-même impliqué dans la formation de microdomaines

spécifiques dans les membranes internes des endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo

et al., 2007). Une hypothèse intéressante serait que le 22:6/22:6-BMP modifie fortement les

propriétés de ces microdomaines riches en BMP. Si ces propriétés sont déterminantes, comme

nous le proposons ci-dessus, la composition en acides gras du BMP pourrait alors intervenir

directement dans la relation fonctionnelle qui existe entre le BMP et l’homéostasie du

cholestérol. Par ailleurs il a été proposé que certaines lipidoses affectant les lysosomes soient

dues à une accumulation de microdomaines dans les endosomes tardifs/lysosomes (Simons et

Gruenberg, 2000). De plus, l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP a été retrouvée en grande

quantité chez des rats traités avec des drogues mimant le phénotype de ces lipidoses (Baronas

et al., 2007). Ainsi, l’enrichissement spécifique du BMP en DHA pourrait être impliqué dans

ces pathologies. Des études plus précises sur les relations métaboliques et fonctionnelles entre

le BMP, le DHA et le cholestérol pourraient permettre de développer de nouvelles approches

thérapeutiques originales.

Notre étude a également permis de montrer que l’espèce moléculaire 22:6/22:6-

BMP, fortement insaturée, présente une grande sensibilité à la peroxydation lipidique qui peut

la rendre vulnérable dans un contexte pathologique où le stress oxydant cellulaire est

augmenté. De cette propriété découle l’un de nos résultats les plus originaux. Il s’agit de

l’action anti-oxydante du 22:6/22:6-BMP vis-à-vis du cholestérol que nous avons mise en

évidence sur un modèle membranaire in vitro. Nous proposons en effet que le 22:6/22:6-

BMP, en étant une cible privilégiée du stress oxydant, puisse protéger les autres molécules

présentes dans son environnement membranaire proche, notamment le cholestérol dérivé des

LDL. Il serait intéressant de mettre en évidence cet effet protecteur au niveau cellulaire en

vérifiant par exemple que les macrophages enrichis en 22:6/22:6-BMP génèrent moins

d’oxystérols (Wen et Leake, 2007). En effet les oxystérols sont très délétères pour les cellules

(Clare et al., 1995) et ils participent à l’apparition et au développement des plaques

d’athérome (Leonarduzzi et al., 2002). Ainsi, l’enrichissement du BMP en DHA pourrait être

un mécanisme en partie responsable de l’effet bénéfique du DHA sur les maladies

cardiovasculaires et dont les bases cellulaires ne sont encore que très peu comprises.

Le BMP a été identifié pour la première fois en 1973. Pendant près de 10 ans sa

structure très particulière a alors fait l’objet de nombreux travaux puis son métabolisme

(remodelage des acides gras, biosynthèse…) a été largement étudié. Depuis 1998 et les



217

premiers travaux du Dr. Kobayashi, l’ensemble des études fonctionnelles sur le BMP mettent

en lumière son rôle essentiel au sein des membranes endosomales et ouvrent des perspectives

nouvelles, à plus ou moins long terme, pour des applications médicales notamment dans le

cadre de l’athérosclérose ainsi que des lipidoses affectant les lysosomes comme la maladie de

Niemann-Pick de type C.

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ANNEXES


255

ANNEXES

ANNEXES LISTES DES ANNEXES


256

LISTE DES ANNEXES

ANNEXE 1 : L’athérosclérose

ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par

chromatographie gazeuse

ANNEXE 3 : Etude en microscopie à fluorescence des macrophages RAW

en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E

ANNEXE 4 : Publications scientifiques

ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose


257

ANNEXE 1

L'athérosclérose

Le contexte physiopathologique du travail présenté dans ce manuscrit concerne

les maladies cardiovasculaires et l’athérosclérose en particulier. Dans cette annexe sont

présentées des informations complémentaires sur l’épidémiologie de l’athérosclérose, sur les

principaux éléments impliqués dans l’athérogenèse notamment les macrophages et les

lipoprotéines, ainsi que sur le processus athéromateux. La majorité des informations

proviennent de l’ouvrage L’athérosclérose : Physiopathologie, diagnostics, thérapeutiques de

J-F Toussaint (Toussaint et al., 2003).

L’athérosclérose est une lésion anatomique touchant les grosses et moyennes

artères, principalement l’aorte et les carotides, les artères coronaires, les artères cérébrales et

les artères des membres inférieurs. De façon générale, le terme « sclérose » désigne toute

dégénérescence fibreuse d’un tissu ou d’un organe. L’athérome correspond à un remaniement

de l’intima des artères par accumulation locale de lipides, de polysaccharides, de sang et de

produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts calcaires. A ceci s’ajoute également des

modifications de la media des parois artérielles. A la différence de l’artériosclérose qui est un

phénomène naturel lié au vieillissement physiologique des artères, l'athérosclérose est un

processus évolutif pathologique qui reste pendant très longtemps asymptomatique avant d’être

révélé par un accident grave dû à l’une de ses nombreuses complications (sténose, ischémie,

thrombose, hémorragie…), par exemple un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire,

un accident vasculaire cérébral (AVC)…

1. Epidémiologie et facteurs de risque

Dans le monde, les deux premières causes de mortalité sont des complications de

l'athérosclérose : les ischémies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux avec



258

respectivement 7,4 millions et 5,1 millions de décès en 1998 (sur un total mondial de 53,8

millions de décès selon le rapport sur la santé dans le monde de l’OMS de 1999). La « Global

Burden of Disease Study » avait déjà rapporté cette tendance pour l’année 1990 (Figure 66)

(Murray et Lopez, 1997a). Toujours d’après cette étude, les prévisions réalisées jusqu’en 2020

indiquent que les accidents cardiovasculaires devraient rester la première cause de décès dans

le monde (Murray et Lopez, 1997b).

Le projet MONICA (« monitoring trends and determinants in cardiovascular

disease ») a suivi l’évolution de la fréquence des maladies cardiovasculaires sur une période

longue (1983-1985 à 1992-1994) et simultanément dans 37 régions appartenant à 21 pays

différents (sans auteur, 1988). Cette étude a montré qu’il existe une très grande disparité de

l’incidence de la maladie suivant les pays. Alors que celle-ci est très élevée dans les pays de

l’Europe du Nord et de l’Amérique du Nord, notamment aux Etats-Unis, elle est beaucoup

plus faible dans les zones méditerranéennes, les pays asiatiques et le tiers monde.

En France, les maladies cardiovasculaires sont à l’origine d’environ 40% des

décès et restent ainsi la première cause de mortalité (Ducimetiere et al., 2006). Les données

de l’étude MONICA pour la France ont également montré que l’incidence de l’athérosclérose

est plus élevée dans le Nord de la France que dans le Sud (Cambou et al., 1996).

Figure 66 : Nombre de décès liés aux maladies cardiaques ischémiques par pays en 1990 (pour 100000 habitants)



259

Les facteurs de risque de l'athérosclérose sont multiples. On peut en distinguer

deux sortes :

- les facteurs de risque non modifiables :

L’âge est le premier facteur de risque associé l'athérosclérose. Le sexe, également, puisque les

hommes sont plus touchés que les femmes qui bénéficient d’une protection hormonale jusqu’à

la ménopause. Enfin il existe aussi un terrain héréditaire favorisant le développement de la

maladie.

- les facteurs de risques modifiables :

La prévalence de l’athérosclérose est corrélée avec le stade d’industrialisation d’un pays ou

d’une région. En effet le mode de vie et les habitudes alimentaires ont des effets importants

sur l’incidence de l'athérosclérose. Le tabagisme, l’alcool, la sédentarité, le stress ainsi qu’une

alimentation trop riche en glucides et matières grasses (cholestérol et acides gras saturés) et

pauvre en fibres alimentaires et vitamines C et E, favorisent la survenue de troubles

métaboliques comme l’obésité, le diabète, l’hypertension artérielle et un taux élevé de LDL

plasmatiques. Ces troubles métaboliques augmentent le risque associé au développement de

complications liées à l'athérosclérose.

2. La paroi vasculaire

Les artères sont toutes constituées de trois couches concentriques qui, de la

lumière du vaisseau vers l’extérieur, sont : l’intima, la média et l’adventice (Figure 67).

L’intima est la couche la plus interne et la plus fine. C’est à ce niveau que se

développe la plaque d’athérome. Elle est constituée d’une couche unique de cellules

endothéliales (l’endothélium) formant une couverture étanche. La zone sous endothéliale est

composée de fibres conjonctives, d’élastine, de collagène et de protéoglycanes formant un

tissu conjonctif lâche. Cette zone renferme également de nombreuses cellules du système

immunitaire.

La média est principalement constituée de cellules musculaires lisses qui assurent

un remodelage permanent des vaisseaux en réponse aux variations physiologiques de

l’organisme. Elle contient également des fibres de collagène et d’élastine. Son épaisseur est

variable suivant le type d’artère.



260

L’adventice est un tissu conjonctif formant la couche externe des artères. Elle est

très riche en collagène et en fibres élastiques, et contient des fibroblastes et des adipocytes.

Elle assure l’ancrage de l’artère à son environnement.

3. Les macrophages

3.1 Origine et morphologie

Les macrophages sont de grosses cellules mononuclées dérivées de la

différenciation des monocytes. Les monocytes, dérivés de la moelle osseuse à partir de

cellules souches myéloïdes, sont présents dans la circulation sanguine. Ainsi les monocytes

peuvent migrer vers les différents organes et infiltrer les tissus en traversant l’endothélium

vasculaire. Ils subissent alors leur différenciation terminale en macrophages résidents.

Il existe une grande diversité de macrophages selon les tissus où ils se trouvent.

Par exemple on les nomme cellules de Kupffer dans le foie, ostéoclastes dans les tissus

osseux, cellules microgliales dans le tissu nerveux, macrophages alvéolaires dans les

poumons, etc. Ils ont néanmoins quelques caractéristiques communes : ce sont de grosses

cellules (20-50 µm de diamètre) possédant un noyau relativement important et excentré, un

système de Golgi très développé et de nombreux granules cytoplasmiques. De plus les

macrophages expriment un grand nombre de récepteurs membranaires. Certains macrophages

ont la capacité de former des pseudopodes pour se déplacer au sein d’un tissu.

Figure 67 : Représentation schématique de la paroi artérielle saine.



261

3.2 Fonctions des macrophages et implications en pathologie humaine

Les macrophages appartiennent à la famille des cellules immunitaires. Ils jouent

un rôle essentiel dans l’immunité innée en tant que défense non-spécifique notamment grâce à

leur capacité de phagocytose. Ils participent également à l’immunité adaptative via le

phénomène d’opsonisation. En effet, après avoir phagocyté et digéré des débris cellulaires ou

des pathogènes ils peuvent se comporter comme des cellules présentatrices d’antigènes

permettant l’activation des lymphocytes T et ainsi l’amplification immunitaire. De plus les

macrophages sécrètent une grande variété de médiateurs comme des cytokines pro-

inflammatoires (IL-1α et β, TNF α et IL-6), des facteurs de croissances (PDGF…), des

chimiokines (IL-8, MCP…) ainsi que des prostaglandines et leucotriènes.

Les macrophages résidents sont des cellules complètement différenciées qui ne se

divisent plus et qui peuvent demeurer plusieurs mois dans un tissu. Ils résident à des endroits

stratégiques susceptibles d’accumulation de débris ou d’invasion microbienne comme les

poumons, le foie, les tissus nerveux ou les tissus conjonctifs. En cas de besoin les monocytes

circulants peuvent également être recrutés sur le lieu d’une inflammation. Ils sont attirés par

chimiotactisme grâce à des signaux d’appel dérivés de cellules endommagées (par nécrose ou

apoptose), de pathogènes ou de cellules présentes sur le lieu d’inflammation comme les

macrophages eux-mêmes.

Les macrophages résidents dans l’espace sous endothélial (intima) jouent un rôle

important au cours de l’athérogénèse. En effet ces derniers ont la capacité de capter, par

endocytose, les lipoprotéines de faible densité (LDL) natives ou modifiées, principalement par

oxydation. Or, dans un contexte pathologique où les macrophages accumulent de nombreuses

vésicules lipidiques riches en esters de cholestérol, ils évoluent en cellules spumeuses

constituant une partie essentielle des lésions athéromateuses.

4. Le métabolisme des lipoprotéines

Le métabolisme des lipoprotéines est complexe. Il dépend de mécanismes faisant

intervenir de nombreux récepteurs et enzymes et permet le transport des lipides exogènes et

endogènes dans l’organisme entier. On distingue trois voies de transport qui sont très



262

interconnectées notamment car se produisent entre elles de nombreux échanges de lipides et

de protéines. Il s’agit de la voie de transport des lipides exogènes issus de l’alimentation (à

partir de l’intestin vers les tissus périphériques), la voie de transport des lipides endogènes du

foie vers les tissus périphériques et la voie de transport retour des lipides endogènes des tissus

vers le foie ou « transport inverse du cholestérol ».

4.1 Transport des lipides exogènes : voie entéro-hépatique

Cette voie de transport permet d’amener les lipides alimentaires de l’intestin vers

les tissus périphériques notamment aux muscles pour la production d’énergie et aux tissus

adipeux pour le stockage d’énergie. Les lipides alimentaires sont hydrolysés et absorbés au

niveau intestinal. Les acides gras et le cholestérol sont alors ré-estérifiés en triglycérides (TG)

et esters de cholestérol (CE) puis assemblés à l’aide de l’apo B-48 pour former des

chylomicrons. Les chylomicrons, riches en TG, sont sécrétés dans la lymphe par les

entérocytes avant de rejoindre la circulation sanguine. La protéine MTP (« Microsomal

Triglycéride Transfer Protein ») joue un rôle essentiel dans l’assemblage et la sécrétion des

chylomicrons. Une fois sécrétés, les chylomicrons acquièrent rapidement les apolipoprotéines

A-I, A-II, A-IV, C et E.

Les chylomicrons sont transportés vers les tissus périphériques où les TG qu’ils

contiennent sont hydrolysés par la lipoprotéine lipase (LPL) liée à l’endothélium des

capillaires. Les acides gras libérés sont rapidement captés par les tissus. Au cours de

l’hydrolyse des TG le rapport CE/TG augmente et une partie des apoA-I se dissocie et

contribue à l’émergence de nouvelles particules de préβHDL. Ces particules HDL, riches en

protéines et pauvres en lipides, jouent un rôle essentiel dans l’efflux du cholestérol des tissus

périphériques et le transport inverse du cholestérol (voir paragraphe 4.3). Les particules

résiduelles de chylomicrons (« remnants ») retournent au foie où elles sont captées par les

hépatocytes. Le récepteur des LDL et le récepteur LRP contribuent à la reconnaissance et à

l’internalisation des résidus de chylomicrons qui subissent alors une lipolyse et une protéolyse

quasi complète. Le cholestérol sera excrété sous forme d’acides biliaires ou utilisé pour la

formation de nouvelles lipoprotéines, les VLDL.



263

4.2 Transport des lipides endogènes du foie vers les tissus

Quelques heures suivant un repas, lorsque la quantité de chylomicrons en

circulation est faible, l’apport en TG aux tissus périphériques est assuré par une autre famille

de lipoprotéines : les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les VLDL sont synthétisées

par le foie à partir des TG et CE hépatiques, ainsi que de l’apoB-100, puis sécrétées dans la

circulation sanguine.

Dans la circulation les VLDL naissantes s’enrichissent en apoC et E provenant

des HDL. Comme les chylomicrons, les TG contenus dans les VLDL sont hydrolysés par la

LPL au niveau des tissus périphériques. En s’appauvrissant en TG les VLDL évoluent

progressivement en lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL). Les IDL continuent de

s’appauvrir en TG sous l’action d’une autre enzyme lipolytique, la lipase hépatique (HL), et

perdent les apolipoprotéines, soit par échange, soit par libération dans le plasma. Ainsi, les

IDL évoluent en lipoprotéines de faible densité (LDL) riches en CE et ne contenant qu’une

apolipoprotéine B-100. Chez l’homme, les VLDL et les IDL acquièrent également des CE

contre des TG par échange avec les HDL. Ce transfert est réalisé grâce à la protéine de

transfert des esters de cholestérol (CETP). C’est donc la combinaison des activités LPL (sur

les VLDL) et HL (sur les IDL), induisant une perte progressive des TG, et de l’activité CETP

(sur les VLDL et IDL), induisant un enrichissement en CE, qui conduit à la formation de LDL

(CE>TG) à partir des VLDL hépatiques (TG>CE).

Les LDL en circulation sont alors captées par les cellules des tissus périphériques

dont les cellules hépatiques ainsi que les macrophages présents dans l’espace sous-endothélial

des artères. La reconnaissance et l’endocytose des LDL se produit grâce à leur interaction

avec différents récepteurs cellulaires spécifiques ou non. Les LDL assurent ainsi un apport en

cholestérol aux tissus périphériques.

4.3 Transport des lipides endogènes des tissus vers le foie : « transport inverse du

cholestérol »

La plupart des tissus périphériques sont incapables de cataboliser le cholestérol.

Le foie est le principal organe capable d’éliminer le cholestérol excédentaire de l’organisme



264

par excrétion dans la bile, soit sous forme native, soit après conversion en acide biliaire. Ainsi

on appelle « transport inverse du cholestérol » (en anglais « reverse cholesterol transport » ou

RCT) la voie de transport qui permet de ramener le cholestérol des tissus périphériques au

foie, par l’intermédiaire des lipoprotéines de haute densité (HDL) (Cuchel et Rader, 2006 ;

Ohashi et al., 2005 ; Tall, 2008). Cette voie a été proposée pour la première fois par Glomset

en 1968 (Glomset JLR 1968).

Les HDL sont synthétisées principalement par le foie sous forme « native » ou

« naissante ». Les HDL natives (aussi appelées préβHDL en opposition aux particules de

HDL de type α plus riches en lipides neutres) sont constituées d’apolipoprotéines A-I

associées à quelques molécules de phospholipides et de cholestérol. Ces particules pauvres en

lipides ont une forme discoïdale et une densité élevée. Des particules de préβHDL peuvent

également être synthétisées par l’intestin ou provenir du métabolisme intravasculaire des

lipoprotéines. En effet les chylomicrons d’origine intestinale, lors de l’hydrolyse de leur TG

par la LPL, perdent des apoA-I qui vont pouvoir reformer des préβHDL grâce à l’activité de

la protéine de transfert des phospholipides (PLTP). De plus, comme nous le verrons plus loin,

les particules de αHDL subissent dans le compartiment plasmatique un remodelage qui

aboutit à la régénération de préβHDL natives.

La capacité des HDL, et notamment des préβHDL, à stimuler l’efflux du

cholestérol des tissus périphériques pour le ramener au foie est l’étape clé du transport inverse

du cholestérol. Les HDL sont capables de capter le cholestérol excédentaire à partir de

l’ensemble des tissus périphériques de l’organisme mais il est généralement admis que c’est

l’efflux du cholestérol à partir des cellules des parois artérielles, principalement des

macrophages, qui est directement pertinent dans la physiopathologie de l’athérosclérose. En

effet les macrophages présents dans l’espace sous endothélial acquièrent de grandes quantités

de cholestérol par endocytose des LDL modifiées. Or l’accumulation de cholestérol sous

forme libre et estérifiée peut mener à la formation de macrophages spumeux jouant un rôle

important dans le développement de la plaque d’athérome. Les mécanismes d’efflux du

cholestérol à partir des macrophages sont décrits en détail dans le chapitre 1 des rappels

bibliographiques.

En captant le cholestérol présent dans la membrane plasmique des macrophages,

les préβHDL s’enrichissent progressivement en cholestérol libre. Ce cholestérol est alors

estérifié par l’enzyme lécithine-cholestérol-acyltransférase (LCAT). Les esters de cholestérol

ainsi formés migrent vers le cœur hydrophobe de la particule qui évolue progressivement en



265

HDL3 (αHDL), sphérique et moins dense que les préβHDL. L’activité LCAT, en consommant

le cholestérol libre et les phospholipides des HDL, restaure une certaine avidité des particules

HDL pour le cholestérol libre membranaire.

Les HDL3 circulantes évoluent alors en HDL2 en échangeant leurs esters de

cholestérol avec les VLDL contre des TG. Cette réaction, catalysée par la protéine de transfert

des esters de cholestérol (CETP), permet de rediriger les esters de cholestérol synthétisés par

la LCAT vers les lipoprotéines contenant l’apoB100 (VLDL et LDL). Celles-ci rapportent

alors les esters de cholestérol au foie grâce à leur interaction avec le récepteur aux LDL (R-

LDL), terminant ainsi le transport inverse du cholestérol.

Lors de ce transfert catalysé par la CETP, les HDL3 s’enrichissent en TG et

évoluent donc progressivement en HDL2, plus grosses et moins denses. Les TG contenus dans

ces particules vont alors être hydrolysés par la lipase hépatique (HL). L’action combinée des

enzymes CETP (qui échange les CE contre des TG) et HL (qui hydrolyse ces TG) appauvrit le

cœur des HDL2 en lipides neutres. Il apparaît alors une instabilité de la particule qui se divise

en une particule HDL de petite taille pauvre en lipides neutres et en une nouvelle particule de

préβHDL.

Les HDL3 évoluent également en HDL2 grâce à l’action de la protéine de transfert

des phospholipides (PLTP) qui permet la fusion de deux HDL3 de taille intermédiaire pour

former une particule HDL2 de grande taille. Lors de cette fusion des particules de préβHDL

sont également régénérées.

Comme nous l’avons vu les esters de cholestérol contenus dans les HDL sont

rapportés au foie après leur transfert aux VLDL. Toutefois les αHDL sont également capables

de transférer le cholestérol et les esters de cholestérol qu’elles contiennent dans les cellules du

foie grâce à leur interaction avec le récepteur SR-B1. Le cholestérol est alors transféré par un

processus sélectif durant lequel la particule de HDL n’est pas endocytée et pouvant donc être

réutilisée pour accepter le cholestérol des tissus périphériques. Une partie mineure du

cholestérol des HDL est également délivrée aux reins et aux tissus stéroïdogènes.

La majorité du cholestérol des HDL entrant dans l’hépatocyte est métabolisé par

voie extralysosomale et est directement éliminé dans la bile. En revanche le cholestérol des

VLDL et LDL internalisées est métabolisé par voie intralysosomale et est éliminé sous forme

de sels biliaires.



266

Figure 68 : Schéma du métabolisme des lipoprotéines : le transport du cholestérol dans l’organisme. VLDL : lipoprotéines de très faible densité. IDL : lipoprotéines de densité intermédiaire. LDL : lipoprotéines de faible densité. HDL : lipoprotéines de haute densité. LPL : lipoprotéine lipase. HL : lipase hépatique. CETP : protéine de transfert des esters de cholestérol. LCAT : lécithine-cholestérol-acyltransférase. CE : esters de cholestérol. FC : cholestérol libre. TG : triglycérides.

cholestérol

cholestérol

LPL

LPL

CHYLOMICRONS

TG CE

CHYLOMICRONSREMNANT

VLDL

IDL LDL

preβHDL

HDLCE

FCLCAT

HDL

HL

CETP

Cellules du foie

Cellules périphériques(macrophages)

Intestin

Capillaires

Capillaires

LIPIDES ALIMENTAIRESVo

ie d

e tr

ansp

ort e

xogè

neVo

ie d

e tr

ansp

ort e

ndog

ène

Tran

spor

t inv

erse



267

5. Le processus athéromateux

La lésion d’athérosclérose passe par différents stades dont chacun est l’évolution

du précédent. La description anatomopathologique moderne de l’athérosclérose retient trois

stades évolutifs de la plaque d’athérome : la strie lipidique (lésions précoces), la lésion fibro-

lipidique ou fibro-athérome (lésions avancées) et la lésion compliquée. Une classification plus

détaillée a été proposée par Stary (Stary et al., 1994) divisant l’évolution de la plaque en sept

stades de gravité croissante (Tableau 17 et Figure 69).

La genèse de la plaque d’athérome, ou athérogenèse, dépend d’un grand nombre

de mécanismes. L’apparition de la plaque au stade précoce de son développement est

principalement due à l’accumulation de LDL dans l’espace sous endothélial où elles vont

subirent des modifications, principalement par oxydation, conduisant à leur internalisation par

les macrophages résidents. Ces macrophages, suite à l’accumulation intracellulaire de

gouttelettes d’esters de cholestérol, vont évoluer en cellules spumeuses et se déposer au sein

de la paroi artérielle. Cette série d’évènements est essentielle au cours des phases précoces de

l’athérogenèse mais aussi au cours de la progression de la plaque d’athérosclérose car ces

mêmes mécanismes se poursuivent dans la plaque constituée.

TYPE DELESIONS

Lésions précocesI Macrophages spumeux isolésII Stries lipidiquesIII Préathérome

Lésions avancéesIV AthéromeV Plaque athéoscléreuse

Lésions compliquéesVI Plaque athéroscléreuse compliquéeVII Plaque fibreuse

TERME PROPOSE

Tableau 17 : Classification des lésions de l’athérosclérose selon Stary. La plaque d’athérome évolue en passant par différents stades, des lésions précoces (types I à III) aux lésions avancées (types IV et V) puis aux lésions compliquées (VI). A ceux-ci s’ajoute un VIIème type de lésion caractérisé par un épaississement massif de l’intima et un noyau lipidique très réduit voire absent.



268

La strie lipidique (types I, II et III)

La lésion initiale est uniquement caractérisée par la présence de

macrophages spumeux isolés dans l’intima des artères (type I). Ces lésions initiales peuvent

survenir très tôt dans la vie, chez de jeunes enfants, voire des nourrissons. Le nombre de

macrophages spumeux augmentent progressivement. Ils s’accumulent en couche dans l’intima

des artères, juste sous l’endothélium (type II). On voit ensuite apparaître, en faible quantité,

des lipides extracellulaires (principalement des esters de cholestérol et du cholestérol libre)

qui s’accumulent sous les cellules spumeuses (type III). A ce stade il n’y a pas encore de

véritable centre lipidique. A aucun de ces trois types lésionnels précoces n’est associée de

manifestation clinique.

La lésion fibro-lipidique (types IV et V)

En général après 40 ans les lésions précoces commencent à évoluer en

lésions avancées. Dans un premier temps ces lésions se caractérisent par l’accumulation d’une

grande quantité de lipides extracellulaires formant un centre lipidique sous le groupement de

cellules spumeuses (type IV). Ensuite, le centre lipidique se recouvre d’une chape fibreuse

(fibrose) constituée de matrice extracellulaire (collagène, glycoprotéines, glycosamino-

glycanes…) ainsi que de cellules musculaires lisses, de macrophages, de cellules

endothéliales et de lymphocytes T (type Va). La lésion fibro-lipidique peut également

présenter des calcifications (type Vb) ou être caractérisée par un centre lipidique très petit

voire absent (type Vc). Les lésions fibro-lipidiques, surtout de type V, peuvent entraîner une

sténose (réduction de la lumière artérielle) partielle mais symptomatique des petites artères

comme les coronaires.

La lésion compliquée (type VI) – manifestations cliniques

Les lésions compliquées sont des évolutions des lésions fibro-lipidiques de

types IV ou V liées à un phénomène d’ulcération (type VIa), d’hémorragie intraplaque (type

VIb) ou de thrombose (type VIc). Le type VIa se caractérise par une perte de substance à la

surface de la plaque. La profondeur de l’ulcération est variable et peut parfois n’être que

superficielle, on parle alors d’érosion. Le type VIb correspond à l’entrée de sang à l’intérieur

du noyau lipidique de la plaque, aboutissant à une augmentation rapide de son volume. Le

type VIc ou thrombose est la complication majeure de l’athérosclérose. Elle se caractérise par



269

une rupture ou une érosion de la plaque qui expose alors du matériel lipidique thrombogène

au sang circulant. Ceci entraîne la formation d’un thrombus obstruant la lumière artérielle.

Lorsque la thrombose se développe jusqu’à occlusion complète de l’artère elle conduit à des

accidents ischémiques aigus comme un angor instable, un infarctus du myocarde ou un

accident vasculaire cérébral. Ces lésions de type VI peuvent entraîner d’autres types de

complications comme des embolies (migration du thrombus dans les artères de moyen et petit

calibre entraînant leur occlusion) ou des anévrysmes de l’aorte (dilatation du calibre artériel

associé à un amincissement de la paroi).

Figure 69 : Représentation schématique de l’évolution et la constitution d’une plaque d’athérome de type fibreuse.

ANNEXES ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par chromatographie gazeuse


270

ANNEXE 2

Chromatogrammes des acides gras analysés par

chromatographie gazeuse

Figure 70 : Chromatogrammes des acides gras. Exemples de chromatogrammes obtenus par chromatographie gazeuse lors de l’analyse de la composition en acides gras des PC, des PE et du BMP extraits de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.



271

14:0

15:0

17:0

16:0

16:1

n-9

16:1

n-7

18:0

18:1

n-9

18:2

n-6

18:1

n-7

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

20:5

n-3

22:6

n-3

22:5

n-3

PC(cellules contrôles)

14:0

15:0

17:0

16:0

16:1

n-9 16

:1n-

7

18:0

18:1

n-9

18:2

n-6

18:1

n-7

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

20:5

n-3 22

:6n-

322

:5n-

3

16:0

DM

A

18:0

DM

A18

:1n-

9 D

MA

18:1

n-7

DM

A

PE(cellules contrôles)



272

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

16:1

n-9

16:1

n-7

18:1

n-7

20:5

n-3

22:6

n-3

22:5

n-3

18:2

n-6

14:0

18:0

15:0

16:0

17:0 18

:1n-

9

BMP(cellules contrôles)

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

16:1

n-9

16:1

n-7

18:1

n-7

20:5

n-3

22:6

n-3

22:5

n-3

18:2

n-6

14:0

18:0

15:0

16:0

17:0

18:1

n-9

BMP(cellules supplémentées en

18:1/18:1-PG)



273

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

16:1

n-9

16:1

n-7 18

:1n-

7

20:5

n-3

22:6

n-3

22:5

n-3

18:2

n-6

14:0

18:0

15:0

16:0

17:0

18:1

n-9

BMP(cellules supplémentées en

22:6/22:6-PG)

20:2

n-6

20:3

n-6

20:4

n-6

16:1

n-9

16:1

n-7

18:1

n-7

20:5

n-3

22:6

n-3

22:5

n-3

18:2

n-6

14:0

18:0

15:0

16:0

17:0

18:1

n-9

BMP(cellules supplémentées en22:6/22:6-PG + vitamine E)

ANNEXES ANNEXE 3 :Etude en microscope à fluorescence des macrophagess RAW


274

ANNEXE 3

Etude en microscopie à fluorescence des macrophages

RAW en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E

1. Localisation subcellulaire du BMP à l’aide de l’anticorps anti-BMP

Contrôle 22:6/22:6-PG 22:6/22:6-PG+ vitamine E

Figure 71 : Localisation subcellulaire du BMP dans les macrophages RAW incubés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. Le marquage est réalisé grâce à l’anticorps anti-BMP et à un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes.

ANNEXES ANNEXE 3 :Etude en microscope à fluorescence des macrophagess RAW


275

2. Marquage des endosomes tardifs/lysosomes à l’aide de LDL et acLDL

fluorescentes

A

Contrôle

22:6/22:6-PG22:6/22:6-PG+ vitamine E

Contrôle 22:6/22:6-PG 22:6/22:6-PG+ vitamine E

B

Figure 72 : Marquage des endosomes tardifs par des LDL et acLDL fluorescentes. Les macrophages RAW sont pré-incubés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E puis incubés en présence de DiI-LDL (A) ou de DiI-acLDL (B) comme décrit dans Matériels et Méthodes.

ANNEXES ANNEXE 4 :Publications scientifiques


276

ANNEXE 4

Publications scientifiques

Documents

Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque et …theses.insa-lyon.fr/publication/2008ISAL0123/these.pdf · 2016. 1. 11. · BMP in cultured macrophages alters the redistribution