Comparaison de trois m©thodes pour la d©tection de Mycoplasma et

Comparaison de trois méthodes pour la

détection de Mycoplasma et Ureaplasma

Par Bandolier Lara

Au Laboratoire FutureLab-BBR, Lausanne Ecole Supérieure de la Santé, Lausanne 2010 – 2011 Mentor : le laboratoire FutureLab-BBR, département de bactériologie

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Sommaire

Mycoplasma et Ureaplasma sont des procaryotes plus communément appelés mycoplasmes. Ce sont des bactéries dépourvues de paroi, ce qui les rend non colorables au Gram. Les mycoplasmes sont principalement à l'origine d'urétrites, de salpingites, mais sont aussi dangereux pour le fœtus car ils peuvent provoquer des méningites voire la mort du bébé. Les mécanismes pathologiques de ces organismes sont encore mal connus, c'est pour cela qu'il faut les détecter rapidement. Les mycoplasmes, grâce à la variation de la structure et de l'expression de leurs protéines de surface, peuvent s'adapter facilement à leur environnement. Il existe plusieurs genres de la famille des Mycoplasmataceae. Il y a les Mycoplasma pneumoniae, génitalium et hominis ainsi que les Ureaplasma urealyticum et parvum. Dans ce travail, nous allons nous intéresser à Mycoplasma hominis et Ureaplasma urealyticum. Le but de cette étude est de comparer trois méthodes pour la détection de Mycoplasma et Ureaplasma dans les frottis vaginaux et dans les urines. Ces méthodes sont :la culture, la PCR en temps réel et le kit Mycoplasma DUO.

Summary

Mycoplasma and Ureaplamsa are prokaryotes more commonly called mycoplasmas. They are bacteria without any cell wall, that’s the reason why they are not colorable by the Gram method. The mycoplasmas are coming from urethritis, salpingit, but are dangerous for the fetus too, because they can cause meningitids or death of the baby. The pathological mechanisms of these organisms are still poorly known, that’s why they must be detected quickly. The mycoplasmas, due to the change in structure and expression of their surface proteins, can easily be adapted to their environment. There exist several species in the family of Mycoplasmataceae. There are Mycoplasma pneumoniae, genitalium and hominis, Ureaplasma urealyticum and parvum too. In this work, we mainly focus on Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum. The purpose of this study is to compare three methods for the detection of Mycoplasma and Ureaplasma in vaginal smears and urine. These methods are: culture, real-time PCR and Mycoplasma Duo kit.

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Table des matières

1. Introduction ...................................................................................................................... 4

1.1 Mycoplasma hominis .................................................................................................... 4

1.1.1 Histoire ................................................................................................................ 4

1.1.2 Caractéristiques, morphologie ............................................................................. 4

1.1.3 Habitat et mode de transmission ......................................................................... 4

1.1.4 Pathogénicité ...................................................................................................... 4

1.1.5 Traitement et prophylaxie .................................................................................... 5

1.2 Ureaplasma .................................................................................................................. 5

1.2.1 Caractéristiques, morphologie ............................................................................. 5

1.2.2 Habitat et mode de transmission ......................................................................... 6

1.2.3 Pathogénicité ...................................................................................................... 6

1.2.4 Traitement et prophylaxie .................................................................................... 6

2. Objectif de l’étude ............................................................................................................ 6

3. Matériels ........................................................................................................................... 7

4. Méthodes .......................................................................................................................... 7

4.1 Culture .......................................................................................................................... 7

4.1.1 Généralité ........................................................................................................... 7

4.1.2 Matériels ............................................................................................................. 7

4.1.3 Préparation des échantillons ............................................................................... 7

4.1.4 Interprétation des résultats .................................................................................. 8

4.2 PCR en temps réel ....................................................................................................... 8

4.2.1 Généralité ........................................................................................................... 8

4.2.2 Extraction de l’ADN ............................................................................................. 9

4.2.3 Matériel ............................................................................................................. 10

4.2.4 Protocole ........................................................................................................... 10

4.2.5 Etape de la PCR ............................................................................................... 11

4.2.6 Matériel ............................................................................................................. 12

4.2.7 Protocole ........................................................................................................... 13

4.2.8 Préparation des échantillons ............................................................................. 13

4.2.9 Interprétation des résultats ................................................................................ 14

4.3 Culture ........................................................................................................................ 16

4.3.1 Généralité ......................................................................................................... 16

4.3.2 Principe ............................................................................................................. 16

4.3.3 Matériel ............................................................................................................. 17

4.3.4 Préparation des échantillons ............................................................................. 17

4.3.5 Protocole ........................................................................................................... 17

4.3.6 Interprétation des résultats ................................................................................ 17

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5. Résultats ......................................................................................................................... 18

5.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 18

5.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 19

6. Analyses des résultats ................................................................................................... 20

6.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 20

6.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 21

7. Problèmes rencontrés .................................................................................................. 21

7.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 21

7.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 21

8. Sensibilité / spécificité ................................................................................................... 22

8.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 22

8.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 23

9. Durée des analyses........................................................................................................ 23

9.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 23

9.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 23

10. Coût des analyses........................................................................................................ 23

11. Synthèse et conclusion ............................................................................................... 24

12. Bibliographie ................................................................................................................ 25

13. Lexique ......................................................................................................................... 27

14. Remerciements ............................................................................................................ 28

15. Annexes ........................................................................................................................ 29

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1. Introduction

1.1 MYCOPLASMA HOMINIS

1.1.1Histoire Microorganisme ubiquitaire, il a été découvert suite à un abcès de la glande de Bartholin en 1937 par Diènes et Edsall. Depuis, près de 15 espèces de mycoplasmes ont été isolées principalement du tractus respiratoire et génital. 1-2-4

1.1.2 Caractéristiques, morphologie Classe : Mollicutes Ordre : Mycoplasmatales Famille : Mycoplasmataceae Genre : Mycoplasma Les mycoplasmes sont les plus petits organismes ayant une croissance extracellulaire. C'est une bactérie en forme de cocci de 0.2 à 0.3 µm de diamètre, non colorable par le Gram suite à l'absence de paroi cellulaire. Ils possèdent de l’arginine déshydrogénase. Cette bactérie pousse sur gélose à 48h en micro-aérobiose, mais pousse très bien en anaérobiose. Sous le microscope binoculaire, nous pouvons les identifier par leur forme en « œufs au plat ». 1-2-4

1.1.3 Habitat et mode de transmission Espèces prédominantes retrouvées dans le tractus uro-génital. Ils se trouvent aussi à la surface des muqueuses du tractus respiratoire, des yeux, des glandes mammaires et des articulations. Le mode de transmission est sexuel. Il existe aussi une transmission de la mère à l'enfant lors de l'accouchement par voie basse. 1-2-4

1.1.4 Pathogénicité Il existe plus de 100 espèces de Mycoplasma dont 3 sont pathogènes pour l'homme : Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis provoque des pyélonéphrites, des vaginoses, des endométrites et des salpingites. Peut, aussi, être la cause de stérilité chez l'homme. Pathologie de la grossesse : Durant la grossesse, les mycoplasmes peuvent coloniser l'endomètre et, par voie ascendante, les membranes fœtales, liquide amniotique et tissus fœtaux. Ils sont aussi responsables de poussées fébriles post-partum et post-abortum(A).

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Infections néonatales : Les mycoplasmes peuvent provoquer des méningites, surtout chez les prématurés ayant une infection respiratoire et des états septicémiques. Les mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans les infections à M.hominis sont mal connus. Trois types de phénomènes jouent probablement un rôle : des propriétés d’adhésion, l’existence de variations antigéniques et la production d’enzymes et de métabolites toxiques. C’est ainsi que des phénomènes d’adhésion ont été décrits chez M.hominis. Les variations de l’expression et de la structure des protéines de surface jouent un rôle important dans l’adaptation des mycoplasmes à leur environnement. 1-2-4

1.1.5 Traitement et prophylaxie Par leur absence de paroi, les Mycoplasmes sont insensibles aux antibiotiques qui agissent sur la synthèse des peptoglycanes comme : les bêtalactamines, glycopeptides...Ils résistent également aux polymyxines, sulfamides, triméthoprimes, acide nalidixique et à la rifampicine. M. hominis est sensible aux lincosamides mais présente une résistance naturelle à certains macrolides (Erythromycine) et dérivés. Les antibiotiques qui peuvent être actifs font partie de la famille des fluoroquinolones (Norfloxacin, Ciprofloxacin) ou des aminosides (Gentamicin, Streptomicin). Le meilleur moyen d'éviter des infections à mycoplasmes est de se protéger lors de relations sexuelles. 1-2-4

Image 1 : Mycoplasma Image 2 : Mycoplasma, Microscope binoculaire

1.2 UREAPLASMA

1.2.1 Caractéristiques, morphologie Classe : Mollicutes Ordre : Mycoplasmatales Famille : Mycoplasmataceae Genre : Ureaplasma Bactérie pléomorphique(B) se présentant sous forme coccoïde, filamenteuse ou multinuclée, d'un diamètre de 0.3 à 0.8 µm. Les uréaplasmes sont dépourvus de paroi mais sont liés par une membrane trilamellaire(C). Ils produisent de l'uréase et sont immobiles. Tout comme les Mycoplasma, leur atmosphère est en micro-aérobiose sur gélose à Mycoplasmes. Sous le microscope binoculaire, nous pouvons les différencier par leur forme « d'oursin ». 1-4

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1.2.2 Habitat et mode de transmission

Nous pouvons isoler les Uréaplasma dans l'appareil uro-génital et rhino-pharynx. C'est une bactérie responsable de maladies sexuellement transmissibles, mais elle peut aussi se transmettre de la mère à l'enfant par accouchement naturel, tout comme les Mycoplasma.1-4

1.2.3 Pathogénicité Il existe 7 espèces d'Ureaplasma dont 2 sont pathogènes pour l'homme : Ureaplasma urealyticum Ureaplasma parvum Le pouvoir pathogène d'Ureaplasma est peu connu, mais c'est la principale cause d'urétrites non gonococciques. Il peut causer une chorioamnionite(D) et une insuffisance pondérale à la naissance. Il a été associé à la pyélonéphrite, au syndrome de Reiter(E), à la pneumonie congénitale et à l'urétrocystite chronique chez les sujets immunodéprimés, habituellement asymptomatiques. 1-4

1.2.4 Traitement et prophylaxie

Ayant la même caractéristique morphologique que les Mycoplasma, les Ureaplasma sont naturellement résistants aux Bêta-lactamines ainsi qu'à tous les antibiotiques qui agissent sur la paroi cellulaire des bactéries. Ils sont sensibles à la tétracycline et aux quinolones.1-4

La seule prévention connue de nos jours est l'utilisation du préservatif.

Photo 3 : Mycoplasma hominis contre Ureaplasma

2. Objectif de l'étude

Au laboratoire de bactériologie FutureLab, nous détectons les Mycoplasma et les Ureaplasma par isolement sur gélose sélective contenant un milieu nutritif et des antibiotiques inhibant la croissance de certaines autres bactéries et levures. Malheureusement, il est possible d'avoir des faux négatifs si l'ensemencement est mal effectué. Le but de cette étude est de comparer trois méthodes : PCR en temps réel Culture sur gélose A7 MYCO Kit Mycoplasma DUO (pour urine et sperme)

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Ceci nous permettra de confirmer ou d'infirmer la qualité de la méthode utilisée actuellement. La spécificité, la sensibilité, la durée et le coût des analyses seront comparés tout au long de ce travail. Pour ce faire, nous avons choisi de travailler avec 25 échantillons pour Mycoplasma et 30 échantillons pour Ureaplasma. Parmi ces échantillons, il y a des urines natives et des frottis vaginaux.

3. Matériels

1. Echantillons provenant de FutureLab. Utilisés directement pour la mise en culture ainsi que pour l’utilisation du Kit Mycoplasma DUO. Congelés dans une solution de conservation avant l’utilisation pour la PCR en temps.

2. Plaques Myco A7 pour la mise en culture. Fabriquant : Biomérieux. N°lot : 1000166580. Date d’expiration : 30.03.2011. La composition sera décrite ci-dessous.

3. Kit et appareil pour l’extraction d’ADN, ainsi que le kit et l’automate pour

l’amplification des échantillons. Pour Uréaplasme : Fabriquant : E.coli s.r.o Studenohorsda. N°lot : 26.09.10 Date d’expiration : 16.03.2011. Pour Mycoplasme : Fabriquant : E.coli s.r.o Studenohorsda. N°lot : 20.11.10. Date d’expiration : 08.09.2011.

4. Kit Mycoplasma DUO qui sera décrit au point 4.3. Fabriquant : BIORAD. N°lot : 0J3192. Date d’expiration : 15.08.2011

4. Méthodes

4.1 CULTURE

4.1.1 Généralité La culture se fait sur Gélose A7 Mycoplasma. C'est une gélose sélective qui a une base nutritive contenant des peptones, du sérum de cheval et des facteurs de croissance qui favorisent le développement des mycoplasmes (Cystéine, PolyVite X, Arginine, Urée). Elle possède aussi des antibiotiques qui inhibent la croissance des bactéries Gram+ et Gram-, ainsi que certaines levures. 7

4.1.2 Matériels

Gélose A7 Mycoplasma mise à température ambiante Ecouvillons Etuve anaérobie Echantillons 7

4.1.3 Préparation des échantillons

Pour les urines, il faut mélanger les vacutainers ou l'urine mi-jet, ensuite imbiber l'écouvillon et ensemencer la gélose en passant dans trois sens différents. Mettre la gélose en anaérobiose à 37 °C pendant 48h.

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Pour les frottis vaginaux, il faut séparer la gélose en deux parties, ensemencer une moitié directement avec l'écouvillon dans trois sens différents. Mettre la plaque en anaérobiose à 37°C pendant 48h.7

4.1.4 Interprétation des résultats Lire les plaques sous microscope binoculaire en prenant soin de regarder chaque champs. Attention : ne pas confondre avec des levures ou des Bacilles négatifs. 1 chaque 2 champs : + 1-2 par champs : ++ 3-5 par champs : +++ >5 par champs : ++++ Totalité des champs pour les frottis vaginaux : 15 champs Totalité des champs pour les urines : 30 champs.

4.2 PCR EN TEMPS RÉEL

4.2.1 Généralité La PCR en temps réel est une méthode rapide de biologie moléculaire pour obtenir une quantité suffisante d'ADN grâce à l'amplification spécifique d'une séquence d'ADN in vitro. Cette méthode permet de détecter et/ou de quantifier le matériel recherché. Grâce à la RT-PCR, nous pouvons voir la réaction de façon exponentielle. Le CT (ou Cycle Treshold) est calculé par le logiciel et, est inversement proportionnel à la quantité initiale de copies. L’appareil de PCR en temps réel est muni d’un couvercle contenant un système optique, permettant l'émission de lumière bleue et la réception de la lumière émise en retour (verte à rouge) par les produits fluorescents, vers une caméra CCD (Charge-Coupled Device). Le signal émis est ainsi mesuré et enregistré par un système informatique.3

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Image 4 : Photo du fonctionnement de l’appareil à PCR

Photo 5 : Agrandissement du système du rotor pour la PCR en temps réel

Il faut savoir, que l'échantillon est traité avant d'être utilisé pour la PCR temps réel. En effet, chaque prélèvement biologique doit subir une extraction d'ADN ou d'ARN.

4.2.2 Extraction de l'ADN Pour l'extraction d'ADN nous avons utilisé l'automate EZ1 BioRobot de QIAGEN. La technique des particules magnétiques donne à l'ADN une haute qualité. Elle est utile pour une utilisation directe d'amplification ou autre application enzymatique. Le rendement dépend de la souche de bactéries, de la densité, du volume d'échantillon et du volume d'élution. L'extraction dure 15 minutes. Le tampon ainsi que la protéinase K vont permettre de détruire la structure de l'ADN afin d'éliminer les protéines et de libérer les acides nucléiques. Quand cette étape est terminée, les acides nucléiques sont capturés pas les particules magnétiques qui vont être lavées à plusieurs reprises. Lors de l'élution, l'éluât se détache des billes et celles-ci sont capturées par un système d'aimantation qui les retient.3

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Photo 6 : Extraction d’ADN manuelle contre automatique

4.2.3 Matériel : Automate EZ1 BioRobot QIAGEN Tampon G2 Protéinase K Echantillons Contrôles + et - Standard interne 5

Photo 7 : Automate Extracteur d’ADN

4.2.4 Protocole : Pour commencer : Pour les frottis vaginaux Mettre 90 µl de Tampon G2 Ajouter 10 µl de Protéinase K 200 µl d'échantillon + 10 µ de standard interne

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Pour l'urine, il faut commencer par centrifuger 5 min à 3000 rpm. Ajouter 200 µl de Tampon G2 dilué 1/10 10 µl de Protéinase K Ensuite : Faire chauffer 15 min à 56 °C Pour finir : Insérer la carte EZ1 DNA Bacteria dans l'automate. Appuyer sur START Choisir le programme avec 50 µl de volume d'élution Presser sur next jusqu'à ce que l'appareil démarre. 5

4.2.5 Etape de la PCR Pour la PCR en temps réel, nous avons utilisé le Rotor-Gene 3000. Il permet la détection et la quantification de microorganismes pathogènes au moyen de sondes marquées par la fluorescence. Cet appareil utilise le « hot Start » afin de réduire les réactions aspécifiques et d'assurer une sensibilité maximale.3

Pour commencer, il y a la dénaturation à 95°C. Cela favorise la séparation des brins d'ADN afin d'obtenir un ADN simple brin.3

Ensuite, il y a l'hybridation à 45°C-65°C. Cette étape permet aux amorces de s'hybrider au brin d'ADN cible afin de servir de point de départ pour la polymérisation du brin d'ADN.3

Pour finir, vient l'étape de l'élongation à 72°C. L'ADN polymérase va polymériser le brin par ajout successif de désoxyribonucléotides libres par complémentarité : A-T, C-G dans le sens 5'---3'. 3

C'est à ce moment que nous pourrons voir s'il y a le pathogène recherché par fluorescence. En effet, lors du passage de la polymérase, celle-ci vient détacher la sonde présente (si le pathogène est présent) car elle possède une activité exonucléasique en 5'. Le fluorochrome émetteur (Reporter) va se détacher du fluorochrome suppresseur (Quencher) ce qui va donner une fluorescence.3

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Photo 8 : Sonde TaqMan

4.2.6 Matériel : Rotor-Gene 3000 Premier Mix contenant les amorces et la sonde Deuxième Mix contenant la polymérase, un tampon et les désoxyribonucléotides Les échantillons Les contrôles Malheureusement, nous n'avons aucun détail sur le contenu des Mix ni sur les séquences des amorces et de la sonde.6

Photo 9 : Rotor-Gene 3000

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4.2.7 Protocole

Mettre dans le premier Mix 10 µl du second (contenant la polymérase, le tampon et les désoxyribonucléotides) Ajouter 10 µl d'échantillon ou de contrôle. Le volume final est de 40 µl. Mettre les tubes dans l'appareil. Ouvrir le programme selon besoin : Pour Ureaplasma :

Hold : 95°C pendant 5 min Cycling : 95 °C pendant 20 secondes 65 °C pendant 20 secondes 72 °C pendant 20 secondes

10 cycles Cycling 2 : 95 °C pendant 20 secondes 60 °C pendant 30 secondes 72°C pendant 30 secondes Avec acquisition FAM/Green, JOE/Yellow 35 cycles Pour Mycoplasama :

Hold : 95°C pendant 15 min Cycling : 95 °C pendant 5 secondes 65 °C pendant 20 secondes 72 °C pendant 15 secondes

5 cycles Cycling 2 : 95 °C pendant 5 secondes 60 °C pendant 20 secondes 72°C pendant 15 secondes Avec acquisition FAM/Green, JOE/Yellow 40 cycles Presser OK pour que le programme commence. A ce moment là, identifier les échantillons.6

4.2.8 Préparation des échantillons

Pour les frottis vaginaux, casser l'écouvillon dans une solution de conservation (UTM-RT MINI transport medium pour Virus, Chlamydia, Mycoplasma et Ureaplasma). Le matériel sera plus stable s’il y a besoin de le congeler.

Pour les urines, on les utilise à l'état natif.

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4.2.9 Interprétation des résultats

Cycling FAM

Nous pouvons voir que les contrôles positifs ont émis de la fluorescence, ce qui signifie que ces échantillons possèdent de l'ADN de la bactérie recherchée.

Cycling JOE

Nous pouvons constater qu'un signal pour les contrôles positifs a été émis, donc il y a aussi de l'ADN bactérien.

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Cycling Cy5

Les contrôles positifs émettent aussi un signal dans ce Cycling. L'ADN bactérien recherché est donc reconnu par la sonde.

Si les échantillons ne donnent aucun signal dans ces Cycling cela veut dire qu'ils ne possèdent pas l'ADN recherché. Pour pouvoir valider la négativité de ces derniers, il faut que l’échantillon positif soit détecté dans FAM. JOE et Cy5 et que le contrôle négatif ne soit pas détecté. Limite de détection de la PCR a été calculée avec différente concentrations :

Concentration (copies/µl) CT Concentration calculée (copies/ µl)

1 1000 19.90 1403.89

2 500 51.46 349.82

3 50 23.88 40.16

4 100 22.77 108.49

5 10 25.26 1.68

6 5 ---------- -----------------------------------------------------

Nous pouvons voir que la détection est faite jusqu’à 10 copies pas µl. En dessous de cette concentration, il faudrait concentrer l’échantillon pour qu’il soit détecté.

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4.3 KIT MYCOPLASMA DUO

4.3.1 Généralité

En raison de l’état commensal ou pathogène des Mycoplasma et Ureaplasma, l’interprétation de leur isolement à partir de prélèvements urogénitaux chez l’adulte doit tenir compte de critères quantitatifs. La notion de traitement dépend du titre et du contexte clinique.7

Photo 10 : Kit Mycoplasma Duo

4.3.2 Principe La cupule X (au milieu en haut) contient un antifongique et un mélange d’antibiotique, d’où sa sélectivité. Elle sert à l’enrichissement sélectif du prélèvement en mycoplasmes, en vue d’une préparation d’inoculum standardisé pour un antibiogramme. L’identification et le titrage des mycoplasmes sont basés sur l’utilisation de leurs propriétés métaboliques (cupules U et U≥104 pour Ureaplasma, cupules H et H ≥104 pour Mycoplasma) :7

Hydrolyse de l’urée par Ureaplasma urealiticum Hydrolyse de l’arginine par Mycoplasma hominis avec libération d’ammoniaque et alcalinisation du milieu. La réaction est visualisée par le virage du jaune au rouge de l’indicateur de pH (rouge de phénol) :7

Cupule jaune : absence de mycoplasmes Cupule rouge : présence de mycoplasmes.7

Le titrage repose sur le principe des dilutions en milieu liquide : Dans la cupule D (au milieu en bas) : dilution 10-1

Dans la cupule U ≥104 (cupule pour uréaplasmes) : dilution 10-2

Dans la cupule H ≥104 (cupule pour mycoplasmes) : dilution 10-2

Nous considérons que toute cupule ayant virée au rouge contient au moins 1 UCC (unité changeant de couleur).7

Chaque cupule contient : Des substrats déshydratés pour l’identification Des facteurs de croissance des mycoplasmes Des inhibiteurs de croissance de la flore polymorphe associée.7

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4.3.3 Matériel

Kit Mycoplasma DUO Etuve à 37 °C Echantillons

4.3.4 Préparation des échantillons Centrifuger les urines 5 min à 1500 rpm7

4.3.5 Protocole Avec la bouteille compte gouttes, distribuer 4 gouttes dans les 3 cupules du bas : U ≥104, D, H ≥104.7

Mettre le culot d’urine dans le milieu de suspension et distribuer à l’aide d’une micropipette 4 gouttes dans les cupules du haut : U, X, H, et une goutte dans la cupule D.7

Avec une autre micropipette, bien homogénéiser le contenu de la cupule D et distribuer respectivement 1 goutte dans la cupule U ≥104 et H ≥104.7

Recouvrir la microplaque avec un film adhésif. Incuber 24h à 37 °C, puis prolonger de 24h si nécessaire.7

4.3.6 Interprétation des résultats La première lecture après 24h est définitive dans le cas des titres forts. La deuxième lecture à 48h permet de confirmer les négatifs, de révéler les titres faibles ou de révéler les souches à titre fort avec un métabolisme lent.7

Négatif : Absence de changement de couleur Positif à Ureaplasma : Virage de(s) cupule(s) U uniquement Positif à Mycoplasma : Virage de(s) cupule(s) H uniquement Positif aux deux : Virage de(s) cupule(s) U et H.

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5. Résultats

5.1 UREAPLASMA

Echantillons Culture PCR en temps réel Kit Mycoplasma DUO

1 Frottis vaginal Négative Négative -------------------------


3 Frottis vaginal Ureaplasma + <103 Négative -------------------------


5 Urines Ureaplasma + <103 Faiblement positive 48 copies

Ureaplasma >104

Mycoplasma <103




9 Urines Négative Négative Négative

10 Frottis vaginal Ureaplasma +++ >104 Faiblement positive 450 copies

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12 Frottis vaginal Ureaplasma + <103 Négative -------------------------

13 Frottis vaginal Ureaplasma ++++ >104 Positive 53480 copies -------------------------





18 Frottis vaginal Ureaplasma +++ >104 Positive 7038 copies -------------------------




22 Frottis vaginal Ureaplasma ++ <103 Positive 74408 copies -------------------------


24 Frottis vaginal Ureaplasma + <103 Positive 22 copies -------------------------


26 Urines Négative Faiblement positive 369 copies

Ureaplasma <103

Mycoplasma <103




Ureaplasma >104


Ureaplasma <103

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Nous pouvons remarquer, comme cité ci-dessus, que la culture d'Uréaplasma nous donne 15 échantillons négatifs et 15 échantillons positifs. La PCR en temps réel nous donne 16 échantillons négatifs pour 14 positifs. Il est dur d'interpréter les résultats du Kit Mycoplasma DUO car, malheureusement, je n'ai pas trouvé assez d'échantillons d'urine positifs pour Uréaplasma. Je l'ai tout de même inclus dans les analyses.

5.2 MYCOPLASMA

Echantillons Culture PCR en temps réel

Kit Mycoplasma DUO

1 Frottis vaginal Négative Négative ------------------------


3 Frottis vaginal Mycoplasma ++++ >104

Positive 15346 copies

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6 Frottis vaginal Négative Faiblement positive 34

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Pour la mise en culture, nous obtenons 10 échantillons positifs et 15 échantillons négatifs. Pour la PCR en temps réel, nous obtenons les mêmes résultats.

6. ANALYSE DES RÉSULTATS

6.1 UREAPLASMA

Pour mener à bien cette étude, j'ai utilisé 15 échantillons négatifs et 15 échantillons positifs pour Ureaplasma. Afin d'obtenir cette quantité, j'ai pris comme méthode de base la mise en culture des échantillons car nous pouvons dire avec certitude qu'il n'y a pas de cultures faussement positives puisque nous voyons quelles bactéries poussent sur la gélose. Pour les échantillons N°3 et N°12, nous pouvons constater que les échantillons sortent positifs pour la culture d’Ureaplasma alors qu’en RT-PCR, ils sortent négatifs. Ces résultats peuvent s’expliquer par leur très faible concentration, ce qui nous donne des faux négatifs. Pour l’échantillon N°5, il y a une cohérence avec la RT-PCR alors que le Kit Mycoplasma DUO nous donne une concentration d’Ureaplasma trop élevée et une positivité pour Mycoplasma alors que l’échantillon est négatif. Il est vrai que cet échantillon était mal ensemencé ce qui pourrait expliquer le faux négatif pour les mycoplasmes. Pour l’échantillon N°10, la culture ne correspond pas à la PCR. En effet, la première nous donne une positivité forte contre une faible positivité. Cela peut s’expliquer pas une inhibition de l’échantillon vu sa quantité. Pour l’échantillon N°26, la culture nous donne un négatif alors que la PCR et le Kit nous donnent faiblement positif pour Ureaplasma. Nous rencontrons à nouveau un faux négatif car la gélose n’avait pas été ensemencée dans les trois sens comme prévu. De plus, le kit nous donne une positivité pour Mycoplasma. Pour l’échantillon N°29, la positivité est cohérente dans la culture et le Kit mais la concentration ne l’est pas. Nous pouvons déjà constater que les résultats ne sont pas concordants. En effet, certains cas devraient être positifs alors qu'en PCR ils ne sont pas détectes et vice versa pour les échantillons négatifs.

Malgré ce fait, nous voyons que les résultats pour Mycoplasma DUO ne sont pas satisfaisants car tout échantillon faiblement positif, donc inférieur à 103, révèle une positivité supérieure à 104.

21

6.2 MYCOPLASMA Pour la comparaison des 3 méthodes concernant Mycoplasma hominis, j'ai choisi 15 échantillons négatifs et 10 échantillons positifs. Comme pour Ureaplamsa, la méthode de référence est la culture sur gélose Myco A7. Nous constatons, que les résultats de la PCR en temps réel sont en totale corrélation avec ceux obtenus par la culture bactérienne. En effet, les 10 échantillons fortement positifs émettent un fort signal dans la méthode de la PCR. Par contre, aucun échantillon n'a pu être testé par le Kit Mycoplasma DUO car tous les échantillons obtenus étaient des frottis vaginaux alors que cette méthode requiert des urines natives.

7. PROBLÈMES RENCONTRÉS

7.1 POUR UREAPLASMA

D’après ces résultats, nous remarquons, pour les urines, que le Kit Mycoplasma DUO et la culture ne correspondent pas. En effet la concentration du kit est toujours plus élevée que le résultat de la gélose. Cela est dû au fait de l’alcalinisation du milieu car il est possible d’y avoir des faux positifs si leur pH est alcalin. De plus, la PCR nous réconforte dans le résultat de la culture. Pour la culture, le seul problème que nous avons rencontré concerne l’ensemencement. En effet, si la gélose est mal ensemencée, il se peut qu’il y ait des faux négatifs. Pour y remédier, il faut l’ensemencer avec un écouvillon bien humide et dans trois sens de la gélose.

La difficulté pour la PCR en temps réel est d'interpréter les résultats faussement positifs ou faussement négatifs. En effet par manque de temps, je n'ai pas pu concentrer les cas faussement négatifs, ni rechercher la cause des cas faussement positifs.

7.2 POUR MYCOPLASMA

Le seul grand problème rencontré durant cette comparaison est le manque d'échantillons. En effet, j'étais sensée obtenir 15 échantillons positifs pour Mycoplasma et malheureusement, je n'en avais que 10. De plus, il m'a été impossible de trouver des urines positives pour Mycoplasma. Il est vrai que les infections causées par les mycoplasmes ne sont pas fréquentes.

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8. Sensibilité / spécificité

Il est impératif, lorsqu'on compare des méthodes, d'évaluer la validité intrinsèque. Pour cela, il faut mesurer la sensibilité ainsi que la spécificité de chaque méthode. Afin d'y parvenir, j'ai utilisé une méthode de référence qui nous permet de savoir si le patient est porteur des germes recherchés ou non et si les autres tests peuvent aussi y parvenir. La sensibilité d'un test est la probabilité que la maladie soit présente lorsque le test est positif. De ce fait, nous tenons compte des faux négatifs et est mesurée chez les personnes malades uniquement

La spécificité d'un test est la probabilité que la maladie ne soit pas présente lorsque le test est négatif. De ce fait, nous tenons compte des faux positifs et est mesurée chez les personnes saines uniquement. Il faut savoir que la précision des valeurs de spécificité et de sensibilité est dépendante du nombre d'échantillons testés. En effet, plus il y a de patients évalués, plus la précision des nombres sera exacte, donc proche de la réalité. Il faut également prendre en compte la prévalence de la maladie. En effet, plus cette dernière est fréquente, plus la sensibilité sera élevée contrairement à la spécificité.

Le seuil d'un test, c'est-à-dire la valeur à partir de laquelle en décide que le test devient positif, influence la sensibilité et la spécificité. Ainsi, si on abaisse ce seuil, le test sera plus sensible mais moins spécifique. La valeur de ce seuil dépend surtout de ce que l'on recherche. Les tests très sensibles permettent surtout de s'assurer qu'une maladie n'est pas présente tandis qu'un test très spécifique nous assure que la maladie est bien présente.

8.1 POUR UREAPLASMA

Comme expliqué précédemment, la méthode de référence utilisée est celle de la mise en culture. De ce fait, la sensibilité et la spécificité vont être calculées à partir des résultats obtenus dans cette dernière. J'ai choisi cette méthode car, pour autant que la gélose soit bien ensemencée, nous pouvons être certains de la positivité de l'échantillon car nous voyons au microscope binoculaire les germes recherchés.

Sensibilité / spécificité de la PCR en temps réel :

PCR positive PCR négative

Culture positive 13 2

Culture négative 1 14

Sensibilité : Vrai positifs / (vrai positifs+faux négatifs) x 100 13 / (13+1) x 100 = 92,8 %

Spécificité : Vrai négatifs / (vrai négatifs + faux positifs) x 100

14 / (14 + 2) x 100 = 87,5 %

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Nous pouvons constater que la PCR en temps réel a une bonne sensibilité ainsi qu'une bonne spécificité. Comme expliqué auparavant, je ne vais pas tester la sensibilité et la spécificité pour le Kit Mycoplasma DUO car il est évident que je n'ai pas du tout assez d'échantillons.

8.2 POUR MYCOPLASMA

Comme pour Ureaplasma, la méthode de référence est celle de la culture. De plus, le Kit Mycoplasma DUO ne sera pas pris en compte car aucun n'échantillon n'a été trouvé pour le tester.

Sensibilité / spécificité de la PCR en temps réel

PCR positive PCR négative

Culture positive 10 0

Culture négative 0 15

Sensibilité : Vrai positifs / (vrai positifs+faux négatifs) x 100 10 / (10+0) x 100 = 100 %

Spécificité : Vrai négatifs / (vrai négatifs + faux positifs) x 100

15 / (15 + 0) x 100 = 100 %

D'après ces résultats, nous avons une sensibilité et une spécificité de 100 %. Avec la petite quantité d'échantillons, j'estime que ce nombre n'est pas significatif.

9. Durée des analyses

La mise en culture se fait l'après-midi lors de l'ensemencement et la plaque Myco A7 est incubée 48h en anaérobiose.

La PCR en temps réel dure environ 3h entre la préparation des échantillons et l'analyse de l'automate.

10. Coût des analyses

La gélose Myco A7 pour la culture revient à 36.70 pour un paquet de 10 plaques, donc pour un patient le montant s’élève à 3.65.

La PCR en temps réel nous revient à 610.- pour 110 réactions donc pour un patient, le montant s’élève à 5.55. Cela comprend tous les réactifs utilisés, un contrôle négatif, un contrôle positif ainsi qu'un standard interne.

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11. Synthèse et conclusion

Tout au long de ce travail, nous avons constaté que les Mycolpasma et les Ureaplasma ne sont pas très connus quant à leur pouvoir pathogène. Il est vrai qu'ils ont une facilité d'adaptation dans l'environnement grâce à l'expression et la structure de leurs protéines de surface. Ils sont probablement la cause de plusieurs maladies infectieuses qui ont une certaine gravité, c'est pourquoi il faut les détecter assez vite pour pouvoir traiter les personnes touchées.

Au laboratoire FutureLab-BBR à Lausanne la méthode choisie pour la détection de mycoplasmes est la culture bactérienne, c'est pourquoi elle a été utilisée comme méthode de référence.

Mon travail a eu pour but d'évaluer trois méthodes telles que la PCR en temps réel, un Kit commercialisé pour les mycoplasmes présents dans les urines et le sperme et la culture sur gélose utilisée actuellement, ceci afin d'évaluer si cette dernière était la meilleure méthode de détection. Pour ce faire, j'ai basé ma comparaison sur la sensibilité et la spécificité de l'analyse, la durée et le coût.

La PCR en temps réel a une bonne sensibilité ainsi qu'une bonne spécificité, la durée de l'analyse est d'environ 3 heures, ce qui est moins que la mise en culture qui, elle, est de 48heures. Par contre le coût de la PCR en temps réel est plus élevé que cette dernière. Quant au kit, il m'est impossible de conclure car je n'avais pas assez d'échantillons pour que les calculs soient exploitables. En conclusion, malgré la durée de l'analyse, j'estime que la culture de mycoplasmes est meilleure que la PCR en temps réel car nous pouvons avec certitude éliminer les faux positifs puisque nous avons la possibilité de voir ce qui se passe sur la gélose. D'un point de vue personnel, la réalisation de ce mémoire a été très intéressante. En effet, je ne connaissais pas beaucoup les mycoplasmes et cela m'a aidé à y voir plus clair. La pratique a été longue est difficile à cause du manque d'échantillons, car les infections causées par Ureaplasma ou Mycoplasma ne sont pas courantes.

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12. Bibliographie

Sites internet

1) Introduction : Djigma Wendkuuni Florencia (30/06/2009), Université de Ouagadougou Site : http://www.cerbafaso.org/textes/DEA_Tese/Memoire_DEA_Flo.pdf (consulté le 03/12/2010)

Biomérieux. (2000), les milieux de culture, site : http://www.biomerieux.com/upload/Milieux_de_culture.pdf (consulté le 03/12/2010)

2)Mycoplasma CM Bébéar, S. Pereyre, (2002) infections à « Mycoplasma hominis », Site : http://emc.42t.com/EMC/Maladies%20infectieuses/Infections%20%E0%20%AB%20Mycoplasma%20hominis%20%BB%20%5B8-039-V-10%5D.pdf (consulté le 05/12/2010)

Jean Weissenbach, (28/01/2008), Genoscope, centre national de séquençage, http://www.cns.fr/spip/Mycoplasma-hominis-opportuniste.html (consulté le 05/12/2010)

3)PCR en temps reel Dubrana Karine, (2010), Examining the distribution of telomeric and DNA repair proteins, site : http://www.md.ucl.ac.be/seminfect/dia-stainier-25-10-01/Stainier-25-10-01.pdf (consulté le

12/12/2010)

Brochures

4)Mycoplasma/Ureaplasma Rallu Fabien, CHU Sainte-Justine, Université de Montréal, Les mycoplasme : des bactéries pas tout à fait comme les autres. 5)Protocole de l’extraction pour la PCR en temps réel QIAGEN, EZ1 DNA tissue Handbook, (avril 2010) 6)Protocole de la PCR en temps réel GeneProof, PCR Kit. Manuals for use with the following devices, République chèque (septembre 2009) 7)Kit Mycoplasma DUO BioRad, Mycoplasma DUO, Identification and differential titration of genital mycoplasmas. (Février 2010)

http://www.cerbafaso.org/textes/DEA_Tese/Memoire_DEA_Flo.pdf

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http://emc.42t.com/EMC/Maladies%20infectieuses/Infections%20%E0%20%AB%20Mycoplasma%20hominis%20%BB%20%5B8-039-V-10%5D.pdf

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http://www.cns.fr/spip/Mycoplasma-hominis-opportuniste.html

http://www.md.ucl.ac.be/seminfect/dia-stainier-25-10-01/Stainier-25-10-01.pdf

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Photos

Photo 1 : http://www.cns.fr/spip/-Mycoplasma-hominis-PG21,183-.html Photo 2 : http://www.mycoplasma.uab.edu/Methodologies.html Photo 3 : http://knol.google.com/k/-/-/1yexqll01wr4o/in5wc2/bannier-hindi%20%284%29.jpg Photo 4-5 : http://www.igh.cnrs.fr/equip/cavalli/Dubrana128.pdf Photo 6 : http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/mineluteqiaquicksystems.aspx Photo 7 : http://www.google.ch/imgres?imgurl=http://www.biorain.com/web/Portals/0/QIAGEN/EZ1%2520Advanced%2520XL.png&imgrefurl=http://www.biorain.com/web/LinkClick.aspx%3Flink%3D114%26tabid%3D58&usg=__PCEZRwbaSGMtTwEa_NxL6gooR-g=&h=268&w=402&sz=85&hl=fr&start=0&zoom=1&tbnid=ZYbWtfqssSb5uM:&tbnh=171&tbnw=235&ei=0Fs0TbG-Nt3NjAeZwsHWCw&prev=/images%3Fq%3DBioRobot%2BEZ1%26um%3D1%26hl%3Dfr%26biw%3D1259%26bih%3D823%26tbs%3Disch:1&um=1&itbs=1&iact=rc&dur=94&oei=lVs0TaTaOcqXOue4jLUC&esq=11&page=1&ndsp=24&ved=1t:429,r:15,s:0&tx=-121&ty=-183 Photo 8 : http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx Photo 9 : http://farmacja.cm-uj.krakow.pl/index.php/owydziale/Page%3Blaboratoria_galeria Photo 10 : http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product/br_category.jsp?BV_SessionID=@@@@1557452986.1295277342@@@@&BV_EngineID=ccceademifiehkicfngcfkmdhkkdfll.0&divName=Corporate&loggedIn=false&serviceLevel=Lit+Request&lang=English&csel=null&catLevel=7&catOID=-21026&isPA=false&categoryPath=%2fCatalogs%2fClinical+Diagnostics%2fMicrobiology%2fIdentification%2fBiochemical+Tests%2fIdentification+Kits%2fMycoplasma+Product+Line+for+Urogenital+Mycoplasmas

http://www.cns.fr/spip/-Mycoplasma-hominis-PG21,183-.html

http://www.mycoplasma.uab.edu/Methodologies.html

http://knol.google.com/k/-/-/1yexqll01wr4o/in5wc2/bannier-hindi%20(4).jpg

http://knol.google.com/k/-/-/1yexqll01wr4o/in5wc2/bannier-hindi%20(4).jpg

http://www.igh.cnrs.fr/equip/cavalli/Dubrana128.pdf

http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/mineluteqiaquicksystems.aspx

http://www.google.ch/imgres?imgurl=http://www.biorain.com/web/Portals/0/QIAGEN/EZ1%2520Advanced%2520XL.png&imgrefurl=http://www.biorain.com/web/LinkClick.aspx%3Flink%3D114%26tabid%3D58&usg=__PCEZRwbaSGMtTwEa_NxL6gooR-g=&h=268&w=402&sz=85&hl=fr&start=0&zoom=1&tbnid=ZYbWtfqssSb5uM:&tbnh=171&tbnw=235&ei=0Fs0TbG-Nt3NjAeZwsHWCw&prev=/images%3Fq%3DBioRobot%2BEZ1%26um%3D1%26hl%3Dfr%26biw%3D1259%26bih%3D823%26tbs%3Disch:1&um=1&itbs=1&iact=rc&dur=94&oei=lVs0TaTaOcqXOue4jLUC&esq=11&page=1&ndsp=24&ved=1t:429,r:15,s:0&tx=-121&ty=-183









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http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product/br_category.jsp?BV_SessionID=@@@@1557452986.1295277342@@@@&BV_EngineID=ccceademifiehkicfngcfkmdhkkdfll.0&divName=Corporate&loggedIn=false&serviceLevel=Lit+Request&lang=English&csel=null&catLevel=7&catOID=-21026&isPA=false&categoryPath=%2FCatalogs%2FClinical+Diagnostics%2FMicrobiology%2FIdentification%2FBiochemical+Tests%2FIdentification+Kits%2FMycoplasma+Product+Line+for+Urogenital+Mycoplasmas








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13. Lexique

A) Post-abortum : Période qui s’étend de la fin de l’accouchement au début des

premières règles. B) Pléomorphique : Caractéristique que possèdent certaines bactéries à changer de

forme selon le milieu où elles se trouvent. C) Membrane trilamellaire : Membrane constituée de 3 couches dont les pôles

hydrophobes sont face à face entourant les protéines. D) Chorioamniotite : La chorioamniotite est une infection de la cavité amniotique qui se

fait le plus souvent par voie ascendante. E) Syndrome de Reiter : C’est une affection qui débute par une atteinte des intestins de

manière fugace, avec des douleurs et une diarrhée. Elle est suivie au bout de deux ou trois semaines par une urétrite.

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14. Remerciements

Je voulais tout d’abord remercier le laboratoire FutureLab-BBR de Lausanne pour son aide et son soutien. Un merci tout particulier au département de bactériologie et de PCR, sans lequel, ce travail n’aurait pas pu se faire. Un grand merci à l’équipe de bactériologie qui a pris soin de garder tous les échantillons sur lesquels une recherche de mycoplasmes était demandée. Un grand merci à Mr. F. Piran, directeur de département, qui a pris du temps de relire mon travail. Merci à tous.

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15. Annexes

Séquence d’ADN pour Mycoplasma :

1 tcgacggccc gggctggtga cgaactcgaa agtctttata gaatttagag acatccttat

61 ttgccatcag cgatcctttc ataaagtttt tttacttctt taactttttg attccagtca

121 agactcaaga agcctttgcg agcaataatc acagtttcgt aatttaaagt gctaaaatca

181 atgtttctta gaattgatct gatttgattt ttgtaatgat ttctcaaaac agcatttgca

241 aattgcttag ggattgaaat acccacttta aagaaatcgg atttgttaaa ataaattatt

301 aaattttttg aaaccacttg attgtgagaa tcaagaattt tctgaaattc ccaatttttt

361 ttaacaacgt tatttttatt tatcataatt taaaaatatg caaggtatta gacttattta

421 ttgtctgata cagttaatgt atatctacct tttgcacgtc tagctgctaa aacttttcta

481 ccatttttag tttgcattct agccataaaa ccatgaactt taatgtgttt gcgttttttt

541 ggttggtatg ttcttttcat aacaattctc ctttgcgttt ttatatataa aataacttaa

601 tttattttac caaaaatacg acaaaaaaag tatataaaat acctaagaaa aaaatttaat

661 attttttatg tttttaatgt aaattaaaag aaacacaaaa tttaaagtta ataacaaaat

721 aaacaaagaa attatttaaa tgtttattat gttattttag tataaaaaac ttcttatttt

781 aaaaacaaaa ggcctaaaaa aaatgttaat aattttgtta ataatttgta aattagcatt

841 tataagggct tattaattta ttaattttga attttaaaat ataatagagg tatgaaaact

901 acaaatccct ctgaattaga tttaaaagcg cataatatgt catttcaaaa agaattagtt

961 aatactgcaa gtgatccctt aatatatgat caattcttgt cgtcattaga aattgtaaaa

1021 gaaaataata aaatgattta catattagtt aaaggacctg aagatgtttt aacatatatt

1081 aagaatagtc ataatgaaag tattaaaaga gcaattaaaa acgtttatgg tgaagaatat

1141 aatttggttt atattagaaa tttagatgaa attaaaagtt tgcaaaatag caataatatt

1201 gaatctccaa ctaattcatt gactaataat tctaaagaaa attttagcaa tattaagaag

1261 aatttaacat ttgatgatta tgcaatagga aaatttaata atatggcttt aaaggcagca

1321 aaggctattt gcaatagtga aaagatattg ttctctcctt tatttattca tgcttcaagt

1381 gggcttggta aaacacatct attacatgct atcggaaatg aattattaaa acacggtaga

1441 agtgcattat atataaatcc tgattcattg acaagaagat tagttgaaca attaaaatca

1501 aagaatcaag aacaaattaa taaaattatt gatgaattaa tgtcttatga ttgcctaatg

1561 tttgatgatg ttcaacaata tggtaatcgt gattctacat taaatgtctt atttaatatt

1621 attgataata tgataatgaa cgataagcaa ataatctttt gtggtgataa aaagccggat

1681 gatttaggtg gatttgaaca aagatttata actagattta atggcggatt aactgttgaa

1741 attttaaaac cagagttaaa tgatgtaatt aatatcttga aatttaagtt gcaagaaaac

1801 ggtataaatc cggaactttg agaggaggaa agcttaaaat ttattgctag aaacttctct

1861 tcatcaataa gaaatattga gggtgcaatt aacagaataa aattatttca agatggtgac

1921 gacggctttt ttacatatga tattaataca ataaaatcaa tatttaacag catgactcaa

1981 gttgctgaga atattacccc cgataaaata attgatgctg tttctaaata ctataaaatt

2041 gacagaaaaa aaatattgag taatgtaaga acaaatgatg tggttaatgc ccgtagaata

2101 gcaacatatt tagtgaataa aatttttaat tatacattgc aagaaatagg caaggttgta

2161 ggaaatcaat cacattcaaa cgttattgtt tcgcttaatt gaattgaaaa aaatgctaac

2221 agtaatccaa cgcttaaatt agcattgcaa aaaatagaaa gcaatcttaa aaaaatttcg

30

Séquence d’ADN pour Ureaplasma :

1 agagtctggc ggcatgccta atacatgcaa atcgaacgaa gcctttttgg cttagtggtg

61 aacgggtgag taacacgtat ccaatctacc cttaagattg ggataactag tcgaaagatt

121 agctaatacc gaataatgac attcttttgc atgaaagaat gtagaaagtt gcgtttgcaa

181 cgcttttgga tgagggtgcg acgtatcaga tagttggtgg ggtaacggct caccaagtca

241 ttgacgcgta gctgtactga gaggtagaac agccacaatg ggactgagac acggcccata

301 ctcctacggg aggcagcagt agggaatttt tcacaatggg cgaaagcctt atgaagcaat

361 gccgcgtgaa cgatgaaggt ctataagatt gtaaagttct tttatttggg aagaaccact

421 aaaataggaa atgattttag tctgactgta ccatttgaat aagtatcggc taactatgtg

481 ccagcagccg cggtaataca taggatgcaa gcgttatccg gatttactgg gcgtaaaacg

541 agcgcaggcg gatttgtaag tttggtatga aatctagatg cttaacgtct agctgtatca

601 aaaactacga atctagagtg tagcagagag ttggggaact ccatgtggag cggtaaaatg

661 cgtagatata tggaagaaca ccggtggcga aggcgccaac ttggactatt actgacgctt

721 aggctcgaaa gtgtggggga gcaaatagga ttagataccc tagtagtcca caccgt

Documents

Comparaison de trois m©thodes pour la d©tection de Mycoplasma et