Centre Léon BérardINSERM / UCBL U590

Jeudi 10 décembre 2009

Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des gènes MYC dans le neuroblastome

Soutenance de thèseAbdelkader Selmi

Directrice de thèse : Dr Sandrine WittmannDirecteur d’unité : Pr Alain Puisieux

2

Sommaire

• Introduction–Cancers embryonnaires : neuroblastome–Gènes MYC & TWIST

• MYC & TWIST dans le neuroblastome

• MYC & TWIST : modèle de progression tumorale

• Conclusion & Perspectives

3

INTRODUCTION

4

Cancer

• Théorie mutationnelle(Elenbaas et al., 2001; Loeb et al., 2003)

– Oncogènes– Suppresseurs de tumeurs

• Théorie instabilité génétique (Weaver et al., 2007; Li et al., 2005)

• Théorie de la cellule souche cancéreuse (Pardal et al., 2003)

• Gènes du développement

• Cancers embryonnaires– neuroblastome, glioblastome

Introduction

• Cellules tumorales

• Cellule souche normale

• Cellule différenciée

• Cellule SoucheCancéreuse

• mutations

• dédifférenciation

Adaptée de Pardal et al., 2003

5

Cancer pédiatrique & cancer adulte

Maris et al., 2002; Pahlman et al., 2004

Introduction

6

Neuroblastome

• Localisation :– 35 % surrénalienne– 65 % abdominale

• Tumeur embryonnaire : enfant très jeune (98% < 2 ans)• Hétérogénéité clinique

– Régression spontanée– Tumeurs agressives, fatales

Reflet d’hétérogénéité biologique

Cervicale

Thoracique

Surrénalienne

Abdominale

Introduction

7

Neuroblastome

• Neuroblastome dérive des neuroblastes– précurseurs du système nerveux périphérique

Cellule de la crête neurale

MélanoblasteGlioblaste NeuroblasteCellule

mésenchymateuse

GlieSystème Nerveux

Périphérique &Médullosurrénale

LéptoméningesEctomesenchyme

Mélanocyte

Thiery, 2002

Introduction

8

Neuroblastome

Instabilité

mitotique

Instabilité

génomique

2N

Cellule différencié

e

TYPE 1

Cellule apoptotiqu

e

TrkA

3N 3N

TYPE 2

TYPE 3

1p-,17q+,NMA

2N/4N

1p-, 17q+

2N/4NTrkB17q+

2N

11q-,14q-, 17q+

2N/4N

• 5 stades– 1 et 2 : localisé– 3 : envahissement des

ganglions lymphatiques– 4 : métastases à

distance– 4S : métastases, enfant

< 1 an

• 3 types (Brodeur et al., 1997)– Instabilité mitotique– Instabilité génomique

• 50 % des neuroblastomes : à haut risque– Amplification de N-MYC (NMA) : importance diagnostique

Introduction

9

N-MYC & TWIST1 :coopération oncogénique

• 30% des neuroblastomes : N-MYC Amplifiés

• Mutation de TP53 : < 5 % des neuroblastomes

Surexpression de

TWIST1

Tumeur

ApoptoseAmplification

de N-MYC p53fonctionnelle • Surexpression de TWIST1

corrélée à l’amplification de N-MYC

• TWIST1 : inhibiteur fonctionnel de la voie p53

Maestro et al., 1999; Valsesia-Wittmann et al., 2004

Introduction

10

MYC, TWIST & neuroblastome

• Neuroblastome–Anomalie du développement –Hétérogénéité biologique

• Implication de deux familles de gènes–MYC : N-MYC (Amplification) et c-MYC (Liu et al., 2008)–TWIST : TWIST1 et TWIST2

• « Double-jeu » des gènes du développement–Développement embryonnaire–Dérégulation = cancer

Introduction

11

Les gènes MYC

• Max• Myc

• INR

• Miz1

• Famille : c-MYC, N-MYC et L-MYC

• Facteurs de transcription à domaine bHLH-LZ

• Hétérodimérisation : Myc-Max

• Max• Myc• boite

E

• CBP/p300

• TIP60• TIP48/

TIP49 • TRRAP

• GCN5

Activation transcriptionnelle Répression transcriptionnelle

Grandori et al., 2000; Adhikary & Eiler, 2005; Cowling & Cole, 2006; Meyer & Penn, 2008

Introduction

12

Les gènes MYC

• Activation oncogénique : dualité fonctionnelleCoopération oncogénique

– BCL-2 : lymphomes (Strasser et al., 1990)

• Régulation de nombreuses fonctions (Vita & Henriksson et al., 2006)

Myc Myc

Dérégulation

Instabilité génomique

Prolifération

Angiogenèse

Apoptose

Croissance cellulaire

Transformation tumorale

Différenciation

Finley et al., 1989; Escot et al., 1993; Nau et al., 1985; Schwab et al., 1983

Introduction

• Nombreux cancers : colon, sein, poumon, neuroblastome…

13

Les gènes MYC et cellules souches

• c-MYC : formation des crêtes neurales (Steventon et al., 2005)

• c-MYC : autorenouvellement– cellules souches embryonnaires murines (Cartwright et al., 2005)

• c-MYC + OCT4 + SOX2 + KLF4 : dédifférenciation (1)– Cellule Souche Pluripotente induite (iPS)

Cellule SouchePluripotente induite

Cellule différenciée

c-MYC + OCT4 + SOX2 + KLF4

Reprogrammation

• N-MYC : prolifération et migration des neuroblastes (Wakamatsu et al., 1997)

1-Okita et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Wernig et al., 2007; Hanna et al., 2008

Introduction

14

Les gènes TWIST

• Facteurs de transcription

• Inhibiteurs– Différenciation– Apoptose– Sénescence oncogénique

• Chimiorésistance

• Nombreux cancers : sein, prostate, œsophage, gliomes…

BoiteTwist

Domaineriche en Glycine

Domaine de liaison à l’ADN bHLH

Twist2

Twist1

54% 95% 100%Homologie

Maestro et al., 1999; Ansieau et al., 2008; Watanabee et al., 2004; Kwok et al., 2005; Xie et al., 2009; Elias et al., 2005

Introduction

15

Les gènes TWIST et cellules souches

• TWIST1 : crête neurale (O’Rourke & Tam, 2002)

• TWIST2 : formation du derme (Sosic et al., 2003)

EMT

Marqueurs épithéliauxE-cadhérine

Caténine α, β, γ

Cancer in situ

Twist1Twist2

Marqueurs mésenchymaux

N-cadhérine, Fibronectine, Vimentine, Smooth muscle

actine

Cancer invasif

Introduction

• Transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) (Kang & Massagué, 2004; Ansieau et al., 2008)

16

Les gènes TWIST et cellules souches

• Cellules Souches Mésenchymales (MSC)+ TWIST1 ou TWIST2

Maintien des propriétés souches (Isenmann et al., 2009)

Introduction

Expression de Id1 et Id2

Transition éptihélio-mésenchymateuse

Croissance cellulaire et survie

Maintien phénotype immature

Twist1

Twist2

ou

Cellule SoucheMesenchymale

17

Dérégulation et interrelations des gènes MYC & TWIST dans le neuroblastome

Développement d’un modèle de progression tumorale à partir des gènes MYC & TWIST

QUELS SONT LES RÔLES DES GÈNES MYC & TWIST DANS LE

NEUROBLASTOME ?

18

RÉSULTATS

19

ÉTUDE DE LA DÉRÉGULATION DES GÈNES MYC ET TWIST DANS

LE NEUROBLASTOME

20

Dérégulation des gènes MYC & TWIST dans les tumeurs de neuroblastome

Corrélation N-MYC et TWIST1 dans les N-MYC amplifiées

Expression de TWIST1 et de c-MYC dans des tumeurs simple copie pour N-MYC

MYC & TWIST – Résultats

Collaboration avec le Dr MD HogartyTexas Children Hospital

RT-PCRquantitative

21

Dérégulation des gènes MYC & TWIST dans les tumeurs de neuroblastome

• 124 échantillons tumoraux

Stade 1 2 3 4 4S Total

n = 11 13 9 74 17 124

• Analyse de l’expression de N-MYC et TWIST1–RT-PCR quantitative

Corrélation entre N-MYC et TWIST1–Pearson = 0,807 ; p < 2,2x10-16– Indépendante du stade

Les gènes TWIST cibles des gènes MYC ? L’inverse ?

MYC & TWIST – Résultats

Collaboration avec le Dr J BénardInstitut Gustave Roussy

22

Les protéines Myc modulent l’expression des gènes TWIST

• Ornithine Décarboxylase (ODC) : cible directe des gènes MYC (Bello-Fernandez et al., 1993;Lutz et al., 1996)

Les protéines Myc modulent l’expression des gènes TWIST

MYC & TWIST – Résultats

RT-PCRquantitative

• Lignée simple copie : SHEP• Surexpression ectopique de c-MYC ou N-MYC : 1 ou 2 µg

24h

23

Les gènes TWIST :cibles de la protéine N-Myc

• Lignée simple copie : TET21N• N-MYC sous contrôle d’un promoteur « Tet OFF »

TWIST1 cible indirecte ? TWIST2 cible directe ?

MYC & TWIST – Résultats

RT-PCRquantitative

N-Myc

Twist1

Actine-β

T0 T2 T4 T6 T8 T20T22T24T26T28T30T32T48

Western Blot

24

Inhibition de l’expression de N-MYC• Lignée WAC : plasmide de surexpression de N-MYC (100x)• ARN interférence : siRNA N-MYC

N-MYC réprime l’expression de c-MYCc-MYC : maintien de l’expression de TWIST1

Zindy et al., 2006; Breit et al., 1989

MYC & TWIST – Résultats

RT-PCRquantitative

25

Étude du promoteur de TWIST1

-1950

E3

non consens

us

-1750 -525 +1

E2boite E

E1boite Eboite E

-93

boiteTATA

INR

TWIST1

• Analyse in silico du promoteur de TWIST1– Boite TATA– Élément INR : liaison de Miz1– Boites E : E1, E2, E3 et non consensusFixation des protéines à domaine bHLH : c-MYC, N-MYC…

Fixation des protéines Myc au promoteur de TWIST1 ?

MYC & TWIST – Résultats

26

Les protéines Myc se fixent sur le promoteur de TWIST1

Fixation des protéines Myc sur l’élément INR (indirecte ?) et sur la boite E1 (directe ?) du promoteur de TWIST1

E3 E2 E1INR

TWIST1

IGRN91 – sonde INR SHEP – sonde INR SK-N-SH – sonde E1

MYC & TWIST – Résultats

1 : contrôle amorces biotinylées seules2A : Amorces biotinylées + extrait protéique2B : 2A + Ac anti-N-Myc2C : 2A + Ac anti-c-Myc3 : 2A + excès amorces non biotinylées

27

Constructions pGL3

• Système reporteur pGL3 enhancer : test dual luciférase

• Fragments du promoteur de TWIST1• Cotransfection avec c-MYC ou N-MYC

PromoteurTWIST1

-1950

E3

-1750 -525

TWIST1

E2

boite E

E1

boite Eboite EINR

+1-93

nonconsensus

boiteTATA

2E-box E2 E1INR

luciférase

minimumluciféras

e

1E-boxS1E-boxAS

E3luciféras

e

MYC & TWIST – Résultats

28

Les protéines Myc activent le promoteur de TWIST1

• Mutation dirigée de la boite E3– 1E-boxS mutée et 1E-boxAS mutée

Activation de TWIST1 par les protéines Myc via les boites E

MYC & TWIST – Résultats

Tests luciférase effectués à 24h dans la lignée SHEP

minimum

1E-boxAS

vide

pODC

1E-boxAS mutée

1E-boxS mutée

2E-box

1E-boxS

29

Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des protéines Myc

• Corrélation d’expression dans le neuroblastome–N-MYC et TWIST1 : indépendante du stade–c-MYC et TWIST1 : dans certaines tumeurs Simple Copie

• Pas de corrélation dans les carcinomes : colon et sein–Tumeurs surexprimant TWIST expriment aussi c-MYC

• Les protéines Myc modulent l’expression des gènes TWIST–Différence entre TWIST1 et TWIST2–c-MYC : relais de N-MYC

MYC & TWIST – Conclusion

30

Les gènes TWIST : cibles transcriptionnelles des protéines Myc

• Fixation des protéines Myc sur le promoteur de TWIST1–Directe sur les boites E– Indirecte sur l’élément INR via Miz1

• Régulation par les protéines Myc–Activation par fixation des boites E–Répression via Miz1

TWIST1 et TWIST2 : cibles transcriptionnelles directes des protéines Myc

MYC & TWIST – Conclusion

31

DÉVELOPPEMENT D’UN MODÈLE DE PROGRESSION TUMORALE

• Les gènes MYC et TWIST sont-ils suffisants pour l’immortalisation et la transformation tumorale de cellules souches ou progénitrices ?

• Est-il possible de développer un modèle de progression tumorale à partir de telles cellules ?

32

• Neuroblastome : anomalie du développement• Pas de modèle d’étapes précoces

Comment définir les rôles exacts des gènes MYC et TWIST au cours du processus tumoral du neuroblastome ?

Modèle de progression tumorale

• Cycle cellulaire• Apoptose• Effets sur p53, p63 et p73• Réponse aux stress exogènes• Chimiorésistance

Cellules ADAS – Introduction

Cellules tumorales ?

c-MYC ou N-MYCet/ou

TWIST1 ou TWIST2

Cellules souchesou progénitrices

• Cellules « normales » : neuroblastes embryonnaires• Cellules souches neurales du système nerveux central

33

Modèle de progression tumorale à partir des cellules ADAS

• Cellules ADAS : cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux

– Cellules Souches Mésenchymales (MSC)– Autorenouvellement– Etat de quiescence

• Pluripotentes (Zangani et al., 1999; Zuk et al., 2002; Safford et al., 2002; Safford et al., 2004; Rodriguez et al., 2005)

– Adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales– Ostéoblastes, myoblastes, chondroblastes– Cellules de la glande mammaire – Lignages neuraux

• Liposuccions : opérations au Centre Léon Bérard

Développer un modèle de progression tumoral à partir des cellules ADAS et des gènes MYC & TWIST

Cellules ADAS – Introduction

Collaboration avec le Dr V Maguer-Satta et le Dr E DelayINSERM U590, Centre Léon Bérard

34

Objectifs

• Caractérisation phénotypique des cellules– Expression de marqueurs

• Détermination de la sensibilité/résistance aux traitements (Cisplatine, Etoposide et Vincristine)

• Dérégulation de l’expression des gènes MYC et TWIST

Cellules tumorales ?

c-MYC ou N-MYC et/ou TWIST1 ou TWIST2

Cellules ADAS

Cellules ADAS – Introduction

35

Extraction et mise en culture

Digestion 45min à 37°C sous agitationmilieu DMEMF12 + 2% BSA + 0,4 mg/mL de collagénase

Lyse des érythrocytes10min à température ambiante

Mise en culture des cellules en suspension

Lipides Tissu fibreux non digéréSurnageant

éliminé

Culot

Centrifugation 10min à 300g

Centrifugation 10min à 300g

J0 : jour extractionP0 : avant 1er passageP1 : après 1er passageP2 : après 2ème passage

Cellules ADAS – Introduction

36

Caractérisation phénotypique des cellules ADAS

Marqueur Moyenne J0

MoyenneP1

GPA 1,35 -

CD133 0 0

CD10 10,99 23,96

CD29 47,27 -

CD90 43,29 29,94

CD15 3,82 39

CD73 33,46 34,56

CD105 6,36 26,95

• J0 : cellules après extraction• P1 : après 1er passage

Présence de cellules ADAS dans les cellules extraites

Cellules ADAS – Résultats

GPA : érythrocytes

Cellules ADAS

Cellules SouchesMésenchymales

CD133 : Cellules souches

Cytométrie en flux

37

Caractérisation phénotypique des cellules ADAS

Composition des sphères change : différenciation ?

Cellules ADAS – Résultats

RT-PCRquantitative

– BMI1 : autorenouvellement– OCT4 & Nanog : pluripotence

– Nestine & PAX3 : cellules neurales– TWIST1 : cellules souches

Expression des marqueurs des cellules souches diminueInduction des marqueurs de l’engagement neural

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Différenciation neuraleprogramme par défaut

• Culture en 2D

Différenciation neurale = programme par défaut ?

Coloration au Giemsa culture 2D J15 Culture 3D

Cellules ADASSphères dissociées

Co-culture sur NIH3T3 irradiées

en absence de sérum

• Culture 3D : Matrigel

Cellules ADAS – Résultats

Prolongements de types « neurites »

39

Différenciation neurale des cellules ADAS

Cellules ADAS

Ensemencement sur des lamelles de verre coatées à la poly-L-

lysine

10 jours

DMEMF125% SVF

Marquage par Immunofluorescence

GFAPCytoplasmique

Astrocytes

O4Cytoplasmique

Oligodendrocytes

NeuNProtéine nucléolaireCellules nerveuses

Différenciation des cellules ADAS en cellules neurales

Cellules ADAS – Résultats

Collaboration avec le Dr A PrivatInstitut des Neurosciences

40

Chimiorésistance des cellules ADAS

• 24h de traitement : pas de diminution du taux de multiplicité

Chimiorésistance intrinsèque des cellules ADAS à P0

Cellules ADAS – Résultats

• P0 : cellules avant 1er passage• Taux de multiplicité par rapport à l’input

Tests uptiblue10 000 cellules / puits

Concentration mol/L

41

Perte de la chimiorésistance

• Après 2 passages : cellules ADAS sensibles aux drogues

Chimiosensibilité : cellules en cours de différenciation ?

Cellules ADAS – Résultats

• P2 : cellules après 2ème passage• Taux de multiplicité par rapport à l’input

Tests uptiblue10 000 cellules / puits

Concentration mol/L

42

Cellules ADAS

• Les prélèvements contiennent des cellules ADAS– Expression des marqueurs des cellules ADAS et MSC– Capables de se différencier

• Ces cellules sont chimiorésistantes à P0

• Electroporation des cellules ADAS possible

Cellules ADAS – Conclusion

Base pour le développement d’un modèle de progression tumorale

– Activation d’oncogènes– Inhibition de gènes suppresseurs de tumeurs

43

CONCLUSIONS& PERSPECTIVES

44

MYC & TWIST

Conclusions & Perspectives

• Régulation des gènes TWIST par les facteurs Myc : complexe– Identification de cofacteurs : Miz1…

– Boucles de rétrocontrôle TWIST vers MYC, TWIST1/TWIST2

– Étude du promoteur de TWIST2

• Cellules ADAS : surexpression des gènes MYC– induction des gènes TWIST ?

-1950

E3

non consens

us

-1750 -525 +1

E2boite E

E1boite Eboite E

-93

boiteTATA

INR

TWIST1

Twist1

Twist2

MaxMyc

Coactivateur

Corepressseur

Miz1

MaxMad

45

Cellule Souche Cancéreuse& Cellules ADAS

• Le modèle de progression tumorale à partir des ADAS

• Transformation d’ une cellule « souche » avec nos gènes d’intérêt : MYC et/ou TWIST

Théorie de la Cellule Souche Cancéreuse (CSC): Acquisition de propriétés oncogéniques ?

Maintien des propriétés souches des cellules ADAS ?

• Cellules tumorales

• Cellule souche normale

• Cellule SoucheCancéreuse

• Cellule différenciée

• mutations • dédifférenciation

Adaptée de Pardal et al., 2003

Conclusions & Perspectives

46

Modèle de progression tumorale à partir des cellules ADAS

• Les cellules ADAS P0 chimiorésistantes– ADAS + MYC et/ou TWIST

Maintien chimiorésistance ?

Régression

RechuteThérapieconventionnelle

Thérapie cibléecontre les CSC

Tumeur

Cellules ADAS : modèle pertinent pour la théorie de la CSC

Adaptée de Pardal et al., 2003

Conclusions & Perspectives

47

Les gènes MYC & TWIST dans les cellules ADAS

• Surexpression des gènes MYC, TWIST ou MYC & TWIST– Cycle cellulaire, apoptose et sénescence– Maintien de la chimiorésistance ?– Maintien des propriétés « souches » ?

Injectiondans des souris nude

Formation de tumeurs ?Localisation particulière ?

« Homing » ?

Clones en agar mouCulture en 2 Dimensions

Transformation ?Immortalisation ?

Cellules ADAS surexprimantc-MYC ou N-MYC

et/ouTWIST1 ou TWIST2

Conclusions & Perspectives

48

Les gènes TWISTnouvelles cibles thérapeutiques

• Rôle crucial des gènes TWIST dans la tumorigenèse– Induction de l’EMT– Inhibition des systèmes de sauvegarde cellulaire–Chimiorésistance–Dérégulation dans de nombreux cancers

• Thérapie anti-Twist : Cellule Souche Cancéreuse–Couplée avec thérapies conventionnelles

Nouvelles perspectives–Neuroblastome–Autres cancers exprimant les gènes TWIST : sein, foie,

prostate, gliomes…

Conclusions & Perspectives

49

Remerciements

L‘équipe : Dr S. WittmannV. BelinE. Garin

AC. JallasJ. Putelat

Les membres du JuryPr G. GilletPr F. BergerDr S. Douc-RasyDr S. Wittmann

Le comité de thèseDr M BillaudDr J Bénard

Nos collaborateursDr V. Maguer-Satte, CLBDr E. Delay, CLBDr A. Privat, INMDr MD. Hogarty, TCHDr J. Bénard, IGR

Dr L. BartholinDr S. AnsieauPr A. PuisieuxINSERM U590, Centre Léon Bérard Les « étudiants »

Ligue Nationale Contre Le Cancer

Merci !